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Exploración de la proteína transmembranal OmpA en la recuperación
mejorada de hidrocarburos presentes en sistemas porosos
Proyecto de Grado para optar por el título de Ingeniero Químico
María Alejandra Tibaquirá Martínez
Asesor: Andrés González Barrios
Ingeniero Químico, M.Sc, Ph.D
Universidad de los Andes
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química
Bogota- Colombia
Junio 2014
Objetivo general:
Evaluar la capacidad de la proteína transmembranal Escherichia coli OmpA como biosurfactante
para la recuperación de hidrocarburos.
Objetivos Específicos:
- Sobreexpresar la proteína OmpA E.coli empleando IPTG como agente inductor.
- Realizar un procedimiento de purificación de la proteína OmpA E.coli a través del método de cromatografía de afinidad con metales inmovilizados.
- Evaluar las propiedades biosurfactantes y emulsificantes de la proteína OmpA E.coli.
- Evaluar la eficiencia de recuperación de hidrocarburos empleando la proteína transmembranal OmpA a través del uso de un modelo piloto de sistema poroso.
Exploración de la proteína transmembranal OmpA en la recuperación
mejorada de hidrocarburos presentes en sistemas porosos
Ma. Alejandra Tibaquirá Martínez, Andrés González Barrios
Universidad de los Andes, Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química
Resumen El empleo de biosurfactantes en la industria petrolera es una alternativa que busca
alcanzar altos niveles de productividad en la recuperación mejorada de hidrocarburos, evitando la
contaminación ambiental por el uso de sustancias químicas tóxicas. El objetivo de este trabajo es
evaluar la recuperación de crudo pesado en sistemas porosos al emplear proteínas transmembranales
(OmpA). OmpA fue purificada a partir de E. coli - W3110/pCA24NOmpA +
inducida
con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido a concentración 2mM. A partir del análisis por
electroforesis se determinó la expresión de la proteína en las muestras purificadas, evidenciando una
concentración mayor de proteína en la muestra purificada final, frente a los lavados del proceso de
purificación. Adicionalmente, el análisis semi -cuantitativo del área de crudo desplazada (ODA)
permitió observar la capacidad de la proteína para la recuperación mejorada de crudo. El estudio de
capacidad emulsionante mostró que la proteína OmpA presenta un índice de emulsificación del
45%. Finalmente, los resultados de la prueba piloto en columna de arena empacada muestran que a
concentraciones de 0.00094% y 0.0015% w/v se alcanza una recuperación adicional de crudo del
11% y 12% respectivamente.
Palabras clave: transmembranales, E. coli, electroforesis , emulsificación, recuperación adicional.
1. Introducción
La demanda por petróleo a nivel mundial
continúa aumentado y la falta de sustitutos
potenciales continúa generando una alta
dependencia de la producción de este. Por
esta razón, uno de los retos principales de la
industria es desarrollar metodologías que
permitan aumentar la eficiencia productiva,
mejorando la recuperación de crudo en los
reservorios. La extracción de crudo se
encuentra dividida en tres etapas. La etapa
primaria aprovecha la energía natural dentro
del pozo para llevar el crudo a la superficie.
En algunos casos, la energía no es suficiente
para llevar el petróleo a superficie, por lo que
se emplean métodos artificiales los cuales
consisten en sistemas de bombeo mecánico
o inyección de gas para reducir la viscosidad.
Durante el recobro primario se logra una
recuperación del 12-15% del OOIP (Original
Oil in Place) [1]. Por otro lado, la etapa
secundaria emplea inyección de agua y gas
que permitan mejorar la movilidad del crudo.
La inyección de agua transfiere momentum al
crudo, lo que permite que este continúe
fluyendo. En el caso de inyección del gas se
genera una capa que permite por expansión
dar energía de transporte al crudo. Durante
esta etapa se alcanza una recuperación del 10-
15% del OOIP [1]. Finalmente, la
recuperación terciaria está constituida
principalmente por procesos térmicos,
inyección de gas e inundación química que
buscan mejorar la eficiencia de barrido y
movilizar el crudo residual que queda en la
zona porosa. Los procesos de recobro térmico
los cuales buscan incrementar la temperatura
del yacimiento para reducir la viscosidad del
crudo o generar una especie de crackeo de las
moléculas con el fin de mejorar la movilidad.
Otro método es la inyección de gas (miscible
o no miscible) para reducir la viscosidad. El
último método, consiste en la inyección de
químicos que buscan aumentar la viscosidad
del agua o mejorar la tensión interfacial
dentro del reservorio. La recuperación
durante el recobro terciario se encuentra entre
un 5-25% del OOIP [1].
En la actualidad, un gran número de los
pozos de extracción se consideran vacíos
aunque continúen teniendo cerca del 50% de
su rendimiento potencial [2]. Es allí donde la
recuperación terciaria (Enhanced Oil
Recovery) entra a cumplir un papel
fundamental en el proceso. Sin embargo, las
desventajas principales de esta recuperación
son su alto costo, debido al uso de productos
químicos los cuales deben ser en su mayoría
importados, [1] así como el impacto negativo
que genera al medio ambiente.
MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery)
es una técnica de recuperación terciaria donde
microorganismos o sus metabolitos recuperan
crudo residual en el reservorio [3]. Existen
tres estrategias principales para llevar a cabo
este proceso: 1) inyección de
microorganismos con capacidad de
producción biosurfactante (método in situ), 2)
inyección de nutrientes que estimulen el
crecimiento de cepas indígenas con capacidad
biosurfactante, 3) producción de bioproductos
ex situ y posterior inyección en el reservorio
[4]. La Tabla 1,muestra los metabolitos con
potencial para ser empleados en la industria
de hidrocarburos.
Dentro de los bioproductos empleados en el
recobro terciario y en la bioremediación se
encuentran los biosurfactantes. Su principal
característica es que son compuestos
anfipáticos en naturaleza, por lo que reducen
la tensión superficial e interfacial [5]. Dentro
de las ventajas de estos cabe resaltar: menor
toxicidad, mayor biodegradación, buenas
características espumantes, alta selectividad a
actividades específicas en condiciones
extremas (temperatura, pH, salinidad) y la
habilidad de ser sintetizados a partir de
recursos renovables [6].
Tabla 1. Microorganismos y su aplicación en la
industria de hidrocarburos [7]
Producto Microorganismo Aplicación
Biomasa
Bacillus licheniformis, Leuconostoc
mesenteroides, Xanthomonas
campestris
1.Modificación de
la permeabilidad
2.Disminución de
viscosidad
3.Degradación de
crudo
Biosurfactante
Acinobacter
caslcoaceticus,
Arthrobacter paraffineus, Bacillus
sp., Clostridium sp. Pseudomonas sp.
1.Reducción de la
tensión interfacial y
la viscosidad
Biopolímeros
Bacillus polymyxa, Brevibacterium
viscogenes,
Leuconostoc
mesenteroides,
Xanthomonas campestris,
Enterobacter sp.
1.Modificación de
la permeabilidad
2.Modificación de
viscosidad
3.Control de
movilidad
Bio-solventes
Clostridium
pasteurianum, Zymomonas mobilis
1.Emulsificación
2.Reducción de
viscosidad
Bio-acidos
Clostridium sp., Enterobacter
aerogenes
1.Aumento de la
permeabilidad
2.Emulsificación
Bio-gases
Clostridium sp., Enterobaxter
aerogenes, Methanobacterium sp.
1.Aumento de la
presión
2. Reducción de la
tensión interfacial y
viscosidad.
3.Expansión del
crudo
4.Aumento de la
permeabilidad
En los últimos años se han realizado
estudios de proteínas transmembranales como
agentes biosurfactantes. Estas proteínas
poseen una naturaleza anfipática debido a que
interactúan con el periplasma y el medio de la
membrana. La Escherichia coli es uno de los
microorganimos más estudiados debido al
amplio conocimiento que se tiene sobre su
estructura molecular [8]. Las proteínas
transmembranales de este microorganimo
como la OmpA, contienen cadenas
hidrofóbicas e hidrofílicas (Figura 1), las
cuales cumplen un rol importante en la
construcción de biopelículas de la E.coli [8].
La estructura terciaria de esta proteína está
compuesta por 170 residuos en el dominio
N- terminal, conformado por ocho cadenas β
antiparalelas y 155 residuos en la C-terminal
del dominio periplásmico [8].
Figura 1. Modelo completo OmpA. La
conformación de láminas β representa la parte
hidrofóbica de la molecula y el dominio
periplasma la parte hidrofílica, mostrando la
estructura anfipática de la molécula. [8]
Como se mencionó anteriormente, uno de los
bioproductos con potencial en el recobro
terciario son los biosurfactantes. América
Latina cuenta con el 48% de las reservas de
crudo pesado (10-22° API) del mundo. En
Colombia el 45% de la producción
corresponde a este tipo de crudo y se estima
que en 15 años alcance el 60% de la
producción total [9]. Sin embargo, para esto
es importante desarrollar tecnologías que
permitan aumentar la eficiencia productiva
sin impactar el medio ambiente, además de
ser sostenibles económicamente. Por esta
razón, el objetivo principal de este trabajo es
extraer y purificar la proteína transmembranal
OmpA (con plásmido resistente al
cloranfenicol, Ver Figura 2), para su
exploración como agente biosurfactante en la
recuperación mejorada de hidrocarburos
presentes en zonas porosas.
Figura 2. Mapa del plásmido pCA24N. El gen
represor es el laclq. La región de resistencia al
clorafenicol se denomina cat. El sitio 6his
corresponde al lugar de producción de
proteínas con 6 histidinas [10]
2. Metodología
2.1 Microorganismos y medio
E. coli –W3110/pCA24N OmpA +
fue
previamente aislado en agar LB (NaCl 10g/L;
Triptona 10g/L; Agar 15g/L; Extracto de
levadura 5g/L) e incubado a 37°C overnight.
Del aislamiento se inoculó una colonia
aislada en 50ml de MedioLB (NaCl 10g/L;
Triptona 10g/L; Extracto de levadura 5g/L;
Cloranfenicol 50µg/mL) y se dejó en un
6xHis
equipo de agitación shaker a 250rpm y 37°C
overnight. Se tomó una alícuota de 5ml del
pre-inóculo, el cual fue inoculado en 195mL
de Medio LB.
2.2 Curva de Crecimiento
El inóculo (200mL) se llevó a un shaker a
250 rpm y 37°C. En intervalos de tiempo de
una hora se realizaron mediciones en el
espectrofotómetro a 600nm. A partir de la
D.O (densidad óptica) reportada para cada
una de las muestras se construyó la curva de
crecimiento. De esta forma es posible
determinar las fases de crecimiento del
microorganismo, así como el tiempo
adecuado para realizar la inducción con
IPTG, que permita sobreexpresar la proteína
de interés.
2.3 Inducción usando IPTG
Se realizó nuevamente el procedimiento
descrito en el numeral 2.1. Se prepararon en
total 600mL de MedioLB y 1000mL para el
segundo proceso de purificación. Pasadas 5
horas y media (D.O =0.7), se agregó el IPTG
a concentración 2mM a cada inóculo.
Nuevamente se dejaron en el shaker (250rpm
y 37°C) por tres horas. Posteriormente, se
centrifugaron las muestras a 4000 rpm y 4°C
durante 15min. Se desechó el sobrenadante y
el precipitado se conservó a -20°C.
2.4 Extracción de la proteína
El precipitado fue resuspendido en 300µL de
Buffer #1 con pH entre 7-8 (50mM Na-
fosfato pH=8.0; NaCl 300mM; 0.01%
Tween®-20; 1%Triton X-100). Las células
resuspendidas fueron sonicadas a una
amplitud del 38% en 40 ciclos de 20s x 40s
(20s sonicación x 40s reposo) las muestras se
colocaron en baño de hielo para mantenerlas
a 4°C. Durante este proceso se genera el
rompimiento de la membrana, conllevando a
la lisis celular.
Finalmente, las muestras se centrifugaron a
13000rpm y 4°C durante 15min. Se almacenó
el sobrenadante a -20°C.
2.5 Purificación de la proteína
El protocolo de purificación de proteína se
lleva a cabo empleando el El kit Dyanabeds
Talon de Invitrogen ®, el cual se basa en
cromatografía de afinidad de metales
inmovilizados.
50µl de la solución dynabeads (perlas
supermagnéticas) se adicionaron a cada
ependorff. Se aplicó un campo magnético
hasta que las perlas se hubieran recolectado
en la pared y el líquido estuviera claro. Se
descartó el sobrenadante. Las perlas se
resuspendieron en 300µL de Buffer#2 (50mM
Na-fosfato pH=8.0; 0.01% Tween® 20; NaCl
300mM), se llevaron al campo magnético
hasta que el líquido estuviera claro. Se
descartó el sobrenadante. Se resuspendieron
las perlas 100µL de Buffer#2 y se agregó el
sobrenadante producto de la sonicación hasta
completar los 700µL. Las muestras se
llevaron a un shaker a 4°C (baño de hielo)
durante 10min. Se aplicó un campo
magnético y se descartó el sobrenadante. Se
realizaron 4 lavados empleando 300µL de
Buffer#2. Se resuspendieron las perlas entre
cada paso de lavado y se aplicó un campo
magnético. Se conservó el sobrenadante de
cada lavado para posterior análisis.
Finalmente se resuspendieron las perlas en
100µL de Buffer #3, buffer de elución
(50mM Na-fosfato pH=8.0; 0.01% Tween®
20; NaCl 300mM; Imidazol 150mM), se
aplicó el campo magnético y se conservó el
sobrenadante con la proteína purificada a
-20°C. Los lavados y la proteína purificada se
guardaron para posterior análisis de
electroforesis y cuantificación de proteína.
Para la recuperación de las perlas se empleó
el protocolo de recuperación del kit
Dynabeads. Ver Anexo 1.
2.6 Electroforesis
Se realizó una electroforesis (SDS PAGE)
para confirmar la presencia de la proteína
OmpA en los lavados y las muestras de
proteína purificada.
Para este procedimiento se empleó un gel de
poliacrilamida al 12% para visualizar las
proteínas del tamaño deseado. Para
comparación de los resultados se usó el
marcador de peso BioRad #161-0318 para la
primera purificación y para la segunda
Lonza#50547.
Se preparó en un beaker el gel de corrido
(3.35mL Agua Desionizada, 2.5mL Buffer
Tris pH=8.0; 0.1mL SDS 10%; 4mL Solución
Acrilamida; 60µL Persulfato 0.1%; 10µL
TEMED) el TEMED y el persulfato de
amonio se agregaron al final debido a que son
los agentes de polimerización. Posteriormente
se preparó el gel de almacenamiento (3mL
Agua Desionizada, 1.25mL Buffer Tris
pH=6.8; 0.1mL SDS 10%; 0.7mL Solución
Acrilamida; 50µL Persulfato 0.1%; 10µL
TEMED). El gel de almacenamiento se
adicionó en la parte superior del montaje.
Las muestras se denaturaron a 90°C por 5
min. El corrido se dio a amperaje constante
de 150V durante una hora y media.
Después de esto, se agregó Fijador de
Proteina (50% etanol, 10% ácido acético,
40% agua). Posteriormente, se adicionó Azul
de Comassie (BioRad,Co) para la coloración.
Finalmente, se realizó la distinción
empleando solución decolorante (50% Agua
Desionizada; 10% ácido acético, 40%
metanol)
2.7 Cuantificación de Proteína
Para la cuantificación de la proteína se
emplearon dos métodos: por
espectrofotometría usando el equipo
NanoDrop y por cuantificación de intensidad
de pixeles con ImageJ®.
El primer método consiste en medir la
absorbancia a 280nm en el NanoDrop. 2µL
de la muestra se ubicaron en el detector para
determinar la concentración en mg/mL.
El segundo método consiste en la lectura de
la imagen escaneada del gel de electroforesis.
La imagen se modifica a escala de grises,
para que el programa identifique
correctamente los pixeles de las bandas de
interés. Posteriormente, se seleccionaron el
carril estándar y los carriles de interés.
ImageJ® presenta el resultado como áreas,
las cuales representan la intensidad del pixel
de cada carril seleccionado. Se determinó el
área de cada banda y se calculó el porcentaje
de cada una. Finalmente, usando el estándar
se obtuvo una curva de calibración (masa
contra área) para cuantificar la proteína de
interés.
2.8 Estudio de la proteína OmpA en
recuperación mejorada de hidrocarburos
2.7.1 Caracterización de la muestra de crudo
Para el desarrollo de la prueba de columna
piloto se empleó crudo proveniente del
campo ubicado en el Municipio de Carmen
de Carupa (Cundinamarca-Boyaca) el cual
presenta una densidad de 12° API. Este se
empleó en una dilución al 20% n-dodecano,
con el fin de facilitar la fluidez en la
columna. Por esta razón, se llevó a cabo
mediciones de la densidad (°API) y la
viscosidad que permitieron caracterizar la
dilución de crudo empleada en el proyecto.
Para determinar la densidad se empleó un
picnómetro metálico y se empleó la
ecuación1:
( )
( ⁄ )
(1)
Posteriormente, se empleó el reómetro para
determinar la viscosidad del crudo, con una
muestra de 22ml. El procedimiento del
reómetro consiste en generar un esfuerzo de
corte incremental a la muestra y
posteriormente realiza la operación inversa.
2.7.2 Evaluación de las propiedades
biosurfactantes de la proteína OmpA en
mezclas de crudo.
Con el fin de evaluar la capacidad
surfactante de la proteína OmpA en
hidrocarburos, primero se realizó una prueba
ODA (Oil Displaced Area) [9]. 50mL de
agua desionizada se agregaron a una placa
petri, luego se agregó una gota de 20µL de
crudo (diluido 20% n- dodecano).
Finalmente, se agregaron 10µL de la
proteína purificada y se evaluó el diámetro
de dispersión definido por el círculo formado
por el desplazamiento del crudo. Paralelo a
esto se realizó un control negativo con
solución salina (NaCl -5%), con el fin de
validar la prueba asegurando que no existan
variables externas que afecten los resultados.
2.7.3. Evaluación del índice de
emulsificación de la proteína OmpA
Una de las pruebas cualitativas de actividad
en biosurfactantes corresponde al cálculo de
la capacidad de emulsificación, empleando la
muestra de crudo caracterizada
anteriormente.
Se emplearon 2ml de la muestra de crudo en
falcons. Posteriormente, se adicionaron 2ml
de la proteína purificada y se homogenizó la
mezcla por 5 minutos. El proceso de
homogenización permite mezclar la fase
dispersa en la fase continua, con el fin de
formar la emulsión. Similarmente, se realizó
un control positivo con Tween® 20 y un
control negativo con solución salina (NaCl
5%) para comparar los resultados. Se dejó
por 24hrs y se determinó el volumen total
(mL) y el volumen de la emulsión (mL). Se
repitió la toma de datos cada 24hrs por los
siguientes ocho días. Finalmente, se empleó
la ecuación 2 para determinar el índice de
emulsificación:
2.7.4 Montaje del sistema de columna
empacada: recuperación de crudo en
sistemas porosos.
Para el análisis de las propiedades
surfactantes de la proteína OmpA en la
recuperación de crudo de sistemas porosos,
se empleó un modelo piloto de columna de
arena empacada de dimensiones 4.4 x 3.8 x
17.5 cm. Las características del modelo se
muestran en la Figura 3 y Figura 4. La arena
(150-250µm tamaño de partícula) se empacó
dando suaves golpes para asegurar una
distribución uniforme en la columna.
Posteriormente, se evacuó la columna
primero con nitrógeno por un minuto para
remover la presencia de . Luego de esto,
se adicionó una solución salina (NaCl 5%)
( )
( )
(2)
hasta que la columna esté saturada. El
volumen total empleado se denomina como
Volumen de Poro (PV). Simultáneamente, se
aplicó vacío por la parte inferior (filtro
106µm) por 2min para evacuar cualquier gas
de la columna. Después, se inyectó el crudo
a velocidad constante.
La columna se dejó incubando por 5 días a
34°C. Pasado este tiempo, se inyectó en la
columna 3PV para asegurar la saturación del
sistema y se calcula el volumen de crudo
recuperado ( ) .Seguido a esto, se
inyectó la proteína purificada a
concentraciones de 0.00094% y 0.0015%w/v
y se calculó el volumen recuperado ( )
La Tabla 2 muestra los parámetros de
cálculo empleados en el proceso.
Figura 3. Modelo columna acrílica 17.5cm
altura. Imagen Adaptada [3]
Figura 4. Esquema de las tapas columna.
Imagen Adaptada [3]
Tabla 2. Parámetros de análisis- prueba de
columna empacada
Parámetro Ecuación
PV
Volumen (mL) de saturación de solución salina
Volumen (mL) desplazado por la solución salina
Volumen (mL) de crudo desplazada segunda saturación
con solución salina
Volumen (mL) de crudo
desplazado con biosurfactante
( )
( )
( )
AOR(%)
3. Resultados y Análisis de Resultados
3.1 Curva de crecimiento
El objetivo de determinar la curva de
crecimiento de la E. coli –K12
W3110/pCA24N OmpA +
es determinar el
tiempo y D.O adecuados para realizar la
inducción con IPTG (este debe encontrarse
dentro de la fase de crecimiento exponencial)
Figura 5. Curva de crecimiento E. coli –K12
W3110/pCA24N OmpA +
En la Figura 5 se puede observar que la fase
de crecimiento exponencial se encuentra
entre las horas 3 y 8 con
. El valor determinado para
realizar la inducción con IPTG se encuentra
alrededor de , por lo que el
tiempo seleccionado de inducción se
encuentra entre la hora 5 y 6. La inducción se
realiza a las 5 horas y media.
3.2 Corroboración de la presencia de
proteína
Con el fin de corroborar la expresión de
proteína en las muestras preparadas se realizó
una electroforesis (SDS PAGE). El objetivo
de esta prueba fue determinar si las muestras
purificadas y/o los lavados obtenidos durante
el proceso de purificación contienen la
proteína de interés OmpA.
En la Figura 6 es posible observar los
resultados de la electroforesis. En carril 5, se
presenta la muestra purificada, es posible
observar la banda correspondiente a la
proteína OmpA con peso molecular 31kDa
[8] lo que indica que esta se expresó
correctamente. Sin embargo, en el carril se
observan bandas adicionales, por lo que se
puede concluir que la purificación de la
proteína no fue ideal, ya que presenta trazas
de otras proteínas.
Resultados similares se observan en la Figura
7 correspondiente al segundo proceso de
purificación. En esta se observa una
diferencia de concentración que se presenta
en la coloración de la banda del purificado 4
(carril 5) y muestra purificada (carriles 7 y
8), esto es un indicador de que el proceso de
purificación es efectivo para concentrar la
proteína de interés. Sin embargo al igual que
en el resultado anterior, no fue posible
purificar la proteína de interés.
Figura 6. Imagen Electroforesis: los números
de carril 1 corresponde al marcador de peso.
Los carriles 2,3,4 corresponden a los lavados
realizados en el proceso de purificación. Los
carriles 6,7,8 corresponden a las muestras de
proteína purificada. La banda de la proteína
OmpA presenta un MW de 30.38kDa
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 5 10
D.O
60
0n
m
Tiempo (horas)
Figura 7. Imagen Electroforesis: los números
de carril 1 corresponde al marcador de peso.
Los carriles 2,3,4 corresponden a los lavados
realizados en el proceso de purificación. Los
carriles 6,7,8 y 9 corresponden a las muestras
de proteína purificada. La banda de la proteína
OmpA se presenta un MW de 32.08kDa (carril
8y 9 ) y de 31.4kDa en el lavado 4(carril 5)
3.3 Cuantificación de proteína
Los resultados obtenidos con el NanoDrop se
muestran en la Tabla 3 (el número de la
muestra corresponde al ependorff analizado).
Tabla 3. Concentración de las muestras de
proteina OmpA purificada, por
espectrofotometría con NanoDrop(280nm)
La concentración final de proteína obtenida
presenta valores por debajo de lo esperado.
Los resultados obtenidos en trabajos
anteriores muestran que con una
concentración de 2mM de IPTG se han
alcanzado concentraciones de 4.28 mg/ml
[11]. Esto puede ser consecuencia del tiempo
de inducción seleccionado ya que si se realiza
sobre el final de la fase exponencial los
rendimientos obtenidos son más bajos. Con
el fin de reducir esta incertidumbre es
recomendable realizar diferentes horas de
inducción, todas dentro de la fase
exponencial, con el fin de determinar un
tiempo donde se maximice la producción.
Similarmente, se cuantificó la proteína
empleando la imagen del gel de
electroforesis. El análisis de intensidad de
pixeles (expresado en área) en el programa
ImageJ permite determinar una curva de
calibración del estándar (marcador de peso).
Se realizó una gráfica del estándar, teniendo
en cuenta el porcentaje de área de cada banda
y la masa total empleada. A partir de esta se
determinó una función lineal, con correlación
R igual a 1. La ecuación 3 corresponde a la
primera purificación de proteína y la ecuación
4 a la segunda purificación:
( )
(3)
( ) (4)
Donde x es la masa (mg) y f(x) el área
relacionada a la intensidad de pixel, se
determina que la concentración de la proteína
para la primera purificación es de 0.151
mg/mL. Para la segunda purificación se
obtuvo valores de 0.123 mg/ ml para el carril
8 y 0.03 mg/ml para el carril 9. Estos valores
concuerdan con los datos obtenidos en el
análisis del Nanodrop.
Concentración mg/ml
Muestra Purificación 1 Purificación 2
1 0.15 0.09
2 0.17 0.14
3 0.15 0.06
4 0.16 0.07
5 0.24 0.04
6 0.12 0.07
7 - 0.09
8 - 0.06
9 - 0.13
10 - 0.12
Media 0.165 0.083
Desviación
Estándar 0.040 0.034
Adicionalmente, el lavado 4 de la segunda
purificación contenía la proteína de interés,
por lo que fue empleado en la prueba de
columna empacada. La concentración de cada
muestra empleada fue de 0.054 mg/ml.
3.4 Caracterización de la muestra de crudo
Los resultados de la medición de densidad del
crudo, permiten confirmar que se empleó
crudo pesado (10-22° API) en las pruebas de
columna. El resultado mostró que la densidad
de la muestra de crudo diluido con dodecano
al 20% tiene una densidad de 18° API.
Tabla 4. Resultados densidad °API muestra de
crudo
Parámetro Resultado
Masa picnómetro- crudo (g) 10.867
ρ crudo ( ) 0.944
ρ crudo (°API) 18.25
Los resultados del estudio de viscosidad en la
muestra de crudo diluida se presentan en la
Figura 8.
Figura 8. Comportamiento de la viscosidad de
la muestra de crudo diluida con n-dodecano
20%
El estudio de la viscosidad de la muestra de
crudo diluida, se observó que la muestra
presenta características pseudoplásticas, con
una disminución de la viscosidad a media que
aumenta la velocidad de esfuerzo de corte.
Esta característica es ocasionada debido a que
mayores esfuerzos hay un rompimiento de las
estructuras internas, debido a que el crudo de
esta zona presenta un porcentaje de material
particulado, así como naftalenos, lo que
genera una disminución de la viscosidad.
Adicionalmente, se observa una disminución
pronunciada de la viscosidad en dos puntos
de la gráfica (0.25 y 0.37 (1/s)), esta
tixotropía se genera por la misma razón
planteada anteriormente. Sin embargo, para
entender con mayor detalle las características
reológicas de la muestra, se deben realizar
replicas que permitan visualizar el
comportamiento de la viscosidad a diferentes
esfuerzos cortantes.
Por otro lado, el crudo original del pozo
presentaba una viscosidad de 70Pa s a 34°C.
Para esta misma temperatura, la muestra de
crudo diluido con n-dodecano (20%) tiene
una viscosidad de 0.63Pa s. Esta propiedad
permitió una mejor fluidez del crudo a lo
largo de la columna empacada.
3.5 Evaluación de las propiedades
biosurfactantes de la proteína OmpA en
mezclas de crudo.
Los resultados de la evaluación de la
capacidad biosurfactante de la OmpA, se
presentan en la Figura 8. La capacidad tenso-
activa se mide con el diámetro de
desplazamiento del crudo. Los resultados del
control negativo no presentaron área de
desplazamiento, confirmando la actividad
surfactante de OmpA en las mezclas crudo-
agua.
0.2
0.28
0.36
0.44
0.52
0.6
0.68
0.005 0.025 0.125 0.625 3.125 15.625 78.125
Vis
cosi
dad
(P
a s)
Log Esfuerzo cortante (1/s)
Velocidad incrementalVelocidad decreciente
La Tabla 5 muestra los resultados de la
prueba al adicionar OmpA.
Tabla 5. Área de desplazamiento
Figura 9. Área de dispersión de crudo al
adicionar 10µL de proteína purificada a) 20µL
de crudo b) Desplazamiento de crudo al
agregar la proteína.
3.5 Estudio del índice de emulsificación de la
proteína OmpA en muestras de crudo.
Los resultados del índice de emulsificación,
mostraron que la proteína OmpA presenta
una actividad emulsificante superior al
control negativo (1-2% superior). Una
capacidad emulsificante del 45-41% sugiere
que la proteína permite movilizar el crudo por
la zona porosa en forma de emulsión.
Adicionalmente, se observa en la gráfica, que
las tres pruebas presentan una estabilidad de
emulsión, ya que el índice se mantiene
relativamente constante durante el periodo de
prueba. Cabe destacar que la causa de este
comportamiento en el control negativo se
debe al porcentaje de asfaltenos presentes en
la mezcla de crudo. Los asfaltenos son
compuestos aromáticos de alto peso
molecular, que se encuentran en suspensión
coloidal en el crudo. La superficie de las
partículas asfalténicas dispersas en la fase
continua (crudo) están rodeadas de resinas en
forma micelar [12], lo que genera la
formación de emulsiones estables.
Figura 10. Estudio del índice de emulsificación
de la proteína OmpA
La Tabla 6, compara los resultados obtenidos
para la proteína OmpA con otros estudios de
agentes biosurfactantes. En los resultados se
observa una alta dispersión de los resultados,
lo que indica que las propiedades del
biosurfactante tienen un efecto sobre el
resultado de esta prueba. Adicionalmente, se
observa que el índice de emulsificación de
OmpA es mayor en comparación a otros
biosurfactantes evaluados anteriormente.
Comparaciones más precisas se podrían
evaluar empleando crudo con características
similares (densidad, viscosidad y
composición) ya que como se explicó
anteriormente, existen componentes en el
crudo que pueden propiciar la formación de
emulsiones.
30
40
50
60
70
0 2 4 6 8Ind
ice
de
em
uls
ific
ació
n (
%)
Días
Control Negativo OmpA
Control positivo
Ensayo Diámetro cm Área
1 3.11 30.38
2 5.39 91.27
3 6.114 118.43
Media 4.87 80.03
a) b)
Tabla 6. Índice de emulsificación diferentes
biosurfactantes
Agente
Recuperación
Muestra
Crudo
%
Fuente
Biosurfactante
Pseudomonas
fluoresens
Diesel 55 [13]
Biosurfactante
Bacillus subtilis
Aceite de
Motor 33 [14]
Biosurfactante
Candida
lipolytica
Diesel 20 [15]
3.6 Exploración de la eficiencia de la proteína
OmpA en la recuperación de hidrocarburos
en modelo de columna piloto
Posteriormente, se realizó el estudio de la
proteína en recuperación de crudo residual en
sistemas porosos. Se emplearon diferentes
concentraciones de proteína purificada
OmpA. Los resultados de recuperación
adicional se muestran en la Tabla 7, se
muestra que en el control negativo no se
observó recuperación adicional (%AOR), lo
que confirma la efectividad de la proteína
para el recobro mejorado de crudo.
Adicionalmente, la recuperación presentó un
incremento cuando se emplearon
concentraciones mayores. Cabe resaltar que
se emplearon bajas concentraciones en
estudio y se logró un recobro mejorado
dentro de los valores esperados en la industria
(5-30%).
Por otro lado, en la literatura se han reportado
resultados de recuperación mejorada de
hidrocarburos presentes en zona porosa los
cuales se presentan en la Tabla 8. Una de las
principales limitaciones en la comparación de
resultados, está relacionado a las
características del crudo empleado (densidad
y viscosidad) ya que estas definen la
movilidad del crudo y por lo tanto la
eficiencia de la recuperación final. Así como
otros factores que no fueron evaluados en
detalle en este proyecto como: porosidad y
permeabilidad, los cuales también definen la
eficiencia de recobro de crudo. Los
resultados presentados en la Tabla 8,
emplearon la misma prueba piloto de
columna empacada. Se observa que el
método in situ con Clostridium
acetobutylicum, presenta un porcentaje de
recuperación de crudo pesado igual al
encontrado en este proyecto. En los otros
casos, se presentaron mayores porcentajes de
recuperación mejorada, sin embargo, cabe
destacar que en estos casos se empleó
muestras de crudo con densidad menor, lo
que facilita la movilización de este a través de
la zona porosa.
Tabla 8. Resultados de recuperación mejorada
de petróleo
Agente
Recuperación
Muestra
°API
%
AOR Fuente
Clostridium
acetobutylicum
18.68 12 [16]
Biosurfactante
lipopetido
Bacillus subtilis
Aceite de
Motor ~43 [17]
Bioemulsificante
Bacillus
lichenformis
22.3 ~31 [3]
ASP1 - ~27 [18]
1Mezcla surfactante-polimero (alkaline surfactant oil).
4. Conclusiones
A partir de los resultados presentados se
observa que a partir del método de inducción
con IPTG y purificación de la proteína con el
kit Dynabeads es posible expresar la proteína
de interés OmpA. Sin embargo, las
concentraciones finales obtenidas son
inferiores a los valores esperados. Por lo
tanto, se debe realizar un análisis del tiempo
de inducción con el fin de determinar uno que
permita maximizar la producción final.
También, se puede evaluar el efecto de
diferentes concentraciones de IPTG en la
cantidad final de proteína.
Por otro lado, a partir del análisis del área de
desplazamiento de crudo (ODA) se puede
concluir que la proteína presenta propiedades
biosurfactantes en una muestra crudo-agua,
ya que logra un área de dispersión del crudo,
resultado que no se evidenció en el control.
Además, la prueba del índice de
emulsificación, reveló que la proteína tiene
un efecto emulsionante en las mezclas crudo-
agua, superior al de la solución salina. Los
resultados finales muestran un índice de
emulsificación del 45%, así como una
estabilidad dela emulsión formada durante los
ocho días de estudio. Estos dos resultados,
revelan las propiedades biosurfactantes de la
proteína OmpA en los sistemas de crudo
agua.
Finalmente, conociendo los resultados
positivos de la proteína se realizó la
evaluación del modelo de columna piloto
para el recobro mejorado de hidrocarburos.
Los resultados obtenidos fueron
satisfactorios, alcanzando porcentajes del 11
y 12% de recuperación para concentraciones
de 0.00094% y 0.0015% w/v
respectivamente. Además, de que no se
reveló actividad de recobro adicional
empleando únicamente solución salina (NaCl
5%) como control. Por lo tanto, se puede
concluir que la proteína transmembranal
OmpA, presenta una actividad biosurfactante
en las muestras de crudo agua que permiten
mejorar la movilidad del crudo en sistemas
porosos, aumentando la recuperación final.
Por lo que es un bioproducto potencial para
ser empleado en las técnicas de recuperación
mejorada MEOR.
5. Trabajo Futuro
Uno de los intereses principales en la
producción de proteínas es obtener un
producto final concentrado. Para esto, es
posible adicionar urea (agente denaturante)
posterior al proceso de homogenización
(sonicación) y centrifugación. La urea
permite solubilizar la proteína y otros
metabolitos presentes en las muestras, de esta
forma se esperaría obtener una mayor
concentración de OmpA. Posterior a esto, es
importante desarrollar procesos de agregación
que permitan renaturar la proteína.
Adicionalmente, en relación a las pruebas de
columna piloto es importante estandarizar el
tamaño de partícula de arena empleado en el
modelo, ya que una mayor dispersión de
tamaño genera incertidumbre en la cantidad
de OOIP que presenta en la columna. Por otro
lado, es importante realizar pruebas a
diferentes concentraciones, que permitan
evaluar la máxima eficiencia de la proteína en
el recobro mejorado de hidrocarburos. Para
esto, se pueden realizar análisis de la CMC
(concentración micelar crítica) el cual es un
parámetro que determina la concentración
mínima de un surfactante para formar
Ensayo
Control 61 15 13 0 76 25 13 0
%0.00094 62 38 11 3 39 61 71 11
%0.00158 64 30 5 3 53 47 83 12
Tabla 7. Resultados de recuperación de hidrocarburos en modelo de columna empacada
micelas. A partir de este, se puede evaluar el
porcentaje de recuperación (%AOR)
empleando concentraciones cercanas a la
CMC.
Otro trabajo futuro es evaluar nuevas
aplicaciones de la proteína transmembranal
OmpA, como en la bioremediación de aguas
y suelos contaminadas por crudo y sus
derivados.
Finalmente, para desarrollar un enfoque
industrial es importante producir la proteína
de interés a gran escala. Para esto se deben
estudiar los fenómenos de transferencia de
masa, calor y momentum en los Erlenmeyer,
con el fin de determinar las variables
necesarias para realizar un proceso de
escalamiento. De esta forma, desarrollar de
manera adecuada una producción en
bioreactores que permitan maximizar la
cantidad de producto final.
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enhanced oil recovery by alkali-surfactant and
polymer flooding. J Petrol Prod Technology. Pags
67-74
Anexo 1
Recuperación de perlas empleadas en el proceso de purificación
Kit Dyanabedas Talon- Invitrogen ®
Por medio de la remoción del ion- metálico del agente quelante, cualquier residuo de la interacción
proteína-cobalto es retirado. Las perlas Dynabeads TALON son regeneradas empleando una
solución buffer de , y puede ser reutilizada en múltiples purificaciones de proteína.
1. Se resuspendieron las perlas (2mg) en 500µL de EDTA (0.2M) y se sonicaron durante
5min.
2. Se aplicó un campo magnético por 2 minutos (hasta que el líquido este claro) para separar
las perlas de la solución buffer. Se descartó el sobrenadante.
3. Se resuspendieron las perlas en 500µL de agua desionizada.
4. Se aplicó campo magnético a los ependorff por 2 minutos y se descartó el sobrenadante.
5. Se repitieron los pasos 3 y 4 dos veces, usando 500µL de agua desionizada en cada lavado.
6. Se resuspendieron las perlas en 500µL de con concentración de 2mM. Se incubó en
un shaker por 10 minutos.
7. Se aplicó campo magnético por 2 minutos hasta que el líquido estuviera claro y se descartó
el sobrenadante.
8. Se resuspendieron las perlas en 500µL de solución buffer PBS (0.1% Tween 20®)
9. Se aplicó campo magnético por 2 minutos y se descartó el sobrenadante.
10. Se realizaron dos lavados con 500µL de etanol (20%). Se aseguró la resuspensión correcta
de las perlas en la solución, así como la remoción total del sobrenadante.
11. Se resuspendieron las perlas en 700µL de etanol (20%) para su almacenamiento.
Fuente: Protocolo re recuperación de Dyanabeas Talon
Manual Invitrogen®
Anexo 2
Resultados de la cuantificación de proteína
Espectrofotometría Nanodrop
Uno de los procesos de cuantificación empleados fue por espectrofotometría, este proceso
se realizó para todos los lavados la proteína para la primera purificación. Los resultados se
presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados de cuantificación de proteína con Nanodrop
Primera purificación
Muestra mg/ml Masa (mg)
1F 0.15 0.105
2F 0.17 0.119
3F 0.12 0.084
4F 0.17 0.119
5F 0.16 0.112
6-F 0.19 0.133
Lavado 4-1 0.25 0.175
Lavado 4-2 0.13 0.091
Lavado 4-3 0.1 0.07
Lavado 4-4 0.06 0.042
Lavado 4-5 0.01 0.007
Lavado 4-6 0.12 0.084
Lavado 3-1 0.91 0.637
Lavado 3-2 0.46 0.322
Lavado 3-3 0.16 0.112
Lavado 3-4 0.18 0.126
Lavado 3-5 0.59 0.413
Lavado 3-6 0.15 0.105
Lavado 2-1 0.52 0.364
Lavado 2-2 0.5 0.35
Lavado 2-3 0.86 0.602
Lavado 2-4 0.82 0.574
Lavado 2-5 0.98 0.686
Lavado 2-6 1.65 1.155
Lavado 1-1 5.41 3.787
Lavado 1-2 6.24 4.368
Lavado 1-3 6.92 4.844
Lavado 1-4 8.51 5.957
Lavado 1-5 6.73 4.711
Figura 1. Comparación de concentración (mg/ml) de los lavados obtenidos en el proceso de
purificación
Los resultados presentes en la Figura 1, muestran la disminución en la concentración de
proteína a medida que se realizan los lavados en el proceso de purificación. Dicho efecto es
esperado, ya que en cada etapa se concentra la proteína de interés OmpA, pero se separa de
otras proteínas también expresadas por el microorganismo. Por lo tanto, en el primer
lavado, se encuentra el mayor número de proteína total, compuesta por un conjunto de
metabolitos incluyendo la proteína de interés.
La Tabla 2 muestra los resultados para el proceso de purificación, en donde se evaluaron
únicamente la proteína purificada y el Lavado 4.
Tabla 2. Resultados de cuantificación de proteína con Nanodrop
Muestra mg/ml mg
p1 0.09 0.009
p2 0.14 0.014
p3 0.06 0.006
p4 0.07 0.007
p5 0.04 0.004
p6 0.07 0.007
p7 0.09 0.009
p8 0.06 0.006
p9 0.13 0.013
p10 0.12 0.012
Lavado 4-1 0.03 0.021
Lavado 4-2 0.14 0.098
Lavado 4-3 0.01 0.007
Lavado 4-4 0.03 0.021
Lavado 4-5 0.01 0.007
Lavado 4-6 0.13 0.091
Lavado 4-7 0.03 0.021
Lavado 4-8 0.03 0.021
Lavado 4-9 0.09 0.063
Lavado 4-10 0.04 0.028
0
2
4
6
8
Lavado 1 Lavado 2 Lavado 3 Lavado 4 Final
Co
nce
ntr
aci
ón
mg
/ml