expresiÓn de proteÍnas en...
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Levaduras E. coliCel. Eucariotas superiores
Producción de proteínas biofarmaceúticas
Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17.
Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad Levaduras transformacióna mitóticab Integrativo Yip ADN homólogo 102 > 1 0,1% Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable rADN rADN nd 100-200 Estable Episomal Replicación ARS 104 1-20 20% (YRp) Centromérico ARS/CEN 104 1-2 1% (YCp) Basados en 2µ ORI, STB, en 104 25 2-8% (YEp) huésped 2µ (Yep13) ORI, STB,REP1, REP2 104 50-100 0,6-1,8% FLP huésped 2µ0 (pJDB248) ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26% en huésped 2µ0 (pJDB219 ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20% D,FLP en huésped 2µ0
(pJB205) a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo
Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad Levaduras transformacióna mitóticab Integrativo Yip ADN homólogo 102 > 1 0,1% Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable rADN rADN nd 100-200 Estable Episomal Replicación ARS 104 1-20 20% (YRp) Centromérico ARS/CEN 104 1-2 1% (YCp) Basados en 2µ ORI, STB, en 104 25 2-8% (YEp) huésped 2µ (Yep13) ORI, STB,REP1, REP2 104 50-100 0,6-1,8% FLP huésped 2µ0 (pJDB248) ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26% en huésped 2µ0 (pJDB219 ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20% D,FLP en huésped 2µ0
(pJB205) a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo
Marcadores de selección
1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en cepas auxotróficas.
Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficaspara leucina, triptofano, uracilo e histidina
2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de cepas.
Ej: Tn903kanr: selección con G418DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamidaCmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol
Promotores y terminadores transcripcionales
Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables
Ej: PGK: fosfoglicerato quinasaGAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasaADH: alcohol deshidrogenasaSon inducidos varias veces por glucosa
Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados.Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa
Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL
Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2
Secreción de proteínas en Saccharomycescerevisiae
¿Para qué?
Plegamiento correctoEvitar efectos tóxicosFacilita la purificación
Péptido señal péptido N-terminal hidrofóbicopropio de levaduras
MF1: feromonaSUC2: invertasaPHO5: fosfatasa ácida
MF1Proteína de 165 aa: prepro factor
Procesamiento: clivaje del péptido señalcorte de Lys-Arg por KEX2remoción de pares Glu-Ala por diaminopeptidasa STE1remoción de Lys-Arg terminal por KEX1
Construcción del gen para expresar en levaduras
• 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son inhibitorias de la iniciación de la traducción
• 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentementeAAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción
• 3- Uso de codones propios del sistema
• 4- Usar ADNc
• 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc.
• 6- Incluir sitios de restricción para el clonado
Expression of tetanus toxin fragment C in yeast: genesynthesis is required to eliminate fortuitous polyadenylationsites in AT-rich DNAMichael A.Romanos*, Andrew J.Makoff, Neil F.Fairweather, Katrina M.Beesley, Debbie E.Slater,Fred B.Rayment, Mike M.Paynel and Jeffrey J.ClareDepartments of Molecular Biology and 'Protein Chemistry, Wellcome Biotech, Langley Court,Beckenham, Kent BR3 3BS, UK. Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 7 1461, 1991
Northern blotting
Glicosilación de proteínas
• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgidonde los hidratos de carbono sufren modificacines
• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También ocurre O-Glicosilación.
• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150 manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones terminales 1-3 glicano
•La mayoría son promotores constitutivos.
•Falta de promotores fuertes. El producto representa 1-5% del total de las proteínas producidas.
•Los promotores inducibles no producen grandes cantidades de mRNA cuando se desregulan.
•Inestabilidad plasmídica.
•Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.
Problemas asociados a la producción en S. c.
Casi todos los productos derivados de levaduras que están en el mercado son producidos en Saccharomyces cereviciae
2009: la FDA apueba la 1era proteína biofarmaceútica producida en una levadura distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreínaproducida en Pichia pastoris por Dynax Inc.
LEVADURAS METILOTRÓFICAS
• Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C
• Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente escalable a grandes volúmenes de producción
• La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles celulares.
• Sistema actualmente muy difundido
•Son las primeras enzimas del camino metabólico de metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.
•A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de homología
•AOX esta constituída por un octámero de subunidadesidénticas a las que se le unen moléculas de FAD.
ALCOHOL OXIDASA
PEROXISOMA CITOSOL
CH3OHO2 AOX GSH FDH
H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2CATALASA FLDH NAD NAD
1/2O2 + H2O DHAS NADH2 NADH2Xu5P
GAP DHA 1/3 GAP constituyentes
DHA DHAP celularesATP
ADP FBP F6P
GAP P2
CH3OH
•AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células compensan esta baja actividad catalítica sintetizando grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable, mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de las proteínas celulares solubles.
•La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional.Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil
.
Métodos de transformación de Pichia pastoris
Método Frecuencia de Conveniencia Integración transformación (por µg) múltiple
Esferoplastos 105 Baja Sí
Electroporación 105 Alta Sí
PEG1000 103 Alta No
LiCl 102 Alta No
Medio MD Medio MM
Muts
Muts
Mut +
Selección de cepas recombinantesHis+Mut+ e His+Muts
Confirmación por PCR y Southern blot
Caracterización de la cepa productora
PCR: presencia y estabilidad del gen
Southern blot: Mut+/Muts
Dot Blot: Nº de copias del gen
PCR cuantitativa: Nº de copias del gen
Southern blot del gen His4
C219 C146 GS115 C112 C27 25 C146
7.400 pb-5.800 pb-4.800 pb-
2.700 pb-
2.800 pb-
8.000 pb-
El ADN genómico de los distintos clones recombinantes (C219, C146, C112, C27 y 25) y de las levaduras sin transformar (GS115) fue digerido con la enzima BglII. La sonda empleada para determinar la presencia del gen HIS 4 corresponde a un fragmento de 1,5 Kb del mismo.
gen endógeno
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos
Glicosilación de proteínas
• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgidonde los hidratos de carbono sufren modificacines
• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También ocurre O-Glicosilación.
• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150 manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones terminales 1-3 glicano
Se cortan las glucosas y una manosa α-1,2 y se transporta a Golgi en donde se adicionan otros azúcares y fosfato
La disposición del “sequon” en la estructura terciaria de la proteína es importante para la glicosilación:
“Competencia”: plegamiento vs. Glicosilación
Formación de puentes de H2
Cercanía a S-S (crecimiento de células con DTT)
Cercanía a COOH terminal (menos tiempo para glicosilarse)
Estabilidad de la estructura secundaria (pro péptido)
Disposición tridimencional de los sequones en la proteína, sobre todo cuando están cerca (glicosilación del 1º puede alterar al 2º)
Disponibilidad de precursores: oligosacárido dolicol, transferasa
Glicosilación y estabilidad de la proteína
En algunos casos la glicosilación confiere termoestabilidad: calor o frío
Puede conferir estabilidad estructural:Evitando proteólisisAyudando con el plegamiento correcto
Ser/Treo
α - manosa
α – 1,2 manosa
O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS
Sequon? Abundancia inusual de ser/treoProlinas cerca de ser/thraa cargados cerca de ser/treo
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos
Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras, pueden tener efectos inmunogénicos en humanos
Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras
TunicamicinaCepas mutantes
Enzimas para desglicosilarNo usar la vía de secreción
Mutagénesis dirigida
La productividad de un sistema recombinante estádeterminada por muchos factores genéticos y fisiológicos.
Posibles cuellos de botella:
Uso de codones
Número de copias del gen
Transcripción eficiente usando promotores fuertes
Señales de traducción
Translocación determinada por el péptido señal
Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi
Secreción
Proteólisis
A Single Mutation in the Activation Site of Bovine TrypsinogenEnhances Its Accumulation in the Fermentation Broth of the
Yeast Pichia pastorisJosé Hanquier,1 Yannick Sorlet,2 Dominique Desplancq,2 Laurence Baroche,2 Marc Ebtinger,3 Jean-François Lefèvre,2 Franc
Pattus,2 Charles L. Hershberger,1 and Alain A. Vertès3* Lilly Research Laboratories,Applied and Environmental Microbiology, February 2003, p. 1108-1113, Vol. 69, No. 2
Engineering of Pichia pastoris for Improved Production ofAntibody FragmentsBrigitte Gasser,1 Michael Maurer,1 Johannes Gach,1 Renate Kunert,1 Diethard Mattanovich1,2Biotechnology and Bioengineering, Vol. 94, No. 2, June 5, 2006
Retención de la cadena pesada, pero no de la liviana, del Fab a lo largo de la fermentación el plegamiento de la proteína y el ensamblado del dímero en el RE son pasos limitantes en la secreción del Fab
1- Uso de AOX1 vs GAP
2-