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EVALUACION DE EXTRACTOS VEGETALES PARA EL CONTROL DE LA BROCA DEL CAFÉ (Hypothenemus hampei, FERRARI)
ANGELICA MARIA BUSTAMANTE PELAEZ
UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PERERIA FACULTAD DE TECNOLOGIA
ESCUELA DE TECNOLOGIA QUIMICA PEREIRA
MAYO 2007
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EVALUACION DE EXTRACTOS VEGETALES PARA EL CONTROL DE LA BROCA DEL CAFÉ (Hypothenemus hampei, FERRARI)
TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al titulo de Tecnóloga Química
Presentado por ANGELICA MARIA BUSTAMANTE PELAEZ
Director JAIME NIÑO OSORIO
UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGIA
ESCUELA DE TECNOLOGIA QUIMICA PEREIRA
MAYO 2007
Resumen
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La zona cafetera Colombiana presenta altas densidades de siembra, topografía de difícil acceso para realizar las prácticas de control así como condiciones climáticas que favorecen la fructificación durante gran parte del año, lo cual hace que el ataque de la broca del café Hypothenemus hampei Ferrari, sea más severo que en muchas otras regiones del mundo cafetero. La mayoría de los países cafeteros a lo cuales ha llegado la broca del café, han atacado el problema utilizando como método único de control los insecticidas sintéticos que causan efectos negativos en el ecosistema. En el presente trabajo se evaluaron mediante un bioensayo de antibiosis, 42 extractos de plantas pertenecientes a 5 familias botánicas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa, mediante un experimento de Antibiosis, utilizando granos de café pergamino húmedo previamente desinfectados y hembras adultas de broca recién emergidas y desinfectadas externamente. Los resultados de este trabajo, revelan que 11 de los extractos metanólicos evaluados presentaron actividad inhibitoria contra la broca del café Hypothenemus hampei Ferrari, lo cual representa el 52.4% de las plantas y solo el 26.2% del total de los extractos crudos evaluados. El extracto metanólico de Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) presentó la mayor capacidad insecticida contra la broca del café. La marcha fitoquímica reportó para el extracto metanólico de esta especie la presencia de esteroles, triterpenos, saponinas, fenoles, flavonoides y taninos a través de cromatografía de capa delgada (CCD). Palabras claves: Alchornea calophylla, Bioprospección, Euphorbiaceae, Hypothenemus hampei Ferrari, Reserva Natural Bremen-La Popa. .
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1. INTRODUCCION
El cultivo del cafeto (Coffea arabica) constituye uno de los principales rubros generadores de divisas en América Latina y particularmente en Colombia; sin embargo, diversos factores bióticos y abióticos, influyen en la producción de este cultivo. Entre los factores bióticos los insectos participan como agentes responsables de los daños presentados en las plantaciones de café (Rosales et al., 1998). Se estima que la broca del café Hypothenemus hampei Ferrari, provoca daños del orden de 500 millones de dólares en todo el mundo (Neves et al., 2005), siendo el insecto plaga de mayor importancia en las plantaciones de café. El 90% de los frutos pueden ser atacados y esto influye en el rendimiento del cultivo y en la calidad del producto. Como forma de controlar la broca del café se utilizan técnicas biológicas en reemplazo de los insecticidas sintéticos, puesto que estos son costosos y altamente tóxicos aplicarlos al controlar la plaga. En muchas regiones cafeteras del mundo, afectadas por la broca del café, utilizan ampliamente los insecticidas como la principal medida de control (Decazy, 1978). En Colombia el uso indiscriminado de insecticidas ha causado serios problemas a la salud de los habitantes de las zonas cafeteras y a los trabajadores, contaminación de las aguas, mortalidad de la fauna y residualidad en el producto final, esto último puede conllevar a un problema de mercadeo del café en el ámbito internacional (Bustillo et al., 1998). El manejo integrado de la broca del café es de importancia fundamental debido a que la carencia de control puede causar reducción significativa en la producción de los cafetales; en este sentido, la aplicación de un programa de manejo integrado de plagas (MIP) que utilice al máximo los conocimientos integradores del agroecosistema, desempeña un papel fundamental para el control de sus poblaciones. El MIP es una filosofía de control que trata de preservar e incrementar los factores de mortalidad natural, implementando diferentes métodos de control, tomando en consideración aspectos ecológicos, económicos y sociales, con la finalidad de maximizar los rendimientos y minimizar su interferencia con el ecosistema (Rosales et al., 1998).
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2. MARCO TEORICO
2.1. DESCRIPCIÓN ZONA DE ESTUDIO
Reserva Natural Bremen-La Popa Esta Reserva se encuentra ubicada en la zona limítrofe de los municipios de Finlandia y Circasia (Quindío), vía que de Armenia conduce a Pereira y es el remanente natural de bosque de mayor área en este departamento. Figura 1. Zona de Reserva Natural Bremen-La Popa La reserva forestal de Bremen-La Popa fue establecida a principios de la década de los 70 para la protección de cuencas hidrográficas del departamento del Quindío. Hoy en día, tiene 336 ha de bosque nativo y 411 ha de plantaciones maderables de árboles exóticos. Actualmente estas plantaciones están siendo aprovechadas y dejadas en regeneración natural; por consiguiente en el futuro esta Reserva tendrá una extensión de 747 ha de bosque natural. Figura 2. Ubicación geográfica zona de estudio Bremen-La Popa
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2.2. DESCRIPCION DE LA BROCA DEL CAFÉ, Hypothenemus hampei Ferrari (Coleóptera: Scolytidae) Clasificación taxonómica: Reino: animalia Clase: insecta Orden: coleoptera Familia: scolytidae Genero: Hypothenemus Especie: Hypothenemus hampei Nombre común: broca del café (Wikipedia, 2006). El adulto de la broca es un pequeño escarabajo de coloración café oscuro brillante, casi negro, los elitros presentan estrías longitudinales paralelas, cubiertos de pelos cortos que crecen hacia atrás. En los machos, las alas son soldadas (rudimentarias) impidiéndoles volar. Caso contrario ocurre en las hembras. La cabeza es globular, con antenas capitadas de cinco segmentos como puede observarse en la figura 3. La hembra mide aproximadamente de 1,65 a 2,0 mm de largo, el macho mide 1,18 mm de largo. En el grano de café afectado la relación entre el número de machos y hembras es de 1:10 (Rosales et al., 1998).
Figura 3. (A) Hembra de broca del café. (B) Macho de broca del café (Bustillo et al., 1998). Las hembras, al iniciar el periodo de oviposición, colocan en promedio dos huevos diarios y posteriormente, después de 10 a 20 días del inicio de la oviposición ponen un huevo por día durante 10 a 12 días y finalmente, un huevo cada dos días. Su ciclo biológico varia de 27 a 30 días (huevo: 6-10 días; larva: 14 días y pupa: 7 días) y se pueden presentar hasta siete generaciones por año.
A
B
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La longevidad promedio del adulto es de 156 días y cada hembra pone de 31 a 119 huevos. Entre cosechas, la hembra permanece en los frutos que caen al suelo debajo de la sombra del cafetal, manteniéndose allí hasta la próxima fructificación. Este lapso se denomina periodo de transito. Los daños se inician en los frutos entre los 120 a 150 días después de la floración, cuando ataca con preferencia frutos de consistencia sólida de aproximadamente un 20% de su peso seco. Este periodo es muy importante, ya que en el deben iniciarse las actividades de muestreos de frutos. Si los frutos se encuentran muy tiernos o acuosos no son preferidos por la broca. Diversos factores favorecen la infestación del insecto. Dentro de los componentes del clima, las lluvias tienen un efecto directo cuando son de poca intensidad, ya que favorecen la reproducción abundante del insecto y su exceso tiene un efecto indirecto al atrasar la cosecha normal (Souza y Reis, 1993). También, la temperatura y la humedad relativa afectan directamente la duración del ciclo de vida; las altas temperaturas lo disminuyen y la elevada humedad facilita su sobrevivencia entre las épocas de cosecha. De manera similar, al realizar la cosecha de forma incorrecta, o donde exista exceso de sombra y/o plantaciones densas se favorece la reproducción, dispersión e infestación de esta plaga (Matiello, 1991; Rena et al., 1994; Souza et al., 1993). Por otra parte, la tasa de reproducción del insecto varia de acuerdo con la altitud; a medida que esta aumenta se afecta negativamente el ciclo biológico y se reproduce lentamente (Souza et al., 1993). La broca inicia su ataque cuando las hembras fecundadas abandonan el interior del fruto, tratando de encontrar otro para su reproducción. Para ello, buscan las condiciones ideales para penetrarlo, generalmente la realizan por la
Larva
Prepupa
Figura 4. Ciclo de vida de la broca del café Hypothenemus
hampei (Bustillo et al., 1998).
Huevo
Pupa
Adulto
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corona. Después de la penetración, la hembra abre una galería y llega hasta el interior del grano, donde fabrica una pequeña cámara para depositar los huevos (Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, 1989; Oliveira, 1982). 2.3. Estrategias para el control de la Broca del café Para la broca del café, el control se debe iniciar cuando en el muestreo se obtiene 5% o más de frutos dañados y de 10% o más de frutos infestados para los muestreos convencional o secuencial, respectivamente (Crocomo, 1990; Gravena, 1992). 2.3.1. Alternativas de manejo De manera general, la aplicación de un programa de manejo integrado de plagas, utilizando el control cultural, biológico y químico tiene las siguientes estrategias: 1. Reducción de las poblaciones de la plaga y de la infestación inicial. 2. Preservación e incremento de los enemigos naturales. 3. Preservación e incremento de la diversidad del agroecosistema. 4. Monitoreo de las plagas y de sus enemigos naturales. 2.3.2. Control cultural Al analizar el daño que la broca le hace al café, su biología y comportamiento de ataque es fácil deducir que el control cultural del insecto está sustentado en las prácticas encaminadas a minimizar la disponibilidad de alimento y refugio de la plaga (Bustillo et al., 1998). Recomendaciones del manejo del cultivo para minimizar los daños causados por la broca del fruto del café.
• La cosecha debe realizarse muy bien, iniciándola, por los lotes de mayor infestación.
• Recolección de los frutos caídos al suelo y de los que permanecen en la planta después de la cosecha (re-re).
• Descomponer la pulpa del fruto antes de usarla como abono. • Eliminación de los cafetales abandonados. • Regulación del sombrío y control de las malezas. • Fertilización adecuada y oportuna.
En Colombia las practicas de cosechas oportunas y recolección de todos los frutos maduros, redujeron los niveles de infestación de un 70% a menos del 6% durante la cosecha (Saldarriaga, 1994).
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2.3.3. Control biológico Para el control biológico de la broca del fruto del café, en 1929 fue introducida de Uganda (África) a Sao Paulo (Brasil) la avispa Prorops nasuta Waterson, de la familia Bethylidae. Existen otros enemigos naturales que pueden ser utilizados (ver tabla 1). Aplicaciones localizadas de hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, en localidades que presentan tiempo nublado y alta humedad relativa favorecen su eficiencia de control, así como también la liberación de los parasitoides Cephalonomia stephanoderis y Heterospilus coffeicola. La liberación de los enemigos naturales de los insectos-plagas, contribuyen a incrementar el impacto del control biológico en un programa de manejo integrado. Tabla 1. Enemigos naturales de la broca del café (Rosales et al., 1998).
Parasitoide: Un parasitoide es un insecto que depreda o parasita a un insecto de otra especie inyectando sus huevos dentro del cuerpo de su huésped para que al eclosionar, sus larvas se alimenten de él, tal como es el caso de Prorops nasuta, Cephalonomia stephanoderis y Heterospilus coffeicola. Entomopatógeno: Organismo causante de enfermedades en los insectos, normalmente son bacterias, virus, hongos o protozoos. Por ejemplo Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae y Paecilomyces spp. 2.3.4. Control químico El control químico de la broca del café debe realizarse cuando las hembras adultas están volando en la búsqueda de nuevos granos de café ó cuando están iniciando la perforación, pretendiendo evitar daños en granos de café sanos (Bustillo et al., 1998); adicionalmente se deben tomar en consideración los índices porcentuales del muestreo o nivel de acción para las plagas (Gravena, 1992).
Enemigo Natural Plaga Nombre común Nombre científico
Hábito
Avispa de Uganda
Prorops nasuta Parasitoide
Avispita Cephalonomia stephanoderis
Parasitoide
Avispita Heterospilus coffeicola
Parasitoide
Hongo Beauveria bassiana Entomopatógeno Hongo Metarrhizium
anisopliae Entomopatógeno
Broca del café
Hongo Paecilomyces spp Entomopatógeno
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Los insecticidas clorpirifos (O,O-dietil O-3,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato) y endosulfan (6,9-metano-2,4,3-benzodioxatiepin) son los más usados para el control de la broca. El endosulfan causa una alta mortalidad, pero se han encontrado linajes de broca resistentes en Nueva Caledonia (Brun et al., 1989). Son comunes los casos de envenenamiento, por lo que hoy se intenta recurrir a agentes más inocuos tales como fenitrothion, fenothion y pirimifos de metilo (Bustillo et al., 1998). No obstante, en general cualquier insecticida es peligroso para la salud del ser humano y contamina el ambiente.
2.4. DESCRIPCION DE LAS FAMILIAS SELECCIONADAS EN EL ESTUDIO Plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiácea y Solanaceae, han sido muy utilizadas en la medicina natural, aunque algunos de sus componentes se usan como antibacterianos o antimicrobianos, antimaláricos o como sedantes (Mahabir, 1995); en este grupo de familias se encuentran algunas especies cuyos extractos se han empleado como insecticidas (Tabla 2), generando la posibilidad de investigar los extractos vegetales de las familias en estudio, de las cuales a continuación, se presenta una descripción general. 2.4.1. Familia Asteraceae Pueden ser hierbas, bejucos, arbustos o árboles, que presentan hojas alternas, verticiladas u opuestas, simples o compuestas; sin estípulas. Inflorescencia de una a numerosas cabezuelas o capítulos con una a numerosas flores sésiles sobre un receptáculo común; cabezuelas heterógamas radiadas o disciformes, u homógamas discoides o liguladas, basalmente rodeadas por un involucro de brácteas (filarias) libres o connatas, en una o varias series; receptáculo convexo, cóncavo, plano o cónico; paleas rodeando las flores o reducidas a cortas escamas o ausentes. Figura 5. Tilesia baccata (Asteraceae).
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En esta familia se encuentran flores perfectas, femeninas, masculinas o estériles; corola gamosépala, regular, tubular, bilabiada, ligulada o filiforme, 2–5 dentada; 4–5 estambres, filamentos usualmente libres, anteras formando un tubo alrededor del estilo, ápice con apéndice, base truncada o con apéndices de varios tipos; ovario ínfero, unilocular, con un óvulo, estilo con 2 ramas, pubescente, glabro o glandular, con las porciones estigmáticas hacia adentro. Frutos con un aquenio coronado por el vilano o papo que es el cáliz modificado a manera de cerdas, escamas, pelos, aristas o setas (Aristeguieta, 1964). 2.4.1.1. Actividad biológica: Algunos extractos de plantas de la familia Asteraceae, como Achyrocline satureioides presentan actividad antmicrobiana; Ageratum conyzoides y Ambrosia cumanensis entre otras, presentaron actividad antimicrobiana contra Staphylococus aureus (Mahabir, 1995). 2.4.2. Familia Euphorbiaceae La familia Euphorbiaceae consta de unos 300 géneros y 7500 especies de distribución cosmopolita, mejor desarrollada en las regiones tropicales y subtropicales (Macbride, 1951). Se encuentran en esta familia hierbas, bejucos, árboles o arbustos, generalmente con látex lechoso o coloreado; plantas monoicas o dioicas. Hojas alternas, simples; estípulas generalmente presentes. Inflorescencia cimosa, racimosa, espigada. Flores unisexuales, perianto inconspicuo, estambres 5 a numerosos, filamentos libres o unidos, anteras con dehiscencia longitudinal; ovario súpero, 3-locular y 3-carpelar (raramente 2), estilos libres o unidos; óvulos 1–2 por lóculo en placentas axilares. Fruto capsular, tricoco con dehiscencia elástica y separándose de la columela central, o algunas veces una drupa; 1–2 semillas. Figura 6. Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae).
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2.4.2.1. Actividad biológica: El extracto etanólico de Acalypha alopecuroidea posee actividad antibacteriana; los extractos etanólicos de Acalypha guatemalensis mostraron actividad antimicrobiana contra cepas de Salmonella typhi (60%), Staphilococcus aureus (50%) y Pseudomona aureginosa (15%); además, los extractos acuosos y etanólicos de Jatropha gossypiifolia fueron activos como molluscicida frente a Bulinus globulus (Mahabir, 1995). Varias especies de Phyllantus, presentan efectos antivirales contra la hepatitis B (Venkateswaran et al., 1987; Thyagarajan et al., 1988; Shead et al., 1992). 2.4.3. Familia Rubiaceae Esta família está constituída por árboles o arbustos, hierbas o trepadoras. Poseen hojas opuestas, simples; estípulas generalmente interpeciolares, persistentes o caducas. Flores perfectas o unisexuales; cáliz con el tubo unido al ovario formando un hipanto, limbo con 4–5 dientes o lóbulos o espatulado; corola gamopétala, actinomorfa, infundibuliforme, campanulada o rotada, lóbulos usualmente 4–6, imbricados, valvados o abiertos; estambres en igual número y alternos con los lóbulos de la corola, insertos en el tubo de la corola, anteras dehiscentes por hendiduras longitudinales; ovario ínfero, usualmente 2-locular, coronado por un disco carnoso, numerosos óvulos en cada lóculo. El fruto puede ser una baya o una cápsula (Andersson, 1992). . Figura 7. Guettarda crispiflora (Rubiaceae). La familia Rubiaceae es una de las más grandes que poseen plantas con flores, consta de unos 600 géneros y tal vez 10.000 especies. Su distribución es cosmopolita pero está mejor representada en las zonas tropicales (Andersson, 1992). 2.4.3.1. Actividad biológica: En algunas especies de esta familia se han reportado saponinas esteroidales (Sparg et al., 2004); así como la presencia del alcaloide camptotecina aislado de Ophiorrhiza mungos, O. pumila, O. filistipula (Wink, 2003). Es importante
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destacar que este alcaloide es la materia prima para hemosíntesis de una serie de derivados con propiedades anticancerígenas. La corteza del árbol Ladambergia macrocarpa, se utiliza contra las fiebres palúdicas y estados febriles en general (García, 1992). 2.4.4. Familia Solanaceae En esta familia se pueden encontrar hierbas, arbustos o árboles, con pelos estrellados y algunas veces con espinas; biosintetizan alcaloides. Posee hojas alternas, simples (raramente compuestas) enteras o hendidas; sin estípulas. Flores perfectas pequeñas a muy grandes; cáliz gamosépalo; corola simpétala, rotada a tubular, lóbulos convolutos, imbricados o valvados; estambres adheridos a la base del tubo de la corola, en igual número y alternos a los lóbulos o reducidos a 4, anteras con dehiscencia longitudinal o por poros; ovario súpero, bicarpelar, generalmente bilocular, numerosos óvulos en placentas axilares elaboradas. La familia Solanaceae consta de 83 géneros y unas 2800 especies de distribución cosmopolita, pero está mejor desarrollada en América del Sur. De importancia económica son la papa (Solanum tuberosum L.), el tomate (Lycopersicon esculentum Miller), el ají (Capsicum frutenses), el tabaco (Nicotiana tabacum), el lulo (Solanum quitoense), entre otros (Hunziker, 1979). Figura 8. Solanum acerifolium (Solanaceae). 2.4.4.1. Actividad biológica: Plantas de esta familia tienen usos medicinales debido a los alcaloides que biosintetizan, tales como hiosciamina, atropina y escopolamina, entre otros, los cuales actúan como anticolinérgicos, antirreumáticos y estimulantes del sistema nervioso central (SNC); así mismo, son usados por causar efectos relajantes y somnolencia. También se han reportado metabolitos secundarios como saponinas, esteroles, taninos, carbohidratos, flavonoides, ácidos grasos y vitamina D (Córdoba, 2002; Mora y Orozco, 2002).
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Solanum torvum Swartz contiene en sus frutos isoflavonoides como el torvanol A y el glicósido esteroidal torvosido H que le dan una fuerte actividad contra el virus herpes simplex tipo I (Arthan et al., 2002). La especies Acnistus arborescens posee fuerte actividad citotóxica debido a sus lactonas esteroidales (Minguzzi et al., 2002). Las especies Solanum lycioides L. y Cestrum parifolium Willd. ex Roem et Schult. también son conocidas por tener metabolitos con capacidad citotóxica y son usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades de la piel, úlceras y fiebre (Moreno-Murillo et al., 2001). 2.4.5. Familia Apocynaceae
Esta familia botánica se encuentra distribuida en todas las zonas tropicales y subtropicales del planeta contando con 15.000 especies divididas en 180 géneros. Presentan diferentes estructuras pudiendo ser leñosas, arbóreas y bejucos; prefieren los climas templados a secos y en algunos casos su crecimiento se circunscribe a suelos arcillosos (Schmidt, 2006). Figura 9. Ervatamia divaricata (Apocynaceae) 2.4.5.1. Actividad biológica: La especie Acokanthera schimperi se utiliza en el tratamiento de varias enfermedades de la piel de origen viral; además, de ella se han identificado compuestos como la ouabaina, amirina, uvaol y derivados del ácido ursólico que inhibe infecciones causadas por rinovirus (Gebre-Mariam et al., 2006). Así mismo Acokantera schimperi ha demostrado actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus y Pseudomona aeruginosa, lo cual hace que sus extractos puedan utilizarse contra enfermedades causadas por estos microorganismos (Tadeg et al., 2005). Dentro de esta familia también se encuentran los alcaloides vinblastina y vincristina, aislados de Cantharanthus roseus, los cuales poseen marcada
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acción para el tratamiento del cáncer, por lo que son utilizados clínicamente contra la leucemia, el cáncer de seno, entre otros (Pung, 2000). 2.4.6. Familia Asclepiadaceae La familia Asclepiadaceae constituye un gran grupo que comprende unas 1700 especies. Se trata de plantas herbáceas, lianas y árboles ocasionalmente, caracterizadas por tener hojas opuestas, simples y sin estípulas. Algunas veces presenta hábitos xerofíticos, con tallos suculentos y sin hojas, en relación con la adaptación al ambiente árido. Las flores son hermafroditas y actinomorfas, pentámeras, dispuestas en inflorescencias cimosas. El cáliz está formado por 5 sépalos más o menos libres, y la corola por 5 pétalos escasamente concrescentes, normalmente con una corona de derivación corolina o de origen estaminal. El androceo está constituido por 5 estambres, generalmente soldados procurando una protección al gineceo, es decir, formando un ginostegio. El gineceo está compuesto por 2 carpelos formando un ovario súpero o, en alguna ocasión, semiínfero; los estilos están fusionados pero presentan 5 estigmas diferenciados con masas polínicas que se enganchan en los insectos polinizadores y aseguran la fecundación cruzada. Figura 10. Asclepias curassavica (Asclepiadaceae) 2.4.6.1. Actividad biológica: Asclepias linaria posee actividad insecticida contra el gorgojo del maíz Sitophilus zeamais y S.orizae (Hernandez, 1994).
En el género Asclepias se encontró ácido cinnámico que actúa como fungicida, pesticida y herbicida, además polifenoles que poseen efectos antibacterianos (Mahabir, 1995).
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2.5. Teorías de defensa de las plantas Los mecanismos de resistencia, son aquellas características de la planta que hacen que el insecto atacante le cause menos daños (Álvarez et al., 2001). La resistencia, es una herramienta importante con la cual cuenta el hombre para encontrar novedosos compuestos bioactivos que ayuden a reducir el daño que éstos puedan causar en los cultivos. Han sido identificados tres tipos de mecanismos: preferencia o no preferencia (antixenosis), tolerancia y antibiosis. La antixenosis se presenta cuando las características físicas o químicas de la planta evitan que esta sea preferida por el insecto para oviposición, refugio o alimento; la tolerancia ocurre cuando la planta mantiene elevadas poblaciones de plaga o esta afecta algunos órganos sin que disminuya la producción y la antibiosis afecta de forma negativa la fisiología del insecto, cuando éste ingiere alguna parte de la planta (Álvarez, et al., 2001).
La resistencia a plagas es una tecnología que puede brindar control a gran diversidad de insectos que suelen afectar a los cultivos pero su utilización debe ser efectuada dentro de un programa de control integrado, lo que permite fomentar el control biológico y reducir el uso de insecticidas. Entre las ventajas de las plantas resistentes se destacan su especificidad, persistencia, compatibilidad con otras tácticas de manejo integrado y el medio ambiente (Aragón, 2003).
Las plantas contienen gran riqueza de agentes químicos, algunos de los cuales pueden ser tóxicos e incluso pueden hacer que una plaga se desarrolle más despacio de lo normal. Hay docenas de productos naturales de plantas que tienen algún efecto antibiótico en los insectos, incluyendo los pesticidas botánicos como la rotenona y el piretro. La resistencia a insectos permite a una planta evitar, tolerar o recuperarse de los daños provocados por las poblaciones de insectos u otros organismos dañinos. Esta característica puede provenir de aspectos morfológicos y/o bioquímicos que afectan el comportamiento y metabolismo de las plagas.
Algunos de los compuestos, como el ácido jasmónico, pueden producirse por las plantas al primer ataque de un insecto o patógeno. Sin embargo, sus niveles son a veces demasiado bajos para proporcionar la protección adecuada. Igualmente, las plantas poseen estructuras como vellos o espinas que pueden impedir que insectos o agentes extraños la ataquen y de esta forma también se presenta un efecto de antibiosis (Caldwell et al., 2004).
Dos de los principales mecanismos de resistencia a insectos son la resistencia ecológica y la genética. Dentro de esta última se destacan las plantas que poseen factores de no preferencia, las que tienen tolerancia al daño y aquellas que provocan antibiosis. La antibiosis implica un efecto fisiológico adverso al desarrollo de un insecto de tipo transitorio o permanente, este efecto puede ser provocado por la presencia de sustancias como metabolitos tóxicos (glucósidos, quinonas), plantas que presentan un desbalance de nutrientes para el organismo plaga y la presencia de enzimas inhibidoras de la digestión.
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Estas sustancias pueden provocar la muerte de insectos pequeños, disminución de la tasa de crecimiento, fallas en la metamorfosis, alteración de la diapausa, reducción de la fertilidad, etc (Aragón, 2003).
2.6. Insecticidas naturales a partir de extractos vegetales A partir de la necesidad por encontrar una nueva alternativa natural para el control de insectos plagas y en lo posible reemplazar los pesticidas sintéticos aparecen los insecticidas botánicos ofreciendo seguridad para el medio ambiente y una eficiente opción agronómica. Muchas plantas son capaces de sintetizar metabolitos secundarios que poseen propiedades biológicas importantes contra insectos plagas (Céspedes et al., 2001), estos deben tener principios activos potentes, con alta estabilidad química y óptima producción. En hortalizas como, la papa, el tomate y la berenjena pertenecientes a la familia Solanaceae, se producen alcaloides como chaconina, solanina y tomatina, que poseen un efecto insecticida amplio, aunque algunas especies de insectos han aprendido a tolerar estas toxinas (Menjivar, 2001). La protección natural de cultivos reduce el riesgo de la resistencia en los insectos, tiene menos consecuencias letales para los enemigos naturales, reduce la aparición de plagas secundarias, es menos nocivo para el hombre, y no ocasiona daños al medio ambiente (Stoll, 1989). Los compuestos son tan variados como las plantas de las cuales han sido aislados y el rango de su efecto protector va desde repelencia, disuasión de la alimentación y oviposición hasta toxicidad aguda e interferencia con el crecimiento y el desarrollo. Algunos extractos de diferentes familias de plantas que han presentado actividad para el control de insectos se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Ejemplos de extractos de plantas que presentan actividad insecticida.
FAMILIA ESPECIE COMENTARIO
Alliaceae
Allium sativum
El extracto de ajo ha sido utilizado como insecticida, repelente, fungicida, bactericida y nematicida (Silva et al., 2002).
Ambrosia cumanensis
En extractos de la planta se han encontrado propiedades insecticidas (Mahabir, 1995).
Franseria artemisioides
La coronofilina extraída de esta planta, posee actividad insecticida contra ciertos dípteros (Mahabir, 1995).
Asteraceae
Agerantum conyzoides
El extracto acuoso de la planta entera ha demostrado actividad insecticida contra Tribolium castaneum y Musca domestica (Mahabir, 1995).
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Nicotiana tabacum
La nicotina es básicamente un insecticida de contacto no persistente. La actividad insecticida de la nicotina provoca contracciones espasmódicas, convulsiones y finalmente la muerte en el insecto (Silva et a, 2002).
Solanaceae
Capsicum frutenses
El extracto de ají es usado como repelente de contacto para insectos adultos, ovicida y disuador de alimentación (Silva et al.,2002).
Leguminosae
Derris elliptica y Lonchocarpus utilis
La rotenona (flavonoide) extraída de las raíces de estas plantas, se comporta como insecticida de contacto, por ingestión y repelente (Silva et al., 2002).
Meliaceae
Azadirachta indica
La azadirachtina es un tetraterpenoide, aislado de la corteza, hojas y frutos del árbol de neem, presenta acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la oviposición y esterilizante (Silva et al., 2002).
Compositae
Chrysantemum cinaerifolium
Las piretrinas son ésteres con propiedades insecticidas atacan tanto el sistema nervioso central como el periférico, lo que hace que el insecto apenas entre en contacto con la superficie tratada deje de alimentarse y caiga (Silva et al., 2002).
Moraceae Artocarpus altilis Park
Actividad insecticida contra C. formicarius e Hypothenemus hampei (Mitchell et al., 2006)
Sapindaceae Blighia sapida Presenta actividad insecticida contra C. formicarius (100%) e Hypothenemus hampei (2.3%) (Mitchell et al., 2006)
Coffea liberica Insecticida contra T. confusum (13%) (Mitchell et al., 2006)
Rubiaceae Borreria laevis Insecticida contra T. confusum (13%)
(Mitchell et al., 2006).
Croton linearis Actividad insecticida contra T. confusum (37%) y Cylas formicus (Mitchell et al., 2006).
Euphorbiaceae Croton cajucara De esta planta se aisló un diterpeno (cis-
dehidro-crotonin) que presenta propiedades insecticidas (Bittner et al., 2001).
Asclepiadaceae Asclepias curassavica
Actividad insecticida contra B. microplus (Mitchell et al., 2006).
Apocynaceae Ervatamia divaricata
Actividad insecticida contra T. confusum (17%) y C. formicarius (Mitchell et al., 2006).
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Como se puede deducir de la tabla 2, cuatro extractos han sido usados como repelentes contra la broca del café, estos son: ají (Capsicum frutenses, Solanaceae), tabaco (Nicotiana tabacum, Solanaceae), ajo (Allium sativum, Alliaceae) y el extracto del árbol de Neem (Azadirachta indica, Meliaceae). Los extractos de las plantas Artocarpus altilis Park (Moraceae) y Blighia sapida (Sapindaceae) han sido evaluados como insecticidas contra la broca del café. 2.7. Análisis estadístico Con el fin de obtener resultados confiables, los ensayos se realizarán por duplicado y utilizando el software estadístico SPSS versión 10 se analizarán los datos obtenidos realizando un análisis exploratorio de normalidad, una prueba de Tukey y un Anova de un factor.
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3. JUSTIFICACION
Con este proyecto se trata de realizar el tamizado de los extractos vegetales de las plantas recolectadas para determinar cuales impiden que la broca perfore y penetre el grano de café y así no puedan llegar a reproducirse dentro del grano del fruto, donde causa el verdadero daño cuando sus larvas se alimentan de la almendra del grano. En nuestro país, la broca del café fue registrada por primera vez en 1988 afectando cafetales del sur del país. Se ha estimado que Colombia tiene aproximadamente 870.000 hectáreas cultivadas en café y actualmente la broca se encuentra distribuida en el 82% del área cafetera, 715.073 ha (Herrón, 1998). La inversión para el manejo de broca es de aproximadamente $96.385 pesos por ha/año (Duque, 1994), los costos se sitúan en un rango que va del 4,8%, hasta un 11,7% del costo total de producción (Marquez, 1998) Respecto a los insecticidas, un alto porcentaje de agricultores utilizan esta herramienta (95,8%), el producto más utilizado es el Thiodan (endosulfan) y el 34% de los agricultores aplican insecticidas cuatro o más veces por año. Estas condiciones muestran un uso intensivo de este recurso, a pesar de que solo el 2,8% lo hace de acuerdo a los lineamientos del MIB (Duque et al., 1996).
Se ha descubierto que la broca ha desarrollado gran resistencia al Endosulfan y otros insecticidas sintéticos (Brun et al., 1989); además, estos productos causan un impacto adverso en el ecosistema. Por lo anterior, es de gran importancia evaluar y encontrar métodos que contribuyan a la disminución de las poblaciones de broca del café, que sean menos contaminantes para el medio ambiente y menos tóxicos para la población humana, contribuyendo al mismo tiempo con este trabajo al descubrimiento de la actividad insecticida de las plantas de nuestra región y el valor de la flora regional.
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4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general Evaluar la capacidad inhibitoria de extractos vegetales de diclorometano y metanol de 21 plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa (Circasia, Quindío) por medio de un bioensayo de antibiosis con broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari). 4.2. Objetivos específicos
• Realizar el proceso de extracción de 21 plantas recolectadas y obtener
los extractos de diclorometano y metanol. • Caracterizar fitoquímicamente los extractos de diclorometano y metanol.
• Preparar y optimizar una dieta artificial para la supervivencia de la broca
del café en condiciones in vitro.
• Estandarizar un protocolo adecuado para la cría y mantenimiento artificial de la broca del café.
• Evaluar por antibiosis la capacidad inhibitoria de los extractos utilizando
granos de café pergamino.
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5. SECCION EXPERIMENTAL
5.1. Materiales 5.1.1. Reactivos La extracción de los materiales vegetales se realizó con n-hexano (C6H14), metanol (MeOH) y diclorometano (CH2Cl2) grado comercial. En la preparación de la dieta artificial se utilizó agar bacteriológico Nº1 (Oxoid, Inglaterra), derosal (Bayer Cropscience-Colombia), benzoato de Sodio (comercial), nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate Sigma-USA), levadura torula (MP Biomedicals, Inc. Francia), formaldehído 37% (Fisher Scientific-USA), ácido ascórbico (Carlo Erba), sacarosa (Sigma-USA), caseína hidrolizada (Oxoid-Inglaterra), etanol absoluto (Carlo Erba), sales de wesson (Sigma-Aldrich-USA) y colesterol (Sigma-USA). Para realizar la marcha fitoquímica se utilizaron cromatofolios de silica gel 60 F254 soportados sobre una placa de aluminio de 20 x 20 cm (Merck). Los solventes utilizados en la preparación de las soluciones patrón de los extractos a 40000 mg/L fueron etanol (EtOH) y butanol (BuOH) ambos marca Merck grado analítico. 5.1.2. Controles Como control positivo se utilizó el plaguicida Endosulfan, el cual ha sido el más utilizado para el control de la broca del café, así mismo se usó como control negativo EtOH al 1 % para extractos metanólicos y la mezcla BuOH-EtOH (3:1) para los extractos de diclorometano. 5.1.3. Materiales Para esterilizar el agar y el café pergamino molido se utilizaron erlenmeyers de diferente volumen Schott Duran (Mainz, Alemania). Para la medición de volúmenes entre 100 y 1000 µL se usaron micropipetas Eppendorf serie 2100 de volumen variable y para los volúmenes entre 10 y 100 µL la pipeta Brand (Mainz, Alemania) serie 01T08000. Las cajas Petri que se emplearon para servir la dieta artificial Cenibroca D-200 fueron Pyrex 100 X 30 mm. Para realizar los ensayos por antibiosis se emplearon tubos eppendorf de 2 mL tyco/Healthcare Kendall.
5.1.4. Equipos Para pesar los reactivos a utilizar en este bioensayo se utilizó la balanza analítica Mettler Toledo AB 204 (Suiza), y para la preparación de los extractos vegetales se empleó un vortex IKA MS1 (Wilmington, EEUU). Soluciones de agar, el café pergamino molido y demás material aseptico fueron esterilizados en autoclaves All American (NY, EEUU) y para asegurar un ambiente descontaminado, los ensayos se realizaron en la cabina de flujo laminar C4
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FLC 120 y para succionar las brocas del café se utilizó una bomba de vacío vacuubrand ME 2C 5.1.5. Material vegetal El material vegetal fue recolectado en la Reserva Natural Bremen La Popa por el grupo de Biotecnología Productos –Naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira UTP bajo la asesoría del taxónomo del Herbario de la Universidad de Antioquia Francisco Javier Roldán (HUA, Medellín, Colombia) durante el periodo de 22-24 de agosto del 2005, tiempo en el cual se recolectaron 21 especies de plantas pertenecientes a las familias botánicas Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiácea y Solanaceae. 5.1.5. Material biológico Para la infestación de la dieta artificial se hizo una compra de 40000 hembras adultas de broca (Hypothenemus hampei, FERRARI) en el laboratorio BIOCAFE (Chinchiná, Colombia) 5.2. Métodos 5.2.1. Proceso de extracción Con el fin de obtener los extractos crudos que se usaron en el bioensayo, el material vegetal se sometió a extracción con tres diferentes solventes, como se resume en la figura 11.
Moler
Eliminar Marco
Rotaevaporar hasta sequedad. (Extracto seco MeOH)
Guardar los extractos a –10°C
Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco CH2Cl2)
Filtrar
Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco n-hexano)
(Extraer con Metanol) x 3
(Extraer con Diclorometano) x 3
Secar el material vegetal a 50 ºC por 48 horas
Marco
Marco
Figura 11. Proceso de extracción del material vegetal y obtención de los extractos
(Someter a extracción 300 g del material vegetal seco y molido con n-hexano) x 3
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5.2.2. Proceso de desinfección del café Para lograr un resultado confiable en este bioensayo se utilizaron granos de café pergamino de primera calidad, perfectamente libres de agentes como hongos y/o ácaros; también se emplearon brocas adultas recién emergidas desinfectadas.
5.2.3. Proceso de desinfección de la broca del café Para la realización del bioensayo usando granos de café pergamino húmedo se realizó la desinfección de la broca con un solo producto, el cual contribuyó a reducir la contaminación experimento. Figura 13. Proceso de desinfección de la broca del café para usar en ensayos de antibiosis con granos de café pergamino. Para el caso de la dieta artificial, la desinfección con cloruro de benzalconio al 10% no fue suficiente y se observó rápidamente contaminación en las cajas Petri; motivo por el cual, se encontró una manera adicional de desinfectar la broca del café y eliminar posibles hongos en la superficie de su cuerpo, obteniendo buenos resultados para el control de la contaminación en la dieta Cenibroca D-200 (Ver figura 14).
Figura 12. Proceso de desinfección para los granos de café pergamino.
Secar las brocas en corriente de aire por 2 minutos o hasta cuando se observen moverse
(Depositar las brocas en los eppendorf con el grano de café pergamino) X 90
En cabina de flujo laminar asperjar las brocas con solución de cloruro de benzalconio al 10% (Sanivec)
Preparar una solución de Derosal (antifúngico) al 3% y sumergir los granos de café seleccionados por 24 horas
Seleccionar los granos de café que se encuentren enteros y sin perforaciones de broca
Sacar los granos de café de la solución, ponerlos en una malla y dejar secarlos completamente
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Figura 14. Proceso de desinfección para la broca del café usada en la dieta artificial Cenibroca D-200. 5.2.4. Preparación de la dieta artificial para la cría de broca del café in vitro Para tener disponibilidad de broca del café en el laboratorio, se requiere una dieta adecuada para su cría, de esta forma se eligió la dieta artificial Cenibroca D-200 que es una pasta dura maleable apta para el desarrollo y crecimiento de la misma (Portilla, 1999). Tabla 3. Composición de la dieta artificial Cenibroca D-200 para la cría de broca del café.
Ingrediente Cantidad para 800 mL Agua 800 mL Agar 22.4 g
Café molido 106.6 g Sacarosa 14.9 g Caseína 21.4 g
Levadura torula 21.4 g Benzoato de sodio 0.85 g
Derosal 2.4 mL Nipagin 1.06 g
Colesterol 0.64 g Acido ascórbico 1.3 g
Sales de Wesson 2.14 g Etanol 10.6 mL
Formaldehído 37% 2.3 mL
E N
C O N D I C I O N E S
A S É P T I C A S
Depositar las brocas en cajas de petri con la dieta artificial Cenibroca D-200 previamente preparada
Asperjar las brocas con solución de EtOH al 96% por 1 minuto
Asperjarlas con una solución de hipoclorito de sodio al 3% por 3 minutos
Asperjarlas con EtOH al 70% por 30 segundos
(Enjuagar las brocas con agua destilada estéril) X 3
Secar las brocas en corriente de aire por 2 minutos o hasta cuando se observen moverse
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La dieta artificial se realizó con el fin de mantener la cría de broca que luego servirá para realizar los bioensayos con los extractos vegetales obtenidos a partir de las plantas recolectadas, en el anexo 1 puede observarse el proceso de realización de la dieta. 5.2.5. Evaluación de los extractos vegetales por Antibiosis En este bioensayo, se manifiesta el mecanismo de antibiosis cuando la broca se alimenta del grano de café impregnado del extracto y los metabolitos secundarios que este contiene, afecta el desarrollo y/o la reproducción del insecto.
Figura 15. Proceso para evaluar los extractos vegetales por antibiosis contra Hypothenemus hampei en café pergamino 5.2.6. Marcha fitoquímica aplicada a los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol Con el fin de detectar los núcleos fitoquímicos presentes en los diferentes extractos crudos evaluados, se realizó una marcha fitoquímica por cromatografía de placa delgada (CCD) para cada extracto vegetal, siguiendo la metodología descrita por Stahl (1969). Se utilizaron reveladores y patrones
Poner los granos en solución de los extracto a 1000 mg/L por 24 horas.
Poner un grano de café con una broca adulta recién emergida previamente desinfectada en un eppendorf.
Sacar los granos de café del tratamiento con el extracto y secarlos por 24 horas.
Tomar 90 granos de café pergamino previamente desinfectado.
90 repeticiones por extracto
Cada 4 días por 40 días, se hace una revisión de los estados biológicos.
Control positivo Endosulfan 1 mg/L
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específicos para cada tipo de núcleo fitoquímico con el fin de comparar los resultados de los extractos con los patrones (ver tabla 4). Tabla 4. Patrones y reveladores utilizados en CCD para la detección de los núcleos fitoquímicos en estudio.
Núcleo fitoquímico Patrón Revelador Alcaloides Papaverina Dragendorff Terpenos
Triterpenos Esteroles
Taxol y lanosterol
Anisaldehído/ CH3COOH-
H2SO4
Flavonoides Kaempferol AlCl3 al 2% en EtOH absoluto Taninos Fenoles
Acido gálico y ácido tánico
FeCl3 al 5% en solución salina saturada
Saponinas esteroidales y triterpénicas
Digitonina H2SO4 10% en EtOH absoluto
Sesquiterpenlactonas
Digitoxina Acido 3,5-dinitrobenzóico MeOH-KOH
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6. RESULTADOS Y DISCUSION Se evaluaron 42 extractos, 21 metanólicos y 21 de diclorometano, pertenecientes a 21 especies vegetales recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa (ver figura 16). En la tabla 4 se muestra el listado de plantas evaluadas y las cantidades de extracto obtenido (n-hexano, diclorometano y metanol).
En la Tabla 5 se muestran los resultados de la marcha fitoquímica; con el signo (+) se confirma la presencia del núcleo fitoquímico en estudio y con el signo (–) la ausencia para cada extracto evaluado.
Figura 16. Reserva Natural Bremen-La Popa. Sitios de muestreo.
En las unidades experimentales (UE) que se revisaron y se presentó perforación del grano, se dio inicio al ciclo biológico de la broca del café, teniendo en cuenta que una vez la broca perfora y penetra el grano, el efecto del extracto sobre el desarrollo del ciclo, es mínimo. Se considera que el efecto sobre el desarrollo del ciclo biológico pudo afectarse por factores ambientales, posiblemente las variaciones de temperatura y humedad que se mantuvieron en el rango 20-26ºC y 70-75% HR. La cantidad de adultas durante los 40 días del ensayo con los extractos metanólicos fue baja, situación similar se presentó con el control negativo (EtOH 1%) donde un efecto de antibiosis prolongó el ciclo de vida de la broca del café (Romero et al., 2004).
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Tabla 5. Plantas recolectadas y peso de cada extracto obtenido del material vegetal recolectado en la Reserva Natural Bremen-La Popa (ventana 1: cuenca río La Vieja).
Peso Extracto (g) Familia Nombre Científico
Voucher FJR
Nº UTP n-Hexano CH2Cl2 MeOH
Apocynaceae Cynanchum sp
3964 123 16,282 6,362 32,286
Asclepiedaceae Oxypetalum cordifolium
3981 139 10,064 12,797 16,331
Pentacalia urbanii
3963 122 7,326 4,276 9,282
Mikania banisteriae
3965 124 7,091 7,107 9,282
Clibadium pentaneuron
3966 125 2,984 4,972 8,270
Critoniella acuminata
3968 127 6,463 5,757 22,907
Baccharis sp 3972 131 7,097 7,587 10,901 Tilesia baccata
3974 133 3,510 7,600 10,328
Mikania lloensis
3977 136 2,720 5,973 14,375
Asteraceae
Lepidaploa lehmannii
3976 135 1,337 1,058 12,617
Acalypha diversifolia
3967 126 4,279 5,469 22,178
Alchornea calophylla
3969 128 6,188 3,756 24,975
Hyeronima sp 3971 130 7,947 4,912 40,649
Euphorbiaceae
Alchornea grandis
3982 140 2,227 3,159 14,058
Guettarda crispiflora
3973 132 0,900 4,823 25,891 Rubiaceae
Faramea sp 3979 138 3,408 4,818 9,601 Solanum acerifolium
3961 120 11,804 9,720 11,695
Solanum trachycyphum
3962 121 12,987 6,359 36,344
Sin Identificar 3970 129 4,909 3,626 13,043 Solanum lepidotum
3975 134 1,410 5,180 19,210
Solanaceae
Cestrum sp 3978 137 8,117 5,657 7,389
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Tabla 6. Marcha fitoquímica por CCD de los 63 extractos de las plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa
Nombre Científico
Extracto Metabolitos Secundarios Familia
Alcaloides Esteroles y Triterpenos
Saponinas Fenoles Flavonoides Taninos
Hexano -1 + - - - - Diclorometano - - - - - -
Apocynaceae Cynanchum sp
Metanol - - - - + - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -
Asclepiedaceae Oxypetalum cordifolium
Metanol + + + - + - Hexano - - - - - - Diclorometano + + - + + +
Pentacalia urbanii
Metanol - + + + + + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - - - -
Mikania banisteriae
Metanol - + + + + + Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -
Clibadium pentaneuron
Metanol - + - - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - + - + - +
Critoniella acuminata
Metanol + - + - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - + - - - -
Baccharis sp
Metanol - - - + - + Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - + -
Tilesia baccata
Metanol - + + - - - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -
Asteraceae
Mikania lloensis
Metanol - - + - - -
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Continuación tabla 6 Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + +
Acalypha diversifolia
Metanol - - - + - + Hexano - - - + - + Diclorometano - - + + + +
Alchornea calophylla
Metanol - + + + + + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + +
Hyeronima sp
Metanol - + + + + + Hexano - - + - - - Diclorometano - - + - + -
Euphorbiaceae
Alchornea grandis
Metanol - + + + - + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - - - -
Guettarda crispiflora
Metanol - - - - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - - - - + -
Rubiaceae Faramea sp
Metanol - - - + - + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + +
Solanum acerifolium
Metanol + + + - - - Hexano - - - - - - Diclorometano + + - - + -
Solanum trachycyphum
Metanol + + + - - - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - + -
Sin Identificar
Metanol + + - - - - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -
Solanum lepidotum
Metanol + - - - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - + - - + -
Solanaceae
Cestrum sp
Metanol + - - - - -
1 (+) = Detección del Fitocompuesto (-) = No Detección del Fitocompuesto
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6.1. Análisis estadístico Con los datos presentados en el anexo 2, se realizó el análisis de normalidad (Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk, ver anexo 3) donde se puede observar que para los estados biológicos de huevos (H) y larvas (L), el nivel de significancia es menor que 0.05 (permitiendo que hasta 2 datos sean mayores a 0.05) lo que infiere que los datos están distribuidos normalmente y puede usarse la prueba de Tukey (ver anexo 4) y el ANOVA de un factor (ver anexo 5) para obtener diferencias en cuanto a H y L para de esta forma ver cuales de los extractos presentaron las diferencias mas pequeñas con relación al control negativo y los demás extractos; en cuanto al total de individuos, al no presentar normalidad entre los datos, se realiza un análisis de Kruskal-Wallis y un análisis de comparaciones múltiples (Tamhane). Para el análisis de los datos se utilizó el software estadístico SPSS versión 10. 6.1.1. Análisis estadístico para huevos Tabla 7. Pruebas de normalidad para el estado de huevos
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Extracto Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
Huevos Control .219 14 .068 .926 14 .336 120.00 .295 14 .002 .626 14 .010**
121.00 .305 14 .001 .696 14 .010** 122.00 .315 14 .001 .716 14 .010** 123.00 .307 14 .001 .794 14 .010** 124.00 .355 14 .000 .636 14 .010** 125.00 .357 14 .000 .645 14 .010** 126.00 .392 14 .000 .671 14 .010** 127.00 .350 14 .000 .732 14 .010** 128.00 .389 14 .000 .688 14 .010** 129.00 .306 14 .001 .775 14 .010** 130.00 .335 14 .000 .652 14 .010** 131.00 .378 14 .000 .674 14 .010** 132.00 .314 14 .001 .814 14 .010** 133.00 .388 14 .000 .685 14 .010** 134.00 .189 14 .188 .872 14 .048 135.00 .388 14 .000 .685 14 .010** 136.00 .302 14 .001 .792 14 .010** 137.00 .368 14 .000 .677 14 .010** 138.00 .392 14 .000 .671 14 .010** 139.00 .349 14 .000 .727 14 .010** 140.00 .350 14 .000 .732 14 .010**
** Este es un límite superior de la significación verdadera. a Corrección de la significación de Lilliefors b Larvas es una constante cuando Extracto = 128.00 y se ha desestimado.
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Tabla 8. Prueba de Tukey para el estado de huevos
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a: Usa el tamaño muestral de la media armónica = 14.000. Tabla 9. ANOVA de un factor para el estado de huevos
HUEVOS Suma de cuadrados
gl
Media cuadrática F Sig.
Inter-grupos 52.286 21 2.490 1.857 0.014
Intra-grupos 383.429 286 1.341
Total 435.714 307
HUEVOS (H)
Subconjunto para alfa =0.05
Extracto
N 1 2 HSD de Tukeya 128.00 14 0.429
127.00 14 0.500 133.00 14 0.500 135.00 14 0.500 140.00 14 0.500 126.00 14 0.571 138.00 14 0.571 124.00 14 0.643 0.643 129.00 14 0.643 0.643 139.00 14 0.643 0.643 131.00 14 0.714 0.714 120.00 14 0.786 0.786 137.00 14 0.786 0.786 121.00 14 0.929 0.929 123.00 14 0.929 0.929 125.00 14 0.929 0.929 136.00 14 1.000 1.000 122.00 14 1.071 1.071 132.00 14 1.071 1.071 134.00 14 1.429 1.429 130.00 14 1.500 1.500 Control 14 2.214
Sig. .673 0.050
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6.1.2. Análisis estadístico para larvas Tabla 10. Pruebas de normalidad para el estado de larvas
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Extracto Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig. Larvas Control 0,208 14 0,103 0,861 14 0,036
120,00 0,290 14 0,002 0,806 14 0,010**
121,00 0,266 14 0,008 0,799 14 0,010** 122,00 0,364 14 0,000 0,644 14 0,010** 123,00 0,317 14 0,000 0,798 14 0,010** 124,00 0,502 14 0,000 0,435 14 0,010** 125,00 0,428 14 0,000 0,627 14 0,010** 126,00 0,383 14 0,000 0,694 14 0,010** 127,00 0,349 14 0,000 0,727 14 0,010** 129,00 0,493 14 0,000 0,407 14 0,010** 130,00 0,388 14 0,000 0,685 14 0,010** 131,00 0,364 14 0,000 0,644 14 0,010** 132,00 0,502 14 0,000 0,435 14 0,010** 133,00 0,389 14 0,000 0,688 14 0,010** 134,00 0,510 14 0,000 0,426 14 0,010** 135,00 0,466 14 0,000 0,544 14 0,010** 136,00 0,343 14 0,000 0,719 14 0,010** 137,00 0,470 14 0,000 0,531 14 0,010** 138,00 0,372 14 0,000 0,680 14 0,010** 139,00 0,410 14 0,000 0,572 14 0,010**
140,00 0,510 14 0,000 0,426 14 0,010** ** Este es un límite superior de la significación verdadera. a Corrección de la significación de Lilliefors b Larvas es una constante cuando Extracto = 128,00 y se ha desestimado. Tabla11. Prueba de Tukey para el estado de larvas
LARVAS (L)
Subconjunto para alfa =0.05
Extracto
N 1 128,00 14 0,000 140,00 14 0,143 124,00 14 0,214 132,00 14 0,214 129,00 14 0,286 134,00 14 0,286 135,00 14 0,286 125,00 14 0,357 137,00 14 0,357 133,00 14 0,429
HSD de Tukeya
130,00 14 0,500
35
138,00 14 0,571
127,00 14 0,643 121,00 14 0,714 122,00 14 0,857 131,00 14 0,857 126,00 14 0,929 139,00 14 0,929 120,00 14 1,071 Control 14 1,143 136,00 14 1,286 123,00 14 1,357
Sig. 0,087 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos a: Usa el tamaño muestral de la media armónica = 14,000. Tabla 12. ANOVA de un factor para el estado de larvas
Suma de cuadrados
gl Media cuadrática
F Sig.
Inter-grupos Intra-grupos Total
45,390 315,857 361,247
21 286 307
2,161 1,104
1,957
0,008
6.1.3. Análisis estadístico para el total de individuos Tabla 13. Pruebas de normalidad para el total de individuos
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Extracto Estadístico
gl Sig. Estadístico gl Sig.
Control 0,229 14 ,045 0,821 14 0,010**
120,00 0,236 14 0,033 0,915 14 0,251 121,00 0,183 14 0,200* 0,909 14 0,207 122,00 0,174 14 0,200* 0,895 14 0,100 123,00 0,201 14 0,131 0,925 14 0,332 124,00 0,235 14 0,035 0,838 14 0,016 125,00 0,248 14 0,019 0,845 14 0,019 126,00 0,194 14 0,159 0,849 14 0,023 127,00 0,301 14 0,001 0,746 14 0,010** 128,00 0,401 14 0,000 0,684 14 0,010** 129,00 0,166 14 0,200* 0,899 14 0,131 130,00 0,234 14 0,036 0,844 14 0,019
Total de Individuos
131,00 0,187 14 0,200* 0,855 14 0,030
36
132,00 0,240 14 0,029 0,905 14 0,178 133,00 0,217 14 0,071 0,859 14 0,034 134,00 0,273 14 0,006 0,815 14 0,010**
135,00 0,351 14 0,000 0,751 14 0,010** 136,00 0,211 14 0,092 0,856 14 0,031 137,00 0,283 14 0,003 0,799 14 0,010** 138,00 0,214 14 0,081 0,889 14 0,086 139,00 0,269 14 0,007 0,736 14 0,010** 140,00 0,362 14 0,000 0,724 14 0,010**
** Este es un límite superior de la significación verdadera. * Este es un límite inferior de la significación verdadera. a Corrección de la significación de Lilliefors Tabla 14. Estadísticos descriptivos
N Media Desviación típica Mínimo Máximo Total de Individuos 308 2,136 1,990 0,0 9,0
Extracto 308 129,5000 6,3546 119,00 140,00 Tabla 15. Prueba de Kruskal-Wallis
Extracto N Rango promedio Total de Individuos Control 14 250,75
120,00 14 187,68 121,00 14 168,71 122,00 14 178,43 123,00 14 196,89 124,00 14 123,86 125,00 14 139,46 126,00 14 152,32 127,00 14 149,82 128,00 14 90,93 129,00 14 136,14 130,00 14 187,29 131,00 14 151,79 132,00 14 161,89 133,00 14 134,75 134,00 14 182,21 135,00 14 113,71 136,00 14 177,32 137,00 14 129,79 138,00 14 142,39 139,00 14 136,07 140,00 14 106,79
Total 308
37
Tabla 16. Estadísticos de contraste
Total de Individuos Chi-cuadrado 49,201
gl 21 Sig. asintót. 0,000
a Prueba de Kruskal-Wallis b Variable de agrupación: Extracto Tabla 17. Comparaciones múltiples (Tamhane)
Intervalo de confianza al 95%
(I) Extracto
(J) Extracto
Diferencia de medias (I-J)
Error típico
Sig. Límite inferior Límite superior
Control 120,00 1,571 0,717 ,991 -1,153 4,296 121,00 2,000 0,717 ,740 -,855 4,855 122,00 1,714 0,717 ,998 -1,440 4,869 123,00 1,286 0,717 1,000 -1,826 4,398 124,00 2,929* 0,717 ,017 ,259 5,598 125,00 2,500 0,717 ,287 -,515 5,515 126,00 2,214 0,717 ,785 -1,022 5,451 127,00 2,500* 0,717 ,040 4,754E-02 4,952 128,00 3,571* 0,717 ,000 1,242 5,901 129,00 2,714* 0,717 ,025 ,162 5,267 130,00 1,500 0,717 1,000 -1,737 4,737 131,00 2,143 0,717 ,896 -1,178 5,463 132,00 2,214 0,717 ,106 -,169 4,598 133,00 2,786* 0,717 ,016 ,266 5,305 134,00 1,857 0,717 ,645 -,701 4,415 135,00 3,143* 0,717 ,005 ,532 5,754 136,00 1,357 0,717 1,000 -2,505 5,220 137,00 2,714 0,717 ,174 -,366 5,795 138,00 2,571 0,717 ,080 -,115 5,258 139,00 2,286 0,717 ,975 -1,592 6,163 140,00 3,286 0,717 ,001 ,847 5,724
* La diferencia entre las medias es significativa al nivel 0.05 Con base en los análisis realizados a los estados biológicos de huevos, larvas y total de individuos, se encontró que 7 extractos metanólicos presentaron actividad contra la broca del café (Hypothenemus hampei, Ferrari), este valor representa un 33.3% de los extractos de MeOH usados para el bioensayo, a las familias Euphorbiaceae y Asteraceae corresponde un 14.3% respectivamente y para la familia Rubiaceae un 4.7% (ver tabla 18). Los extractos que presentaron posible actividad contra la broca del café, corresponden a los extractos metanólicos de Alchornea calophylla (Euphorbiaceae), Critoniella acuminata (Asteraceae), Tilesia baccata (Asteraceae), Lepidaploa lehmannii (Asteraceae), Alchornea grandis (Euphorbiaceae), Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae) y Faramea sp
38
(Rubiaceae), debido a que estos extractos presentaron valores menores en sus medias (Tukey-H y L) comparados con el control negativo, este efecto puede observarse mejor en la prueba Tukey para los huevos, donde los valores de las medias se dividen en dos subconjuntos con grado de significancia del 0.05. Para el total de individuos, al no presentarse normalidad, se realizó un análisis no paramétrico con la varianza de Kruskal Wallis, donde por medio de la variación entre los rangos se ve una diferencia estadística notoria entre los extractos y se procedió a realizarse la prueba de Tamhane para determinar mas precisamente estas diferencias, llegando a la conclusión que las plantas mostradas en la tabla 18 son las que presentan las mayores diferencias y se soportan aún mas los resultados obtenidos con los estados biológicos de huevos y larvas. En la figura 17, se puede ver el efecto sobre el total de individuos del extracto metanólico de la planta Alchornea calophylla (UTP 128) que fue el que presentó la mayor actividad para el control de la broca del café en el tiempo. Esta planta pertenece a la familia euphorbiaceae, en la cual se ha reportado actividad contra larvas del mosquito que transmite el dengue (Aedes aegypti, Diptera: Culicidae) en algunos aceites esenciales de plantas del genero Croton como Croton zehntneri, Croton argyrophylloides, Croton nepetaefolius y Croton sonderianus (Lima et al., 2006) En esta familia se también se presentan diterpenos que poseen propiedades insecticidas; de Croton cajucara se aisló cis-dehidro-crotonin y de Croton linearis otro diterpeno tóxico para los insectos (Bittner et al., 2001).
El análisis fitoquímico de las especies vegetales activas, realizado por el GBPN (Ver tabla 6), indica que el extracto metanólico en la planta Alchornea calophylla, los agentes responsables de la actividad contra la broca del café son esteroles, triterpenos, fenoles, flavonoides y taninos, lo cual indica que la actividad contra la broca del café puede justificarse con la presencia de este tipo de metabolitos.
Figura 17. Individuos presentes el extracto metanólico activo de Alchornea calophylla (UTP 128-Rep 1).
Extracto 128 MeOH
0
0,5
11,5
2
2,5
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (Días)
To
tal
Total deindividuos
39
Tabla 18. Plantas con actividad contra la broca del café
En la búsqueda de agentes insecticidas botánicos para el control de la broca del café, a través de este bioensayo se encontró que solo los extractos metanólicos tuvieron efecto sobre el insecto, mientras que los extractos de diclorometano y el control negativo no presentaron ningún efecto tóxico sobre la broca del café que pudiera causar su muerte o una acción de repelencia, permitiendo que la broca penetrara todos los granos de café y completara su ciclo biológico en los 40 días de duración del ensayo. El efecto de inactividad puede observarse en la figura 18.
Figura 18. Individuos presentes el extracto inactivo de diclorometano de Alchornea calophylla (UTP 128-Rep 1).
Voucher FJR Familia
Nombre científico
Nº de plantas recolectadas
% actividad insecticida
3968
Critoniella acuminata
3976 Lepidaploa lehmannii
3974
ASTERACEAE
Tilesia baccata
8 14.3
3969 Alchornea calophylla
3967 Acalypha diversifolia
3982
EUPHORBIACEAE
Alchornea grandis
4 14.3
3979 RUBIACEAE Faramea sp 2 4.7
Extracto 128 Diclorometano
0
2
4
6
8
10
12
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (Días)
To
tal
Total individuos
40
Teniendo en cuenta que el ciclo biológico de la broca se extendió por efectos ambientales o secundarios del solvente en que se disolvieron los extractos metanólicos (EtOH 1%), se determinó el porcentaje de perforación de los granos de café, ya que en los 40 días se mantuvo la población inicial de 1 adulta de broca o cero si esta murió posiblemente por el efecto del extracto (ver figura 19). Figura 19. Porcentaje de perforación de los granos de café en cada extracto metanólico evaluado. En la figura 19 se puede observar que el extracto 128 presentó la mínima perforación con tan solo un 36%, aportando mas certeza a los resultados estadísticos donde el extracto MeOH 128 estuvo en los primeros lugares con los valores mas bajos. En la figura 20 se puede observar el efecto de un extracto metanólico activo, que causó la muerte de la broca del café, contrastado con la figura 21 donde un extracto inactivo permitió que la broca perforara y penetrara el grano de café para reproducirse en su interior.
Figura 20. Acción sobre la broca del café de un extracto metanólico activo (muerte del insecto).
% Perforacion
020406080
100120
120
122
124
126
128
130
132
134
136
138
140
Nº Extracto
Por
cent
aje
% Perforacion
Control (-)
41
Figura 21. Acción sobre la broca del café de un extracto inactivo (desarrollo del ciclo biológico).
42
7. CONCLUSIONES
� Once extractos metanólicos presentaron compuestos bioactivos contra la broca del café.
� La fuerte actividad biológica en los extractos metanólicos podría
explicarse por la presencia de esteroles, triterpenos, saponinas, fenoles, flavonoides o taninos.
� Los extractos de diclorometano fueron inocuos, permitiendo a la broca
del café la perforación del grano y el desarrollo completo del ciclo biológico en su interior.
� Al encontrar actividad insecticida en once plantas, se puede inferir el
potencial que tiene la Reserva Natural Bremen-La Popa para aportar beneficios en el control de la broca del café
43
11. RECOMENDACIONES
� Se propone realizar la separación e identificación de los metabolitos
secundarios de los extractos metanólicos que presentaron mayor actividad contra la broca del café.
� Efectuar evaluaciones in vivo de los extractos activos.
� Continuar los estudios de actividad contra la broca del café de las
plantas de la flora regional.
44
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48
ANEXOS
49
Anexo 1. Preparación de 800 mL de dieta artificial Cenibroca D-200.
Transferir a un erlenmeyer 800 mL de agua
Adicionar 22.4 g de Agar
Calentar hasta disolución
Esterilizar la mezcla por 20 minutos Adicionar 106.06 g de café molido estéril
Adicionar 14.9 g de sacarosa
Adicionar 21.4 g de caseína Adicionar 21.4 g de levadura torula
Adicionar 0.85 g de benzoato de sodio Adicionar 1.06 g de Nipagin Adicionar 0.64 g de colesterol Adicionar 1.3 g de ácido ascórbico
Adicionar 2.14 g de Sales de Wesson Adicionar 2.4 mL de derosal Adicionar 10.36 mL de etanol Adicionar 2.3 mL de formaldehído 37 % Licuar los ingredientes hasta completa homogenización, teniendo el vaso, la tapa y la cuchilla de la licuadora previamente esterilizados
Realizar la infestación con brocas adultas recién emergidas, previamente desinfectadas
Servir en una bandeja y poner en la estufa por 48 horas a 50ºC
Servir en cajas petri esterilizadas y dejar en cabina de flujo laminar por 24 horas para que seque
completamente.
50
Anexo 2. Datos obtenidos en las revisiones de los bioensayos
Extractos metanólicos
Extracto Rep t H L P C A T 120 1 4 0 0 0 0 0 0 120 1 8 0 0 0 0 1 1 120 1 12 1 0 0 0 1 2 120 1 16 0 2 0 0 1 3 120 1 20 1 4 0 0 1 6 120 1 24 0 3 0 0 1 4 120 1 28 2 0 0 0 1 3 120 2 4 5 0 0 0 1 6 120 2 8 0 0 0 0 1 1 120 2 12 1 0 0 0 1 2 120 2 16 1 1 0 0 1 3 120 2 20 0 2 0 0 1 3 120 2 24 0 2 0 0 1 3 120 2 28 0 1 0 0 1 2 121 1 4 1 1 0 0 1 3 121 1 8 0 0 0 0 0 0 121 1 12 0 1 0 0 1 2 121 1 16 5 0 0 0 1 6 121 1 20 0 0 0 0 0 0 121 1 24 0 0 0 0 0 0 121 1 28 0 0 0 0 0 0 121 2 4 3 0 0 0 1 4 121 2 8 1 2 0 0 1 4 121 2 12 2 1 0 0 1 4 121 2 16 1 1 0 0 1 3 121 2 20 0 1 0 0 1 2 121 2 24 0 2 0 0 1 3 121 2 28 0 1 0 0 1 2 122 1 4 0 0 0 0 0 0 122 1 8 0 0 0 0 1 1 122 1 12 2 0 0 0 1 3 122 1 16 0 4 0 0 1 5 122 1 20 0 4 0 0 1 5 122 1 24 0 2 0 0 1 3 122 1 28 0 0 0 0 0 0 122 2 4 5 0 0 0 1 6 122 2 8 1 0 0 0 1 2 122 2 12 1 1 0 0 1 3 122 2 16 4 0 0 0 1 5 122 2 20 0 0 0 0 0 0 122 2 24 0 0 0 0 0 0
Rep= repetición t= tiempo (Días) H= huevos L= larvas P= pupas C= carmelitas A= adultos
51
122 2 28 2 1 0 0 1 4 123 1 4 0 0 0 0 0 0 123 1 8 2 4 0 0 1 7 123 1 12 2 0 0 0 1 3 123 1 16 0 2 0 0 1 3 123 1 20 0 0 0 0 0 0 123 1 24 0 2 0 0 1 3 123 1 28 2 3 0 0 1 6 123 2 4 3 0 0 0 1 4 123 2 8 1 0 0 0 1 2 123 2 12 2 0 0 0 1 3 123 2 16 0 3 0 0 1 4 123 2 20 1 3 0 0 1 5 123 2 24 0 2 0 0 1 3 123 2 28 0 0 0 0 0 0 124 1 4 0 0 0 0 1 1 124 1 8 2 0 0 0 1 3 124 1 12 0 0 0 0 0 0 124 1 16 0 0 0 0 0 0 124 1 20 0 0 0 0 0 0 124 1 24 0 0 0 0 0 0 124 1 28 0 0 0 0 0 0 124 2 4 4 0 0 0 1 5 124 2 8 0 0 0 0 1 1 124 2 12 0 0 0 0 0 0 124 2 16 0 1 0 0 1 2 124 2 20 1 0 0 0 1 2 124 2 24 1 0 0 0 1 2 124 2 28 1 2 0 0 1 4 125 1 4 2 0 0 0 1 3 125 1 8 0 0 0 0 0 0 125 1 12 0 0 0 0 0 0 125 1 16 0 1 0 0 1 2 125 1 20 0 0 0 0 0 0 125 1 24 0 0 0 0 0 0 125 1 28 0 0 0 0 0 0 125 2 4 5 0 0 0 1 6 125 2 8 4 0 0 0 1 5 125 2 12 0 0 0 0 0 0 125 2 16 1 2 0 0 1 4 125 2 20 1 0 0 0 1 2 125 2 24 0 1 0 0 1 2 125 2 28 0 1 0 0 1 2 126 1 4 0 0 0 0 1 1 126 1 8 0 0 0 0 1 1 126 1 12 0 0 0 0 0 0 126 1 16 2 3 0 0 1 6 126 1 20 2 3 0 0 1 6
52
126 1 24 0 4 0 0 1 5 126 1 28 0 2 0 0 1 3 126 2 4 2 0 0 0 1 3 126 2 8 1 0 0 0 1 2 126 2 12 0 0 0 0 0 0 126 2 16 0 0 0 0 0 0 126 2 20 1 1 0 0 1 3 126 2 24 0 0 0 0 0 0 126 2 28 0 0 0 0 0 0 127 1 4 0 0 0 0 1 1 127 1 8 1 0 0 0 1 2 127 1 12 0 0 0 0 0 0 127 1 16 0 0 0 0 0 0 127 1 20 0 2 0 0 1 3 127 1 24 0 0 0 0 0 0 127 1 28 0 0 0 0 0 0 127 2 4 1 0 0 0 1 2 127 2 8 2 0 0 0 1 3 127 2 12 1 1 0 0 1 3 127 2 16 0 2 0 0 1 3 127 2 20 1 1 0 0 1 3 127 2 24 0 2 0 0 1 3 127 2 28 1 1 0 0 1 3 128 1 4 1 0 0 0 1 2 128 1 8 0 0 0 0 0 0 128 1 12 0 0 0 0 0 0 128 1 16 0 0 0 0 0 0 128 1 20 0 0 0 0 0 0 128 1 24 0 0 0 0 0 0 128 1 28 0 0 0 0 0 0 128 2 4 2 0 0 0 1 3 128 2 8 0 0 0 0 0 0 128 2 12 1 0 0 0 1 2 128 2 16 1 0 0 0 1 2 128 2 20 0 0 0 0 0 0 128 2 24 0 0 0 0 0 0 128 2 28 1 0 0 0 1 2 129 1 4 0 0 0 0 1 1 129 1 8 0 0 0 0 1 1 129 1 12 0 0 0 0 0 0 129 1 16 0 0 0 0 0 0 129 1 20 1 0 0 0 1 2 129 1 24 1 0 0 0 1 2 129 1 28 0 0 0 0 1 1 129 2 4 1 0 0 0 1 2 129 2 8 2 0 0 0 1 3 129 2 12 2 0 0 0 1 3 129 2 16 0 0 0 0 0 0
53
129 2 20 1 3 0 0 1 5 129 2 24 1 1 0 0 1 3 129 2 28 0 0 0 0 0 0 130 1 4 0 0 0 0 1 1 130 1 8 8 0 0 0 1 9 130 1 12 2 0 0 0 1 3 130 1 16 0 2 0 0 1 3 130 1 20 2 0 0 0 1 3 130 1 24 0 2 0 0 1 3 130 1 28 2 1 0 0 1 4 130 2 4 0 0 0 0 1 1 130 2 8 0 0 0 0 0 0 130 2 12 2 0 0 0 1 3 130 2 16 2 1 0 0 1 4 130 2 20 1 0 0 0 1 2 130 2 24 0 0 0 0 0 0 130 2 28 2 1 0 0 1 4 131 1 4 0 0 0 0 0 0 131 1 8 0 0 0 0 0 0 131 1 12 0 2 0 0 1 3 131 1 16 0 1 0 0 1 2 131 1 20 3 4 0 0 1 8 131 1 24 0 4 0 0 1 5 131 1 28 0 0 0 0 0 0 131 2 4 3 0 0 0 1 4 131 2 8 2 0 0 0 1 3 131 2 12 0 0 0 0 0 0 131 2 16 0 0 0 0 0 0 131 2 20 1 0 0 0 1 2 131 2 24 0 1 0 0 1 2 131 2 28 1 0 0 0 1 2 132 1 4 1 0 0 0 1 2 132 1 8 1 0 0 0 1 2 132 1 12 1 0 0 0 1 2 132 1 16 1 0 0 0 1 2 132 1 20 3 0 0 0 1 4 132 1 24 3 0 0 0 1 4 132 1 28 0 0 0 0 0 0 132 2 4 2 0 0 0 1 3 132 2 8 0 0 0 0 1 1 132 2 12 0 0 0 0 0 0 132 2 16 1 1 0 0 1 3 132 2 20 0 2 0 0 1 3 132 2 24 1 0 0 0 1 2 132 2 28 1 0 0 0 1 2 133 1 4 0 0 0 0 1 1 133 1 8 0 0 0 0 1 1 133 1 12 0 0 0 0 0 0
54
133 1 16 0 0 0 0 0 0 133 1 20 2 0 0 0 1 3 133 1 24 2 0 0 0 1 3 133 1 28 0 0 0 0 0 0 133 2 4 0 0 0 0 0 0 133 2 8 1 2 0 0 1 4 133 2 12 0 1 0 0 1 2 133 2 16 1 1 0 0 1 3 133 2 20 0 0 0 0 0 0 133 2 24 0 1 0 0 1 2 133 2 28 1 1 0 0 1 3 134 1 4 3 0 0 0 1 4 134 1 8 3 0 0 0 1 4 134 1 12 3 0 0 0 1 4 134 1 16 0 0 0 0 0 0 134 1 20 0 0 0 0 0 0 134 1 24 2 0 0 0 1 3 134 1 28 2 0 0 0 1 3 134 2 4 2 0 0 0 1 3 134 2 8 1 0 0 0 1 2 134 2 12 2 0 0 0 1 3 134 2 16 0 0 0 0 0 0 134 2 20 1 2 0 0 1 4 134 2 24 0 2 0 0 1 3 134 2 28 1 0 0 0 1 2 135 1 4 0 0 0 0 0 0 135 1 8 0 0 0 0 0 0 135 1 12 0 0 0 0 0 0 135 1 16 0 0 0 0 0 0 135 1 20 0 0 0 0 0 0 135 1 24 0 0 0 0 0 0 135 1 28 0 0 0 0 0 0 135 2 4 0 0 0 0 0 0 135 2 8 1 0 0 0 1 2 135 2 12 2 0 0 0 1 3 135 2 16 0 1 0 0 1 2 135 2 20 1 2 0 0 1 4 135 2 24 1 0 0 0 1 2 135 2 28 2 1 0 0 1 4 136 1 4 0 0 0 0 0 0 136 1 8 0 0 0 0 0 0 136 1 12 3 0 0 0 1 4 136 1 16 3 2 0 0 1 6 136 1 20 2 4 0 0 1 7 136 1 24 2 4 0 0 1 7 136 1 28 2 4 0 0 1 7 136 2 4 1 0 0 0 1 2 136 2 8 0 0 0 0 1 1
55
136 2 12 0 0 0 0 0 0 136 2 16 1 0 0 0 1 2 136 2 20 0 1 0 0 1 2 136 2 24 0 3 0 0 1 4 136 2 28 0 0 0 0 0 0 137 1 4 0 0 0 0 0 0 137 1 8 0 0 0 0 0 0 137 1 12 0 0 0 0 1 1 137 1 16 0 0 0 0 0 0 137 1 20 0 0 0 0 0 0 137 1 24 3 2 0 0 1 6 137 1 28 2 0 0 0 1 3 137 2 4 1 0 0 0 1 2 137 2 8 4 0 0 0 1 5 137 2 12 0 0 0 0 0 0 137 2 16 0 0 0 0 0 0 137 2 20 0 0 0 0 0 0 137 2 24 0 1 0 0 1 2 137 2 28 1 2 0 0 1 4 138 1 4 2 0 0 0 1 3 138 1 8 2 0 0 0 1 3 138 1 12 0 0 0 0 0 0 138 1 16 0 0 0 0 0 0 138 1 20 0 0 0 0 0 0 138 1 24 0 0 0 0 0 0 138 1 28 0 0 0 0 0 0 138 2 4 0 0 0 0 1 1 138 2 8 1 0 0 0 1 2 138 2 12 0 2 0 0 1 3 138 2 16 2 1 0 0 1 4 138 2 20 1 3 0 0 1 5 138 2 24 0 1 0 0 1 2 138 2 28 0 1 0 0 1 2 139 1 4 0 0 0 0 0 0 139 1 8 1 0 0 0 1 2 139 1 12 0 0 0 0 0 0 139 1 16 0 0 0 0 0 0 139 1 20 2 5 0 0 1 8 139 1 24 2 5 0 0 1 8 139 1 28 0 0 0 0 0 0 139 2 4 0 0 0 0 0 0 139 2 8 2 0 0 0 1 3 139 2 12 1 1 0 0 1 3 139 2 16 0 0 0 0 0 0 139 2 20 1 0 0 0 1 2 139 2 24 0 2 0 0 1 3 139 2 28 0 0 0 0 0 0
56
140 1 4 0 0 0 0 0 0 140 1 8 0 0 0 0 0 0 140 1 12 0 0 0 0 0 0 140 1 16 1 1 0 0 1 3 140 1 20 0 0 0 0 0 0 140 1 24 0 0 0 0 0 0 140 1 28 0 0 0 0 0 0 140 2 4 1 0 0 0 1 2 140 2 8 0 0 0 0 0 0 140 2 12 2 0 0 0 1 3 140 2 16 1 0 0 0 1 2 140 2 20 1 0 0 0 1 2 140 2 24 0 0 0 0 0 0 140 2 28 1 1 0 0 1 3
Negativo 1 4 3 0 0 0 1 4 Negativo 1 8 2 0 0 0 1 3 Negativo 1 12 0 2 0 0 1 3 Negativo 1 16 4 3 0 0 1 8 Negativo 1 20 4 2 0 0 1 7 Negativo 1 24 1 2 0 0 1 4 Negativo 1 28 2 1 0 0 1 4 Negativo 2 4 2 0 0 0 1 3 Negativo 2 8 2 0 0 0 1 3 Negativo 2 12 3 1 0 0 1 5 Negativo 2 16 2 0 0 0 1 3 Negativo 2 20 3 1 0 0 1 5 Negativo 2 24 1 1 0 0 1 3 Negativo 2 28 2 3 0 0 1 6