evaluación de la incorporación y del contenido en nutrientes de rodofíceas como indicador del...
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Máster en Biotecnología AvanzadaUniversidad de Málaga - Universidad Internacional de Andalucía
Curso 2011/2012
Raquel Sánchez de Pedro Crespo
Málaga, 2012
Memoria del trabajo final de máster
“Evaluación de la incorporación y del contenido en nutrientes de
rodofíceas como indicador del estado ecológico de las aguas del
estuario del río Palmones y su potencial biorremediador”
UNIVERSIDAD DE MÁLAGA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE ECOLOGÍA Y GEOLOGÍA
Área de Ecología
Visado en Málaga, 2 de julio de 2012
La directora,
Fdo: Prof. Raquel Carmona FernándezProfesora Contratada Doctor de Ecología
Universidad de Málaga
Memoria presentada para optar al Máster en Biotecnología Avanzada
Fdo: Raquel Sánchez de Pedro Crespo
INDICE DE CONTENIDOS
1. Introducción
1.1 Antecedentes ......................................................................................................................3
1.2 Justificación del trabajo y objetivos .................................................................................7
2 Material y métodos
2. Material y métodos
2.1 Características biológicas de las especies estudiadas ................................................11
2.1.1 Bostrychia scorpioides (Hudson) Montagne ex Kützing ........................................11
2.1.2 Catenella caespitosa (Withering) L.M. Irvine ..........................................................12
2.2 Caracterización del área de muestreo ..........................................................................14
2.3 Toma de muestras, manipulación y mantenimiento de cultivos ...............................16
2.4 Relación entre peso fresco, peso seco, área y volumen ............................................17
2.5 Obtención de fotografías por microscopía óptica ......................................................18
2.6 Incorporación de nutrientes ............................................................................................19
2.6.1 Diseño experimental ................................................................................................. 19
2.6.2 Tasa de incorporación y parámetros cinéticos ......................................................20
2.6.3 Determinación de la actividad nitrato reductasa ..................................................23
2.7 Métodos analíticos de estimación de la composición interna ...................................23
2.7.1 Clorofila a y carotenoides totales ............................................................................23
2.7.2 Ficobiliproteínas .........................................................................................................24
2.7.3 Proteínas solubles totales .........................................................................................24
2.7.4 Carbono, nitrógeno y fósforo total .........................................................................25
2.7.5 Nitrato, nitrito y amonio interno .............................................................................25
2.8 Análisis de nutrientes en muestras de agua .................................................................26
2.9 Tratamiento estadístico de los resultados ....................................................................27
3
3. Resultados
3.1 Concentración de nutrientes en el agua del estuario ...............................................31
3.2 Incorporación de nutrientes : Nitrógeno y fósforo .....................................................31
3.2.1 Incorporación de nitrato y amonio ..........................................................................32
3.2.1.1 Variación de la concentración en el medio .....................................................32
3.2.1.2 Efecto de la especie de nitrógeno (NH4+vs. NO3
-) ...........................................36
3.2.1.3 Incorporación de nitrógeno total ..................................................................... 40
3.2.2 Incorporación de fosfato ...........................................................................................42
3.3 Efecto de las fuentes de nitrógeno sobre la composición interna ...........................44
4 a
4. Discusión
4.1 Evaluación de la capacidad de incorporación de nutrientes ......................................47
4.2 Relación entre la disponibilidad de nutrientes, las reservas internas y las cinéticas
de incorporación de N y P total .............................................................................................52
4.3 ¿Son B. scorpioides y C. caespitosa potenciales especies indicadoras de la
eutrofización del río Palmones ?............................................................................................55
5. Conclusiones ....................................................................................................................................63
6. Bibliografía ......................................................................................................................................67
Principales abreviaturas
a Coeficiente de significación estadístico
ANOVA Análisis de la varianza
B Biomasa
Cl a Clorofila a
C:N Índice carbono : nitrógeno
C:P Índice carbono : fósforo
Km Constante de semisaturación para el nutriente
M-M Michaelis Menten
N:P Índice nitrógeno : fósforo
NRA Actividad nitrato reductasa
PBP Ficobiliproteínas
PCN Punto de compensación para el nutriente
PF Peso fresco
PS Peso seco
PST Proteínas solubles totales
RPC R- Ficocianina
RPE R- Ficoeritrina
SA : V Relación superficie : área volumen
Vmax Velocidad máxima de incorporación del nutriente
1. Introducción
Introducción
1. Introducción
1.1. Antecedentes
El aumento de la eutrofización de los ecosistemas costeros y fluviales de todo el
mundo, como consecuencia de las presiones antropogénicas, ha conducido a una continua y
creciente búsqueda de buenos indicadores para el control y gestión de la calidad de las
aguas. El uso de macroalgas y fanerógamas marinas como indicadores in situ de
contaminación constituye una alternativa a los índices fisicoquímicos. Las características
inherentes a estos organismos que hacen ventajoso su uso como indicadores en la
monitorización continua de nutrientes y contaminantes son numerosas: Poseen capacidad de
respuesta a los cambios del ecosistema, cuyo análisis en términos de calidad presenta un
valor adicional (Jones et al., 1996) en relación a la disponibilidad de nutrientes para los
organismos (Lyngby, 1990); al ser sésiles son fáciles de recolectar en abundancia; su
localización permite realizar estudios antes y después de eventos contaminantes así como su
caracterización a lo largo de gradientes. Concretamente, en el marco normativo Europeo, la
directiva marco del agua (Directiva 2000/60/CE) en su Anexo V recoge el uso de macroalgas
como elementos de calidad biológica en la evaluación del estatus ecológico de las zonas
costeras (Panayotidis et al., 2004; Viana et al. 2010).
Gran parte de los indicadores con macroalgas se basan en predicciones cualitativas a
partir de cambios en la estructura y función de los ecosistemas, atendiendo a la composición
taxonómica, sensibilidad o tolerancia a los impactos, datos de abundancia, riqueza e índices
de diversidad (Niell y Pazó 1978; Orfanidis et al., 2003). Por otro lado, otros métodos
consisten en la medida de nutrientes y contaminantes en tejidos de macroalgas (Fong et al.,
1994), que puede proporcionar datos más completos a largo plazo (Lourenço et al. 2006;
Huntington y Boyer, 2008). Esta metodología aprovecha la capacidad de las macroalgas para
acumular contaminantes y nutrientes, muchos de ellos tóxicos y que en muchos casos no
pueden detectarse por técnicas analíticas (Pérez-Ruzafa, 2003), lo que minimiza las
dificultades asociadas con la obtención de muestras representativas de determinados
compuestos. Los índices más extendidos en relación con el análisis de nutrientes son el índice
C:N:P (Redfield et al., 1963), o el uso de discriminantes isotópicos (Viana et al. 2011), que
proporcionan medidas puntuales de la calidad de la materia. No obstante, el estudio
ecofisiológico de los organismos implicados es un paso previo necesario para la correcta
evaluación del potencial indicador, debido a las particularidades fisiológicas de cada especie
en concreto (Fong et al., 2001). Esta caracterización ecofisiológica implica una alta
complejidad en los procesos, que precisan de una interpretación en un entorno
multidimensional, desde análisis fisiológico a nivel celular a su comprensión ecológica a
nivel sistémico, el cual constituye el enfoque del presente trabajo.
3
Introducción
Un punto clave en la aplicación de los métodos de control y gestión de la eutrofización
existentes es la adaptación de éstos a cada ecosistema en particular. Un caso relevante es la
escasez de indicadores con macroalgas en aguas de transición, concretamente en estuarios
(Orfanidis et al., 2001), en comparación con el amplio espectro de indicadores desarrollados
para áreas costeras (Schiel et al., 2006). Este menor número de métodos de control y gestión
de la eutrofización deriva de las particularidades de este tipo de sistemas, a pesar de su alta
productividad y su papel en la amortiguación de los procesos naturales e impactos
antropogénicos que se producen en la intersección mar-tierra. Las principales limitaciones
para aplicar los métodos desarrollados para áreas costeras en estuarios se relacionan con la
existencia de amplios rangos de variabilidad ambiental (salinidad,profundidad, concentración
de nutrientes) a diferente escala temporal, lo que se manifiesta en una reducción del número
de especies capaces de habitar en ellos y en la distribución diferencial de estas a lo largo de
gradientes.
Por otro lado, las diferencias entre regiones biogeográficas hacen necesaria la
adaptación de las metodologías desarrolladas, tanto en costas como estuarios. Una muestra
de las variaciones entre diferentes ecosistemas se encuentra en las metodologías más
extendidas para macroalgas marinas como la RSL (Reduced Species List) en el Reino Unido y
la CFR (Quality of rocky bottoms) en el mar Cantábrico, el primero de ellos ajustado a las
costas Andaluzas recientemente por (Bermejo et al., 2012). En el caso de aguas de transición,
por ejemplo se ha empleado el límite de distribución de determinadas especies Fucáceas
como indicadores de calidad en estuarios británicos (Wilkinson et al. 2007). La distribución de
tales especies está limitada a estuarios atlánticos de la península Ibérica, y prácticamente
ausentes en las costas y estuarios atlánticos con mayor influencia mediterránea, como es el
caso de las aguas andaluzas (Hernández et al. 2010). Autores como Garcia de Lomas et al.
(2007) y García et al. (2009) han propuesto métodos para la evaluación de la calidad de las
aguas atlánticas andaluzas, con métodos basados en la composición, abundancia o cobertura
de hábitats de fanerógamas (métodos SISIP y AQI). Un ejemplo de ello es el estuario del río
Palmones, ámbito de estudio del presente proyecto, estuario somero de cuenca pequeña en
el cual ha sido propuesto este último método (Peralta et al. 2000). Sin embargo, en este
estuario al igual que en muchos otros, la progresiva sustitución de especies de macrófitos
perennes por macroalgas oportunistas han reducido los métodos de control de la
eutrofización a la detección de algas verdes nitrófilas y las proliferaciones asociadas a estas
(Peralta et al. 2000).
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Introducción
Las especies protagonistas de este estudio son las rodofíceas del estuario del río
Palmones, Bostrychia scorpioides (Hudson) Montagne ex Kützing y Catenella caespitosa
(Withering) L.M. Irvine, que se distribuyen en numerosos estuarios y manglares del planeta
(Peña et al., 1999; Melville y Pulkownik, 2007). Las observaciones preliminares en el estuario
del río Palmones sugieren que B. scorpioides y C. caespitosa sobreviven en el ecosistema
mientras otros organismos a lo largo de las dos últimas décadas han desaparecido. La
modificación de los aportes de nutrientes originados por la construcción de una presa en la
cuenca del río Palmones en 1987 (Clavero et al., 1997) y los impactos derivados de los
efluentes de una antigua fábrica de celulosa (Hernández et al. 2000) destacan como los
principales impactos causantes de un deterioro de la calidad de las aguas, que han sufrido un
alto proceso de eutrofización (Niell et al., 2005), y de las pérdidas de biodiversidad, como la
desaparición de la fanerógama Zostera noltii que cubría el 10% del sedimento del estuario
(Jiménez et al., 1987). En este sentido, la tolerancia a los impactos que muestran las
rodofíceas del estuario del río Palmones puede suponer una ventaja en su uso como
indicadores de la presencia o del exceso de nutrientes, lo que suscita el interés del presente
estudio.
La selección de los grupos taxonómicos o especies de macrófitos más adecuados
como indicadores del estatus ecológico de las aguas en base a estudios ecofisiológicos de
nutrientes ha ocasionado opiniones divergentes en la comunidad científica. Según Fong et al.
(2001) o Lilliesköld Sjöö y Mörk (2009), las especies del género Ulva son buenos indicadores
para la identificación de las fuentes de nitrógeno y registran los aumentos puntuales o
pulsos de nutrientes que se producen en el medio. Sin embargo, Runcie et al. (2003,
2004) critican que la limitada capacidad de almacenaje de N y P que estas especies de
crecimiento rápido presentan y las altas tasas de renovación de los mismos sólo pueden
proporcionar información sobre los nutrientes en la columna de agua a corto plazo. Estos
autores defienden el uso de especies como Catenella nipae, con menores tasas de renovación
de los nutrientes internos, que proporcionan una información más integrada en períodos de
tiempo mayores, tanto para el N como el P, de forma paralela a Melville y Pulkownik
(2006) que proponen especies de rodofíceas como Bostrychia moritziana o Bostrychia tenella
como indicadores de nutrientes en estuarios y manglares. De todo lo anterior se deduce que
el tipo de estudio y la dinámica de los nutrientes de cada ecosistema en particular
determinará la elección de la especie más apropiada, lo que requiere un conocimiento de la
dinámica de los nutrientes en el ecosistema. Por esta razón, el presente trabajo plantea
estudiar cómo las diferentes concentraciones de nutrientes afectan a la capacidad de
incorporación y acumulación de estos. Además, en ecosistemas como el estuario del río
Palmones en el que la disponibilidad de nutrientes es discontinua, existen evidencias de que
5
Introducción
algas con elevadas tasas de incorporación y rápido crecimiento poseen ventajas competitivas
frente a otras especies (Pedersen & Borum 1997), que en mayor o menor medida puede
estar relacionada con la tolerancia de estas especies a los cambios del sistema.
A nivel global, las aplicaciones de las algas han tomado un gran auge en el campo de
la biotecnología en las dos últimas décadas. Sin embargo, existen características deseables
en las macroalgas indicadoras de la calidad de aguas costeras y litorales que van más allá de
la mera monitorización y que constituyen los principios de la biotecnología ambiental y la
ficotecnología: (1) que actúen como biofiltradores de nutrientes y contaminantes, es decir,
su utilidad en la biorremediación, tanto en sistemas naturales como su inclusión en sistemas
de acuicultura cuyos efluentes pueden alterar el medio ambiente; (2) que su biomasa sea
susceptible de ser aprovechada en procesos biotecnológicos, principalmente orientado a la
obtención de productos de alto valor añadido, alimentación humana y animal, o
biofertilizantes. Un ejemplo de ello es la inclusión de macrófitos en sistemas de acuicultura
(Chopin et al. 2001; Harrison y Hurd 2001), como medida biológica de control de los
productos de desecho (nitrógeno y fósforo) de tal actividad y producción de biomasa algal,
ha supuesto a su vez una mejora para la eutrofización de zonas costeras (Fei, 2004).
Desde el punto de vista de la biorremediación se conoce la capacidad de acumulación
y detoxificación de metales que poseen las rodofíceas de estuarios de los géneros Bostrychia
y Catenella (Ospina-Alvarez & Peña, 2006; Henriques 2009). Esto sugiere que si alguna de las
especies estudiadas en este proyecto muestra alta capacidad para incorporar y almacenar
nutrientes poseerá un valor añadido al actuar como sumidero de nutrientes en un medio
eutrófico. En cuanto al interés de estas especies a nivel biotecnológico, las especies de los
géneros Bostrychia y Catenella poseen aminoácidos tipo micosporina (Karsten et al. 2000),
sustancias con propiedades antioxidantes y protectoras de alto interés comercial (Figueroa
et al. 2003), y además Catenella caespitosa constituye una fuente potencial de carragenatos
(Datta & Datta, 2004). De esta forma, el presente trabajo puede asentar las bases necesarias
para el aprovechamiento de estas especies a nivel biotecnológico en estudios futuros.
6
Introducción
1.2. Justificación del trabajo y objetivos
El presente trabajo pretende llevar a cabo el estudio ecofisiológico de dos especies
de rodofíceas de estuario, con una estructura de experimentación a multiescala, que va de lo
sistémico a lo celular en la identificación de indicadores de nutrientes en un estuario
mediterráneo: El estuario del río Palmones. Este ecosistema ha sido estudiado de modo
polifacético y profundo desde hace más de 25 años por el grupo de investigación de
Ecofisiología de Sistemas Acuáticos de la Universidad de Málaga, por lo que el estudio no
parte un conocimiento cero.
Desde el punto de vista de la gestión cabe destacar que el entorno donde se enmarca
este estudio se encuentra bajo la figura de protección de “Paraje Natural marismas del río
Palmones”, donde el uso de macrófitos como indicadores biológicos de la eutrofización que
aquí se presenta está bien definido entre los fines de investigación de su Plan de Ordenación
de los Recursos Naturales (PORN). En este sentido, la finalidad del trabajo no es únicamente
proporcionar una herramienta de control y monitorización, sino que en un sentido más
amplio pueda ser de utilidad en la gestión del hábitat, considerando su capacidad natural de
recuperación y los factores que determinan la relación entre las comunidades biológicas.
Las fluctuaciones en las concentraciones de los nutrientes a escala estacional y su
intermitente disponibilidad para las rodofíceas del estuario motivan a examinar su capacidad
de respuesta a pulsos de nutrientes tras períodos de limitación, a corto plazo y a
concentraciones reales, así como determinar en qué medida las diferentes fuentes de
nutrientes (NH4+, NO3
- y PO43-) contribuyen a su producción y supervivencia.
El objetivo principal del proyecto es determinar la capacidad de incorporación de
nutrientes de las rodofíceas B. scorpioides y C. caespitosa en la evaluación de su uso como
indicadores del grado de eutrofización y su potencial biorremediador.
Para la consecución de este objetivo se determinarán:
1) Las cinéticas de incorporación de amonio, nitrato y fosfato en concentraciones y
estequiometría reales.
2) La relación entre el contenido interno de nutrientes y las concentraciones de
nutrientes en el agua del estuario.
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2. Material y Métodos
Material y métodos
2. Material y métodos
2.1 Características biológicas de las especies estudiadas
2.1.1 Bostrychia scorpioides (Hudson) Montagne ex Kützing
Bostrychia scorpioides (Hudson) pertenece a la clase Florideophyceae, de la división
Rhodophyta, orden de las Ceramiales, en la familia Rhodomelaceae.
Morfológicamente, los talos de B. scorpioides son de color pardo oscuro a negro,
filamentosos, con ápices circinados. Posee un talo uniaxial de crecimiento acrópeto, con
ramificaciones alternas que a partir de los laterales primarios se ramifican en otros de orden
secundario (Fig. 2.1). La estructura interna del talo presenta gran número de células
pericentrales, compactas en torno a un eje central. No obstante, existen diferencias
morfológicas en especímenes de hábitats menos salinos, que suelen ser menos ramificados
(Van Reine et al., 1980).
Figura 2.1 Talos de B. scorpioides del estuario del río Palmones. a) Talo no reproductivo. b) Talo con
tetrasporangios en las zonas apicales. c) Carposporofito con cistocarpos en las zonas apicales y d)
detalle del cistocarpo con carposporas.
11
Material y métodos
Se trata de una especie subcosmopolita, mayormente distribuida en la costa oeste de
Europa, Sudáfrica, Sudamérica, en el Sur de Australia y Nueva Zelanda.
B. scorpioides se encuentra en zonas altas del intermareal estuárico sometidas a un alto
grado de emersión (Karsten, 1989; Gorostiaga et al., 2004), como es el caso del río Palmones,
así como en zonas altas del intermareal en manglares (hábitats tropicales) y también, aunque
menos frecuente, en zonas protegidas del supralitoral costero sobre rocas o sedimento.
El ciclo de vida para esta especie es del tipo “Polysiphonia ”. Se trata de una especie
dioica, encontrándose las estructuras especializadas en la función reproductora
(espermatangios y carpogonios) en individuos separados.
B. scorpioides es una especie perenne, que se encuentra presente en su hábitat durante
todo el año en las diferentes fases de su ciclo fenológico, aunque en otras especies de
estuario de su género, estacionalmente sólo quedan perennes sus estolones, a partir de los
cuales se regeneran los talos con posterioridad, lo cual ocurre como consecuencia de las
bajas temperaturas (Yarish y Edwards, 1982).
2.1.2 Catenella caespitosa (Withering) L. M. Irvine
Catenella caespitosa pertenece a la clase Florideophyceae, de la división Rhodophyta,
orden de las Gigartinales, en la familia Caulacanthaceae.
Los talos son de color rojo pardo, filiformes, más o menos aplanados o subcilíndricos.
Los filamentos están ramificados irregularmente, algunos son reptantes a modo de estolón y
otros erectos, con segmentos de tamaño inferior a un centímetro de longitud, separados por
constricciones a intervalos irregulares. La estructura del talo se compone de una médula
formada por células alargadas dispuestas libremente y otras periféricas más pequeñas, que
de forma compacta constituyen el córtex.
Es una especie subcosmopolita, ampliamente distribuida en los mares templados y
cálidos (Dixon y Irvine, 1977; Dawes y Mathieson, 2008). Aparece frecuentemente en zonas
protegidas y umbrías (Batelli, 2004), tanto en el intermareal superior de estuarios como en
zonas altas del intermareal rocoso de las costas atlánticas (Fernández y Niell, 1982; Silva et
al., 2010). Su distribución geográfica es más amplia que la de B. scorpioides, encontrándose
en otras regiones como el Mediterráneo o el mar Adriático (Batelli, 2004). Debido a la diversa
variedad de hábitats que puede ocupar, manifiesta un amplio polimorfismo, desde formas
filiformes a otras más compactas, como respuesta adaptativa a diferentes grados de
exposición. Concretamente, en zonas de estuario donde las condiciones son medias, es
posible encontrar a la vez ambas formas de crecimiento (Van Reine et al.,1983).
12
Material y métodos
El ciclo de vida para esta especie es del tipo “Polysiphonia ”. A diferencia de B.
scorpiodes, se trata de una especie monoica, en cuyo gametofito haploide se observan
ramificaciones laterales especializadas en la función reproductora (Fig. 2.2). Los
espermatangios se distinguen por su superficie rugosa respecto a las estructuras femeninas,
que presentan forma esférica y superficie lisa (Fig. 2.2). Los tetrasporangios, cuyas
tetrasporas presentan división zonal, se encuentran insertos entre las células más externas
del córtex de los talos diploides.
En cuanto a su ciclo, el carácter anual o perenne de C. caespitosa depende de la
localidad en la que se encuentre, siendo perenne en el estuario del río Palmones. Batelli
(2004) estudió la fenología de C. caespitosa en dos comunidades del la costa de Eslovenia, al
Norte del mar Adriático, en dicha localidad, C. caespitosa estuvo presente durante todo el
año, y en fase tetrasporofítica durante los meses estivales.
Figura 2.2 Talos de C. caespitosa del estuario del río Palmones. a) Talo gametofítico, en el que se
pueden observar cistocarpos. b) Talo con tetrasporangios. c) Detalle de un talo con cistocarpo (♀) y
espermatangio (♂). d) Detalle de un cistocarpo liberando carposporas.
13
Material y métodos
2.2. Caracterización del área de muestreo
Los ejemplares de B. scorpioides y C. caespitosa empleados en este trabajo se tomaron
del estuario del río Palmones (36º10'21'' N , 5º20'22''W; 30STF80), situado en la Bahía de
Algeciras (Fig 2.3), término municipal de Los Barrios (Cádiz, España). Este espacio se localiza
al final de una cuenca de pequeño tamaño (de 95 km²), de los cuales 58 hectáreas se
encuentran bajo la figura de protección de Paraje Natural por la Ley 2/1989, de 18 de julio
(BOJA núm. 60, de 27/07/1989); también es Zona de Especial Protección para las Aves y se
encuentra propuesto como Lugar de Interés Comunitario (LIC).
(36º10’ 13’’ N - 05º26’ 28’’ W)
Figura 2.3 Esquema de la situación geográfica y detalle del estuario, incluyendo la posición de la zona
de muestreo.
14
Zona de Muestreo
Material y métodos
Desde el punto de vista hidrológico, la cuenca alta al final de la cual se encuentra,
recibe precipitaciones de 800 a 1050 µM en la época lluviosa, y de 7 a 18 µM en verano
(Izquierdo, 2001). Desde 1987 sus aguas están embalsadas por la presa de Charco Redondo,
situada a 12.5 km de su nacimiento a 23 km del estuario. Según la clasificación de Pritchard
(1967), el estuario del río Palmones es de mezcla parcial, el cual intercambia aguas con la
Bahía de Algeciras, y está considerado un sistema aislado de la cuenca, con una longitud
aproximada de 3.5 km. La profundidad media en marea baja es de 1.5 m, y durante las
mareas vivas experimenta un vaciado diario con régimen lento. La amplitud de mareas es de
0.6 m a 2m, con una frecuencia de 1.67 d -1 (Izquierdo, 2001). El rango de salinidad varía entre
29 y 35 ups (Clavero et al., 1997).
B. scorpioides
Zona de mezcla
C. caespitosa
Figura 2.4 Distribución de B. scorpioides y C. caespitosa en las partes leñosas basales de un ejemplar de
Sarcocornia perennis del estuario del río Palmones.
Las muestras se recolectaron en marea baja, entre los meses de marzo de 2010 y mayo
de 2011. Se eligieron una serie de puntos de recolección distribuidos a lo largo de una franja
de un canal localizado en la parte media del estuario (Fig. 2.3), zona en la que existe mezcla
de agua de mar y de río según Izquierdo (2001).
En la localización de estudio, B. scorpioides y C. caespitosa cohabitan bajo el dosel de
vegetación de plantas halófitas, que sirve de sustrato de fijación para estas especies epífitas
situadas en los márgenes del estuario. Desde los primeros muestreos, se observó que C.
caespitosa ocupa una posición relativamente más baja y cercana al lecho del sedimento como
15
Material y métodos
muestra la figura 2.4, mientras que B. scorpioides se encontró en una franja que domina las
zonas más altas del intermareal estuárico y algo más extensa que la anterior. No obstante,
existe una franja intermedia en la que se encuentran juntas ambas especies (Fig. 2.4). La
posición que ocupan en el estuario, les permite estar protegidas de la excesiva insolación por
el efecto de dosel que ejercen las quenopodiáceas.
2.3. Toma de muestras, manipulación y mantenimiento de cultivos
Para la medida de nutrientes se tomaron muestras de agua del canal, transportándose
en frío y oscuridad al laboratorio, donde se filtraron por GF/C y se congelaron para su
posterior análisis, según los métodos que se explican en el apartado 2.8.
Las muestras de algas frescas se transportaron en recipientes de plástico, sumergidas
en agua del propio estuario y conservadas en frío. Una vez en el laboratorio, se enjuagaron
con agua de mar natural para retirar el sedimento y se limpiaron para eliminar epífitos,
epifauna y otros restos de materia orgánica.
Los cultivos de B. scorpioides y C. caespitosa se mantuvieron en cilindros de
metacrilato en luz blanca fluorescente (F-18W/54-765 SYLVANIA) a una irradiancia de 45
µmoles · m-² · s-1 (Fig. 2.5), a la cual ambas especies pueden encontrase en el estuario al
mismo tiempo. La temperatura media del agua del estuario del río Palmones en la
localización de los muestreos es de 16.9ºC±0.4 en invierno y de 23.3ºC±1.3 en verano
(Izquierdo, 2001). Dado que los experimentos se realizaron entre los meses de octubre y
marzo, la temperatura empleada en las condiciones de cultivo y experimentación fue de
15ºC ±1, próximos a esos valores de referencia. Ambas especies estuvieron expuestas a un
fotoperíodo 12:12 h luz:oscuridad, en agua de mar natural filtrada mediante filtros GF/C, a
pH 8.2, salinidad de 34 ups, y con aireación continua. El agua de mar de los cultivos se renovó
semanalmente.
Figura 2.5 Mantenimiento de los cultivos de B. scorpioides y C. caespitosa.
16
Material y métodos
2.4. Relación entre peso fresco, peso seco, área y volumen
La relación existente entre el peso fresco, peso seco y área permite expresar los
resultados en base a la variable más adecuada. La composición interna (ficobiliproteínas,
proteínas solubles totales, nutrientes internos, etc.) se expresó respecto al peso seco, ya que
representa la fracción de materia orgánica efectiva que realiza las funciones fisiológicas en
macrófitos; el peso fresco o el área se han utilizado, en cambio, en las medidas relacionadas
con la fotosíntesis.
A los talos una vez limpios y cortados se les retiró el exceso de agua y fueron pesados.
La cantidad de biomasa empleada en cada una de las 28 réplicas se encontró en el rango de
10 a 50 mg, cantidad que se empleó en la extracción de proteínas solubles totales y
pigmentos. Para la determinación del área se empleó el material fresco una vez pesado.
Mediante el uso de un escáner de superficie plana (CanoScan LiDE 25) se escaneó cada réplica
por separado junto a una escala de referencia, de forma que se obtuvo una imagen plana con
una resolución de 800 puntos por pulgada (Fig. 2.6).
Figura 2.6 Ejemplo de imagen escaneada de a) B. scorpioides y b) C. caespitosa para la determinación
del área. Escala en cm.
17
ba
Material y métodos
Las imágenes se procesaron con el software de dominio libre ImageJ 1.43 (Análisis y
procesamiento de imágenes en Java). La selección de los elementos para los que se
determinó el área se realizó por contraste de la imagen mediante el plugin “Threshold
colour” del mismo software. El área obtenida se multiplicó por dos para obtener la superficie
total, despreciando el grosor del propio talo. Una vez hallada la superficie, las muestras
frescas se secaron en una estufa a 60ºC durante 24h, tras las cuales fueron pesadas de nuevo
para la realización de la correlación PF/ PS. El índice superficie:biomasa fue de 47 cm²·gPF -1
para B. scorpioides y 116 cm²·g-1 para C. caespitosa, es decir, en C. caespitosa esta relación fue
2.5 veces mayor que en B. scorpioides. El peso seco fue de un 28.7% respecto al peso fresco
en B. scorpioides y de un 15.3% en C. caespitosa.
A partir de otras muestras, se determinó la relación SA:V, para su consideración en la
incorporación de nutrientes. El volumen de los talos se midió sumergiendo diferentes
cantidades de biomasa en una probeta graduada, hallándose una relación entre el peso freso
y el desplazamiento experimentado en la columna de agua. La relación SA:V obtenida para B.
scorpioides fue de 4.8 ± 1.3 cm-1, menor a la de C. caespitosa con un valor de 11.7 ± 1.8 cm-1.
2.5. Obtención de fotografías por microscopía óptica
Para la observación y obtención de las fotografías de la morfología de las especies
estudiadas, se utilizó un microscopio óptico de campo claro Multizoom Nikon, modelo AZ-
100, con una cámara digital Nikon Digital Sight DS-5Mc refrigerada, conectada al microscopio
(Fig 2.7) y a un ordenador (PC) donde está instalado el programa Nis-Elements diseñado para
la captación, almacenaje y tratamiento de fotografías.
Figura 2.7 Microscopio óptico utilizado en la observación de la morfología de las especies estudiadas.
Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación (SCAI), Universidad de Málaga.
18
Material y métodos
2.6 Incorporación de nutrientes
Los nutrientes para los que se han estudiado las cinéticas de incorporación en B.
scorpioides y C. caespitosa han sido el amonio, nitrato y fosfato, siendo de especial interés en
este estudio las interacciones entre las especies químicas del nitrógeno.
2.6.1 Diseño experimental
El material fresco se aclimató a las condiciones de laboratorio durante 5-6 días tras la
recogida de muestras, sin la adición de ningún nutriente al medio de cultivo ni la realización
de incubaciones previas al experimento. Sólo se emplearon talos en estado vegetativo.
La incorporación de nutrientes se estimó a partir de incubaciones con diferentes
concentraciones conocidas de amonio, nitrato o fosfato, monitorizando la variación del
sustrato en el medio cultivo a corto plazo (3h). Las concentraciones iniciales empleadas en el
experimento fueron de 5, 10, 20 y 40 µM para nitrato y amonio y de 2, 5, 10 y 20 µM para el
fosfato. Estas concentraciones se prepararon a partir de soluciones madres concentradas de
NaNO3, ClNH4 y NO3NH4 para la incorporación de nitrato, amonio y ambos de forma conjunta,
respectivamente. Para el fosfato se utilizó Na2HPO4. Las soluciones se prepararon en agua de
mar artificial (Tabla 2.1), con una salinidad de 34 ups y el pH 8.2, ajustado mediante la adición
de NaOH y HCl 1N. Para cada concentración inicial se realizaron cuatro réplicas, en cada una
de las cuales 200 mg de alga fueron incubados a 250 µmoles·m-²·s-1 de luz blanca (F-18W/54-
765 SYLVANIA), saturante para la fotosíntesis, en una placa agitadora a 100 RPM (Fig.2.8).
Tabla 2.1 Composición del agua de mar artificial empleada en los experimentos de incorporación de
nutrientes y crecimiento.
Componentes Concentración
NaCl 0.5 M
KCl 0.01 M
CaCl2 0.01 M
MgCl2 · 6H2O 7 µM
MgSO4 · 7 H2O 0.03 M
NaHCO3 2.5 µM
Los tiempos de incubación fueron cortos y constantes para todas las concentraciones,
tomándose una muestra de 3 ml del medio a los 0, 15, 30, 45, 60, 120 y 180 minutos,
respectivamente. Las muestras de agua se congelaron y mantuvieron a -20ºC para la
posterior medida de la concentración de nitrato, nitrito, amonio y ortofosfato mediante un
autoanalizador QuAAtro AQ2 AACE (Seal Analytical), cuyos métodos de análisis se detallan
en el apartado 2.8 de este capítulo.
19
Material y métodos
Figura 2.8 Experimento de incorporación de nutrientes. Incubaciones en tubos Falcon de 50 ml, sobre
placa agitadora y luz fluorescente a 250 µmoles · m-² · s-1.
2.6.2 Tasas de incorporación y parámetros cinéticos
Una vez determinadas las concentraciones resultantes a cada uno de los tiempos se
calcularon las tasas de incorporación para la obtención de los parámetros cinéticos.
En una primera aproximación, se representaron gráficamente las concentraciones de
cada nutriente remanente en el medio (expresado en µM) respecto al tiempo, que ofrecen
una imagen primaria de los cambios producidos en el medio durante el experimento.
En segundo lugar, se calcularon las tasas de incorporación, expresadas en µmoles
nutriente·g PS -1· h-1, para cada intervalo de tiempo del experimento según la expresión:
V=[ (S t−1 ·V t−1)− (S t ·V t )]
B·t
donde:
St-1 y St son las concentraciones inicial y final para un intervalo dado.
Vt-1 y Vt son los volúmenes del medio en el tiempo inicial y final del intervalo
B representa la biomasa expresada como gramos de peso seco.
t es el período de tiempo en el que se tomó la muestra.
Aunque en un principio se realizaron los cálculos para todos intervalos de tiempo, la
comparación y representación de las cinéticas se ha realizado en base a los valores obtenidos
en el intervalo de 0 a 30 minutos, excepto en los casos donde la disminución no ocurra en los
primeros intervalos o incluso se produzca un aumento.
Para la obtención de parámetros se representaron las tasas de incorporación frente a la
concentración inicial y obteniendo los ajustes a modelos lineales o de saturación por
regresión por mínimos cuadrados mediante los paquetes estadísticos que se detallan en el
20
Material y métodos
apartado 2.9. Las cinéticas de saturación se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten,
incluyendo cierta modificación que permite determinar el punto de compensación para el
nutriente (PCN), el cual emplea una ecuación similar al modelo de cuota celular (Droop,
1983):
donde:
[S] es la concentración del nutriente, expresada en µM.
Vmáx es la velocidad máxima de incorporación, expresada en µmoles nutriente · g PS -1· h-1.
Km es la constante de semisaturación (concentración a la cual se alcanza la mitad de la velocidad
máxima ) expresada en µM.
PCN es el punto de compensación para el nutriente expresado en µM.
El valor de eficiencia a bajas concentraciones de sustrato o afinidad, se obtuvo como el
cociente en la velocidad máxima y la constante de semisaturación Km.
Por otro lado, las cinéticas que no mostraron saturación se ajustaron al modelo lineal,
donde la pendiente de dicho ajuste (m) fue el parámetro empleado para compararlas entre
sí. En la comparación de parámetros cinéticos de diferentes modelos se empleó el valor de la
velocidad máxima obtenido a la mayor concentración ensayada y el tipo de cinética.
Adicionalmente para el tratamiento en el que amonio y nitrato se suministraron a la vez
se han representado las tasas de incorporación de nitrógeno total, obtenidas como la suma
de µmoles· gPF-1· h-1 de N-NO3- y N-NH4
+ incorporado, respecto a la concentración total de
nitrógeno en el medio (de 10 a 80 µM). Las concentraciones representadas aparecen
duplicadas en este caso, debido a que las especies químicas de nitrógeno aportan cada una
un átomo al medio.
La figura 2.9 esquematiza el procedimiento seguido en el experimento de
incorporación de nutrientes, incluyendo el posterior análisis de las muestras de agua
tomadas para la determinación de los nutrientes y de la composición elemental.
21
V =V máx ·[S ]−PCN
K m+[ S ]
Material y métodos
Figura 2.9 Esquema de los experimentos de incorporación de nutrientes.
22
Material y métodos
2.7 Métodos analíticos de estimación de la composición interna
Las muestras conservadas a -20ºC se emplearon para cuantificar el contenido
pigmentario y las proteínas totales solubles. En las extracciones de ficobiliproteínas y
proteínas solubles totales se procedió al homogeneizado de 30 mg de peso fresco en un
mortero Retsch modelo µM 400, a una frecuencia de 30 s-1, en tres ciclos de dos minutos
cada uno, sumergiendo la muestra en nitrógeno líquido entre ciclos.
Por otro lado, a partir de muestras en seco se determinó el contenido total de
nitrógeno, carbono y fósforo, además de la concentración celular interna de nitrato y
amonio. El material empleado se secó en una estufa a 60ºC, durante 48 horas, y
posteriormente fue pulverizado en un mortero Retsch modelo µM 400, a una frecuencia de
30 s-1 durante 3 minutos.
2.7.1 Clorofila a y carotenoides totales
La extracción de los pigmentos liposolubles se realizó en N,N-dimetilformamida (DMF)
en condiciones de frío y oscuridad, manteniéndose en estas condiciones durante 12 horas
(Fig. 2.10). Una vez realizada la extracción se procedió a medir la absorbancia del
sobrenadante a las longitudes de onda necesarias para el cálculo de la concentración de
clorofila a y carotenoides totales.
Para calcular la concentración de clorofila a se utilizó la ecuación dada por Inskeep y
Bloom (1985):
Para el cálculo de la concentración de carotenoides totales se utilizó la ecuación dada
por Wellburn (1994):
Carotenoides (mg·g−1 PF ) =[1000⋅( A480−A750)]−[0.89⋅11.65⋅( A664−A750 ) ] 245· g PF (g)
·V (ml )
Figura 2.10 Esquema del procedimiento empleado en la determinación de clorofila y carotenoides.
23
Cla ( mg·g−1 PF )=11.65 ( A664,5−A750 )
g PF ( g )·V (ml )
Material y métodos
2.7.2 Ficobiliproteínas
La extracción de los pigmentos hidrosolubles se realizó en tampón fosfato 0.1 M, pH
6.5 a 4ºC y en condiciones de oscuridad (Moon y Dawes, 1976). Tras 12 horas en oscuridad, el
extracto se centrifugó a 11000 RPM, a 4ºC durante 15 minutos (centrífuga Eppendorf
modelo 5804R). A partir del sobrenadante se determinó la concentración de R-ficoeritrina y
R-ficocianina espectrofotométricamente, con un espectrofotómetro Thermo modelo
Biomate 5. En la figura 2.11 se muestra un esquema del procesado del extracto hidrosoluble
para la posterior medida de proteínas solubles totales y ficobiliproteínas. Para el cálculo de la
concentración de ficobiliproteínas se utilizaron las ecuaciones cromáticas propuestas por
Beer y Eshel (1985):
RPE ( mg·g−1 PS )=[ ( A564−A592)−( A455−A592 ) ·0. 2 ] ·0 .12
PS ( g )·V ( mL)
RPC ( mg·g−1 PS )=[ ( A618−A645 )−( A592−A645 )· 0 .51 ] ·0 .15
PS ( g )·V (mL )
2.7.3 Proteínas solubles totales
Las proteínas solubles totales se determinaron a partir del sobrenadante del extracto
hidrosoluble en tampón fosfato, por el método del ácido bicinconínico (Smith et al., 1985).
Este método se basa en la reacción de la proteína con el cobre en un medio alcalino (reacción
Biuret). El complejo formado de color morado intenso es estable para un amplio rango de
concentraciones de proteínas, poseyendo un alto coeficiente de extinción a 562 nm. Las
muestras se incubaron en un baño térmico a 30ºC durante 30 minutos, tiempo tras el cual se
enfriaron bajo agua fría y se procedió a la cuantificación mediante un espectrofotómetro
Thermo modelo Biomate 5. La recta patrón se elaboró con albúmina bovina (BSA) en un
rango de 0 a 1000 mg /ml de proteína.
Figura 2.11 Esquema del procedimiento empleado en la determinación de ficobiliproteínas y
proteínas solubles totales.
24
11000 RPM, 4ºC, 15'
Material y métodos
2.7.4 Carbono, nitrógeno y fósforo total
El contenido en carbono y nitrógeno interno total se determinó mediante el método
de la diferencia por ignición (Kristensen y Andersen, 1987), mediante la combustión de las
muestras homogeneizadas, en un autoanalizador Perkin Elmer modelo 2400C (Fig. 2.12).
Figura 2.12 Esquema del procedimiento empleado en la determinación de fósforo total.
Para la determinación del contenido de fósforo total se empleó la metodología
propuesta por Pardo et al. (1999). Las muestras una vez secas se calcinaron durante 1 hora a
450ºC, y se hizo una digestión ácida de 15 mg de muestra con 5 ml de HCl 3.5N, 16 horas en
agitación a temperatura ambiente. El extracto obtenido se neutralizó con NaOH 2N y HCl 0.1
N alcanzando valores de pH situados entre 1 y 2. Este pH es el necesario para la operatividad
del método del verde malaquita, que ha sido el empleado para la determinación del fósforo
total (Fernández et al., 1985). La reacción tiene lugar a partir del oxalato verde malaquita y el
heptamolibdato, que forman junto al fósforo un complejo fosfomolibdato de coloración
verdosa que tiene su máximo de absorbancia a 660 nm.
Las medidas de C, N y P total se expresaron en porcentaje sobre peso seco, mientras
que los índices C:N y N:P se expresaron como relación molar.
2.7.5 Nitrato y amonio interno
La determinación de la concentración interna de nitrato (Wood et al., 1967), nitrito
(Shinn,1941) y amonio (Slawyk y MacIsaac, 1972) se determinó según el procedimiento para
algas utilizado en Corzo y Niell (1992).
Para la extracción de NO3-, NO2
- y NH4+ interno se resuspendieron de 12 a 15 mg de
muestra seca en 5 ml agua destilada, durante 1 hora en un baño agitador a 30ºC (Fig 2.13).
A continuación se centrifugaron a 4500 RPM, a 25ºC durante 15 minutos (centrífuga
Eppendorf modelo 5804R). Del sobrenadante se midió la concentración de los nutrientes en
un autoanalizador QuAAtro AQ2 AACE (Seal Analytical), descrito en el apartado 2.8.
25
0.5 ml muestra + 1mlVerde Malaquita
Tª ambiente(Pardo et al., 1999)
Material y métodos
Figura 2.13 Esquema del procedimiento empleado en la determinación de nitrato y amonio interno.
2.8 Análisis de nutrientes en muestras de agua
Las muestras de agua procedentes de los experimentos de incorporación de nutrientes
así como los extractos de nitrato y amonio interno fueron procesadas mediante un
Autoanalizador QuAAtro AQ2 AACE (Seal Analytical) para la determinación de nutrientes
(Fig. 2.14).
La determinación de nitrato se realizó por una versión automatizada del método de
Shinn (1941) y Wood et al. (1967). Este procedimiento sigue un proceso mediante el cual el
nitrato es reducido a nitrito en una columna de cadmio-cobre a pH 8. El nitrito formado a
partir del nitrato más el nitrito ya existente en la muestra reaccionan con sulfanilamida y
posteriormente con N-1-naftil-etilendiamina, formándose un compuesto de color púrpura
con su máxima absorbancia a 540 nm. Los datos resultantes corresponden a la suma de
nitratos y nitritos. La concentración de nitrito se determina directamente mediante el
proceso anterior, pero sin el paso previo por la columna reductora, los valores obtenidos se
restan a los anteriores para conocer la concentración de nitrato.
Figura 2.14 Autoanalizador QuAAtro AQ2 AACE empleado en la medida de nutrientes en el agua.
El método automatizado utilizado en la medida de la concentración de amonio se basa
en Slawyk y MacIsaac (1972). En la reacción que tiene lugar (reacción de Berthelot), el amonio
reacciona con el salicilato sódico, nitroprusiato sódico e hipoclorito sódico, produciendo un
compuesto azul-verdoso cuya absorbancia es medida a 660 nm.
26
4500 RPM, 25ºC, 10'
Material y métodos
El método de determinación de fosfato se basa en la reacción en medio ácido entre el
anión fosfato y el molibdato amónico en presencia de tartrato de potasio y antimonio
(Murphy y Riley, 1962). En esta reacción se genera ácido fosfomolíbdico, el cual es reducido
mediante ácido ascórbico generando una coloración azul debida al molibdeno, que presenta
su máximo de absorción a 880 nm.
2.9 Tratamiento estadístico de los resultados
Los talos empleados en las incubaciones del experimento se analizaron por separado
para la determinación de la composición interna, tomándose el valor medio a partir de cuatro
réplicas para cada concentración. La significación estadística para cada concentración y
tratamiento se analizó mediante t-test para un nivel de significación de a =0.05.
Las tasas de incorporación de nutrientes se obtuvieron como la media de las cuatro
réplicas para cada concentración, tratamiento y tiempo de toma de la muestra. Con el fin de
comparar los resultados de diferentes modelos cinéticos, se compararon las tasas obtenidas
a la mayor concentración de cada tratamiento ( 40 µM para las fuentes de nitrógeno y 20 µM
para las de fósforo) durante los 30 primeros minutos en los cuales se produjo un descenso
significativo de la concentración en el medio. Los datos de intervalos sucesivos para los
cuales la tasa no experimentó cambios fueron tomados conjuntamente. Para examinar las
diferencias en las tasas de incorporación de nutrientes entre las especies y en función de la
adición conjunta o por separado de las fuentes de nitrógeno se emplearon tres test de
análisis de la varianza (ANOVA) de dos vías. En los casos en los que los efectos fueron
significativos, se realizaron test de comparación de medias (test HSD de Tukey).
Las cinéticas de saturación se ajustaron mediante regresión no lineal por mínimos
cuadrados, empleando métodos iterativos, mientras que las cinéticas lineales se ajustaron
mediante regresión lineal, en ambos casos para la obtención de los parámetros cinéticos.
Para el procesamiento de datos y análisis estadístico se utilizó el programa SigmaPlot
11.0 (Systat Software). La representación y obtención de los parámetros de las cinéticas de
incorporación de nutrientes se realizó con el programa Kaleidagraph 4.0 (Synergy Software).
27
Material y métodos
28
3. Resultados
Resultados
3. Resultados
3.1.1 Concentración de nutrientes en el agua del estuario
La figura 3.1 representa las concentraciones de NH4+, NO3
- y PO43-, medidas en el agua
del estuario durante la marea entrante, entre los meses de marzo de 2010 y mayo de 2011. A
pesar de que la concentración media de NH4+ en el estuario (30 µM) fue superior a la de NO3
-
(10 µM) su disponibilidad fluctuó enormemente, registrándose concentraciones que fueron
desde 5 µM en febrero 2010 a un máximo de 85 µM en noviembre 2010.
Figura 3.1 Concentraciones de NH4+, NO3
- y PO43- medidas entre los meses de marzo'10 y mayo'11 en
el canal del estuario del río Palmones en el que se realizaron los muestreos. En los meses en los que no
aparecen barras no se tomaron datos.
La concentración de NO3- en ningún mes superó los 15 µM, con una tendencia
creciente en los meses de invierno y decreciente en la época estival, registrándose mínimas
de 2 µM (mayo, 2010). La concentración de fosfato se encontró por debajo de los 5 µM todos
los meses en los que se realizaron medidas.
3.2 Incorporación de nutrientes: Nitrógeno y fósforo
En los apartados siguientes se describen los resultados de los experimentos de
incorporación de nitrógeno y fósforo, sus interacciones y los parámetros cinéticos obtenidos
para las especies B. scorpioides y C. caespitosa.
31
Resultados
3.2.1 Incorporación de nitrato y amonio
3.2.1.1 Variación de la concentración en el medio
Como primera aproximación al estudio de los nutrientes, se estudiaron las variaciones
de las concentraciones externas de NH4+ y NO3
- en el medio de cultivo. Aunque dichas
medidas no están relativizadas a la biomasa, los resultados pueden ser comparables debido a
la similar cantidad de alga empleada. Estas gráficas además pueden explicar algunas de las
respuestas observadas posteriormente en las cinéticas.
En primer lugar, se encontró una clara diferencia en el comportamiento de las dos
especies ante la presencia de amonio, que puede observarse en la figura 3.2. En B.
scorpioides las disminuciones en la concentraciones iniciales de NH4+ se produjeron a tiempos
más tempranos que en C. caespitosa, lo que indicó una respuesta más rápida al NH4+ en B.
scorpioides. Tras la primera hora de experimento, en B. scorpioides el NH4+ alcanza
concentraciones en el medio por debajo de 1 µM, tras una brusca caída inicial de la
concentración en el medio. La presencia de NO3- tuvo efectos en la disminución de la
incorporación de NH4+ (Figura 3.2 C) de B. scorpioides, pues a concentraciones superiores a 10
µM el NH4+ se agotó en el medio a las dos horas, una hora más tarde de lo que se había
producido en ausencia de NO3-. Esto muestra que en presencia de NO3
- B. scorpioides requiere
un tiempo mayor para incorporar todo el NH4+ disponible en el medio.
Por otro lado, en C. caespitosa la disminución de la concentración del nutriente a lo
largo del experimento se produjo de una forma más gradual que en B. scorpioides (Fig. 3.2 A).
Al contrario de lo que ocurrió en B. scorpioides, el NH4+ no se agotó en el medio, alcanzando
en todas las concentraciones una concentración final similar (Fig. 3.2 B). Además, en la
concentración inicial de 5 µM la concentración de NH4+ no varió en el tiempo de incubación,
reflejando la baja afinidad de C. caespitosa por el NH4+. En cambio, cuando se añadió NO3
- al
medio (a+n), la concentración de NH4+ disminuyó desde los primeros minutos y a todas las
concentraciones, agotándose en la primera hora, salvo a la mayor de las concentraciones en
que fue a las tres horas (Fig. 3.2 D).
32
Resultados
Figura 3.2 Variación de la concentración de NH4+ en el medio de incubación durante el experimento
de incorporación de nutrientes, en B. scorpioides (A,C) y C. caespitosa (B,D). (a)= incorporación de NH4+;
(a+n)= incorporación de NH4+ en presencia de NO3
-.
En segundo lugar, se obtuvo la variación temporal de la concentración de nitrato en el
medio de cultivo, que fue siempre menor que la del NH4+ en las dos especies estudiadas. El
comportamiento de B. scorpioides y C. caespitosa ante las especies de nitrógeno reveló un
aspecto interesante: la rápida incorporación que se había observado para el NH4+ no ocurrió
para el NO3- y en su lugar durante los primeros intervalos de muestreo apareció un tiempo de
retardo (hasta de una hora) en la incorporación de NO3- (Fig. 3.3).
33
Resultados
Figura 3.3 Variación de la concentración de NO3- en el medio de incubación durante el experimento
de incorporación de nutrientes, en B. scorpioides (A, C) y C. caespitosa (B, D). (n)= incorporación de NO3-;
(n+a)= incorporación de NO3- en presencia de NH4
+.
Aunque las diferencias en el comportamiento de las dos especies ante el NO3- no
fueron tan evidentes como en el NH4+, C. caespitosa comenzó a incorporar el NO3
- de forma
más inmediata que en el caso del NH4+, y sin presentar fase de retardo. En la figura 3.3 se
pudieron identificar dos tendencias en la variación del NO3- en el medio. La primera a la
mayor concentración inicial (40 µM), donde el nitrato no se agotó en el medio y que en el
caso de B. scorpioides permaneció constante durante la primera hora (Fig. 3.3 A). La segunda
de ellas, a concentraciones más bajas, donde la disminución de NO3- en el medio se produjo
gradualmente, requiriendo ambas especies más tiempo para incorporar todo el nitrato
disponible respecto al NH4+, aunque con particularidades en cada especie.
34
Resultados
En B. scorpioides, la concentración de NO3- comenzó a disminuir a partir de la primera
hora del experimento, a todas las concentraciones (F1,14=1.89, P=0.133). Por esta razón, se
empleó el intervalo de 60 a 180 minutos para la obtención de los parámetros cinéticos para
esta especie (Tabla 3.1), intervalo en el cual se produjo una disminución sirnificativa en la
concentración de NO3- (r²=0.64, p=0.001). Hay que señalar que no se produjo una
incorporación total del NO3- disponible, alcanzándose valores finales de 1.5, 3.5 y 13 µM para
las concentraciones iniciales de 5, 10 y 20 µM, respectivamente. La interacción entre las
especies de nitrógeno (n+a), mostró un resultado positivo en B. scorpioides, ya que
desapareció el retardo inicial de la disminución del NO3- experimentado en ausencia de NH4
+,
e incluso se agotó a 5 y 10 µM, transcurridas 2 y 3 horas respectivamente, cuando antes no se
había producido a ninguna de las concentraciones iniciales.
En la incorporación de NO3-, C. caespitosa requirió una hora menos que B. scorpioides
para activar los mecanismos de incorporación de este nutriente. En este caso, la disminución
de la concentración con el tiempo fue gradual (Fig. 3.3B), en comparación con el rápido
agotamiento que se observó en la incorporación de NH4+, en B. scorpioides. La adición de
NH4+ produjo un efecto inhibidor, apareciendo una fase de retardo de 30 minutos en la que
se observó incluso un ligero aumento de la concentración en el medio a todas las
concentraciones, salvo a 40 µM, a la cuál se incorporó desde el tiempo inicial (Fig. 3.3 D). Sin
embargo, independientemente de que hubiese NH4+ en el medio, el NO3
- se agotó en el
medio en 2-3 horas (Fig. 3.3 B,D), excepto 40 µM donde el patrón de disminución de nitrato
fue distinto al resto de concentraciones. A partir de las condiciones iniciales de 5 y 10 µM de
NO3-, y transcurridos 120 minutos se alcanzaron concentraciones por debajo de los límites de
detección, tiempo que asciende a 180 minutos a la concentración inicial de 20 µM. A 40 µM la
concentración remanente en el medio alcanza valores finales de 13±3 µM (Fig. 3.3 B) muy
inferior a la encontrada en B. scorpioides (Fig. 3.3 A). En cambio, no se produjeron cambios
significativos a 40 µM cuando se añadió NH4+ al medio (P=0.231), alcanzándose una
concentración 2.8 veces superior a la encontrada en ausencia de NH4+.
La diferencia entre las concentraciones finales alcanzadas a 40 µM y la aparición del
retardo inicial a menores proporcionó una idea inicial del efecto inhibidor del NH4+ sobre la
capacidad de C. caespitosa para retirar NO3- del medio.
35
Resultados
3.2.1.2 Efecto de la especie de nitrógeno (NH4+ vs. NO3
-)
En este apartado se comparan las cinéticas de incorporación obtenidas en el intervalo
de 0 a 30 minutos bajo tres tratamientos de nitrógeno NO3- (n), NH4
+ (a), y la combinación de
ambos como NH4NO3 (a+n y n+a). Las gráficas obtenidas (Figuras 3.4 y 3.5) muestran un
incremento de las tasas de incorporación de NH4+ y NO3
- con la concentración, en las dos
especies y en todos los tratamientos, excepto en algunos casos en los que se produjo
saturación sin cambios significativos en las tasas de incorporación.
Figura 3.4 Cinéticas de incorporación de NH4+ y NO3
- en B. scorpioides en el intervalo de 0 a 30
minutos. (a) = incorporación de NH4+; (n)= incorporación de NO3
-; (a+n)=incorporación de NH4+ en
presencia de NO3-; (n+a)= incorporación de NO3
- en presencia de NH4+.
El análisis de la varianza de las tasas medias medidas a 40 µM de cada fuente de
nitrógeno por separado ha mostrado que las tasas de incorporación de NH4+ fueron
superiores a las de NO3- (Tabla 3.1, 3.2) en las dos especies, lo que se corresponde con las
acentuadas disminuciones de NH4+ en el medio de las figuras 3.2 y 3.3, especialmente en B.
scorpioides. No obstante, las tasas de incorporación de NH4+ de B. scorpioides fueron
superiores a las de C. caespitosa, mientras que las de NO3- fueron similares (Tabla 3.1).
36
Concentración ( mM)
Tabla 3.1 Parámetros cinéticos y tasas medias de incorporación medidas a 40 µM, de 0-30 minutos, en µmol N-NO3-/ N-NH4
+·gPS-1·h-1. Constante de
semisaturación (Km) y punto de compensación para el nutriente (PCN) en µM; pendiente del ajuste lineal (m) y eficiencia Vmáx/Km en l· gPS-1 · h-1. Las desviaciones
estándar se muestran entre paréntesis. Los valores con distinta letra en el superíndice muestran diferencias significativas entre los tratamientos (p ≤0.001). 1
representa la Vmáx obtenida a partir del ajuste al modelo de Michaelis-Menten (M-M) (a=0.05).
Fase de saturación Fase lineal Tasa a 40 µM
Tratamiento Modelo cinético Vmax Km Vmáx / Km PCN r² m r² V40 μM
Intervalo
(min)
B. scorpioides NH4+ Bifásico 42.2 ± 29 10.9 ± 13 3.9 ± 5.3 0 0.89 1.5 ± 0.1 0.96 67.0 ± 6.9 a 0-30
NH4++ NO3
- Bifásico 27.4 ± 2.1 6.5 ± 1.2 4.2 ± 0.8 3.3 ± 0.2 0.98 0.85 ± 0.05 0.98 42.9 ± 1.1 b 0-30
NO3- * Saturación 23.3 ± 2.1 20.2 ± 3.9 1.2 ± 0.3 0 0.94 - - 15.4 ± 1.1 c 60-180*
NO3-+ NH4
+ Bifásico 8.0 ± 1.6 3.7 ± 2.2 2.2 ± 1.7 0 0.89 0.58 ± 0.03 0.97 21.5 ± 2.2 d 0-30
C. caespitosa NH4+ Saturación 112.1 ± 37 42.2 ± 25 2.7 ± 1.8 2.6 ± 1.3 0.92 - - 48.3 ± 5.1 e 0-30
NH4++ NO3
- Saturación 44.8 ± 3.0 14.9 ± 2.5 3.0 ± 0.5 0 0.96 - - 32.3 ± 3.7 f 0-30
NO3- * Bifásico 5.0 ± 1.8 3.2 ± 4.6 1.5 ± 2.3 0 0.43 1 0.70 ± 0.10 0.91 16.8 ± 2.9 c 0-30
NO3-+ NH4
+ Lineal - - - - - 0.17 ± 0.10 0.48 2 9.0 ± 0.9 h 15-45
Los valores representan la media ± ES para los parámetros. Los valores de. r² fueron significativos para al menos P<0.05. * Las tasas de incorporación de nitrato
en los intervalos 60-120 y 120-180 se tomaron conjuntamente debido a que no se encontraron diferencias significativas (p<0.001).1 r²=0.43 es significativa para F1,10=6.65, P=0.0297. 2 r² =0.48 es significativa para F1,13=10.946, P=0.006.
37
Resultados
Las cinéticas de incorporación de amonio en B. scorpioides fueron bifásicas, mientras
que en C. caespitosa se obtuvieron cinéticas de saturación tanto en ausencia como en
presencia de nitrato.
En B. scorpioides la adición de nitrato no afectó ni a la Vmax (t=0.516,P=0.615) ni a la Km
(t=0.337,P=0.739) en la fase de saturación. La concentración a la que se alcanzó una tasa de
25 µmol NH4+·gPS-1·h-1, aumentó de 10 a 20 µM (Fig. 3.4), y apareció un punto e
compensación para el nutriente a 3.3±0.2 µM. En consecuencia, la afinidad por el amonio
como Vmáx/Km no se vio afectada por la adición de nitrato (t=-0.056, P=0.956). Sin embargo,
en la fase lineal, se encontró una menor pendiente obtenida en presencia de nitrato (Tabla
3.1) debido a la disminución de la tasa de incorporación a 40 µM. (Tabla 3.2), alcanzándose
una tasa de 43±1 µmol NH4+·gPS-1·h-1 en presencia de NO3
- respecto a los 67±6.9 µmol
NH4+·gPS-1·h-1 obtenidos en el caso contrario.
Mientras que en B. scorpioides el mecanismo de incorporación de NH4+ fue bifásico y no
se saturó a 40 µM, en C. caespitosa las cinéticas fueron de saturación (Fig. 3.5) tanto en
presencia como en ausencia de NO3- en el medio. En este caso, los parámetros cinéticos no
variaron de forma significativa (Vmax, P=0.081; Km, P=0.287; Vmáx/Km , P=0.874), excepto el
punto de compensación para el amonio que disminuyó de 2.6±1.3 µM a 0 µM. Este hecho se
corresponde con las respuestas más rápidas que se observaron en las figura 3.1D.
Tabla 3.2. Resultados de los ANOVA de dos vías que examina las diferencias en las tasas de
incorporación de nutrientes a 40 µM entre las especies, en función de: A) Las fuentes de nitrógeno por
separado; B) La presencia de NO3- en la incorporación de NH4
+; C) La presencia de NH4+ en la
incorporación de NO3- .
Factor Valor F p- level Orden de los principales factores
A. a vs. n- S × NS 17.356 0.002 B(a) > C(a) > B(n) = C(n)
B. a vs. a+nS 38.510 <0.001 B > C
NH4+ 71.675 <0.001 a > a+n
C. n vs. n+a S × NO3- 48.649 <0.001 B(n+a) > B(n) = C(n) > C(n+a)
38
Resultados
En general, la comparación de la tasas de incorporación de NH4+ a 40 µM muestra que
el efecto del nitrato en la incorporación de amonio fue el mismo para las dos especies, en las
cuales la adición de NO3- (a+n) produjo una disminución del 36%. No obstante, la clara
diferencia entre las especies observada a 40 µM no es tan evidente a concentraciones
menores a 20 µM de NH4NO3. Como muestran las figuras 3.4 y 3.5 para B. scorpioides y C.
caespitosa, respectivamente, a 10 µM ambas especies incorporaron 18 µmol NH4+·gPS-1·h-1,
aunque a 5 µM B. scorpioides mostró una tasa mayor.
Las cinéticas de incorporación de nitrato variaron con la especie y los tratamientos,
encontrándose además una interacción significativa (Tabla 3.2), indicando que el NH4+ afectó
a la incorporación de NO3- de distinta forma según la especie. Las cinéticas de incorporación
de NO3- en comparación con las de NH4
+, presentaron una tendencia a la saturación en B.
scorpioides, siendo lineales en C. caespitosa.
Figura 3.5 Cinéticas de incorporación de NH4+ y NO3
- en C. caespitosa en el intervalo de 0 a 30
minutos. (a) = incorporación de NH4+; (n)= incorporación de NO3
-; (a+n)=incorporación de NH4+ en
presencia de NO3-; (n+a)= incorporación de NO3
- en presencia de NH4+.
39
Concentración ( mM)
Resultados
En B. scorpioides se produjo un cambio de cinética de saturación a bifásica en presencia
de amonio, indicando un aumento en la afinidad a altas concentraciones (Fig 3.4),
alcanzándose una tasa de incorporación de NO3- superior en presencia de NH4
+ a 40 µM más
rápidamente (Tabla 3.1).
En C. caespitosa se obtuvo un ajuste bifásico para el NO3- (n), alcanzó una tasa máxima
de 5±1.8 µmol NO3-·gPS-1·h-1 a 20 µM de NO3
- en la primera fase y aumentó linealmente con
una pendiente de 0.7±0.10 l· gPS-1·h-1 (t=3.748,P=0.004) hasta una V40 µM significativamente
superior a a la de la fase de saturación (Tabla 3.1). Por el contrario, la adición de amonio
disminuyó las tasas de incorporación de nitrato notablemente. En todo caso, el NH4+ inhibió
en un 60% la incorporación de NO3- en esta especie, a 40 µM, al contrario de lo que ocurrió
en B. scorpioides, obteniéndose una afinidad muy inferior (0.17±0.10 l· gPS-1·h-1).
Los resultados muestran que la adición conjunta de nitrato y amonio tiene efectos más
patentes a concentraciones mayores (Figuras 3.4, 3.5). Las interacciones entre las especies
fueron más evidentes en la incorporación de amonio que en la de nitrato, siendo estas
similares (P=0.039). Sin embargo, hay que señalar que los intervalos a los que estas fueron
calculadas fueron distintos (Tabla 3.1), encontrando una respuesta más rápida en C.
caespitosa.
3.2.1.3 Incorporación de nitrógeno inorgánico total
La figura 3.6. representa la incorporación de NH4NO3 en términos de µMoles totales de
nitrógeno g-1 h-1. En esta gráfica la concentración disponible de nitrógeno total se duplica
debido al doble aporte de nitrógeno proporcionado por el NH4NO3, tal como se indicó en el
apartado 2.8.2. Las cinéticas de incorporación de nitrógeno total fueron bifásicas en las dos
especies, con una primera fase de saturación hasta los 40 de N total (equivalente a 20 µM de
NH4NO3) y lineal desde esta concentración a los 80 µM de N total (40 µM de NH4NO3). Por un
lado se han comparado las fases de saturación, en la que B. scorpioides incorporó 49±5.9
µMol N· gPS -1 · h-1, tasa significativamente superior a la de C. caespitosa con 37±2.3 µMol N·
gPS -1· h-1 (P>0.05). Por otro lado, la segunda fase de tipo lineal en las dos especies mostró
diferencias mayores, con una pendiente de 0.8±0.03 l· gPS-1 · h-1 en B. scorpioides y 0.24±0.02
l· gPS-1· h-1 en C. caespitosa. La constante de semisaturación (Km) no mostró diferencias
significativas, con un valor medio de 12 µM de nitrógeno total, ni tampoco el punto de
compensación para el nitrógeno, que fue de 6 µM en ambas especies. De esta forma, a 80 µM
de nitrógeno total, B. scorpioides alcanzó una tasa máxima de incorporación de 64.7±1.6
µMol N· g PS -1· h-1, 1.4 veces superior a la de C. caespitosa (p<0.001, Fig. 6). En esta última
especie la tasa alcanzada a 80 µM no fue significativamente superior a la obtenida a 40 µM
(Tabla 3.3).
40
Resultados
Figura 3.6 Tasas de incorporación de nitrógeno total en el intervalo de 0 a 30 minutos en B.
scorpioides y C. caespitosa.
Cabe puntualizar que la tasa máxima alcanzada medida en ambas especies mostró un
valor menor al obtenido por la ecuación del modelo de Michaelis-Menten (Tabla 3.3), situada
para las dos especies en torno a los 30 µMol N· g PS -1· h-1 (Figura 3.6).
Tabla 3.3 Parámetros cinéticos de incorporación de N total. Tasa media de incorporación de N a 80
µM, en el intervalo de 0-30 minutos (Vmáx), en µMol N·gPS-1·h-1; Constante de semisaturación (Km) y
punto de compensación para el nutriente (PCN) en µM; pendiente del ajuste lineal (m) y eficiencia
Vmáx/Km en l· gPS-1 · h-1. Los valores con distinta letra en el superíndice muestran diferencias
significativas entre los tratamientos (p≤0.001).
Fase de saturación Fase lineal
Vmax Km PCN r² m r² V80 μM
B. scorpioides 49±5.9a 11.5±7 a 6.1±1.0 0.98 0.80±0.03 0.98 64.7±1.6b
C. caespitosa 37±2.3c 12.3±6a 6.2±0.1 0.98 0.24±0.02 0.98 39 ± 1.0 c
41
Concentración ( mM)
Resultados
3.2.2 Incorporación de fosfato
La variación de la concentración de PO43- en el medio (Fig. 3.7) fue distinta para cada
especie. En B. scorpioides, a todas las concentraciones, hubo un descenso constante respecto
a la inicial, que condujo al agotamiento del nutriente en el medio a 2 y 5 µM, tras 1 y 3 horas,
respectivamente. En C. caespitosa, durante la primera hora disminuyó la concentración de
forma más acentuada que en B. scorpioides, agotándose el PO43- en la menor de las
concentraciones (Fig. 3.7); en cambio, tras la primera hora no se produjeron disminuciones
significativas, e incluso se obtuvo un aumento en la concentración en el medio a 20 µM,
pasando de 12 a 16 µM entre la segunda y tercera hora del experimento.
Figura 3.7 Variación de la concentración de PO43- en el medio de incubación durante el experimento
de incorporación de nutrientes, en B. scorpioides y C. caespitosa.
A partir de la disminución de la concentración en el medio entre 0 y 30 minutos
obtuvimos las tasas de incorporación correspondientes (Tabla 3.4), que aumentaron con la
concentración en ambas especies (p≤0.001). Como muestra la figura 3.8, la incorporación de
fosfato tanto en B. scorpioides como en C. caespitosa mostró cinéticas bifásicas, donde se
diferenció una primera fase de saturación por debajo de los 10µM y una lineal a partir de esta
concentración; sin embargo, la capacidad de incorporación de PO43- en C. caespitosa fue
superior a la de B. scorpioides. La comparación de la primera fase de la curva bifásica (Tabla
3.4) mostró que B. scorpioides incorpora el fosfato a una velocidad mucho menor, y el alto
valor de Km reflejó la baja afinidad que muestra por este nutriente. En cambio, a 10 µM, C.
caespitosa alcanzó una Vmáx equivalente a 3 veces la de B. scorpioides .
42
Resultados
Figura 3.8 Tasas de incorporación de fosfato en el intervalo de 0 a 30 minutos en B. scorpioides y C.
caespitosa.
Por otro lado, las pendientes de la segunda fase de la cinética bifásica fueron
diferentes, siendo nuevamente mayor la obtenida en C. caespitosa, de 0.7 l· gPS-1 · h-1
respecto a la de B. scorpioides de 0.43±0.03 l· gPS-1 · h-1. El cociente Vmáx/Km confirma este
resultado, reflejando una afinidad ocho veces superior para C. caespitosa (Tabla 3.4).
Tabla 3.4 Parámetros cinéticos de la incorporación de fosfato, de 0 a 30 minutos, en B. scorpioides y C.
caespitosa. Tasa media máxima de incorporación a 20 µM (Vmáx (a 20 µM)) en µMol PO43-· gPS-1·h-1;
Constante de semisaturación (Km); pendiente del ajuste lineal (m) y eficiencia Vmáx/Km en l· gPS-1 · h-1. El
asterisco indica que existen diferencias significativas entre las dos especies (a=0.05). 1Representa la
Vmáx obtenida a partir del ajuste al modelo de Michaelis-Menten (M-M).
Fase de saturación Fase lineal Incorporación a 20 µM
Vmax Km Vmáx / Km r² m r² V20 μM Intervalo (min)
B. scorpioides 11.4±1.9 13.4±3.5 0.85±0.3 0.94 0.43±0.03 0.98 10.0±0.7 0-30
C. caespitosa 18.4±2.4 2.30±1.0 8.0±0.4 0.98 0.70±0.10 0.98 21.5±1.9 0-30
43
Concentración ( mM)
Resultados
3.3 Efecto de la fuente de nitrógeno sobre la composición interna
Tras el análisis de la composición interna al comienzo y al final del experimento, se obtuvo que a
corto plazo ni la concentración ni los diferentes tratamientos tuvieron efectos significativos sobre los
diferentes componentes internos (P>0.05). En cambio, sí se han encontrado diferencias entre las dos
especies estudiadas (Tabla 3.5).
Tabla 3.5 Concentraciones de los diferentes constituyentes internos medidos tras el experimento de
incorporación de nutrientes. El asterisco indica que existen diferencias significativas entre las especies
(t-test, p<0.05). Los valores mostrados son las medias±SD obtenidos a partir de las réplicas de cada
experimento de incorporación de nutrientes (n = 40-80). 1 n = 20.
Componente interno B. scorpioides C. caespitosa
*Clorofila a (mg· g-1 DW) 0.94 ± 0.19 0.60 ± 0.18
*Carotenoides totales (mg· g-1 DW) 0.23 ± 0.05 0.16 ± 0.05
*RPE (mg· g-1 DW) 5.24 ± 1.96 8.00 ± 3.22
*RPC (mg· g-1 DW) 2.37 ± 0.87 1.71 ± 1.00
*PST (mg· g-1 FW) 31.1 ± 6.88 11.2 ± 3.41
*C total (% DW) 31.2 ± 0.99 27.3 ± 1.03
*N total (% DW) 4.25 ± 0.24 3.90 ± 0.22
*P total (% DW) 0.58 ± 0.03 0.48 ± 0.09
*C:N (razón molar) 8.64 ± 0.83 8.20 ± 0.32
N:P (razón molar) 1 17.7 ± 2.44 18.0 ± 2.43
* NO3- interno (mM) 2.59 ± 1.96 1.97 ± 1.08
* NH4+ interno(mM) 17.4 ± 3.43 6.33 ± 1.64
En términos generales se encontró un mayor contenido de todos los componentes internos en
B. scorpioides (P<0.001), excepto para el contenido en R-ficoeritrina que fue 1.5 veces superior en C.
caespitosa (P<0.001), así como los valores de N:P que no presentaron diferencias entre las especies
(P=0.699). Los mayores rangos de diferencia se encuentran en el amonio interno y en las proteínas
solubles totales, ambos 2.8 veces superior en B. scorpioides (Tabla 3.5).
44
4. Discusión
Discusión
4. Discusión
4.1 Evaluación de la capacidad de incorporación de nutrientes
Bostrychia scorpioides y Catenella caespitosa mostraron superiores tasas de
incorporación y afinidad por el N respecto al P, y a su vez mayor preferencia por el NH 4+ que
por el NO3-, como es frecuente en macroalgas (D'Elia y DeBoer, 1978; Pedersen y Borum,
1997). Si bien hay excepciones en las que no existen interacciones entre las formas
inorgánicas de N y las tasas a corto plazo son similares (Kraemer et al., 2004; Runcie et al.,
2003). Esta tendencia es acorde con las proporciones en las que estas fuentes de nutrientes
se hallan en el estuario, donde el NH4+ constituye la mayor carga de nitrógeno disuelto. De
forma similar, tasas de incorporación de NO3- superiores a la de NH4
+ en algas de estuario se
relacionan con una mayor contribución de tal fuente de nitrógeno al estado eutrófico de las
aguas (Kennison et al., 2011).
Las cinéticas de incorporación de NH4+ fueron bifásicas en B. scorpioides y de saturación
en C. caespitosa, con tasas de incorporación superiores en B. scorpioides en todos los casos.
Por el contrario en la incorporación de NO3- se obtuvieron cinéticas bifásicas en C. caespitosa
y de saturación en B. scorpioides, aunque las diferencias entre las especies fueron menos
evidentes y se obtuvieron en intervalos diferentes.
En términos generales, respecto a las cinéticas de saturación, los mecanismos bifásicos
permiten integrar pulsos de nutrientes en un rango más amplio de concentraciones. Hasta el
momento las cinéticas bifásicas se han descrito para el NH4+ y el NO3
- en plantas vasculares
(Ullrich, 1992; Buchanan et al., 2000), fitoplancton (Collos et al., 1992; Lomas y Glibert, 1999)
y algunas macroalgas (Lavery y McComb, 1991; Campbell, 1999; Martinez y Rico, 2004). Los
estudios más recientes a nivel molecular relacionan ĺas cinéticas bifásicas, el caso del NH4+
(Howitt and Udvardi, 2000) y del NO3- (Forde et al., 2000), con la existencia de
transportadores de alta y baja afinidad, denominados HATS y LATS (de “High” y “Low” Affinity
Transport Systems, respectivamente), aunque hasta el momento sólo se han estudiado en
organismos modelos de plantas vasculares y microalgas. La actividad de los HATS es inducible
por altas concentraciones de N inorgánico en el medio, mientras que la expresión de los LATS
suele ser constitutiva, manteniendo una actividad constante e independiente de las
concentraciones externas.
En la incorporación de NH4+, las cinéticas bifásicas de B. scorpioides indican que esta
especie es capaz de incorporar nutrientes en el estuario en un rango más amplio que C.
caespitosa, cuyas cinéticas de saturación implican una baja capacidad de uso de altas
concentraciones externas de NH4+. En la bibliografía no se han encontrado otras especies de
47
Discusión
rodofíceas que presenten cinéticas bifásicas, siendo más frecuentes en todos los grupos de
algas las cinéticas de saturación para el NH4+, tal como se obtuvo en C. caespitosa. Sólo en
ciertas especies de heterocontofitas Campbell (1999) encuentra este tipo de cinéticas para el
NH4+, concretamente en una bahía donde existen altas concentraciones de NH4
+ como ocurre
en el estuario del río Palmones.
El aumento lineal de las tasas de incorporación NH4+ en B. scorpioides refleja la
componente difusiva que muchos autores indican para el NH4+, y que es frecuente en
macroalgas (Taylor et al., 1998; Martínez y Rico, 2004; Phillips y Hurd ,2004). En relación a
ello, la saturación obtenida en C. caespitosa podría explicarse por una disminución en dicho
proceso de difusión del NH4+ (McGlathery et al., 1996; Taylor y Rees, 1999). Según Campbell
(1999) la disminución en la difusión del NH4+ puede estar originada por una baja capacidad de
almacenamiento. Los valores de NH4+ interno determinados fueron un orden de magnitud
mayor que los valores de concentración de NH4+ del estuario y superiores a las
concentraciones que Waite y Mitchell (1972) señalan como tóxicas para algunas algas. En B.
scorpioides, la mayor concentración interna de NH4+ indica una mayor capacidad de
almacenamiento respecto a C. caespitosa. Muchos autores indican que el llenado de estas
reservas suele ejercer un control negativo sobre la incorporación del nutriente (Rosenberg et
al., 1984), lo que se correspondería con la fase de control interno a la que hace mención
Pedersen (1994). Puesto que B. scorpioides presentó tasas de incorporación más altas y no se
produjo saturación, es probable que sus reservas estén por debajo de su máxima capacidad,
como consecuencia de la aclimatación en ausencia de nutrientes; en cambio, en C. caespitosa,
con menor contenido en N interno, se observaron menores tasas de incorporación y una
afinidad muy inferior a la de B. scorpioides. Aunque esto puede sugerir que sus reservas se
encuentren llenas y ejerzan inhibición por feedback, la presencia del retardo previo a la
incorporación de NH4+ indica que se debe a que esta especie posee una alta capacidad de uso
de sus reservas internas (McGlathery et al., 1996).
Las tasas de incorporación de amonio obtenidas fueron similares o superiores a las de
otras rodofíceas (D'Elia y DeBoer, 1978; Thomas y Harrison, 1985; Campbell, 1999; Dy y Yap,
2001). Todas esas especies presentan la característica común de sobrevivir en ambientes
intermareales cuando alguna de las formas de nitrógeno no está disponible, lo que está
bastante relacionado con altas capacidades de almacenamiento de este nutriente
asegurando su supervivencia (DeBoer, 1981).
Un caso llamativo es el de Catenella nipae, que según Runcie et a. (2003) posee
potencial como indicadora del contenido en N en estuarios, en base a su capacidad de
almacenar nutrientes durante un periodo relativamente largo. En el caso de C. caespitosa y B.
scorpioides, aunque las tasas obtenidas no fueron tan altas como las de C. nipae, debido a que
48
Discusión
las concentraciones empleadas fueron mucho menores, la afinidad que obtuvimos por el
NH4+ fue superior, lo que sugiere que las especies aquí estudiadas pueden responder de
forma más rápida a los cambios de N en el medio y sus tiempos de integración de esas
variaciones serán posiblemente menores, sin alcanzar las altas tasas de renovación propias
de algas clorofíceas con alta afinidad por las fuentes de N (Thomas y Harrison, 1987;
Pedersen,1994; Campbell, 1999).
La presencia de NO3- produjo una disminución de las tasas de incorporación de NH4
+ en
ambas especies. Además, en B. scorpioides se produjo un aumento de la concentración de
NH4+ necesaria para la incorporación, con un desplazamiento de la cinética completa, y al
mismo tiempo un retraso en el consumo de todo el NH4+ disponible en el medio de cultivo,
respuesta similar a la que Runcie et al. (2003) encuentran en Ulva lactuca. En el caso de B.
scorpioides esta respuesta puede explicarse por el mayor índice C:N de esas muestras (tabla
4.1). D'Elia y DeBoer (1978) encuentran una relación directa entre el índice C:N y el aumento
de las tasas de incorporación, debido al control negativo que induce la síntesis de
metabolitos como aminoácidos (Fujita et al., 1988). Sin embargo, en C. caespitosa no hubo
diferentes valores de C:N, lo cual no explica las mayores tasas obtenidas en ausencia de NO3-
y el retardo previo a la incorporación. Esto sugiere que la incorporación no es una función
directa de la limitación en N en los tejidos, aunque sí puede depender de las reservas de N
(Pedersen y Borum, 1996).
En la incorporación de NO3- se obtuvieron cinéticas de saturación en B. scorpioides y
bifásicas en C. caespitosa, con la principal diferencia de que C. caespitosa requirió menos
tiempo que B. scorpioides para activar sus mecanismos de incorporación de NO3-. Las cinéticas
de saturación de NO3- son frecuentes en macroalgas (DeBoer, 1981), y suelen asociarse a un
sistema de transporte activo mediado por la enzima nitrato reductasa. No obstante, en
muchos casos la principal limitación de la velocidad de incorporación es la asimilación del
NH4+ para la biosíntesis de proteínas. No obstante, también hay casos en los que la
incorporación de NO3- no se satura, incluso a concentraciones de 1000 µM, como en Fucus
serratus (Gordillo et al., 2002), aunque al tratarse de una especie de crecimiento lento las
tasas son inferiores a las del presente estudio.
Los resultados demostraron que C. caespitosa fue la especie con mayor afinidad por el
NO3-, donde el NO3
- interno aumentó respecto a las muestras iniciales, indicando que la
incorporación de NO3- a corto plazo tiene efectos a nivel de composición interna en esta
especie. Pese a la menor afinidad de B. scorpioides por el NO3- respecto al NH4
+, este valor es
superior al de C. caespitosa, lo que sugiere que B. scorpioides puede ser más eficiente en el
rango de bajas concentraciones. En cambio, C. caespitosa a la mayor concentración posee una
49
Discusión
capacidad de incorporación superior, debido a su cinética bifásica, todo lo contrario de lo que
ocurre en B. scorpioides para el NH4+.
La inhibición de la incorporación de NO3- en presencia de NH4
+ que se observó en C.
caespitosa es frecuente en macroalgas (Haines y Wheeler, 1978; Thomas et al., 1985; Thomas
y Harrison, 1987; Smit, 2002), pues la asimilación del NH4+ requiere un menor coste
energético respecto al NO3- (Syrett, 1981; Turpin, 1991). No obstante, la inhibición fue
significativa a partir de cierta concentración, como ocurre en otras rodofíceas (D'Elia y
DeBoer, 1981). En cambio, el aumento de la tasa de incorporación de NO3- en B. scorpioides
no puede explicarse a través de este mecanismo, como ocurre en otras especies en las cuales
la incorporación de NO3- tampoco se inhibe por la presencia de NH4
+ (Bird, 1976; Hanisak y
Harlin, 1978; Harrison et al., 1986). Por un lado, cierta limitación en N puede evitar el efecto
inhibidor del NH4+ sobre el NO3
-, como ocurre en Fucus gardnieri (Thomas y Harrison, 1987),
de modo que si la limitación es muy alta, las tasas de incorporación de NH4+ y NO3
- pueden
mantenerse de forma simultánea (Thomas, 1983). Por otro lado, Rees et al. (2007) indican
que la aclimatación de una especie a un medio con elevadas concentraciones de NH4+, como
es el estuario del río Palmones, puede ser el responsable de una insensibilidad de la enzima
nitrato reductasa a la inhibición por el NH4+, lo que parece ser la explicación más plausible en
este estudio.
En la incorporación de PO43- en ambas especies se obtuvieron cinéticas bifásicas, que
aparecen en algunas macroalgas (Gordillo et al., 2002; Martínez y Rico, 2004), e incluso
trifásicas (Friedlander y Dawes, 1985). Lomas y Glibert (1999) atribuyen la escasez de
referencias sobre este tipo de cinéticas al uso de rangos de bajas concentraciones, tal como
ocurre en el presente estudio, ya que en muchos casos se eligen en base a las
concentraciones naturales del hábitat. En este caso la presencia de este tipo de cinética
demuestra que pese al estrecho rango de variación anual en la concentración de PO43- en el
estuario, ambas especies pueden integrar pulsos de altas concentraciones de PO43-, en
especial C. caespitosa, según la alta afinidad que mostró. Los valores de afinidad en la
segunda fase de la cinética fueron superiores a los de otras algas procedentes de ambientes
eutróficos, e incluso a algunas clorofíceas (Runcie et al., 2004). No obstante, los parámetros
cinéticos de la fase de saturación no difieren mucho de las de especies procedentes de
medios oligotróficos (Wallentinus, 1984; De Boer, 1981; Pedersen et al., 2010).
Más allá de las cuestiones fisiológicas, las diferencias encontradas entre las especies en
la incorporación de los nutrientes guardan relación con las posiciones que ocupan en la
zonación del intermareal del estuario, de forma similar a la que se ha observado en especies
50
Discusión
del intermareal rocoso (Phillips y Hurd, 2004). La disponibilidad de nutrientes es más limitada
en la zona del intermareal superior, encontrándose en ellas especies con mayor afinidad por
la principal fuente de nitrógeno debido al menor tiempo que se encuentran en inmersión. En
el estuario del río Palmones, al ser el NH4+ la principal fuente de N, B. scorpioides muestra
mayor afinidad por éste, de forma similar a las respuestas cinéticas de algas de ambientes
ricos en NO3- que presentan mayores afinidades por este otro (Phillips y Hurd, 2004).
En cuanto a la influencia de los aspectos morfológicos sobre las diferencias halladas
entre las especies, la mayor tasa de incorporación de NH4+ de B. scorpioides no puede
atribuirse a una mayor relación SA:V, ya que fue menor que en C. caespitosa. En base a la
correlación positiva que Rosenberg y Ramus (1984) encuentran entre las tasas de
incorporación de NH4+ y dicha relación, se estimarían valores de SA:V entre 9 y 30 cm -1. La
relación SA:V para C. caespitosa se encuentra en el rango esperado, al igual que ocurre en
otras especies (Hein et al., 1995; Taylor et al., 1998; Pedersen et al., 2004); sin embargo, este
valor de SA:V fue muy bajo en B. scorpioides respecto a las altas tasas de incorporación de
NH4+ que se observaron, al igual que en otras rodofíceas (Wallentinus, 1984). En relación a la
posición más alta que B. scorpioides ocupa en la zonación del intermareal estuárico, es
probable que la menor relación SA:V le permita reducir las pérdidas hídricas (Rosenberg y
Ramus, 1984; Hurd y Dring, 1990). Sin embargo, aunque esta supervivencia según Raven
(1982) conlleva un coste de superficie metabólicamente activa, no parece afectar a las tasas
de incorporación de NH4+.
Los valores de afinidad y tasas de incorporación de NH4+ en B. scorpioides, y por el NO3
- y
PO43- en C. caespitosa, no se encuentran muy alejados de los que alcanzan algunas de las
especies empleadas en biorremediación de efluentes con alto contenido en N y P (O'Brien
y Wheeler, 1987; Lavery y McComb, 1991). Estas especies son fundamentalmente clorofíceas
del género Ulva y rodofíceas de los géneros Porphyra y Gracilaria (Neori et al., 2004), debido a
su alta eficiencia en la incorporación de nutrientes, altas tasas de crecimiento e interés a nivel
comercial. Hay que considerar que las tasas y cinéticas de incorporación de nutrientes se han
calculado en el rango de concentraciones del estuario, bastante bajas respecto a las cargas
de N y P de los efluentes de acuicultura. No obstante, en tales aguas la mayor carga de N es
en forma de NH4+, ante lo cual B. scorpioides presenta una mayor idoneidad para este tipo de
aplicaciones, sin tener en cuenta otros aspectos como su tasa de crecimiento y su eficiencia
de biofiltración a escalas mayores.
51
Discusión
4.2 Relación entre la disponibilidad de nutrientes, las reservas internas y las
cinéticas de incorporación de N y P total
La disponibilidad de nutrientes para las rodofíceas del estuario, plantea una situación
compleja de analizar. Las claves para comprender los procesos que en él ocurren son los
cambios estacionales en las concentraciones de los nutrientes (Izquierdo, 2001), las
fluctuaciones diarias por los ciclos mareales (Clavero et al., 1997, 1999) y el progresivo
aumento de la eutrofización (Niell et al., 2005). Las concentraciones de nutrientes medidas
en el agua del estuario fueron consistentes con las de Izquierdo (2001), las cuales se incluyen
en la tabla 4.1. El NH4+ es la especie de N mayoritaria en la columna de agua al igual que en
otros estuarios (Sharp et al., 1982) y experimenta las mayores fluctuaciones. El NO3-, se
encuentra en menores concentraciones excepto en verano y sus cambios son menores (Tabla
4.1). El PO43- apenas alcanza un máximo de 5 µM y se mantiene más estable durante todo el
año.
Tabla 4.1 Concentraciones medias estacionales de cada nutriente en el agua del estuario, ade
Izquierdo (2001) y bdel presente estudio, expresadas en µM de nutriente y contenido en N y P (% PS) e
índices C:N, N:P (razón molar) en muestras de B. scorpioides y C. caespitosa tomadas in situ.
Otoño-Invierno Primavera Verano
NH4+ 77a-85b 5b-7a 2a
NO3- 15b-35a 2b-3a 12a
PO43- <1a 2a 3a-5b
%N
%P
4.7
0.50
3.71
-
2-3
0.15-0.30
C:N
N:P
7.7
16
9.6
-
11
18 1 Ejemplares de B. scorpioides recolectados en mayo, empleados en la incorporación de NH4
+.
La tabla 4.1 muestra el contenido en N y P total medido en las algas en diferentes
períodos del año. Estos datos no se han incluido en los resultados debido a que aquí se
comparan con datos de estudios previos. A corto plazo, en los experimentos de
incorporación de nutrientes, los resultados de composición interna no mostraron diferencias
incluso habiéndose empleado concentraciones de nutrientes superiores a las medias del
estuario. Sin embargo, la comparativa a largo plazo pone en evidencia que las variaciones
estacionales en la concentración de nutrientes en el agua sí repercute de forma significativa
en el contenido total de N y P en los tejidos, lo que también se ha observado en otras algas
de estuario (Gordon et al., 1981; Pedersen y Borum, 1996). Cabe señalar que los cambios
estacionales en la composición elemental no es un factor que afecte a la variabilidad de los
52
Discusión
resultados obtenidos en los experimentos de incorporación de nutrientes, pues las algas
empleadas se recolectaron durante los meses invernales, excepto los ejemplares de B.
scorpioides empleados en la incorporación de amonio (Tabla 4.1).
Ambas especies mostraron una composición similar, con un índice C:N de 7.7 y N:P de
16, un 4.7% PS de N y 0.5% PS de P, que corresponden al período de máximas
concentraciones de N total (100 µM de N total). Así mismo, la disminución en el contenido
total de N durante la época estival guarda relación con las menores concentraciones en la
columna de agua, alcanzándose un 2.5% en B. scorpioides y un 2% en C. caespitosa. Estos
valores a pesar de ser bajos no se consideran limitantes para el crecimiento, pues son iguales
o superiores al 2% (Hanisak, 1979). Las muestras de B. scorpioides tomadas a finales de
primavera con un 3.7% PS de N, ofrecen un valor intermedio entre los anteriores. La
homogeneidad de resultados se debe probablemente a que los ejemplares de B. scorpioides y
C. caespitosa se tomaron de la franja intermedia de la zonación en el estuario, donde la
disponibilidad de nutrientes para ambas especies es la misma.
Los porcentajes de N y P obtenidos comparados con los que encuentra Duarte (1992)
entre 46 especies de macroalgas indican que las rodofíceas del estuario del río Palmones
cuentan con un alto porcentaje de N y P; sin embargo, el contenido en N y P respecto al
carbono, se encuentra en una proporción más próxima a la del fitoplancton (106:16:1)
(Redfield et al.,1963), que a la que Duarte (1992) o Atkinson y Smith (1983) señalan para
macroalgas (800:49:1 y 550:30:1, respectivamente), lo que indica de nuevo que el
crecimiento de estas especies no estaría limitado por N o P.
El valor de N:P permaneció constante todo el año y próximo al que Lapointe et al.
(1992) determinan en macrófitos de zonas templadas. De acuerdo con la clasificación que
Björnsäter y Wheeler (1990) realizan para este índice, no estarían limitadas ni en N ni en P en
el estuario en ninguna época del año. En el estuario del río Palmones las concentraciones de
fósforo son menos variables que las de nitrógeno total, por lo que el mantenimiento del
índice N:P nos indica que la ratio entre estos nutrientes se mantiene a lo largo de las
estaciones.
En cuanto al porcentaje de P de las rodofíceas del presente estudio (0.48 a 0.58 % PS),
es superior al de algas de medios eutróficos tropicales (Fong et al., 2003) y próximo a los que
Lourenço et al. (2006) determinan en B. radicans. En tal caso, B. radicans procede de un
medio eutrófico de similares concentraciones de nutrientes al de este estudio, aunque con
un contenido en N total bastante superior al encontrado en este estudio (6.6-9% PS). En este
sentido, el alto contenido en N y P total que puede atribuirse al actual grado de eutrofización
del estuario del río Palmones (Niell et al., 2005), similar a la relación que Peckol et al. (1994)
encuentran en zonas con diferente carga de N.
53
Discusión
Ahora bien, ¿qué relación existe entre las respuestas cinéticas a los nutrientes y
las variaciones estacionales en la columna de agua? En el estuario, el NH4+, NO3
- y PO43-
están simultáneamente disponibles, aunque en diferentes proporciones a lo largo del año
(Tabla 4.1). Como respuesta a esas fluctuaciones en la concentración o en la disponibilidad de
los nutrientes, se ha observado que las rodofíceas del estuario del río Palmones emplean
mecanismos bifásicos a través de los cuales aprovechan más versátilmente los nutrientes.
Las tasas obtenidas en la simultánea incorporación de las dos especies de N serían más
próximas a las reales, en este caso comparándolas en términos de N total (NO3- + NH4
+). La
primera fase de saturación a concentraciones menores a 40 µM de N total proporcionó un
valor de Km relativamente bajo, que sugiere el funcionamiento de este mecanismo entre los
meses de primavera y verano, cuando el N total disponible en el medio está entre los 7 y 14
µM; además, la concentración necesaria para que se produzca incorporación (PCN) se
encuentran incluso en la época estival, cuando se producen las menores concentraciones en
el estuario.
En el caso del P las concentraciones son menores a 5 µM durante todo el año
(Izquierdo, 2001). El valor de Km para C. caespitosa, fue muy próximo a los 3 µM de
concentración media de P en el estuario, mientras que B. scorpioides precisa de una
concentración al menos tres veces superior en términos de Km, que a su vez, es próxima a los
valores máximos cercanos a 5 µM, que sólo se alcanzan en meses invernales. Este hecho
demuestra por un lado, la enorme diferencia entre C. caespitosa, cuya afinidad por el PO43- es
ocho veces mayor que en B. scorpioides, y por otro, que en base a las concentraciones de
PO43-, éste puede ser limitante para B. scorpioides y no para C. caespitosa. Ahora bien, a
concentraciones superiores a los 40 µM de N total B. scorpioides ha demostrado una
capacidad de integración de pulsos de nutrientes superior a C. caespitosa, con una tasa que
duplica la de esta última a 80 µM N total y una afinidad cuatro veces superior según las
pendientes obtenidas en la segunda fase lineal. Las altas concentraciones que se producen
en la época de lluvias, pondrían en funcionamiento la segunda fase de las cinéticas tanto de
N como de P, coincidentes con los máximos de 120 µM de N total que se alcanzan en invierno
en el estuario. Hay que señalar que en C. caespitosa no encontramos cambios significativos en
la tasa a 40 y a 80 µM. De esta forma se predice que en los períodos con bajas
concentraciones de N la interacción entre las especies será mayor que en los episodios de
altas concentraciones, pues en ellos la incorporación de C. caespitosa se satura prácticamente
y la ventaja es clara para B. scorpioides.
Prestando atención a la zona de convergencia entre la marisma, el estuario y el
sedimento donde se encuentran B. scorpioides y C. caespitosa, cabe la posibilidad de que estas
especies incorporen nutrientes de algún otro compartimento del ecosistema. Caulerpa
54
Discusión
cupressoides (Williams,1984) es capaz de incorporar el NH4+ desde el sedimento como
mecanismo que remedia la limitación en N en la columna de agua cuando existe, siendo el
valor de Km próximo a la concentración de NH4+ en el agua intersticial, lo que justifica esta
capacidad. En ese sentido, si en la columna de agua las concentraciones de PO43-
normalmente no superan los 5 µM, ¿qué suponen las elevadas tasas de incorporación en la
segunda fase de la cinética bifásica para el PO43-? Catenella caespitosa incorpora el doble de
PO43- con un 60% más de afinidad que B. scorpioides, y además toma mayor contacto con el
lecho de sedimento, en cuya agua intersticial se han medido concentraciones de hasta 112
µM (Ruiz, 2008) y la existencia de flujos desde el mismo (Clavero et al., 2000). La eficiencia a
elevadas concentraciones plantea la hipótesis de que esta especie también podría utilizar el
PO43- del agua intersticial del sedimento. En el caso del N, en el agua intersticial del
sedimento de la marisma se alcanzan concentraciones de NH4+ de 134 a 1500 µM (Palomo,
2004), mientras que la retención de apenas un 15% del NO3- por el sedimento origina
concentraciones que no difieren de las que encontramos en la columna de agua (entre 1 y 18
µM), respecto a lo cual no es sencillo sugerir una hipótesis.
4.3 ¿ Son B. scorpioides y C. caespitosa potenciales especies indicadoras
de la eutrofización del estuario del río Palmones?
Sin duda, resulta complejo determinar cuál es la concentración de nutriente
biológicamente disponible para la incorporación y asimilación (Lyngby, 1990), un punto
importante en estudios fisiológicos de macrófitos (Harrison y Hurd, 2001). En este trabajo se
han evaluado los índices C:N y N:P, así como el porcentaje de N y P en los tejidos, que han
demostrado una buena relación con las concentraciones del agua, a excepción del índice N:P,
que no mostró cambios a lo largo de las estaciones. Al igual que otros estudios, los
resultados que hemos obtenido pueden proporcionar datos completos en estudios a largo
plazo (Cohen y Fong, 2005; Lourenço et al., 2006; Huntington y Boyer, 2008), debido a la
capacidad integradora de las especies empleadas, planteándose como un complemento al
muestreo directo en la columna de agua. No obstante, estos valores proporcionan una
medida puntual de la calidad de la materia (Redfield et al., 1963), siendo la medida de los
flujos de nutrientes existentes entre las tasas de incorporación, asimilación y acumulación
integrado en un período de tiempo, lo que constituye la clave necesaria para evaluar el
potencial indicador de estas especies.
La principal divergencia entre los autores en cuanto a la selección de una especie como
indicadora de la presencia o exceso de nutrientes en el agua está basada en la estrategias de
incorporación de nutrientes, comúnmente asociada a tipos funcionales de algas (Litter y
Litter, 1984). Los resultados obtenidos han demostrado que las rodofíceas del estuario del
55
Discusión
río Palmones poseen la capacidad de incorporar y acumular N y P en exceso, respuestas
ecofisiológicas frecuentes en otras rodofíceas como Gracilaria spp. (Fujita, 1985). Esta
estrategia frente a las de especies oportunistas supone una ventaja competitiva (Anderson
et al., 1996), pues su posterior movilización permite el mantenimiento de las funciones
vitales durante períodos de escasez de nutrientes.
Un punto clave en este estudio es que aunque los valores de C:N han sido similares, sí
se han encontrado diferencias claras en las cinéticas de incorporación de nutrientes, que
arrojan mayor luz a la hora de interpretar los valores observados. Las dos rodofíceas de este
estudio según la teoría de Grime (1977) se considerarían especies perennes, propias de
estadíos más avanzados de la sucesión. En relación con las respuestas a los cambios en la
concentración de nutrientes, poseen capacidad de integrar pulsos de estos a largo plazo, al
contrario que las especies oportunistas cuya respuestas es más a corto plazo según sus altas
tasas de asimilación (Fong et al., 1994; Liliesköld Sjöö y Mork, 2009). Sin embargo, desde el
punto de vista de la incorporación de nutrientes, hemos encontrado valores de afinidad por
el N en B. scorpioides muy próximos a los de especies oportunistas, y para el P en el caso de C.
caespitosa, lo que puede permitir una mejor identificación de las fuentes de contaminación
en cada caso en particular.
Puesto que los mayores cambios en la carga de nutrientes se producen en el N, B.
scorpioides permitiría en un menor tiempo detectar estos cambios debido a su mayor
capacidad de respuesta. En el caso de C. caespitosa, una idea similar la sostienen Runcie et al.
(2003, 2004) para Catenella nipae, en base a la gran capacidad de almacenaje que poseen y
menores tiempos de renovación, así como Melville y Pulkownik (2006) para B. moritziana o B.
tenella. Además de la relación encontrada entre los nutrientes en los tejidos y las
fluctuaciones estacionales o la capacidad que poseen B. scorpioides y C. caespitosa para
integrar amplios rangos de concentraciones, cumplen otros criterios que hacen que sean
adecuadas para su uso como indicadores: Son especies subcosmopolitas (Dixon y Irvine,
1977), que pueden compararse con poblaciones de otras regiones (Jones et al., 1996);
pueden resistir un amplio rango de condiciones ambientales (salinidad, temperatura,
desecación), lo que las hace resistentes a períodos adversos y que puedan encontrarse
durante todo el año; su recolección es barata y sencilla; y previamente se ha determinado la
capacidad de acumulación de metales en las mismas especies (Henriques, 2009).
Por otro lado, a la hora de aplicar otros índices o métodos actualmente empleados en
la evaluación de la eutrofización, las particularidades biogeográficas y ecológicas del estuario
del río Palmones imponen las principales limitaciones. Por ejemplo, los métodos propuestos
por Wilkinson et al. (2007) o García et al. (2009) están basados en la distribución de especies
56
Discusión
de macrófitos que se restringen a estuarios con mayor influencia atlántica (el caso de las
Fucáceas), o que actualmente están ausentes en el estuario del río Palmones, como la
fanerógama Zostera noltii (Peralta et al., 2000), clara evidencia de la eutrofización del
estuario. Cabe señalar que respecto a la presencia o ausencia de las rodofíceas aquí
estudiadas, C. caespitosa no se considera una especie ni tolerante ni sensible frente a la
presencia de un foco contaminante (Sfriso, 2009), por lo no puede considerarse un buen
indicador por su mera presencia como ocurre con las fanerógamas.
En otros casos lo más interesante es determinar la predominancia de una determinada
especie en la comunidad, lo cual es difícil de evaluar, excepto cuando es evidente. En este
estudio, la cuantificación de la biomasa o el porcentaje de cobertura de las rodofíceas resulta
difícil de determinar, debido a que no se distribuyen en un horizonte continuo sobre una
superficie uniforme. Por este motivo y también debido al menor número de especies, los
índices basados en la composición de especies como el índice RSL (Reduced Species List),
propuesto por Wells et al. (2007) y adaptado por Bermejo et al. (2012) a las costas atlánticas
andaluzas, tampoco resulta de utilidad para el estuario.
Desde esta perspectiva, la detección de especies oportunistas asociadas a aumentos en
la concentración de nutrientes del medio, parece ser de todos estos métodos el único que
adecuado para el estudio de la eutrofización en el estuario del río Palmones (Scanlan et al.,
2007; WFD-UKTAG, 2009). La capacidad de desplazamiento que presentan estas especies se
debe mayormente a la gran capacidad de incorporación de nutrientes que poseen (Lavery y
McComb, 1991; Fong et al., 1996). No obstante, otros factores ecofisiológicos se han de
tener en cuenta como por ejemplo la combinación de condiciones abióticas favorables como
temperatura, viento y corrientes (Liu et al., 2009) así como la acción de factores bióticos.
Como ejemplo encontramos casos en los que la relación entre la dominancia de
determinadas especies y la capacidad de incorporación no es tan evidente, debido a la acción
de herbívoros (Lotze y Schramm, 2000).
Actualmente los efectos que la progresiva eutrofización del estuario del río Palmones
(Clavero et al., 1997, 1999; Niell et al., 2005) puede tener sobre las especies de rodofíceas
aquí estudiadas se desconocen, sobre todo en relación con las modificaciones que podrían
generar en la estructura de la comunidad (Duarte, 1995). Es evidente que la sustitución de las
comunidades perennes por oportunistas indican un deterioro de la calidad de las aguas
(Mercado, 2011), siendo la consecuencia final de los múltiples efectos adversos del
incremento de biomasa y porcentaje de cobertura de estas especies en estuarios. En el
estuario del río Palmones se han observado extensas proliferaciones de especies de Ulva,
que recubren todo el intermareal de forma ocasional. Los principales cambios se producen
57
Discusión
por el efecto de dosel que ejerce sobre otros organismos (Hernández et al., 1997), que en el
estuario del río Palmones afecta en mayor medida a C. caespitosa debido a su relativa
posición inferior en el intermareal del estuario (observación personal). Además, estas
proliferaciones ocasionan sobreproducción de materia orgánica, que conduce al
agotamiento del oxígeno en la columna de agua y la producción de sulfhídrico en los
sedimentos, ocasionando un empobrecimiento en la calidad del agua debido a la
proliferación de bacterias heterotróficas (Valiela et al., 1997; Fong et al., 2011).
Según la Directiva Marco de Agua (2000/60/CE) la evaluación del estado ecológico
debe estar basada en tres clases de indicadores: hidromorfológicos, fisicoquímicos y
biológicos. Estos últimos indicadores hacen referencia a la composición y abundancia de la
flora acuática y el fitoplancton, donde se enmarcarían las especies de rodofíceas estudiadas.
La normativa recomienda que el control de las poblaciones de macroalgas sea cada 3 años, y
en el caso de los índices fisicoquímicos cada 3 meses. En base a los resultados de este
estudio, se propone al menos un muestreo trimestral para el análisis del contenido en
nutrientes en los tejidos de las rodofíceas, con el fin de obtener en el futuro información más
detallada acerca de las tendencias a largo plazo. La adecuada estrategia de muestreo en tal
caso será de vital importancia, atendiendo a la homogeneidad de la franja de recolección de
los ejemplares en la zonación intermareal y al estudio a lo largo de gradientes para la
detección de focos de contaminación. Si bien, para una completo estudio de la eutrofización
es necesaria la integración de diversos indicadores (Karr & Chu, 1999), lo que también
concluye un reciente estudio acerca del origen de la materia orgánica en el río Palmones
(Arrojo, 2012).
La caracterización las cinéticas de incorporación de nutrientes de las dos especies
estudiadas ha permitido a través de este estudio identificar los aspectos que hacen
apropiado su uso como indicadores de la eutrofización del estuario del río Palmones. Estas
especies son capaces de retirar nutrientes a corto plazo, siendo conocido también su función
como organismos bioacumuladores de metales (Henriques, 2009). De esta forma
desempeñan un papel biorremediador relevante que puede ser abordado desde dos puntos
de vista:
(1) Ambiental, aminorando los efectos de la eutrofización y la contaminación, al igual
que la vegetación halófita del estuario (Palomo et al., 2004; Muñoz y Niell, 2009).
(2) Biotecnológico, puesto que el conocimiento de las bases fisiológicas de estas
especies abre nuevas puertas a futuras aplicaciones en biorremediación de efluentes dirigido
a la obtención de productos de valor añadido, como aminoácidos tipo micosporina con
58
Discusión
efecto antioxidante (Karsten et al., 2000), tal como se ha encontrado en B. scorpioides, o
carragenatos (Datta y Datta, 2004) en el caso de C. caespitosa, ambas sustancias de interés en
la industria bioquímica.
Sin duda son múltiples los factores fisiológicos a considerar en el cultivo a macroescala
de macroalgas, como son el historial nutricional, las tasas de crecimiento y la densidad del
cultivo óptima, profundidad de tanque, tasa de renovación del agua o frecuencia de
cosechado (Chopin et al., 2001). Sin embargo, en lo relativo a la fisiología de nutrientes es
fundamental determinar si el objetivo es la producción de biomasa o la depuración de
efluentes. En el primer caso, el principal factor a controlar es precisamente las tasas de
incorporación de nutrientes, tal como se han estudiado para las rodofíceas del presente
trabajo, lo que conlleva una pérdida en la eficiencia de eliminación de nutrientes del medio.
En el segundo caso en cambio, el cultivo estará orientado a obtener las máximas eficiencias
de remoción de nutrientes. No obstante, es posible alcanzar soluciones intermedias que
permitan alta producción de biomasa y depuración al mismo tiempo (Neori et al., 1996).
59
5. Conclusiones
Conclusiones
5. Conclusiones
5.1 Bostrychia scorpiodes y C. caespitosa presentan claras diferencias en las tasas de
incorporación de nutrientes. Bostrychia scorpioides posee una mayor Vmáx y
afinidad por el amonio, mientras que C. caespitosa presenta una mayor capacidad
para incorporar nitrato.
5.2 La presencia de nitrato disminuye la incorporación de amonio en ambas especies.
En cambio, la adición de amonio produce un aumento en la incorporación de
nitrato en B. scorpioides y una disminución en C. caespitosa.
5.3 Ambas especies muestran cinéticas bifásicas en la incorporación de N total,
presentando B. scorpioides mayores tasas que C. caespitosa, sólo a altas
concentraciones, mientras que Catenella caespitosa muestra una afinidad por el P
ocho veces superior que B. scorpioides.
5.4 El índice C:N de las dos especies varía estacionalmente con máximos en verano y
muestra correlación con la menor carga de nitrógeno de los meses estivales,
mientras que el N:P permanece constante durante todo el año.
5.5 B. scorpioides debido a su mayor afinidad por el N presenta mayores ventajas en su
uso como indicador del contenido de N en el medio, y C. caespitosa en el caso del
P.
5.6 Ambas especies cumplen los principios de la biotecnología ambiental en cuanto a
su potencial biorremediador, la producción de compuestos de alto valor añadido y
los beneficios al medio ambiente.
63
Conclusiones
64
6. Bibliografía
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