Biol.Mar. Edgar Cruz Acevedo.

M.C. Belisario Leyva

IBQ. Sarahi Roos Muñoz

IBQ. Jesús Efrén Astorga Rodríguez

Materia Ecotoxicología

Dra. Luz María García de la Parra

[1 de Diciembre del 2010]

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ACETILCOLINESTERASA EN CAMARÓN BLANCO (Litopenaeus vannamei)

EXPUESTO A DIAZINÓN

INTRODUCCIÓN

Los plaguicidas organofosforados han sido de amplio uso, primero con fines

bélicos durante la segunda guerra mundial (década de los 1940`s) y

posteriormente en la agricultura para el control de plagas. Bajo esta denominación

se incluyen más de 250 sustancias empleadas como plaguicidas (insecticidas,

nematicidas, fungicidas y herbicidas) (Osuna et al., 1997; Tuler y Bowen, 1989).

Los organofosforados son esteres del Ácido Fosfórico (unión de un Ácido y un

Alcohol) o Tiofosfórico (por la sustitución, en un ácido, de un átomo de oxígeno por

otro de azufre), y dependiendo de la sustitución de sus radicales en la fórmula

básica pueden dar origen a diferentes grupos de compuestos, los que de acuerdo

a su naturaleza tienen particulares grados de penetración, distribución, activación

y/o degradación, con variaciones en el nivel de efecto debido a la variación de

selectividad y potencialidad (Badii y Varela, 2008). A diferencia de los

organoclorados, los plaguicidas organofosforados presentan bajos factores de

bioacumulación y lipoficilidad, además de un alto grado de degradación en el

medio (Badii y Varela, 2008; Henao y Nieto, 2006).

Un organofosforado muy utilizado en la agricultura es el Diazinón, el cual es un

insecticida de contacto e ingestión, usado para el combate de plagas que atacan

el follaje de los cultivos o para el control de estas en el hogar (moscas, chinches,

arañas y otros), ver anexo 1. Este compuesto no se encuentra normalmente en la

naturaleza y su liberación al ambiente únicamente se da por desechos de origen

antropogénico.

El Diazinón está ubicado en el lugar 25 de los 1699 productos químicos

propuestos para su inclusión en la lista prioritaria de la Environmental Protection

Agency (EPA) de los Estados Unidos de América (EUA), la cual recomienda una

concentración máxima de 20 g (Diazinón)/L de agua en el ambiente. Debido a su

poca persistencia en el ambiente y la mínima bioacumulación, los casos

documentados de intoxicación han sido por exposiciones agudas a altas

concentraciones de éste compuesto o su principal metabolito, el Diazoxón

(ATSDR, 2010).

La Acetilcolina (ACh) es un neurotransmisor específico en las sinapsis del sistema

nervioso somático (SNS) y en las sinapsis ganglionares del sistema nervioso

autonomo (SNA), y su acción se refleja en la producción de movimientos y/o

reacciones. Cuando la estimulación para la transmisión de señales mediadas por

la ACh es cesada, la enzima Acetilcolinesterasa (AChE), que se encuentra en la

membrana postsináptica, ejerce acción sobre la ACh, catalizando su hidrólisis a

Colina y Acetato, los que a su vez son reincorporados a la síntesis de una nueva

ACh (Badii y Varela, 2008).

Los plaguicidas organofosforados han sido ampliamente documentados como

agentes anticolinesterásicos, inhibiendo la unión de la ACh con la AchE,

generando un aumento de ACh en el medio. La acumulación excesiva de ACh y la

disminución de los impulsos nerviosos provocan en los organismos una

estimulación inicial de los receptores muscarinicos (tipo predominante de receptor

colinérgico en el cerebro, donde son involucrados principalmente en la memoria y

aprendizaje) y una posterior parálisis en la transmisión de impulsos, provocando

una sobreestimulación y posterior depresión del SNC (Basack et al., 1998; Badii y

Varela, 2008).

Los invertebrados acuáticos (principalmente moluscos bivalvos y crustáceos) son

ampliamente utilizados como bioindicadores en el estudio de los efectos

provocados por compuestos organofosforados sobre la inhibición de esterasas,

esto debido principalmente a que son filtradores de grandes volúmenes de agua

(por respiración y/o alimentación), pudiendo acumular grandes cantidades de

contaminantes, además que muestran una alta sensibilidad en la actividad de la

AChE, Carboxilesterasa (CAE) y Butirilesterasa (BChE) expuestos a

organofosforados (Basack et al., 1998; Thompson, 1999). Estudios con camarones

han demostrado que los organofosforados tienen una toxicidad de

aproximadamente 1000 veces mayor en la inhibición de AChE para estos

organismos que otro tipo de plaguicidas (Couch, 1979).

En la medición de los efectos de Organofosforados en la actividad de la AChE se

utiliza la reacción de Ellman (Esquema 1), la cual emplea el sustrato análogo

Acetiltiocolina; la liberación de tiocolina por la acción de la enzima es medida por

la reacción con el Ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) para formar el anión

de Ácido tionitrobenzoico, dando como resultado un color amarillo. Esta reacción

de color se mide espectrofotométricamente y la actividad de AChE se obtiene

relacionando los cambios de la absorbancia de las muestras con la actividad

específica/minuto/mg de proteína total (Ellman et al., 1961; Zúñiga-Lagunes,

2006):

Yoduro de Acetilcolina Tiocolina + Acetato

Tiocolina + DTNB Ácido tionitrobenzoico (Color amarillo)

AChE

Esquema 1. Reacción de Ellman para la medición de actividad de Acetilcolinesterasa

(AChE) (Zúñiga-Lagunes, 2006).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material

Jeringas de tuberculina de 1 mL.

Jeringas de insulina de 0.5 mL.

Agujas de 29G x 13 mm y de 25G x 16 mm.

Equipo de disección.

Homogenizador POLYTRON Modelo PT-1300D.

Micropipetas de 10, 100, 200 y 1000 L.

Tubos eppendorf de 1.5 mL.

Centrifuga Refrigerada marca Heraues.

Microplaca de 96 pozos.

Lector de microplaca: Multiskan Ascent V1.22.

Reactivos

Fosfato monobásico de Sodio (Na2HPO4).

Agua desionizada.

Fosfato de dibásico de Potasio (KH2PO4).

Ácido Etilendiaminotetraacético (EDTA), como anticoagulante.

Yoduro de acetilcolina.

Preparación de soluciones

Buffer de Fosfatos Salino (PBS) 50 mM: Se disolvieron 7.584 g de Na2HPO4 en

100 mL de agua desionizada y 1.8 g de KH2PO4 en 100 mL de agua desionizada y

se mezclaron ambas soluciones y se aforaron a 1000 mL (preparado en una

proporción aproximada de 80% Na2HPO4 y 20% KH2PO4), se ajustó el pH a 7.4.

Esta solución es estable por varios meses (tomamos una solución previamente

preparada).

5,5 ditiobis – 2 – nitrobenzoico (DTNB) 270 μM: Se disolvieron 0.0107 g de DTNB

en 100 mL de buffer fosfatos 50 mM en frasco ámbar y se mantuvo a 4°C. Esta

solución permanece estable por 4 semanas.

Acetiltiocolina 3 mM: Se disolvieron 0.0215 g de yoduro de acetiltiocolina en 25 mL

de agua desionizada en frasco ámbar. Esta solución se preparó al momento de la

evaluación y se mantuvo en frío.

Organismos

5 – Litopenaeus vannamei (4 juveniles y 1 adulto)

Condiciones de los organismos en cautiverio:

Temperatura ambiente.

Oxigenación constante.

Fotoperíodo artificial de 12 hr de luz y 12 hr oscuridad.

Recirculación de agua continua.

Alimentación: 2 veces al día.

Retiro de heces y restos de alimento: Diario.

Tratamiento

Como organismos control se tomaron 2 camarones juveniles y 1 adulto, los cuales

no fueron inyectados, y como organismos tratados fueron tomados 2 camarones

juveniles a los que se les inyectó una concentración de diazinón de 322.25 g/mL

en PBS, y se dejo transcurrir aproximadamente 1 hora de exposición.

Transcurrido el tiempo, tanto a los camarones controles como los tratados se les

extrajo 100 L de hemolinfa con una jeringa de tuberculina (la jeringa contenía

previamente 100 L de anticoagulante EDTA), y la hemolinfa fue colocada en

tubos eppendorf (retirando la aguja para no dañar a los hemocitos), todos los

tubos se mantuvieron en hielo, así como también los camarones de los cuales se

tomó hemolinfa.

Preparación de la muestra

A) Disección del músculo y ojo.

Se diseco los ojos y parte del músculo de camarón blanco (Litopenameus

vannamei).

1. Los tejidos disecados de los organismos (máximo 0.15 g para evitar el rebose del tubo al momento de homogenizar), se colocó en tubo eppendorf de 1.5 mL y posteriormente se homogenizó con el buffer de homogenización en una relación inicial de 1:5 (1 g tejido en 5 mL de buffer de homogenización; manteniendo el tubo eppendorf con la muestra en hielo) con el homogenizador por aproximadamente 2 min. 2. Se llevó el homogenizado a una relación de aproximadamente 1:10 adicionando más buffer de homogenización esto fue con el fin de solubilizar las proteínas. 3. Se centrifugó el homogenizado a 8500 rpm por 10 min a 4°C. 4. Se separó el sobrenadante en un tubo limpio y se mantuvo en frío hasta su análisis. 5. En una alicuota del sobrenadante, se determinó la concentración de proteínas totales del tejido centrifugado de acuerdo al procedimiento de Bradford, efectuando una dilución adicional de 1:10 con buffer PBS 50 mM. 6. La evaluación de esterasas de los tejidos se efectuó en el sobrenadante (ver punto 4).

B) Hemolinfa

1. La hemolinfa se obtuvo como se indica en el “Tratamiento” (explicado arriba), fue centrifugada a 8500 r.p.m. por 10 min a 4 °C, para separar los hemocitos.

2. Se separó el sobrenadante en un tubo eppendorf y se mantuvo en frío hasta su análisis.

3. En una alícuota del sobrenadante (plasma), se determino la concentración de

proteínas totales de acuerdo al procedimiento de Bradford. Se tomó 10 l del sobrenadante y se diluyó con buffer fosfatos 50 mM en una relación de 1:10 y se realizó la prueba de manera directa en la submuestra. 4. La evaluación de esterasas se efectuó directamente en el plasma de la hemolinfa (punto 2). Medición de la actividad de Esterasas. AchE en músculo, ojo y hemolinfa.

1. Se inició el programa de Microplate Manager para el lector de microplaca.

2. Se abrió la plantilla de Esterasas-AchE del archivo de protocolos y se

configuró al número de muestras a leer.

3. Se prepararon las celdas para el blanco adicionando 25 L de buffer PBS (blanco), por triplicado.

4. Se colocaron 25 L del sobrenadante de cada una de las muestras homogenizadas en los pozos de la microplaca, por triplicado (Esquema 2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A HC1 HC2 HC3 OC1 OC2 OC3 TC1 TC2 TC3 Bco

B HC1 HC2 HC3 OC1 OC2 OC3 TC1 TC2 TC3 Bco

C HC1 HC2 HC3 OC1 OC2 OC3 TC1 TC2 TC3 Bco

D

E O1 O2 T1 T2 H1 H2

F O1 O2 T1 T2 H1 H2

G O1 O2 T1 T2 H1 H2

H: Hemolinfa C: Control O: Ojo T: Tejido Bco: Blanco

Esquema 2. Ubicación de controles y tratados en la microplaca.

5. Se adicionaron 150L de DTNB en todos los pozos con micropipeta múltiple (Tabla 1).

6. Se adicionó a todos los pozos 50 L de la solución de acetiltiocolina, con micropipeta múltiple (Tabla 1). Se agitó por 5 segundos y se leyó a 414 nm. Se registró la absorbancia de la cinética enzimática a los 10 min.

Tabla 1. Procedimiento para la evaluación de AChE en las muestras de tejido y

hemolinfa.

Cálculos

La actividad

enzimática se

expresó como

actividad

específica/minuto

/mg de proteína

total (nmoles

/min/mg proteína).

Actividad de Esterasas = A/min x 9 x 106 nmoles = nmoles/min/mg Prot.

13.6x103 X Pp X mg prot.

A = Cambio de la absorbancia por minuto (muestra – blanco).

9 = Volumen total ensayado/ Volumen de la muestra (225L/25L).

13.6 x103 = Coeficiente de extinción molar () para el ácido tio-nitrobenzoico.

mg proteína = Concentración de proteína total mg/ml en la hemolinfa o extracto del tejido ensayado.

Pp = Profundidad del volumen total trabajado en el pozo de la microplaca (0.802 cm).

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS (MÉTODO DE BRADFORD)

Reactivos

Blanco Muestra

Muestra de tejido

homogenizado 25 l

DTNB 270 M 150 l 150 l

Buffer PBS 50mM 25 l

Acetiltiocolina 3mM 50 l 50 l

Se leyó a 414 nm por 5 min a 25°C

A) Solución Albumina suero bovino (BSA) 1 mg/mL:

Pesar 10 mg de BSA, disolverlo en 10 mL de agua destilada. Para realizar la curva

estándar se hace una dilución 1:1 de la solución anterior (100 µL de BSA en

100µL H2O).

B) Solución Bradford:

Preparar el reactivo utilizando una relación 1:4 (BIORAD: agua) tomando en

cuenta la cantidad de muestras a analizar y las concentraciones de la curva, así

como también el número de réplicas.

*Nota: ambos reactivos se prepararon el día en que se realizó la lectura, debido a

que deben permanecer en fresco y el reactivo de Bradford debe mantenerse en la

oscuridad.

Procedimiento:

Primeramente se comenzó a llenar la placa con las diferentes

concentraciones de la curva patrón, tal como se muestra en el esquema 2.

Tabla 2. Procedimiento para la evaluación de la curva de proteínas en las

muestras de tejido y hemolinfa.

0

mg/mL

0.1

mg/mL

0.2

mg/mL

0.3

mg/mL

0.4

mg/mL

0.5

mg/mL

BSA diluido (L) 0 2 4 6 8 10

H2O (L) 10 8 6 4 2 0

Biorad Dil (L) 200 200 200 200 200 200

Volumen final (µL) 210 210 210 210 210 210

Posteriormente, se vertieron en la placa 10 µL de muestra. Tanto las

muestras como la curva se hicieron por triplicado.

Una vez llena la placa, se agregaron 200 µL de solución Bradford a todas las

celdas, y se dejó reposar 15 minutos para que se llevara a cabo la reacción.

Posteriormente, se leyó la absorbancia a 595 nm en un lector de placas Multiskan

Ascent V1.22.

Cálculos

Los valores de absorbancia de la curva de calibración fueron utilizados para

realizar una gráfica de dispersión: concentración (μm) vs absorbancia (nm) para

obtener la ecuación de la recta mediante una regresión lineal. El valor de la

pendiente fue utiliza para obtener los cálculos.

En el caso de las muestras, la concentración de la proteína se obtiene de la

siguiente ecuación:

y = mx + b (Ec. 1)

Despejando x

x = [y – b] / m (Ec. 2)

Donde:

x = concentración de proteína

y = absorbancia de la muestra

b = ordenada al origen

m = pendiente de la recta

Una vez que se obtiene la concentración de la proteína, se calcula el

promedio de las 3 réplicas de cada muestra y este valor promedio se utiliza para

los cálculos de las actividades de la acetilcolinesterasa.

La ubicación de las celdas para la curva y las muestras en la microplaca es

observada en la esquema 3.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A TC1 TC2 TC3 OC1 OC2 OC3 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

B TC1 TC2 TC3 OC1 OC2 OC3 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

C TC1 TC2 TC3 OC1 OC2 OC3 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

D

E HC1 HC2 HC3 T1 T2 O1 O2 H1 H2 Bco

F HC1 HC2 HC3 T1 T2 O1 O2 H1 H2 Bco

G HC1 HC2 HC3 T1 T2 O1 O2 H1 H2 Bco

H: Hemolinfa C: Control O: Ojo T: Tejido Bco: Blanco

Esquema 3. Ubicación de curva (de 0 a 0.5 mg/mL) y muestras en la microplaca.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Esta práctica se ha planteado ante la necesidad de conocer más ampliamente el

comportamiento de los plaguicidas organofosforados (tomando como modelo el

diazinón) sobre los organismos acuáticos, en este caso, sobre camarones del

género Penaeus sp.

En el cuadro 1 se observan los valores de absorbancia/min para los organismos

control y tratados.

Cuadro 1. Niveles de absorbancia/min para las muestras y para los organismos

controles.

Muestras Absorbancia/min (Promedio)

Hemolinfa Control 1 (HC1) 0,011

Hemolinfa Control 2 (HC2) 0,014

Hemolinfa Control 3 (HC3) 0,010

Hemolinfa 1 (H1) 0,016

Hemolinfa 2 (H2) 0,005

Ojo Control 1 (O1) 0,031

Ojo Control 2 (O2) 0,053

Ojo Control 3 (O3) 0,015

Ojo 1 (O1) 0,025

Ojo 2 (O2) 0,009

Tejido Control 1 (TC1) 0,025

Tejido Control 2 (TC2) 0,024

Tejido Control 3 (TC3) 0,009

Tejido 1 (T1) 0,014

Tejido 2 (T2) 0,019

La curva de proteínas se construyó en un rango de concentraciones de 0 a 0,5

mg/mL los resultados obtenidos son mostrados en el cuadro 2 y el esquema 4, con

esta última se cálculo la cantidad de proteína, usando la Ec. 2.

Cuadro 2. Curva de proteínas

Concentración (mg/mL)

Absorbancia/min Proteína

Nota: En algunos casos se tuvo que eliminar algunos datos que eran muy

variables para tomar valores más parecidos, sin embargo a pesar de esto el valor

del coeficiente de regresión nos dio debajo de 0.9.

0 0,3035 0,01167

0 0,3175 0,02194

0,1 0,3665 0,05791

0,1 0,2965 0,00653

0,1 0,4475 0,11737

0,2 0,5565 0,19738

0,2 0,8365 0,40292

0,2 0,5485 0,19151

0,3 0,6945 0,29868

0,3 0,6895 0,29501

0,3 0,7695 0,35373

0,4 0,7955 0,37282

0,4 0,8405 0,40585

0,4 0,9035 0,45210

0,5 0,8065 0,38089

0,5 0,9875 0,51376

0,5 0,9675 0,49908

Esquema 4. Curva estándar de proteínas.

En el cuadro 3 se observan los resultados obtenidos para la actividad de esterasa

(promedio) para cada una de las muestras (tratamientos y controles) con su

respectiva desviación estándar en cada caso, además de el porcentaje de

inhibición para cada uno de los tejidos (músculo, ojo y hemolinfa) el cuál resulta de

la comparación con el control %Inhibición = 100 – [(Actividad Esterasa del

control/Actividad esterasa del Tejido) * 100].

Muestra Actividad Esterasa promedio

(nmol/min/mg proteína)

Desviación Estándar

Porcentaje de Inhibición

Músculo Control 2,4349 0,7895 41,72

Ojo Control 5,4176 1,5491 13,64

Hemolinfa Control 0,3691 0,0531 -4,63

Músculo 1,4190 0,1420

Ojo 4,6785 0,6683

Hemolinfa 0,3862 0,3416

La figura 5 nos muestra gráficamente las variaciones existentes entre tejidos y sus

respectivos controles, se puede observar claramente que el tejido que presenta un

mayor porcentaje de inhibición de la actividad acetilcolinesterasa es el tejido

muscular, esto sin duda porque fue la principal vía de exposición del tóxico en el

organismo, y como el tiempo de exposición fue muy corto (aproximadamente 1

hora) lo más probable es que no se alla alcanzado a distribuir de una manera

uniforme en hemolinfa, motivo por el cuál no se observa una variación aparente

entre organismos control y tratados para este tejido.

Figura 5. Actividad Esterasa en Muestras y Controles.

Faltaría poner la actividad de esterasas para cada una de las

muestras, y comparar los controles con las muestras (colocar

gráfica), tengo unas fotografías no se si conciderarían en poner

un esquema del procedimiento al final, cualquier cosa la vemos

mañana, saludos!

OBSERVACIONES

El número de organismos para el ensayo fue muy bajo (3 organismos),

además dichos organismos no eran homogeneos, es decir, presentaban

tamaño variable, no fueron pesados, ni medidos, para haber cálculado la

dosis adecuada, falto inyectar con solución buffer de fosfatos (PBS) a los

organismos control.

Los valores de pH, salinidad y cantidad de oxígeno, no fueron medidos.

El tiempo al cuál fueron expuestos los organismos fue muy corto

(aproximadamente una hora).

CONCLUSIONES

La hemolinfa no tuvo inhibición de la enzima Acetilcolinesterasa.

La inhibición fue mayor en músculo, quizás porque fue el que estuvo

directamente expuesto, es decir, fue la vía principal de exposición y dado

que el tiempo de exposición fue corto no se alcanzó a ejercer el efecto en

hemolinfa porque se necesitaba mayor tiempo de exposición.

Hubo mucha variación en los resultados de la curva de proteínas, quizás

por ser la primera vez que se realizó el experimento por parte de nosotros,

algunos factores que pudieron interferir son: la falta de experiencia en el

pipeteo de las muestras, etc.

En caso de observar una anomalía es necesario volver a repetir de

preferencia todo el experimento, por cuestiones de tiempo no se hizo así.

BILIOGRAFÍA

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Potential for human exposure. Accedido el dia 29/11/2010. Enlace:

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Couch, J. 1979. Shrimps (Arthropoda: crustacea: Penaeidae). Pollution Ecology of

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L. Robledo Marenco y C. A. Romero Bañuelos. 2006. Utilización de 4-pyridine aldoxime

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Ellman G.L., D. Courteney, J. Andres y R.M. Featherstone. 1961. A new and rapid

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Osuna I., D. López, J.G. Galindo y M.C. Riva. Evaluación toxicológica de Metil-paration,

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Zúñiga-Lagunes, S. R. 2006. Evaluación de esterasas, Inhibición de Acetilcolinesterasa y

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Ecofisiología, UNAM. 10 p.

ANEXO 1: HOJA TÉCNICA DEL DIAZINÓN