estudio de la efectividad de la proteína ompa de
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Estudio de la efectividad de la proteína OmpA de Escherichia coli K-12
W3110/pCA24N/ompA, como biosurfactante para la separación de grasas y aceites
de aguas residuales generadas en la industria cosmética.
MARIA LILIANA BELTRÁN RAMOS
Proyecto de grado para optar al título de Ingeniera Química
Asesor,
ANDRES GONZALEZ BARRIOS
Ingeniero químico, M. Sc., Ph. D
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTA D.C.
NOVIEMBRE 2018
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Objetivo general:
• Evaluar la efectividad de la proteína OmpA obtenida a partir de Escherichia coli
W3110/pCA24N/ompA como biosurfactante para la remoción de grasas y aceites presentes en
el agua residual de la industria cosmética.
Objetivos específicos:
• Elaborar la curva de crecimiento del Escherichia coli, con el fin de obtener el tiempo exacto
para realizar el proceso de inducción y obtener una sobreexpresión de la proteína.
• Producir la proteína OmpA de Escherichia Coli en escala de laboratorio, y establecer un
protocolo de extracción de la misma.
• Determinar la efectividad de remoción de grasas y aceites en el agua residual, proveniente
de la industria cosmética, a partir del método Soxhlet.
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Estudio de la efectividad de la proteína OmpA de Escherichia coli
K-12W3110/pCA24N/ompA, como biosurfactante para la
separación de grasas y aceites de aguas residuales generadas en la
industria cosmética.
Maria Liliana Beltrán Ramos1, Andrés González Barios Ph.D2 1Universidad de los Andes, Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química
2Profesor asociado, Universidad de los Andes, Facultad de Ingeniería, Departamento de
Ingeniería Química
1. Introducción
La industria cosmética en Colombia, ha
estado en auge los últimos años
posicionándose como el cuarto mercado en
América latina y con un crecimiento esperado
del 11.6%. Esto ha generado, que los niveles
de contaminantes producidos por esta área
hayan aumentado, y de la misma forma
llevado a las grandes empresas a incursionar
en métodos alternativos para el tratamiento de
aguas residuales. [1] Las aguas residuales de
la industria cosmética se caracterizan por
tener valores elevados de sólidos
suspendidos, DQO (Demanda química de
oxígeno), detergentes, grasas y aceites
[2].Productos tales como el aceite de ricino,
aceite mineral, ceras, glicerina, acetato de
amilo entre otros, son uno de los componentes
aceitosos de más del 90% de los elementos
distribuidos por esta industria, y por ende,
uno de los componentes que se encuentran en
mayor proporción en las aguas residuales [3].
En Colombia, el nivel de grasas y aceites en
el agua se encuentra regulado por la
resolución 631 del 2015, en donde se estipula
que el máximo valor permitido para estos
componentes corresponde a 15,00 mg/L
como promedio diario y 25 mg/L como
promedio mensual [4]. La presencia de estas
en los cuerpos de agua ocasiona la aparición
de natas y espumas, y generan cambios
fisicoquímicos en las propiedades del agua.
Con el fin de reducir el impacto de las altas
concentraciones de grasas y aceites, se ha
incursionado en diferentes métodos de
tratamiento para su remoción. Entre ellos, se
encuentra la implementación de trampas de
grasa, en el cual los contaminantes quedan
atrapados dentro de un tanque de acero
inoxidable, en donde el sistema los recupera
por calefacción y deja pasar el agua
clarificada [5].El tratamiento biológico, en el
cual se implementa una cepa de bacterias
especialmente formulada para la remoción de
grasa animal y vegetal, la cual requiere de
ciertas dosificaciones de productos químicos,
para garantizar la degradación de las grasas y
aceites, lo cual lo hace menos efectivo y
desfavorable para el ambiente [6]. Por otro
lado, se encuentra el método de flotación por
aire disuelto (DAF). Este último
procedimiento consiste en que, en ausencia de
agitación, se introducen micro burbujas de
aire, las cuales al ascender generan una
adhesión de las partículas presentes en el
líquido, separándolas y formando una capa
flotante de material concentrado. Sin
embargo, este método no es eficiente cuando
la emulsión agua y aceite es estable, y debe
4
hacerse el rompimiento de la emulsión
mediante la adición de un surfactante[7].
Una de las alternativas recientes, que surgió
debido a las nuevas tecnologías sostenibles es
la implementación de biosurfactantes como
agentes separadores de contaminantes
presentes en las aguas residuales.
Los biosurfactantes pueden producirse por
una amplia gama de microorganismos que
incluyen bacterias, hongos y levaduras, tales
como el Bacilus Salmalaya, Pseudomonas
aeruginosa y Saccharomyces lipolytica
[8].Son llamados biotensoactivos por la
presencia de moléculas anfifílicas, las cuales
tienen propiedades emulsificantes,
dispersantes y tenso activas, que les permiten
disminuir la tensión superficial del agua de 75
mN/m a 25 mN/m aproximadamente. De la
misma forma, favorecen la biodegradación de
sustratos insolubles, reduciendo la tensión
superficial entre la fase acuosa y oleaginosa.
Son compuestos extracelulares, de baja
toxicidad, con bajo espectro de actividad
tenso activa a condiciones de pH, salinidad y
temperatura extremos y son biodegradables.
Sin embargo, existen ciertas desventajas que
los hacen poco implementados en algunas
industrias, tales como que su producción es
costosa a gran escala, es difícil obtener un
producto puro y la regulación de la síntesis
para su producción, es poco comprendida [9].
La parte hidrofóbica del biosurfactante se
debe a la presencia de grupos de ácidos grasos
de cadena larga, y también puede ser un
fosfato, alcohol, ácido carboxílico,
carbohidrato, aminoácido o péptido cíclico
[8].Presentan una superficie inferior, y la
tensión interfacial incluye grupos de
macromoléculas tales como proteínas,
lisopéptidos, glicolípidos y fosfolípidos.
Se ha incursionado en el estudio de síntesis de
biomoléculas peptídicas que puedan ser
empleadas como surfactantes, y en general se
componen de nano péptidos que forman
interfaces estables usando aminoácidos
hidrofóbicos. Los péptidos comúnmente
contienen metionina, valina y leucina, y
permiten cambiar las interacciones
moleculares, disminuyendo la tensión de
líquidos, y permitiendo garantizar la
estabilidad de emulsiones.
El estudio de péptidos ha permitido dar paso
al estudio de diferentes proteínas como
surfactantes provenientes de distintos tipos de
organismos [10].
Uno de los microorganismos que han sido
mayormente estudiados para la obtención de
proteínas recombinantes, ha sido el
Escherichia coli, entre la cual se destaca la
proteína transmembranal OmpA. El lado N-
terminal de esta proteína es variable, pero el
dominio clásico cuenta con 171 residuos de
aminoácidos que atraviesan la membrana
ocho veces en cadenas β-antiparalelas con
cuatro bucles expuestos a la superficie
relativamente grande e hidrofílicos y con
cortos giros periplásmicos. El dominio C-
terminal, se encuentra en el periplasma y se
une al peptidoglicano conectándolo así a la
membrana externa [11].
Ilustración 1. Modelo completo Proteína OmpA [23]
5
Para la determinación de aceites y grasas en
el agua residual, se utiliza el método de
extracción Soxhlet. En este procedimiento,
los aceites y las grasas sólidas o viscosas
presentes se separan de la muestra líquida por
filtración sobre una matriz sólida absorbente.
Después de la extracción en un aparato
soxhlet con solvente orgánico, se pesa el
residuo que queda de la evaporación del
solvente para determinar el contenido en
grasa y aceite. No se mide una cantidad
absoluta de una sustancia específica; si no que
se determinan grupos de sustancias con
características físicas similares, con base en
su solubilidad en el solvente (n-hexano) [12].
Con base a lo anterior, se puede determinar
que no se han implementado métodos
eficientes para la remoción de aceites y grasas
de las aguas residuales de la industria
cosmética, que sean amigables con el
ambiente y de bajo costo.
El presente proyecto, pretende llevar a cabo
la implementación de la proteína OmpA
proveniente del Escherichia coli K-12
W3110/pCA24N/OmpA como
biosurfactante, con el objetivo de reducir
considerablemente la cantidad de aceites y
grasas presentes en la aguas residuales de la
industria cosmética. Para ello, se establecen
diferentes aspectos importantes, tales como
realizarla curva de crecimiento del
microorganismo, con el fin de conocer el
tiempo exacto para la inducción de lactosa,
determinar un procedimiento para la
obtención y cuantificación de la proteína,
preparación de emulsiones agua/aceite
mineral, planteamiento de un diseño de
experimentos con variaciones en la
concentración de aceite y proteína y la
implementación del método Soxhlet, para
conocer el porcentaje de remoción de aceites
que tiene el biosurfactante.
2. Metodología
El desarrollo metodológico tiene cuatro
partes principales: Microorganismo y medio,
obtención de la proteína, preparación de
emulsiones y evaluación de remoción de
grasas y aceites.
2.1 Microorganismo y Medio
Para llevar a cabo la experimentación se
requirió de la preparación de un medio LB
sólido, el cual permitiera realizar la siembra
de un clon del Escherichia coli. Se prepararon
100 mL de medio, con 1.036 g/L de NaCl,
0.5069 g/L de Extracto de levadura, 1.059 g/L
de Agar y 1.0438 g/L de Triptona.
Posteriormente, se auto clavó la solución y se
preparó el antibiótico pertinente
(cloranfenicol).
Es importante resaltar que se requiere que el
cloranfenicol presente una concentración de
50 𝜇𝑔/𝑚𝐿. Para esto, se realiza una dilución
de 0.1 g de cloranfenicol en un balón de 50
mL y se afora con etanol. Después de esto, se
extrae 2.5 mL de esta solución y se colocan
Ilustración 2. Plásmido de clonación pCA24N. T5-lac,
región de inducción de lactosa. [10]
6
en un balón de 25 mL, el cual se afora con
etanol.
Después de que la solución se atoclavara, se
esperó a que el medio LB se encontrara a
temperatura ambiente (evitando
solidificación), y se agregó el cloranfenicol
en la cabina de flujo laminar horizontal
esterilizada por radiación UV, se adiciona
1𝜇𝐿de cloranfenicol por cada mL de medio.
Se sirvió el medio en 3 cajas de Petri y se
esperó su solidificación a una temperatura de
37°C.Se descongeló el clon de la proteína
OmpA y se tomaron 5𝜇𝐿 con una micropipeta
para realizar una siembra por agotamiento.
Este procedimiento consiste en dejar caer una
gota en el agar, y esparcir en líneas en un solo
sentido, flameando el asa entre cada barrido.
Las cajas con los cultivos fueron llevados a la
incubadora a 37°C durante un periodo de 18-
24 horas y al día siguiente se guardaron en
una nevera a 4°C.
Por último, se preparó 50 mL de medio LB
líquido en un Erlenmeyer de 500mL, con
0.509 g/L de NaCl, 0.506 g/L de triptona y
0.251 g/L de extracto de levadura. Se
autoclavó la solución y se agregan 50𝜇𝐿 de
cloranfenicol. Se realiza la inoculación de la
bacteria de medio solido a líquido, con las
puntas de micropipeta previamente
autoclavadas, y se incuba en un shaker a 37°C
y 250 rpm durante 16 horas.
2.1.1 Curva de Crecimiento
Se realizaron dos curvas de crecimiento en
Erlenmeyer. Para esto, se prepararon dos
medios LB líquidos de 195 mL, que contenían
1.952 g/L de NaCl, 1.949 g/L de triptona y
0.977 g/L de extracto de levadura. Se
agregaron 195𝜇𝐿 de cloranfenicol.
Posteriormente, estos medios fueron
inoculados con el medio preparado en el
literal 2.1. Se agregaron 5 mL del preinóculo
en cada Erlenmeyer, y se dispusieron en una
incubadora shaker a 37°C y 250 rpm, por un
periodo breve de tiempo para garantizar la
mezcla. Se tomó 1mL del inóculo obtenido, y
a través de un espectrofotómetro se determinó
la densidad óptica de la muestra, medida a
600 nm. Los valores de absorbancia se
registraron cada hora, durante 10 horas. Es
importante destacar, que la extracción del mL
se realizó en la cabina de flujo laminar
horizontal, con micropipetas previamente
auto clavadas, y que se separaron 2 mL del
medio LB líquido con cloranfenicol, antes de
agregar el preinóculo, para usarlo como
blanco en las mediciones UV.
2.1.2 Inducción de lactosa
Se realizó la preparación del medio LB sólido
y líquido y se repitió el procedimiento de
siembra e inoculación. Se preparó un pre
inóculo de 50 mL, y se inoculó en un medio
líquido de 500 mL, previamente autoclavados
y el cual contenía 50𝜇𝐿 de cloranfenicol. Se
registró la absorbancia por medio del
espectrofotómetro, hasta que llegara al valor
deseado correspondiente a la fase
exponencial, durante aproximadamente 4
horas (absorbancia en un rango de 0.9 a 1). En
la cabina de flujo laminar horizontal
esterilizada por radiación UV, se realiza la
inducción de 5 g/L en el cultivo.
Posteriormente se realiza la incubación del
inóculo en un shaker a 250 rpm y 37°C, por
cuatro horas más hasta que se alcanzara la
fase estacionaria.
2.2Obtención de la proteína
2.4.1 Centrifugación
En la cámara de flujo laminar esterilizada con
UV, se sirvió en inóculo obtenido en 10 tubos
falcon de 50 mL. Posteriormente, se realiza
un proceso de centrifugación durante 1 hora,
7
a 4500 rpm y a una temperatura de 4°C. Al
terminar este procedimiento, se obtienen las
células en el precipitado de la solución
centrifugada. Con el fin de determinar el peso
de estas células, todos los precipitados fueron
recolectados en un solo tubo, el cual fue
pesado previamente.
2.4.2 Lisis por sonicación
Al falcon obtenido en el numeral anterior, fue
agregado un buffer de lisis en una proporción
de 4mL por cada gramo de células presentes.
Después de esto, se lisan las bacterias con el
sonicador de punta en un baño de hielo por 40
ciclos de 20sx40s ya una amplitud de 37%.
2.4.3 Centrifugación final y cuantificación de
proteínas
Posterior al proceso de sonicación, se
introduce el tubo Falcon en la centrifugadora
refrigerada, a una velocidad de 4500 rpm,
durante 1 hora a 400°C. Esto se realiza, con
el objetivo de obtener la proteína en el
sobrenadante y los residuos en el precipitado.
La cuantificación de la proteína se realiza
utilizando el programa Nanodrop, con una
longitud de onda de 280 nm, y utilizando el
buffer de lisis como blanco.
2.3. Obtención de Emulsiones a separar
Con el objetivo de realizar en el laboratorio
una muestra sintética del agua residual de la
industria cosmética, se realizó una
investigación de las principales materias
primas que se implementan en la elaboración
de productos de esta industria. Se determinó
que el aceite mineral, era conveniente para
simular los aceites y grasas presentes en el
agua, puesto que es empleado en productos
como cremas, lociones, productos de
protección solar entre otros. Además, es
manejado en un amplio rango de
concentraciones que puede ser del 1 al 99%
dependiendo del producto. [13]
Para realizar la emulsión aceite- agua, se
requiere la adición de un surfactante que
garantice una mezcla homogénea y estable.
Con base a esto se utiliza el método HLB
(balance hidrofílico-lipofílico), con el fin de
emplear dos tipos de surfactantes, que
pudieran mezclarse siguiendo la regresión
lineal basada en fracciones en peso [14]
𝐻𝐿𝐵𝑀 = 𝑥1𝐻𝐿𝐵1 + 𝑥2𝐻𝐿𝐵2 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1
De acuerdo a esto, se decidió emplear Tween
20 (fase continua), el cual posee un HLB de
16.7, y Span 80 (Fase dispersa), el cual posee
un HLB de 4.3. El HLB requerido, para la
mezcla aceite mineral- agua corresponde a
10. [15]
2.4 Evaluación de Remoción de grasas y
Aceites
Para conocer el efecto del biosurfactante en la
remoción de grasas y aceites del agua, se
planteó un diseño factorial 2𝑛 con réplica. En
este se evaluaron dos factores, los cuales
corresponden a la concentración de aceite
presente en el agua y a la concentración de
proteína aplicada a la emulsión.
La concentración de grasas y aceites en el
agua residual de la industria cosmética varía
dependiendo la actividad para la que se
utilice. Las mayores concentraciones se
presentan en los procesos de producción del
maquillaje y tratamientos, mientras que
concentraciones bajas se presentan para las
labores de limpieza y aseo de los equipos de
proceso. [3]. De esta manera se determinó
emplear un nivel de 25% fase dispersa y un
nivel de 50% fase dispersa, con el objetivo de
obtener diferentes concentraciones, de
acuerdo a los procedimientos realizados en la
industria.
8
La concentración de proteína aplicada, se
espera evaluar en diferentes tipos de dosis
(baja y alta) y establecer si existe una relación
entre la cantidad de proteína aplicada y el
porcentaje de remoción de grasas y aceites del
agua residual. Se determinan dos niveles
0.025% w/w y 0.1 % w/s.
De esta manera se realizarán 8 experimentos,
como se resume en la tabla a continuación
Tabla 1.Diseño de Experimentos
2.4.1 Preparación de Muestras
Para la preparación de las muestras que se
emplean en el diseño experimental se parte de
la cantidad de agua residual realizada en el
punto 2.3. Se determina que a cada muestra se
agregaran 2.5 mL de proteína, y a partir de la
concentración obtenida a través del programa
Nanodrop, se calcula la cantidad de agua que
debe añadirse a la muestra para garantizar un
%w/w de 0.025 y 0.1. La explicación de este
cálculo se puede observar en la sección de
Anexos.
Con base a lo anterior, se establece que es
necesario añadir 82.5 g de agua residual para
garantizar una relación de 0.025% w/w, y
206.2 g de agua residual para obtener una
relación de 0.1% w/w, tanto para las muestras
de que contienen 25 % fase dispersa, como
para las que contienen 50% fase dispersa.
2.4.2 Decantación
Después de obtener las 8 muestras con la
adición de proteína, se colocan en 8 embudos
de decantación respectivamente, con el fin de
favorecer la separación del aceite del agua. El
proceso de decantación se lleva a cabo
durante 24 horas, para garantizar la máxima
eficiencia. No se considera tapar los
embudos, puesto que se está haciendo una
simulación del proceso de tratamiento de
aguas residuales, en el cual el agua se
encuentra directamente expuesta al ambiente.
Adicional a las 8 muestras, se utilizan 2
blancos, uno que contiene agua residual del
25% fase dispersa y otro que contiene agua
con un 50% de dispersa, a los cuales no se les
agrega proteína. Esto se realiza con el
objetivo de evaluar cómo sería la separación
del aceite únicamente por acción de la
gravedad, y de esta manera evaluar la
efectividad del biosurfactante.
Al finalizar el periodo de 24 horas, el
precipitado se recolecta en envases de vidrio,
los cuales han sido previamente lavados con
agua caliente y hexano, esto con el fin de
eliminar residuos de detergente, el cual puede
afectar los resultados del experimento.
2.4.3 Método Soxhlet
El método Soxhlet, se basa en el principio de
que cualquier aceite o grasa viscosa presente
en una muestra, se puede separar del líquido
por filtración, y después de una extracción en
un aparato Soxhlet con solvente (n-hexano),
el residuo remanente de la evaporación de
este último, puede pesarse y de esta manera
determinar la concentración de grasa y aceites
de la muestra [16].
Inicialmente, se registra el volumen total de
cada una de las 10 muestras elaboradas
previamente, marcando el envase en el
menisco. Se realiza una verificación de acidez
de la muestra (pH < 2), en este caso fue
necesario agregar 1 mL de H2SO4 a cada
muestra, para cumplir con el requerimiento.
Posteriormente, se realiza una filtración de
100 mL de sílice diatomácea, el cual tiene
Factores
Concentración Proteína 25% 50%
0.025 % w/w 2 réplicas 2 réplicas
0.1% w/w 2 réplicas 2 réplicas
Concentración Aceite
9
como objetivo atrapar las grasas presentes en
la muestra, y después se procede a realizar la
filtración de la muestra acidificada por
gravedad, utilizando papel filtro Whatman
40. Al finalizar el periodo de filtración, se
deja secar el papel filtro durante 2 días [16].
Después de que el papel filtro se encuentre
completamente seco, se pesa un matraz
(secado previamente a 103°C) y se le adiciona
a este 100 mL de n-hexano. El matraz se
coloca en el aparato Soxhlet y se extrae el
aceite y la grasa a una velocidad de 20 ciclos/
hora, durante un periodo de 8 horas.
Al finalizar este procedimiento, se realiza la
destilación del hexano que contiene el matraz,
en un baño del rotavaporador a una
temperatura de 85°C. Posteriormente,
después de destilar todo el hexano, el matraz
es llevado a un horno, para su secado a una
temperatura de 60°C durante 30 minutos. Se
lleva el matraz a un desecador de
enfriamiento durante un día. Se pesa el matraz
y se calcula la concentración de grasas y
aceites, a partir de la siguiente ecuación [16]
𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎𝑠 𝑦 𝐴𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒𝑠 [𝑔
𝐿] = (𝑃2 − 𝑃1) ∗
1000
𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2
𝑃2: 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑎𝑧 𝑦 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜 [𝑔]
𝑃1: 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑎𝑧 [𝑔]
3. Resultados y Análisis
3.1 Microorganismo y Medio
3.1.1 Curva de Crecimiento
Se realizaron dos inóculos, para garantizar la
obtención de resultados de mayor precisión,
con respecto a la curva normal de crecimiento
bacteriano. Cada uno mantuvo las mismas
condiciones de crecimiento, 50 mL de
preinóculo en 195 mL de inóculo.
• Primer Inóculo
• Segundo Inóculo
Como puede observarse en las gráficas 1 y 2,
el crecimiento bacteriano tiene un
comportamiento similar en ambos inóculos, y
permite diferenciar las tres fases principales
del proceso de crecimiento: Fase Lag, Fase
exponencial y Fase estacionaria.
Se puede establecer, que la fase lag, la cual
involucra el reinicio del ciclo bacteriano,
tiene una duración promedio de 1 hora y se
encuentra en un rango de absorbancia de
0.118 a 0.171 Por otro lado, es posible
evidenciar la fase exponencial, momento en
Gráfica 2. Curva de Crecimiento del Escherichia coli K-12
W3110/pCA24N/ompA para el segundo inóculo durante un
periodo de 10 horas.
Gráfica 1. Curva de Crecimiento del Escherichia coli K-12
W3110/pCA24N/ompA para el primer inóculo durante un periodo de
10 horas.
10
que las bacterias comienzan a crecer
aceleradamente (debido a que recuperan el
ciclo celular),se da entre la 4 y 5 hora de
medición, donde la absorbancia se encuentra
en un rango correspondiente a 0.954 y 1.277.
Por último, es posible evidenciar la fase
estacionaria en las últimas cuatro horas,
donde debido a la disminución de nutrientes
y el agotamiento de los mismos, el número de
células del cultivo no varía. En este punto la
absorbancia se maneja en un rango de 1.381 a
1.651.
Con base a lo anterior, puede determinarse
que el momento propicio para la inducción de
lactosa y permitir que ocurra la
sobreexpresión de la proteína OmpA ocurre
al pasar las 4 primeras horas de crecimiento.
La inducción de lactosa permite la activación
del plásmido pCa24N, del cual depende la
sobreexpresión de la proteína OmpA [17].
Por otro lado, puede establecerse que la
información obtenida es confiable debido a
que se genera una tendencia similar en ambos
inóculos y las variaciones de absorbancia se
mantienen en magnitudes cercanas.
Se espera que, en el proceso de inducción de
lactosa, se alcance la absorbancia registrada
en las 4 horas, la cual puede variar entre 0.954
y 1.057.
3.2 Producción de la Proteína
Al terminar el proceso de centrifugación, se
determinó el peso de las células que fueron
recuperadas, como se presenta a continuación
De esta manera, el peso total de todo el
precipitado recuperado durante la
centrifugación corresponde a 3.87 g.
Puesto que se mantiene una relación de 4 mL
de Buffer de lisis por gramo de células, para
el proceso de sonicación fue necesario
agregar 15.47 mL de buffer de lisis a las
células precipitadas.
Por otro lado, al finalizar el proceso de
sonicación y la última centrifugación, se
obtuvieron 20 mL de proteína, representadas
en el sobrenadante de la muestra, como puede
observarse en la ilustración número 3.
Ilustración 3. Proteína OmpA obtenida al finalizar la
centrifugación.
Posteriormente, a través del programa
Nanodrop se determinó que la concentración
de proteína de la muestra es de 8.25 mg/mL,
en una relación 260/280 nm de 1.8.
Es importante tener en cuenta que, aunque se
espera la sobreexpresión de la proteína
OmpA en el sobrenadante, como no fue
llevado a cabo un proceso de purificación, el
valor de concentración que se obtiene con el
espectrofotómetro de barrido espectral, puede
tener interferencias por la presencia de otras
moléculas que pueden ser cuantificadas a
través del programa. La decisión de no llevar
a cabo un proceso de purificación,
principalmente se debe a los costos que puede
generar este procedimiento tanto a nivel
Peso Tubo Inicial [g] Peso Tubo Final [g] Peso Células [g]
13.37 17.23 3.87
Tabla 2. Cantidad de Células recuperadas
11
laboratorio como a nivel industrial. Esto
disminuiría la oportunidad del biosurfactante
de ser implementado como una alternativa
óptima, eficiente y competitiva en
comparación con los métodos de tratamiento
de aguas convencionales, los cuales son más
económicos.
En investigaciones realizadas previamente, se
ha tenido como objetivo la caracterización
fisicoquímica de la proteína transmembranal
OmpA, y la determinación de la
concentración micelar crítica (CMC), un
parámetro relevante en el estudio de los
surfactantes. El CMC, se determina como la
concentración de surfactante límite para la
formación de micelas en una disolución [17].
El valor reportado para la concentración de
proteína en estas investigaciones es de 8.16
mg/mL [17].
Con base a lo anterior, puede establecerse que
el valor de concentración hallado para la
proteína se encuentra en un valor propicio,
para garantizar la efectividad de este como
biosurfactante. Las diferencias entre el valor
hallado y el encontrado en investigaciones
previas, puede deberse al método
experimental empleado, puesto que, en esta
última, la obtención de la proteína se realizó
a través de un biorreactor y se le hizo un
proceso de purificación. Lo cual permite
obtener un resultado de mayor precisión, pues
se asegura que todo el contenido de la muestra
pertenece únicamente a la proteína OmpA
[17].
3.3 Obtención de emulsiones a separar
Se decidió preparar dos tipos de emulsiones,
de acuerdo a lo presentado en el diseño de
experimentos. En primera instancia, se
determina la proporción de Tween 20 y Spam
80 a utilizar, con base en la ecuación 1.
Tanto para la emulsión de 25% fase dispersa
como para la de 50 % de fases dispersa, el
surfactante representara un 4% de la
emulsión.
Se harán emulsiones de 800 mL, de esta
forma se adicionarán 32 g de surfactante con
las siguientes proporciones
10 = 𝑥𝑇𝑤𝑒𝑒𝑛20 ∗ (16.7) + 𝑦𝑆𝑝𝑎𝑛80 ∗ (4.3)
1 = 𝑥𝑇𝑤𝑒𝑒20 + 𝑦𝑠𝑝𝑎𝑛80
𝑥𝑡𝑤𝑒𝑒𝑛20 = 0.46 ; 𝑦𝑠𝑝𝑎𝑛80 = 0.5403
De esta forma se obtiene, que debe emplearse
14.72 g de Tween 20 y 17.28 g de Span 80
para que el biosurfactante permita generar
estabilidad en las emulsiones.
Por otro lado, se determinó que para la
emulsión de 25% fase dispersa se requieren
182.72 g de aceite y 585.28 g de agua;
mientras que para la emulsión de 50 % fase
dispersa, se requieren 382.2 g de aceite y
385.28 g de agua.
3.4 Evaluación de remoción de grasas y
aceites
3.4.1 Decantación
Se realizó el proceso de decantación de las 8
muestras en el diseño de experimento, y de
los blancos respectivos. Una imagen del
montaje puede observarse en la sección de
anexos.
Al pasar el periodo de 24 horas, se pudo
observar claramente como en todos los
embudos de las 8 muestras experimentales,
existe una separación notoria de la fase
dispersa y de la fase continua. Por otro lado,
las muestras de blanco se mantuvieron
estables, y no fue posible observar una
separación significativa de las fases. Este
hecho, demuestra que efectivamente el
biosurfactante tiene una influencia en la
separación de grasas y aceites del agua, sin
12
embargo, solo con esta observación, no es
posible identificar si este efecto es
significativo.
Ilustración 4. Muestra de blanco 25% fase dispersa después
de un periodo de decantación de 24 horas.
Ilustración 5. Muestra 1, 25% fase dispersa- 0.025%w/w de
Proteína, después de un periodo de decantación de 24 horas.
A continuación, se muestra el volumen de
precipitado recuperado para cada una de las 8
muestras experimentales y de las dos
muestras blanco.
3.4.2 Método Soxhlet
A través del método Soxhlet fue posible
cuantificar la cantidad de grasa presente en la
muestra, aplicando la ecuación 2. [18]
De esta manera se obtiene los siguientes
resultados
Blanco Fase Dispersa % w/w Proteína Volumen [mL]
9 25% - 58
10 50% - 42
Tabla 4. Volumen de precipitado de cada muestra después
de la decantación.
Tabla 3. Volumen de precipitado de las muestras de blanco.
Tabla 5. Parámetros para la determinación de la cantidad de grasas y
aceites presentes en la muestra.
Muestra Fase Dispersa % w/w Proteína Volumen [mL]
1 25% 0.025% 50
2 25% 0.025% 37
3 50% 0.025% 40
4 50% 0.025% 30
5 25% 0.10% 48
6 25% 0.10% 52
7 50% 0.10% 40
8 50% 0.10% 54
Muestra Volumen [mL] Peso Matraz Inicial [g] Peso Matraz Final [g]
1 50 115.88 116.43
2 37 112.20 112.66
3 40 112.92 113.26
4 30 112.82 113.04
5 48 110.06 110.20
6 52 115.01 115.18
7 40 116.03 116.31
8 54 109.67 109.93
9 58 114.01 117.23
10 42 113.73 116.46
Método Soxhlet
13
Para determinar el porcentaje de remoción de
grasas, se emplea la concentración obtenida
en las muestras blanco, puesto que estas
representan el agua tratada inicialmente sin
ningún tipo de tratamiento, y por ende son un
estimativo de la cantidad de grasa inicial de
las muestras [19]. De esta manera se establece
la eficiencia de remoción empleando la
siguiente ecuación [20]
%𝑅𝑒𝑚𝑜 =(𝐶𝐵 − 𝐶𝑖)
𝐶𝐵
𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3
𝐶𝐵: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜
𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑙 𝑡𝑖𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 [𝑔
𝐿]
𝐶𝑖: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑛 𝑙𝑎𝑠
8 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 [𝑔
𝐿]
El porcentaje de remoción obtenido se
muestra a continuación
Tabla 6. Resultados de remoción de grasas de las 8
muestras experimentales
Es importante destacar, que en el método
Soxhlet se realizó una muestra blanco y una
muestra patrón, para garantizar la efectividad
del método, descartando interferencias por la
presencia de grasa en el papel filtro, o en los
equipos empleados; y pasa asegurar que
realmente se esté realizando mediciones de
grasas y aceites.
En los resultados anteriores, es posible
observar como la concentración de grasa y
aceite de las muestras, disminuye de manera
considerable al adicionar cierta cantidad de
proteína OmpA. La mayor eficiencia de
remoción se presenta en la muestra 5, que
tiene 25% fase dispersa y un % w/w de
proteína de 0.1, por otro lado, la menor
eficiencia se encuentra en la muestra 2, que
contiene un 25% de fase dispersa y un % w/w
de proteína de 0.025. Este comportamiento,
es un indicio de que el factor que influye en
el porcentaje de remoción es la proporción de
proteína aplicada en el agua, sobre las
características de la fase dispersa de esta
última. Este comportamiento será explicado
con mayor detalle más adelante. Por otro
lado, se puede establecer que el
biosurfactante es eficiente puesto que los
porcentajes de remoción alcanzados son
altos, como puede observarse en la tabla 6, en
la cual todos presentan una eficiencia mayor
al 75%. En tratamientos convencionales de
remoción de grasa, tales como las trampas de
grasa, el tratamiento biológico y el método de
flotación de aire disuelto, los porcentajes de
remoción, teniendo en cuenta las condiciones
de operación y las características del agua
Muestra Concentración grasa [g/L] Porcentaje de remoción [%]
1 10.95 80.29%
2 12.28 77.88%
3 8.44 86.99%
4 7.52 88.40%
5 3.07 94.46%
6 3.21 94.21%
7 6.95 89.28%
8 4.76 92.66%
9 55.54 -
10 64.86 -
Gráfica 3. Concentración de grasa de las 8 muestras
experimentales y de los 2 blancos.
14
residual tratada, oscilan entre el 70% y el 90%
[21].
Por otro lado, en tratamientos que emplean
biosurfactantes, se destacan los provenientes
de bacterias productoras de lipasa, en el cual
la remoción de grasas alcanza tasas
superiores al 60% [22]. De la misma forma,
investigaciones que involucran la adición de
enzimas de diferentes microorganismos tales
como, el Aerobacter aerogenes, Bacillus
subtilis, y Celulomona biazotea, para la
eliminación de lípidos de las aguas residuales
producidas en la limpieza de equipos
industriales, reportan remociones del 70% al
90% [22]. El Acinetobacter sp, el cual ha sido
uno de los microorganismos más efectivos
para remoción de grasas, genera una
disminución del 60-65% [22]. De una manera
similar, se han realizado pruebas con P.
aeruginosa 𝐿𝑃602, para el tratamiento de
aguas residuales con altos contenidos de
aceite, en donde el contenido de lípidos fue
reducido en un 70 % en las primeras 24 horas,
y fue indetectable después de 48 horas [22].
Es importante destacar, que la efectividad de
estos biosurfactantes radica en la
implementación de tratamientos adicionales,
como trampas de grasa, y que dependen en
gran proporción de las características propias
del aceite que contiene el agua residual.
Con base a lo anterior, se determina que la
eficiencia del biosurfactante, se encuentra
dentro de los estándares esperados de
remoción, y de acuerdo a los métodos de
tratamiento convencionales, representa una
alternativa viable, capaz de ser incorporada a
gran escala. Sin embargo, es importante tener
en cuenta, que la efectividad varía, tanto por
el tipo de agua empleada como por la cantidad
de proteína agregada. Al ser comparada con
otro tipo de biosurfactantes, la eficiencia de
remoción se encuentra dentro del rango
esperado, teniendo en cuenta diferencias en
métodos de obtención y propiedades de los
microorganismos empleados.
Para determinar las diferencias presentadas
en cuanto a concentración de grasa y
porcentaje de remoción, dependiendo de
factores tales como, la fase dispersa de la
muestra y la cantidad de proteína aplicada, se
halla el promedio de los resultados obtenidos
de cada muestra para cada factor, como se
muestra a continuación
Tabla 7. Concentración y % de remoción de grasas
promedio, de acuerdo a las características de la fase
dispersa.
De acuerdo a los resultados anteriores, es
posible establecer que las características de la
fase dispersa del agua residual no generan un
alto impacto en la remoción de grasas, ni en
la concentración de estas en el agua. Esto
puede observarse, en la diferencia de
remoción entre los dos tipos de agua, la cual
es inferior al 3 %, y en la diferencia de
concentración de grasas, la cual es de 0.46
g/L. Sin embargo, para aplicaciones a gran
escala, esta diferencia puede ser significativa,
y de esta manera aguas residuales con
mayores concentraciones de grasa y aceites,
serán tratadas de manera más efectiva al
realizar la aplicación del biosurfactante.
Tabla 8. Concentración y % de remoción de grasas
promedio, de acuerdo al % w/w de proteína.
% w/w Proteína Concentración grasa [g/L] Porcentaje de remoción [%]
0.025% 9.80 83.39%
0.10% 4.50 92.65%
Fase dispersa Concentración grasa [g/L] Porcentaje de remoción [%]
25% 7.38 86.71%
50% 6.92 89.33%
15
Por otro lado, el efecto de la relación %w/w
de proteína con respecto al agua, tiene un
efecto de mayor relevancia, tanto en la
concentración de grasas y aceites obtenido al
final del proceso, como en el porcentaje de
remoción. La diferencia de concentración de
grasas es de 5.3 g/L, mientras que la
diferencia entre el porcentaje de remoción es
de 9.26%. Esto representa, que a medida que
aumenta la presencia de la proteína OmpA de
Escherichia coli en un determinado tipo de
agua, se obtendrá una mayor eficiencia de
remoción de grasas y aceites. El hecho de que
a una mayor proporción de la proteína OmpA,
se obtengan una efectividad alta en la
disminución de concentración de grasa en el
agua, se debe a su naturaleza anfifílica que le
permite interactuar tanto con la mitad del
periplasma como con la membrana hidrófoba,
lo cual permite la separación de las moléculas
de grasa [23]. Por otro lado, tiene una alta
homología a la proteína emulsionante AlnA,
usada en el biosurfactante comercial Alasan
[24], lo cual hace que se puede reconocer
como un biosurfactante potencial de alta
eficiencia.
Para comprobar el efecto de los dos factores
implementados en la remoción de grasas, y
para establecer si este efecto es
estadísticamente significativo, se realiza un
diseño factorial en el programa
computacional Minitab®. Se maneja un nivel
de significancia del 5%, con el fin de
disminuir la probabilidad de cometer un error
tipo II, (no rechazar la hipótesis nula, dado
que esta es falsa). Se plantean las siguientes
hipótesis
𝐻0: 𝑁𝑜 𝑒𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒 𝑢𝑛 𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 % 𝑑𝑒
𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑝𝑒𝑟𝑠𝑎 𝑦/𝑜 𝑒𝑙 %𝑤
𝑤𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
𝐻1: 𝐸𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒 𝑢𝑛 𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 % 𝑑𝑒
𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑝𝑒𝑟𝑠𝑎 𝑦/𝑜 𝑒𝑙 %𝑤
𝑤𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
Los resultados llevados a cabo a través de
Software se presentan a continuación
Con base a lo anterior, es posible fundamentar
estadísticamente, la significancia de los
factores involucrados, en la remoción de
grasas y aceites de las aguas residuales de la
industria cosmética.
En el caso de las características de la fase
dispersa, y puesto que el valor del p-value es
mayor a la significancia (5%), se establece
que no se rechaza la hipótesis nula, y que no
hay una diferencia significativa en el
porcentaje de remoción de grasa, al
implementar aguas residuales con un 25 % de
fase dispersa y un 50% fase dispersa. Este
hecho rectifica lo establecido anteriormente.
Por otro lado, en el caso del % w/w de
proteína implementado, el valor del p-value
es menor al nivel de significancia del 5%, por
lo que se rechaza la hipótesis nula. Se
determina que existe una diferencia
significativa al mantener una relación de
0.025% de proteína con respecto al agua en
comparación con emplear una relación del
0.1%, en cuanto a la remoción de grasas y
aceites del agua residual de la industria
cosmética. Esto rectifica que a mayor
Ilustración 6. Resultados diseño Factorial
16
presencia de la proteína OmpA, la efectividad
del método de tratamiento va a ser
considerablemente alta.
Por último, cuando existe una interacción del
porcentaje de fase dispersa, con el %w/w de
proteína, el efecto en la remoción de grasas y
aceites es significativo, siendo más alto
cuando se presenta una mayor presencia de la
fase dispersa, y mayor proporción de proteína
en el agua. La significancia de esta
interacción puede observarse específicamente
en el diagrama de Pareto, encontrado en la
sección de anexos. De la misma forma, la
prueba de residuales del diseño factorial, se
encuentra en esta sección.
4. Conclusiones
A través de la metodología planteada, y
realizando una simulación del agua residual
de la industria cosmética, a través de
emulsiones aceite mineral-agua, fue posible
determinar la eficiencia de la proteína OmpA
del Escherichia coli como biosurfactante para
la remoción de grasas y aceites. De esta
manera, se establece que la proteína OmpA
del Escherichia coli, es un biosurfactante
potencial, puesto que, al aplicarlo a las
emulsiones, disminuyo significativamente la
concentración de grasas presentes en estas,
con remociones superiores al 75%.
Por otro lado, se puede establecer que a partir
de la construcción de la curva de crecimiento
del Escherichia coli, se determina el
momento propicio para la inducción de
lactosa, el cual fue de 4 horas, lo que
garantiza la sobreexpresión de la proteína
OmpA. De la misma forma, fue posible
desarrollar emulsiones aceite-mineral agua,
teniendo en cuenta el método HLB, lo que
permitió evaluar la efectividad de la proteína
en una simulación del entorno real.
Se puede establecer que, la relación %w/w de
proteína aplicada al agua, tiene un efecto
altamente significativo en la remoción de
grasas de las muestras, en la cual con una
relación de 0.1% w/w se obtienen las mayores
remociones. Por otro lado, las características
de la fase dispersa del agua, no representa un
impacto significativo en el proceso de
tratamiento. Sin embargo, cuando existe una
interacción entre las características del agua y
la proporción de proteína, existe un efecto
significativo, lográndose altas remociones
con los dos factores.
Además, se establece que el método Soxhlet,
es un mecanismo adecuado para la
cuantificación de grasas y aceites, puesto que,
permitió determinar la concentración de estos
compuestos en las muestras, y de esta manera
poder obtener un porcentaje de remoción.
Por último, con el objetivo de garantizar la
efectividad del método, y evaluar de manera
precisa el potencial biosurfactante de la
proteína OmpA, es recomendable realizar una
purificación de esta, para eliminar la
interferencia en mediciones de concentración,
producto de la presencia de otras moléculas
diferentes.
17
Referencias
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http://www.ideam.gov.co/documents/1469
1/38155/Grasas+y+Aceites+en+agua+por
+m%C3%A9todo+Soxhlet..pdf/15096580-
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18
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[24] S. Segura, A. Macía, D. Carrero, W.
Lawrence, M. Vives, H. Castro, O. Álvarez
y A. González, «Escherichia coli´s OmpA
as Biosurfactant for Cosmetic Industry:
Stability Analysis and Experimental
Validation Based on Molecular
Simulations,» de Advances in
computational Biology, Springer
International Publishing, 2014, p. 265.271.
19
Anexos
1. Resultados de absorbancia para los dos inóculos
Tabla 9. Absorbancia inóculo 1
Tabla 10.Absorbancia inóculo 2
2. Registro fotográfico Obtención Proteína
Hora Tiempo [h] Absorbancia [A]
10:12 a. m. 0 0.118
11:12 a. m. 1 0.167
12:12 p. m. 2 0.378
1:12 p. m. 3 0.729
2:12 p. m. 4 1.056
3:12 p. m. 5 1.277
4:12 p. m. 6 1.381
5:12 p. m. 7 1.526
6:12 p. m. 8 1.586
7:12 p. m. 9 1.628
8:12 p. m. 10 1.651
Hora Tiempo [h] Absorbancia [A]
10:12 a. m. 0 0.155
11:12 a. m. 1 0.171
12:12 p. m. 2 0.285
1:12 p. m. 3 0.673
2:12 p. m. 4 0.954
3:12 p. m. 5 1.143
4:12 p. m. 6 1.231
5:12 p. m. 7 1.319
6:12 p. m. 8 1.412
7:12 p. m. 9 1.489
8:12 p. m. 10 1.523
20
Ilustración 7. Medio LB
Ilustración 8. Precipitado con buffer de lisis.
Ilustración 9. Proceso de lisis en el sonicador de punta.
21
3.Preparación de Muestras
• 0.025% w/w
8.25𝑚𝑔
𝑚𝐿∗ 2,50𝑚𝐿 = 20.62 𝑚𝑔
0.025% =20.62 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎
𝑚𝑔 𝑎𝑔𝑢𝑎 = 82500 𝑚𝑔 = 82.50 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎
• 0.1% w/w
8.25𝑚𝑔
𝑚𝐿∗ 2,50𝑚𝐿 = 20.62 𝑚𝑔
0.10% =20.62 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎
𝑚𝑔 𝑎𝑔𝑢𝑎 = 206250 𝑚𝑔 = 206.50 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎
Ilustración 10. Resultados de concentración de Proteína usando Nanodrop.
22
Ilustración 11. Emulsiones del 25% y 50% fase dispersa.
4. Montaje de embudos de decantación de las muestras
23
5. Método Soxhlet
6. Grasa recuperadas al finalizar el método Soxhlet
24
7. Gráfica de Pareto y de residuales, Diseño de experimentos
De acuerdo a la gráfica de Pareto, se puede observar que el factor que tiene mayor efecto en la remoción
de grasas, es el % w/w de proteína en la muestra. Esto, debido a que supera el valor correspondiente al
valor estándar, lo que lo hace estadísticamente significativo. De la misma forma, es posible decir que la
interacción entre las características del agua residual y la proporción de proteína aplicada, superan el
valor estándar y de esta manera tienen un efecto estadísticamente significativo en la remoción de grasas
y aceites del agua residual de la industria cosmética.
Por otro lado, al realizar el análisis de residuales se comprueba que no existen valores atípicos, por lo
que se mantiene el supuesto de homocedasticidad. De la misma forma, al no observarse una tendencia
clara en el comportamiento de los residuos, se establecen que estos son independientes.
Ilustración 12. Gráfica de residuales