expression antimikrobieller peptide in der synovialis der ... · aqua dest. lat. aqua destillata,...

AusderKlinikfürDermatologie,VenerologieundAllergologie

(Direktor:Prof.Dr.ThomasSchwarz)

imUniversitätsklinikumSchleswig‐Holstein,CampusKiel

anderChristian‐Albrechts‐UniversitätzuKiel

ExpressionantimikrobiellerPeptideinder

SynovialisderPsoriasis‐Arthritis,bei

rheumatoiderArthritisundOsteoarthrose

sowieinderHautderPsoriasis

Inauguraldissertation

zur

ErlangungderDoktorwürde

der

MedizinischenFakultätderChristian‐Albrechts‐UniversitätzuKiel

Vorgelegtvon

HenrikeEdithTessieBierkarre,geb.Kosfeld

ausWesterland/Sylt

Kiel2015

2

Referent: Prof.Dr.med.RegineGläser,KlinikfürDermatologie,

VenerologieundAllergologie

Koreferent: Prof.Dr.med.DeikeVaroga,MVZOrthopädieundChirurgie

TagdermündlichenPrüfung:24.November2016

ZumDruckgenehmigtKiel,den23.Juli2016

Gez.Prof.Dr.med.JohannRoider

3

FürmeineEltern

4

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................................................................7

1.Einleitung..........................................................................................................................................................................9

2.MaterialundMethoden...........................................................................................................................................11

2.1.Material.......................................................................................................................................................................11

VerwendeteChemikalien........................................................................................................................................11

PufferfürdieImmunhistochemie.......................................................................................................................11

Tris‐Base‐Saline(TBS)‐Puffer(Waschpuffer)............................................................................................11

Citratpuffer..............................................................................................................................................................12

VerwendeteAntikörperundKits........................................................................................................................12

VerwendeteAntikörper......................................................................................................................................13

VerwendeteKits.....................................................................................................................................................15

VerwendeteIsotypkontrollen..........................................................................................................................15

2.2.Methoden...................................................................................................................................................................16

Immunhistochemie....................................................................................................................................................16

HerkunftdesUntersuchungsgutes.................................................................................................................16

HerstellungderSchnittpräparate...................................................................................................................16

GrundlagenderImmunhistochemie.............................................................................................................16

Avidin‐Biotin‐Komplex(ABC)‐Methode.......................................................................................................17

AblaufderImmunhistochemie‐Färbung.....................................................................................................18

Kontrollen.................................................................................................................................................................20

BeurteilungderHautpräparate.......................................................................................................................21

BeurteilungderSynovialispräparate............................................................................................................23

Gesichtsfeldauszählung......................................................................................................................................23

Synovitis‐Score.......................................................................................................................................................24

Statistik...........................................................................................................................................................................26

DerexakteFishertest...........................................................................................................................................26

3.Ergebnisse.....................................................................................................................................................................27

3.1.ImmunhistochemieGelenke..............................................................................................................................27

Psoriasis‐Arthritis(PsA).........................................................................................................................................27

S100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37..........................................................................................................27

Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3..........................................................................................................28

RheumatoideArthritis(RA)..................................................................................................................................31

5

S100A8,S100A9undHNP1‐3........................................................................................................................31

Psoriasin,RNase7,hBD‐2,hBD‐3undLL‐37............................................................................................31

Osteoarthrose(OA)...................................................................................................................................................34

S100A9,HNP1‐3...................................................................................................................................................34

S100A8,LL‐37,Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3.........................................................................34

GesundeSynovialis....................................................................................................................................................35

S100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3.........................................................................................................35

Psoriasin,RNase7,hBD‐2,LL‐37...................................................................................................................36

3.2.ErgebnisseHaut......................................................................................................................................................38

ImmunhistochemiePsoriasisvulgaris..............................................................................................................38

S100A8,S100A9..................................................................................................................................................38

HNP1‐3undLL‐37................................................................................................................................................40

Psoriasin(S100A7)undRNase7...................................................................................................................42

hBD‐2undhBD‐3..................................................................................................................................................44

3.3.VergleichderImmunreaktivitätvonAMPinGelenk‐probenmittelsFishertest.........................46

3.4.ZusammenfassungderErgebnisse..................................................................................................................47

4.Diskussion.....................................................................................................................................................................49

4.1.Methoden...................................................................................................................................................................49

Untersuchungsmethoden........................................................................................................................................49

BeurteilungderHautproben.................................................................................................................................50

BeurteilungderGelenkproben.............................................................................................................................51

4.2.ErgebnisseGelenke................................................................................................................................................51

Psoriasis‐Arthritis(PsA).........................................................................................................................................51

RheumatoideArthritis(RA)..................................................................................................................................53

Osteoarthrose(OA)...................................................................................................................................................55

GesundeSynovialis....................................................................................................................................................57

4.3.TherapienderPatienten......................................................................................................................................58

4.4.VergleichderGelenkerkrankungen................................................................................................................59

AMP‐ExpressioninderMembranasynovialis..........................................................................................60

S100A8undA9......................................................................................................................................................60

HNP1‐3......................................................................................................................................................................61

LL‐37...........................................................................................................................................................................63

4.5.ErgebnisseHaut......................................................................................................................................................64

S100A8undS100A9..........................................................................................................................................64

HNP1‐3undLL‐37................................................................................................................................................66

6

PsoriasinundRNase7.........................................................................................................................................67

hBD‐2undhBD‐3..................................................................................................................................................68

4.6.VergleichHaut–Gelenk.......................................................................................................................................69

4.7.ZusammenfassungundAusblick......................................................................................................................71

Literaturverzeichnis......................................................................................................................................................76

Danksagung.......................................................................................................................................................................82

Lebenslauf..........................................................................................................................................................................83

Veröffentlichungen.........................................................................................................................................................84

7

Abkurzungsverzeichnis

ABC engl.avidin‐biotin‐complex,Avidin‐Biotin‐Komplex

AK Antikörper

AMP Antimikrobielle(s)Peptid(e)

Aquadest. lat.aquadestillata,destilliertesWasser

AZ Aktenzeichen

biot. biotinyliert

BSA BovinesSerumalbumin

C6H5Na3O7.2H2O NatriumcitrattribasischDihydrat

C6H8O7.H2O CitronensäureMonohydrat

CRP C‐reaktivesProtein

DMARD engl.diseasemodifyinganti‐rheumaticdrug,eineGruppe

antirheumatischerMedikamente

E.coli Escherichiacoli,Gram‐negativesBakterium

ERK extrazelluläreSignal‐regulierteKinase

etal. lat.etalii,undandere

Ges. Gesamt

H2O2 Wasserstoffperoxid

hBD humanesβ‐Defensin

HCl Salzsäure

HNP humane(s)neutrophile(s)Peptid(e)/Defensin(e)

IFN Interferon

IHC Immunhistochemie

IL Interleukin

JNK C‐junN‐terminaleKinase

l Liter

LL‐37 humanesCathelicidin(37Aminosäurenlang,beginnend

mitLeucin‐Leucin)

M molar

MAPK mitogen‐aktivierteProteinkinase

8

mg Milligramm

µg Mikrogramm

min lat.minutum,Minute(n)

µl Mikroliter

ml Milliliter

µm Mikrometer

MMP Matrix‐Metalloproteinase

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natronlauge

NSAID engl.non‐steroidalanti‐inflammatorydrug,nicht‐

steroidaleantiinflammatorischeMedikamente

OA Osteoarthrose

PASI engl.psoriasisareaandseverityindex,einScorezur

BewertungderKrankheitsaktivitätderPsoriasis

PsA Psoriasis‐Arthritis

PsV Psoriasisvulgaris

RA rheumatoideArthritis,syn.chronischePolyarthritis

RNase Ribonuklease

sec lat.secundo,Sekunde(n)

SELDI‐TOF‐MS engl.Surface‐EnhancedLaserDesorption/Ionization

Time‐Of‐FlightMassSpectrometry,eineMethodeder

Massen‐Spektrometrie

TBS engl.tris‐bufferedsaline,Tris‐gepufferteKochsalzlösung

TH‐Zelle T‐Helfer‐Zelle

TLR engl.toll‐likereceptor,Toll‐ähnlicherRezeptor

TNF Tumor‐Nekrose‐Faktor

Tris Tris(hydroxymethyl)‐aminomethan

v/v engl.volumepervolume,VolumenproVolumen

w/v engl.weightpervolume,MasseproVolumen

9

1.Einleitung

PsoriasiswirdnachdemheutigenKenntnisstandnichtmehrnuralseineErkrankung

der Haut, sondern als chronisch inflammatorische Systemerkrankung angesehen. Die

KomorbiditätderPsoriasisumfasstdabeimehrereErkrankungen,u.a.Krankheitendes

metabolischen Syndroms, Herz‐Kreislauferkrankungen, chronisch‐entzündliche Darm‐

erkrankungen, psychische Erkrankungen und die Psoriasis‐Arthritis (PsA). Von den

PatientenmitPsoriasisanderHautentwickelninDeutschlandungefähr30%einePsA

(Henes et al. 2014). Die PsA entwickelt sich dabei in der Regel erst nach den Haut‐

veränderungen,weshalbvielePatientenbereits jahrelang indermatologischerBetreu‐

ung sind,wenn sie arthritische Beschwerden entwickeln (Mease et al. 2014). Da eine

zusätzlichePsAdie Patientendeutlich stärker einschränkt als ein alleinigerBefall der

Haut(Reichetal.2009),istesvonhöchsterWichtigkeit,diePsAmöglichstfrühzeitigzu

diagnostizieren,umdieBehandlunganschließendraschbeginnenzukönnen.Umdieszu

ermöglichen, istdieErforschungderPathogenesebeiderEntitätenessenziell–welche

UnterschiedegibteszwischenderPsoriasisanderHautundderPsoriasisamGelenk?

WelcheFaktorenführennebenderDermatosezurArthritis?ZieldieserArbeitwares,

UnterschiedesowieGemeinsamkeitenzwischenderPsoriasisanderHautundderPso‐

riasisamGelenkinderExpressionantimikrobiellerPeptide(AMP)herauszufinden.

AlsAMPbezeichnetmaneine großeGruppevon endogenenProteinen, die vonvielen

Epithelzellen und spezialisierten Zellen des angeborenen Immunsystems gebildet

werdenkönnen.EvolutionsbiologischbetrachtetsindAMPsehralteMoleküle,diesich

sowohl bei Tieren als auch bei Pflanzen finden. Je nach Wirkspektrum können sie

bakterizid, viruzid oder fungizid wirken und ermöglichen Epithelien so einen wirk‐

samenSchutzvorderenUmwelt (Harderetal.2007).Sie sindhochaktivundkönnen

bereits in Konzentrationen im nano‐ oder mikromolaren Bereich wirksam werden

(Zasloff2002).

Diemenschliche Haut produziert konstitutiv AMP, um sich vor invadierendenMikro‐

organismenzuschützenundumihrebakterielleNormalflorazuregulieren(Braffetal.

2005).Dabei sindAMPnicht nur in gesunderHaut detektierbar, sondern auch in der

10

Haut verschiedener Erkrankungen wie der Psoriasis (Harder et al. 2005). In der

barrieregestörtenHautderPsoriasisläsionensindAMPstarkinduziertundschützendie

Haut äußerst wirksam vor Bakterien – so wirksam, dass Psoriasisläsionen seltener

infiziertwerdenalsgesundeHaut (Henseleret al. 1995).DieseklinischeBeobachtung

führte1997schließlichzurIsolationdeserstenantimikrobiellenPeptidesausmensch‐

licher Haut: dem humanen β‐Defensin hBD‐2 (Harder et al. 1997). Seitdem wurden

weitereAMPauspsoriatischerHautisoliert(HarderundSchröder2005).

Doch AMP wirken nicht nur antimikrobiell, sondern haben weitere Funktionen: Sie

können chemotaktisch auf Zellen des erworbenen Immunsystems wirken und ver‐

stärkensomitdieImmunantwort(Yangetal.2004).GegenstandaktuellerForschungist

dieRolle derAMP inderPathogenese verschiedensterKrankheitenwie derPsoriasis.

Beispielsweisewird hier demCathelicidinLL‐37unddemβ‐DefensinhBD‐2mit ihrer

Aktivierung plasmazytoider dendritischer Zellen ein wichtiger Beitrag zum Fort‐

schreiten der Pathogenese der Psoriasis zugeschrieben (Vergleich 4.5. HNP1‐3 und

LL‐37,S.66,und4.5.hBD‐2undhBD‐3,S.68).

Sostelltesich fürdievorliegendeArbeitdieFrage, inwieferndieAMP,die inderHaut

vonPsoriasisläsionenstarkinduziertsind,auchinderSynovialisderPsoriasis‐Arthritis

exprimiert werden – wie unterscheidet sich die AMP‐Expression psoriatischer Syno‐

vialisvonderpsoriatischerHaut,wogibtesGemeinsamkeiten?Insgesamt8AMP–Pso‐

riasin(S100A7),Ribonuklease7(RNase7),diehumanenβ‐DefensinehBD‐2undhBD‐3,

dasCathelicidinLL‐37,S100A8(CalgranulinA),S100A9(CalgranulinB)unddiehuma‐

nen α‐Defensine HNP1‐3 (humane neutrophile Peptide 1‐3)–wurden ausgewählt und

immunhistochemisch in Proben von Psoriasis vulgaris (läsionale und nicht‐läsionale

Haut von Psoriasispatienten sowie gesunde Kontrollen), Psoriasis‐Arthritis (PsA),

rheumatoider Arthritis (RA), Osteoarthrose (OA) und gesunder Synovialis untersucht.

Neben demVergleich der Psoriasis an der Hautmit der Psoriasis am Gelenkwurden

durchdieAuswahlvonProbenandererGelenkentitätenweitereVergleichemöglich:Der

derPsAmitderRA–zweierhochgradigerSynovialitiden,derderPsAmitderOA(einer

niedriggradigenSynovialitis)undderVergleichmitgesundenKontrollen.

11

2.MaterialundMethoden

2.1.Material

VerwendeteChemikalien

Aquadest. DeltaSelectGmbH,München;institutseigenerAutoklav

BovinesSerumalbumin(BSA) Sigma,Steinheim

C6H5Na3O7.2.H2O Merck,Darmstadt

C6H8O7.H2O Merck,Darmstadt

H2O2 Merck,Darmstadt

Ethanol BÜFA,Hude‐Altmoorhausen

Eukitt Kindler,Freiburg

Hämalaun Merck,Darmstadt

HCl Sigma,Steinheim

NaCl Merck,Darmstadt

NaOH Merck,Darmstadt

Tris/HCl Sigma,Steinheim

Tween®20 Sigma,Steinheim

Xylolersatz Vogler,Giessen

PufferfürdieImmunhistochemie

Tris‐Base‐Saline(TBS)‐Puffer(Waschpuffer)

DerTBS‐Pufferwurdezunächstals10‐fach‐Konzentrathergestellt,autoklaviertundan‐

schließend bei 4 °C aufbewahrt. Hierauswurde zur Verwendung die einfache Lösung

hergestellt,derpH‐Wertauf7,4–7,6mitHCloderNaOHeingestelltundanschließend

0,05%(v/v)Tween®20zugesetzt.

12

TBS‐Puffer(einfacheLösung):

8,763gNaCl

7,88gTris/HCl

6,5mlNaOH

ad1.000mlAquadest.

Citratpuffer

FürdenCitratpufferwurdenzunächstdieStammlösungenAundBgetrennthergestellt,

autoklaviertundanschließendbei4°Caufbewahrt.

Citrat‐Puffer0,01M:

‐StammlösungA:

21,01g0,1MC6H8O7.H2O

ad1.000mlAquadest.

‐ StammlösungB:

29,4g0,1MC6H5Na3O7.2H2O

ad1.000mlAquadest.

ZurVerwendungwurdendiebeidenLösungendanninfolgendemVerhältnisgemischt:

‐ 27mlStammlösungA+123mlStammlösungB

ad1.500mlAquadest.

‐ pH6,0mitHCloderNaOHeingestellt

VerwendeteAntikörperundKits

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Antikörper gegenPsoriasin undRNase 7

warenamInstitut fürDermatologiederUniversitätsklinikKielhergestelltwordenund

lagenzuBeginnderArbeitbereitsvor.DieAntikörpergegendieanderenAMPwurden

vonuntengenanntenHerstellernbezogen.

ZurHerstellungwurdenzunächstVersuchstieremitdemgewünschtenAntigenimmuni‐

siert. Anschließendwurde für dieHerstellung polyklonaler Antikörper Serum gewon‐

nen, das die gesuchten Antikörper enthielt. Für die Herstellung monoklonaler Anti‐

körper wurde den Tieren die Milz entnommen, um die antikörperproduzierenden

Plasmazellen zu gewinnen.Diese produzierten anschließend inKultur dieAntikörper,

13

dieausdenZellüberständenisoliertwurden.EineausführlicheBeschreibungfindetsich

beiGläser,Harderetal.2005.

VerwendeteAntikörper

Primärantikörper Sekundärantikörper

Antikörper PsoriasinAB2 Anti‐Mausbiot.

Art Monoklonal Polyklonal

Spezies Maus Kaninchen

Verdünnung 1:8000 1:200

Arbeitskonzentration 1,25µg/ml 6µg/ml

Katalognummer ‐ E0354

Hersteller DermatologieKiel DakoCytomation

Glostrup,Dänemark


Antikörper RNase7 Anti‐Ziegebiot.

Klonalität Polyklonal Polyklonal

Spezies Ziege Kaninchen


Arbeitskonzentration 26µg/ml 2,8µg/ml

Katalognummer ‐ 305‐066‐045

Hersteller DermatologieKiel JacksonImmunoResearch

WestGrove,U.S.A.


Antikörper hBD‐2 Anti‐Ziegebiot.


Spezies Ziege Kaninchen


Arbeitskonzentration 1µg/ml 2,8µg/ml

Katalognummer C‐500P1‐61 305‐066‐045

Hersteller PeproTechCell JacksonImmunoResearch

Concepts,D‐Umkirch WestGrove,U.S.A.

14


Antikörper hBD‐3 Anti‐Kaninchenbiot.


Spezies Kaninchen Schwein


Arbeitskonzentration 0,001µg/µl 2,93µg/ml

Katalognummer C‐500P2‐41L E0431

Hersteller PeproTechCell DakoCytomation

Concepts,D‐Umkirch Glostrup,Dänemark


Antikörper LL‐37 Anti‐Kaninchenbiot.


Spezies Kaninchen Schwein


Arbeitskonzentration 0,006µg/µl 2,93µg/ml

Katalognummer PA‐LL37100 E0431

Hersteller Innovagen DakoCytomation

Lund,Schweden Glostrup,Dänemark


Antikörper S100A8 Anti‐Mausbiot.

Klonalität Monoklonal Polyklonal



Arbeitskonzentration 2µg/ml 6µg/ml

Katalognummer BM4029 E0354

Hersteller AcrisAntibodies DakoCytomation

SanDiego,U.S.A. Glostrup,Dänemark

15


Antikörper S100A9 Anti‐Mausbiot.





Katalognummer ab24111 E0354

Hersteller Abcam DakoCytomation

Cambridge,U.K. Glostrup,Dänemark


Antikörper HNP1‐3 Anti‐Mausbiot.





Katalognummer HNP103 E0354

Hersteller BioLogo DakoCytomation

D‐Kronshagen Glostrup,Dänemark

VerwendeteKits

‐Vectastain®ABCPeroxidaseKitElitePK‐6100Standard Vector,Burlingame,U.S.A.

‐Vector®NovaREDTMPeroxidaseSubstrateKitSK‐4800 Vector,Burlingame,U.S.A.

VerwendeteIsotypkontrollen

Isotypkontrolle

Maus

Isotypkontrolle

Kaninchen

Isotypkontrolle

Ziege

Verdünnung wiePrimärantikörper wiePrimärantikörper wiePrimärantikörper

Herstellerkonzentration 0,1mg/ml 15mg/ml 15mg/ml

Katalognummer X0943 X0936 26‐787‐278030

Hersteller DakoCytomation DakoCytomation GenWayBiotech

Glostrup,Dänemark Glostrup,Dänemark SanDiego,U.S.A.

16

2.2.Methoden

Immunhistochemie

HerkunftdesUntersuchungsgutes

Insgesamtwurden 27 Synovialis‐ und 12Hautpräparate untersucht. EswurdenHaut‐

biopsien von 4 unbehandelten Patientenmit Psoriasis vulgaris gewonnen: Von jedem

PatientenjeweilseineProbeauseinerPsoriasisläsionundeineProbeauseinermakro‐

skopischgesundenHautpartiegleicherLokalisation.Zusätzlichwurdenausdemhisto‐

logischen Archiv der Dermatologie Kiel 4 Präparate von hautgesunden Patienten

herausgesucht, die den Psoriasispatienten in Alter, Geschlecht und Körperlokalisation

derBiopsieentsprachen.DieKontrollprobenstammtenausnichtbetroffenenRändern

vonNävuszellnävus‐Exzisionen.FüralleBiopsienlageinpositivesEthikvotumvor(Kiel

AZA104/06).

DieSynovialispräparateerhieltenwirzumeinenvonProf.DennisMcGonagleausLeeds,

U.K. Diese Proben wurden arthroskopisch gewonnen. Zehn Präparate stammten von

Patienten mit Psoriasis‐Arthritis, vier von Patienten mit Osteoarthrose und acht von

PatientenmitrheumatoiderArthritis.

VonProf.Dr.rer.nat.ThomasPufeausAachenwurdenfünfweitereSynovialispräparate

gelenkgesunderKontrollenzurVerfügunggestellt.

SämtlicheGewebeprobenwurdeninFormalinfixiertundinParaffineingebettet.

HerstellungderSchnittpräparate

Vonden in4%‐igemFormalin fixiertenund inParaffineingebettetenPräparatenwur‐

denmithilfeeinesRotationsmikrotoms5‐7µmdickeSchnitteangefertigt.Diesewurden

zurEntfaltungaufein45°CwarmesWasserbadgelegtunddannaufsilanisierteObjekt‐

trägeraufgezogen.DanachwurdendiePräparateanderLuftgetrocknetund inPräpa‐

ratekästenaufbewahrt.

GrundlagenderImmunhistochemie

DieImmunhistochemiestellteineMethodedar,mitderüberspezifischeAntikörperge‐

suchte Antigene innerhalb eines histologischen Präparates detektiert werden können

17

(Coons 1941). Es kann zwischen direkter und indirekter immunhistochemischer Fär‐

bung gewähltwerden. Bei der direktenMethode bindet an das Antigen nur ein Anti‐

körper, der selbst mit einem Farbstoff markiert ist. Bei der indirekten Immunhisto‐

chemie führenmehrereAntikörper zur Färbung: ein primärer, der gegen dasAntigen

gerichtet ist,undeinsekundärer,dergegendenprimärengerichtet ist.Andensekun‐

därenAntikörperisteinFarbstoffodereinEnzym,daseinSubstratzueinemFarbstoff

umsetzt,gekoppelt.DiesistbeispielsweisederFallbeideruntenbeschriebenenAvidin‐

Biotin‐Komplex‐Methode(Hsuetal.1981).

EinewichtigeVoraussetzungfürdieimmunhistochemischeDetektionvonAntigenenist,

dassdiese fürdie spezifischenAntikörperzugänglichsind.DieFixierungdesGewebes

mit Formalin kann zur Maskierung der Antigene führen: Durch Quervernetzungen in

FormvonAldehydverbindungenzwischenProteinenkönnenAntikörpergegebenenfalls

nichtmehrbinden(Werneretal.2000).DieseQuervernetzungensindjedochteilweise

reversibel und mithilfe verschiedener Demaskierungsmethoden können die Antigene

wiederfreigelegtwerden(Shietal.2001).IndervorliegendenArbeitwurdedieHitze‐

demaskierung inCitratpuffermiteinemDampfgarergewählt (Namimatsuetal.2005).

Um ein Abschwimmen der Präparate von den Objektträgern während der Hitzede‐

maskierungzuverhindern,wurdensilanisierteObjektträgerverwendet,diedurchposi‐

tive Ladungen auf ihrer Oberfläche kovalente Bindungenmit den Geweben eingingen

undsoeinAbschwimmenverhinderten.

Avidin‐Biotin‐Komplex(ABC)‐Methode

Die ABC‐Methode ist eine besondere Form der indirekten Immunhistochemie (Hsu,

Raine et al. 1981). Hier bindet ein biotinylierter Sekundärantikörper an den Primär‐

antikörper.AndasVitaminBiotinbindetdasGlykoproteinAvidin,daseinebesondere

Affinität zum Biotin hat und insgesamt 4 Bindungsstellen für dieses besitzt. An die

anderen Bindungsstellen kann das biotinylierte Enzym binden, das letztendlich sein

Substrat in einen Farbstoff umwandelt. Durch die vielen Bindungsstellen können sich

großeKomplexebilden,wodurchdasSignalverstärktwird. IndieserArbeitwurdeals

EnzymPeroxidasegewählt.

18

Abbildung1:SchematischeDarstellungAvidin‐Biotin‐Komplex‐Methode

AblaufderImmunhistochemie‐Färbung

ZunächstwurdendieSchnitte imTrockenschrankbei63°CfüreineStundegetrocknet,

umunterdemSchnittverbliebenesWasserabzutrocknen,welcheszurZerstörungdes

Präparates während der Hitzedemaskierung führen könnte. Anschließend wurde in

XylolersatzdasParaffinentfernt,zweimalje10min.DannwurdendieSchnitteineiner

absteigendenAlkoholreiherehydriert:

100%Ethanol 2x2min

96%Ethanol 2x2min

80%Ethanol 1x2min

70%Ethanol 1x2min

Aquadest. 1x10min

Tabelle1:absteigendeAlkoholreihe

ImAnschlusswurdendieProbenimDampfgarerdemaskiert.DabeiwurdendieSchnitte

20 min lang in Citratpuffer gekocht und kühlten danach 45 min im Citratpuffer ab.

DarauffolgtedieBlockierungderendogenenPeroxidasemithilfevon3%‐igemWasser‐

stoffperoxid in Aqua dest. für 10 min. Um diese Blockierungslösung zu entfernen,

wurden die Schnitte anschließend kurz inAqua dest. und dann für 5min in TBS und

Tween (im Folgenden als „Waschpuffer“ bezeichnet) gewaschen. Der Waschpuffer

wurdemit Labortüchern vorsichtig von den Rändern abgesaugt. Die Schnittewurden

19

miteinemFettstifteingekreist,umbeidennachfolgendenSchrittendieentsprechenden

LösungenwährendderInkubationaufdenPräparatenzuhalten.

Anschließendwurden die Präparate blockiert, um elektrostatische Ladungen der Pro‐

teine im Untersuchungsgut abzusättigen, die später zu unspezifischen Antikörper‐

bindungenführenkönnten.HierzuwurdeTBSmit12%BSAoderNormalserumausdem

Kaninchen,fallsder1.AntikörpernichtvomKaninchenstammte,verwendetund20min

bei Raumtemperatur inkubiert. Falls Kaninchen‐Normalserum verwendetwurde, ging

mandavonaus, dassdasnicht‐immunisierteKaninchenkeine spezifischenAntikörper

gegendasgesuchtehumaneAntigengebildethatte.

FolgendwurdedieBlockierungslösungabgeschütteltundder1.Antikörperaufgetragen,

derfür1StundebeiRaumtemperaturoderbei4°CüberNachtinkubiertwurde.

Danachwurden die Präparate zweimal für je 3minmitWaschpuffer gewaschen, um

nicht gebundene Antikörper vom Präparat zu entfernen, wobei die Negativkontrollen

getrenntgewaschenwurden.Anschließendwurdeder2.Antikörperaufgebracht,derfür

30minbeiRaumtemperaturinkubierte.

Erneut wurde mitWaschpuffer zweimal je 3 min gewaschen, bevor der AB‐Komplex

aufgetragenwurde.Hierfürwurdenzuvor10µlderAvidinlösungmit10µlderBiotin‐

Peroxidase‐Lösung (Vectastain® ABC Peroxidase Kit Elite PK‐6100 Standard, Vector,

Burlingame,U.S.A.)in1000µlTBS‐Pufferzusammengebracht,uminnerhalbvon30min

beiRaumtemperaturaneinanderzubindenunddenAB‐Komplexzubilden.

Anschließendwurdedreimal je3minmitWaschpuffergewaschen.Danachwurdedas

Peroxidase‐Substrat aufgetragen und 4min in dunkler Kammer bei Raumtemperatur

inkubiert.EswurdedasVector®NovaREDTMPeroxidaseSubstrateKitSK‐4800(Vector,

Burlingame,U.S.A.) verwendetunddieLösungunmittelbarvorher inAquadest. ange‐

setzt(37,5µlLösungA+25µlLösungB+25µlLösungC+25µlLösungD+2,5mlAqua

dest.).

Die Präparatewurden anschließend 10min inWaschpuffer gewaschen, kurz in Aqua

dest. getaucht und mit Hämalaun gegengefärbt. Hierzu wurde 30%iges Hämalaun in

Aquadest.hergestellt, indasdieSchnitte30secgetauchtwurden.Danachwurdendie

PräparateunterfließendemLeitungswasser7minlanggebläut.

FolgendwurdendieSchnitteinaufsteigenderAlkoholreihedehydriertundzweimalje2

mininXylolersatzgetaucht.AbschließendwurdensiemitEukitt®eingedeckt.

20

Kontrollen

Um die Spezifität der Antikörper gegenüber dem gesuchten Antigen sicherzustellen,

wurdenbeidenFärbungenjeweils3Kontrollenmitgefärbt.HierfürwurdenProbenver‐

wendet, von denen zuvor sichergestellt worden war, dass sie das gesuchte Antigen

enthalten:

Psoriasin(S100A7),RNase7 GesundeHaut

hBD‐2,hBD‐3,S100A8,S100A9 Psoriasisvulgaris

LL‐37 Wundrand

HNP1‐3 Verrucavulgaris

Tabelle2:KontrollenzumNachweisdereinzelnenAMP

Es wurde in jeder Serie eine Positivkontrolle gefärbt, die alle Schritte des Protokolls

durchliefundamEndeandenspezifischenLokalisationeneindeutigeImmunreaktivität

zeigensollte.

DieNegativkontrollewurdebisaufden1.Antikörpergenaubehandeltwiealleanderen

Präparate.WährenddiePräparatemitdem1.Antikörperinkubierten,wurdedieNega‐

tivkontrolleinderBlockierungslösungbelassenundanschließendgetrenntmitWasch‐

puffergewaschen.ImAnschlusswurdesiewiedermitdenanderenPräparatenzusam‐

menbehandelt.AmEndesolltedieNegativkontrollekeinerlei Immunreaktivitätzeigen

undsobeweisen,dassdieFärbungalleinaufdem1.Antikörperberuhteundkeineun‐

spezifischenReaktionenstattfanden.

UmdieSpezifitätdesPrimärantikörperszudokumentieren,wurdezusätzlicheineIso‐

typkontrolleverwendet.WährendderInkubationszeitdes1.Antikörperswurdeaufdie

IsotypkontrolleeinunspezifischerKontrollantikörperaufgebracht,derausdemgleichen

Tier stammte wie der spezifische Primärantikörper. Da der Antikörper der Isotyp‐

kontrolle jedoch nicht an spezifische Antigene binden konnte,wurde er im folgenden

SchrittmitdemWaschpufferabgewaschen.SokonnteauchderSekundärantikörperim

nächstenSchrittnichtbindenunddiePräparatebliebenletztendlichnegativ.Aufdiese

Weisekonntesichergestelltwerden,dassdieFärbungaufderspezifischenAffinitätdes

PrimärantikörperszumAntigenberuhte.

21

BeurteilungderHautpräparate

DiePräparatewurdennachderFärbungimLichtmikroskopaufImmunreaktivitätunter‐

sucht.ZurBeurteilungwurdedazueinScorebenutzt,derdieExpressionderantimikro‐

biellenPeptide inden jeweiligenEpidermisschichtenbeschreibt.Hier ist anzumerken,

dassbeiPsoriasisaufgrundderParakeratoseperdefinitionemkeinStratumgranulosum

existiert.ZurVergleichbarkeitmitdenKontrollprobenwurdendiesubcornealenSchich‐

tenderPsoriasispräparatebeiderBeurteilungalsStratumgranulosumklassifiziert.Es

wurden0‐4PunktenachfolgendenKriterienvergeben:

0 KeinerleiImmunreaktivität

1 ImmunreaktivitätimStratumcorneum

2 ImmunreaktivitätinStratumcorneumundgranulosum

3 ImmunreaktivitätinStratumcorneum,granulosumundspinosum

4 ImmunreaktivitätingesamterEpidermis

Tabelle3:ScorezurBeurteilungderEpidermis

Abbildung2:BeispielefürEpidermisscore,10xvergrößerteläsionalePsoriasis(0–keineImmun‐

reaktivität;1–ImmunreaktivitätnurStratumcorneum;2–ImmunreaktivitätStratumcorneum

und subcorneal (entsprechend Stratum granulosum); 3 – Immunreaktivität Stratum corneum,

subcorneal(entsprechendStratumgranulosum)undStratumspinosum;4–Immunreaktivitätin

gesamterEpidermis)

22

DesWeiterenwurde das dermale Stroma hinsichtlich der Immunreaktivität bewertet.

Hierwurdebeurteilt,inwiefernz.B.eingewanderteLeukozytenpositivgefärbtwaren:Es

wurdezwischenleichter,mittlererundstarkerImmunreaktivitätunterschieden.

LeichteImmunreaktivitätbedeutete,dassnureinzelneZellengefärbtwarenunddieFär‐

bungeherschwachwar.Einestarke Immunreaktivitäthingegenbedeuteteeinestarke

FärbungvielerZellen.WarenmäßigvieleZellenmittelgradigkräftiggefärbt,wurdedies

alsmittlereImmunreaktivitäteingestuft.

+ LeichteImmunreaktivität

++ MittlereImmunreaktivität

+++ StarkeImmunreaktivität

Tabelle4:ScorefürLeukozyteninderDermis

Abbildung3:ImmunreaktivitätamBeispielläsionalerPsoriasis,rotePfeilemarkierendermale

Infiltrate(a:negativeDermis,b:positiveDermis+,c:positiveDermis+++)

23

BeurteilungderSynovialispräparate

DiePräparatewurdennachderFärbungimLichtmikroskopaufImmunreaktivitätunter‐

sucht. Die Untersucher waren dabei verblindet, d.h. sie kannten die Diagnosen der

Patienten,vondenendieProbenstammten,nicht.3verschiedeneMusterderFärbung

wurdenbeurteilt:

1. ImmunreaktivitätinSynoviozytenderMembranasynovialis

2. ImmunreaktivitätineingewandertenLeukozytenimSynovialstroma

3. ImmunreaktivitätinLeukozyten,dieinBlutgefäßenzuerkennenwaren

Abbildung4:Beurteilungder ImmunreaktivitätderSynovialispräparate (1.: Immunreaktivität

inSynoviozyten,2.: Immunreaktivität ineingewandertenLeukozyten imSynovialstroma,3.: Im‐

munreaktivitätinLeukozyteninBlutgefäßen)

Die Immunreaktivität in Synoviozyten wurde mithilfe einer Gesichtsfeldauszählung

weiterquantifiziert,dieimFolgendenbeschriebenist.

Gesichtsfeldauszählung

UmquantitativeAussagenüberdieImmunreaktivitätderMembranasynovialismachen

zukönnen,wurdenSynoviozytennachpositivundnegativunterschiedenundbei100‐

facher Vergrößerung 10 Gesichtsfelder pro Präparat ausgezählt. Eine Zelle wurde als

positiv gewertet,wenn ihr Zytoplasmapositiv gefärbtwar. Gezähltwurdendie Zellen

oberhalbderBasalmembran.FallsdieMembranasynovialisentzündungsbedingtbreiter

alseinGesichtsfeldwar,wurdedasgesamteGesichtsfeldausgezählt.

JederUntersucherwählte10repräsentativeGesichtsfelderproPräparatzurBeurteilung

aus.ÜberdieZahlenderpositivenSynoviozytenunddieGesamtzahlenkonntensodie

prozentualenAnteilederpositivenZelleninderMembranasynovialisermitteltwerden.

DieMethodewurdevonzweiunabhängigenUntersucherndurchgeführt.

24

Im folgenden Bild ist exemplarisch ein Gesichtsfeld bei 100facher Vergrößerung zu

sehen mit den Markierungen für P=positiv und N=negativ. Die Basalmembran ist als

schwarzeLiniegekennzeichnet.Esbefindensich34positiveund10negativeSynovio‐

zytenindiesemGesichtsfeld,woraussicheineGesamtzahlvon44ergibtunddamitein

prozentualerAnteilderpositivenSynoviozytenvon34/44=77,3%.

Abbildung5:GesichtsfeldauszählungamBeispielrheumatoiderArthritis

Synovitis‐Score

Um die Entzündung in der Synovialis in jedem Präparat zu quantifizieren und damit

vergleichbarmachenzukönnen,wurdendiePräparatemithilfeeinenSynovitis‐Scores

(Krennetal.2006)beurteilt.Eswurde jedesPräparatmitHämalaungefärbtundmit‐

hilfe eines Lichtmikroskopes von einem unabhängigen Untersucher verblindet unter‐

sucht.Folgende3Kategorienwurdendabeibeurteilt:

1. AnzahlderSynoviozytenschichteninderMembranasynovialis

2. DichteresidenterZellen(Fibroblasten,Fibrozyten,Endothelzellen,

Makrophagen)imSynovialstroma

3. VorhandenseineingewanderterLeukozyten(Lymphozyten,Plasmazellen)

JedeKategoriewurdemit 0‐3Punktenbewertet (sieheTabelle 5) unddiePunkte ad‐

diert.DiePunktesummenwurdenwiefolgteingeteilt:0‐1–keineSynovitis,2‐4–leicht‐

gradigeSynovitis,5‐9–hochgradigeSynovitis.

25

Kategorie Punkte Bewertung

Synoviozyten‐

schichten

0 SynoviozytenbildeneineZellschicht

1 Synoviozytenbilden2‐3Zellschichten

2 4‐5Zellschichten,darunternebendenSynoviozyteneinige

multinukleäreZellen

3 >5Zellschichten,ggf.ulzeriert,infiltriertmitmulti‐

nukleärenZellen

Dichteresidenter

Synovialstroma‐

zellen

0 normaleDichteresidenterZellen

1 leichterhöhteDichteresidenterZellen

2 moderaterhöhteDichteresidenterZellen,ggf.multi‐

nukleäreZellen

3 starkerhöhteDichteresidenterZellen,ggf.multinukleäre

Riesenzellen,Pannusund/oderrheumatoideGranulome

Vorhandensein

eingewanderter

Leukozyten

0 keineLymphozytenoderPlasmazellen

1 wenigeLymphozytenoderPlasmazellen,v.a.perivaskulär

lokalisiert

2 mehrereLymphozytenundPlasmazellen,teilweise

Follikelbildung

3 starkeinflammatorischeInfiltrierung,mehreregroße

Follikel

Tabelle5:BeurteilungvonSynovialispräparatenmittelsSynovitisscore(3Kategorien,diemit je‐

weils 0‐3 Punkten bewertet werden, die Summe der Punkte wird folgendermaßen eingeteilt:

0‐1 Punkt – keine Synovitis, 2‐4 Punkte – leichtgradige Synovitis, 5‐9 Punkte – hochgradige

Synovitis)

26

Statistik

DerexakteFishertest

Der Test nach Fisher eignet sich zur Untersuchung auf statistische Signifikanz bei bi‐

närenDaten invoneinanderunahängigenStichproben.ErwurdevonRonaldA.Fisher

und Frank Yates für die Vierfeldertafel entwickelt, d.h. für zwei voneinander unab‐

hängigeVariablen,diebeidenur2möglicheMerkmalsausprägungenannehmenkönnen

(Fisher et al. 1948). In der vorliegenden Arbeit wurde der Fishertest für die Unter‐

suchungderGelenkprobenverwendet.Dainsgesamt4voneinanderunabhängigeStich‐

proben existierten (Psoriasis‐Arthritis, Rheumatoide Arthritis, Osteoarthrose und ge‐

sunde Synovialis), wurde ein modifizierter exakter Fishertest angewendet (Clarkson

1993). Ziel der Untersuchungwar es, einemögliche statistische Signifikanz zwischen

den4Diagnosenzuuntersuchen.DazuwurdendieimmunreaktivenAMPhBD‐3,LL‐37,

S100A8,S100A9undHNP1‐3injeweils3GruppeneingeteiltanalogzurBeurteilungder

Synovialisproben:

1.Membranasynovialis

2.EingewanderteLeukozytenimSynovialisstroma

3.LeukozyteninBlutgefäßenderSynovialis

Soergabensichaus5antimikrobiellenPeptidenà3Gruppeninsgesamt15Gruppenmit

je27Synovialispräparatender4verschiedenenDiagnosen.Füralle15Gruppenwurde

mittels desmodifizierten exakten Fishertests der p‐Wert für die jeweilige Gruppe er‐

mittelt. Dazu wurden die Präparate tabellarisch aufgelistet und bei jedem Präparat

zwischenpositiv(1)undnegativ(0)unterschieden(eineBerücksichtigungderprozen‐

tualenGesichtsfeldauszählungderMembranasynovialiswarsomitnichtmöglich).Mit‐

hilfedesProgramms„R“konntedannüberdieTabellenfürjededer15Gruppenderje‐

weiligep‐Werterrechnetwerden(R‐Core‐Team2013).

27

3.Ergebnisse

3.1.ImmunhistochemieGelenke

Insgesamt wurden 27 arthroskopisch gewonnene Synovialisbiopsien immunhisto‐

chemisch aufgearbeitet: 10 Proben von Patienten mit Psoriasis‐Arthritis, 8 von

Patienten mit rheumatoider Arthritis, 4 von Patienten mit Osteoarthrose und 5 von

gelenkgesundenPatientenausRoutinearthroskopien.

Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung wurden 3 Aspekte beurteilt: 1. Immun‐

reaktivitätinSynoviozytenderMembranasynovialis,2.ImmunreaktivitätinLeukozyten

imSynovialstroma,3. Immunreaktivität inLeukozyten inBlutgefäßen.UmdieImmun‐

reaktivität der Synoviozyten zu quantifizieren, wurden die positiven und negativen

SynoviozytenausgezähltundderAnteilderpositivenSynoviozytenanderGesamtzahl

ausgerechnet.BeiderImmunreaktivitätderLeukozytenimSynovialstromaundinBlut‐

gefäßenwurdezwischenpositiv(indenTabellen„+“)undnegativ(indenTabellen„–“)

unterschieden.

Psoriasis‐Arthritis(PsA)

S100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37

EineExpressionvonS100A8undS100A9wurdein7von10PsA‐Probenidentifiziert.

DieImmunreaktivitätwarvoralleminLeukozytenimSynovialstromazufinden,die,der

MorphologieundderZelldichteindiesenArealennachzuurteilen,imRahmenderEnt‐

zündungeingewandertwaren.EinigepositiveLeukozytenfandensichauchinGefäßen

und zeigten eine positive Färbung ihres Zytosols und des sie umgebenden Serums. In

einem Präparat zeigte sich außerdem eine Induktion von sowohl S100 A8 als auch

S100A9inderMembranasynovialis.Hierproduziertendurchschnittlich31%derZellen

S100A8und14%S100A9.NachVerteilungundMorphologiehandeltees sichhierbei

umSynoviozyten.

28

HNP1‐3wurden in8von10Präparatennachgewiesen.DiepositivenZellenwarenvor

allemLeukozytenimSynovialstromaundinBlutgefäßen.VieledieserLeukozytenwaren

Granulozyten (durch die Morphologie mit dem typischen septierten Zellkern identi‐

fiziert),dieeinebesondershoheImmunreaktivitätinihremZytosolundauchindemsie

umgebenden Extrazellularraum zeigten. In einem Präparat konnte außerdem eine

HNP1‐3‐ExpressioninSynoviozytengezeigtwerdenmitdurchschnittlich25%positiven

Zellen.

LL‐37war,imVergleichzudenbishergenanntenAMP,eherschwachnachweisbarund

konnte invereinzeltenLeukozyten in2von10Präparaten identifiziertwerden. Inder

MembranasynovialiszeigtesichkeineLL‐37‐Expression.

Die Gesamtpunktezahlen der Synovitisscores, die für jede Biopsie beurteilt wurden,

reichtenvon0(keineSynovitis)bis6(hochgradigeSynovitis).

Von7PsA‐PatientenlagenInformationenzumedikamentösenTherapienzumZeitpunkt

der Biopsie vor. Alle Patienten erhielten NSAID („non‐steroidal antiinflammatory

drugs“),3erhieltenDMARD(„disease‐modifyingantirheumaticdrugs“)undeinPatient

systemischKortikosteroide.

Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3

Die Präparate zeigten keinerlei Immunreaktivität für das S100‐Protein Psoriasin

(S100A7),dieRibonukleaseRNase7unddie humanenβ‐DefensinehBD‐2undhBD‐3.

WederinderMembranasynovialis,nochinStromaoderBlutgefäßenkonntenpositive

Zellenimmunhistochemischnachgewiesenwerden.

ZusammenfassendwurdeinderPsoriasis‐ArthritiseinehoheImmunreaktivitätgegen‐

überS100A8,S100A9undHNP1‐3nachgewiesen,diebei2PatientenaucheineProduk‐

tion dieser antimikrobiellen Peptide in der Membrana synovialis durch Synoviozyten

einschloss.DesWeiterenwurdeeineleichtePositivitätfürLL‐37imSynovialstromage‐

funden. Psoriasin, RNase 7, hBD‐2 und hBD‐3 konnten hingegen nicht nachgewiesen

werden.

29

#S100A8 S100A9 HNP1‐3 LL‐37 Synovitisscore

CRPTherapie

Sy St G Sy St G Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N

1 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 1 0 2 x x x x

2 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0,25 + ‐ 0 ‐ ‐ 1 2 2 5 28 ‐ Su +

3 0 ‐ + 0 + + 0 + + 0 ‐ ‐ 1 3 0 4 x + x +

4 0 ‐ 0 ‐ + 0 + + 0 ‐ ‐ 1 0 0 1 7 ‐ Su +

5 0,31 + + 0,14 + + 0 + + 0 + + 2 3 1 6 29 ‐ ‐ +

6 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 + ‐ 0 ‐ ‐ 1 0 1 2 73 x x x

7 0 ‐ + 0 ‐ + 0 ‐ + 0 + ‐ 0 0 0 0 x x x +

8 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 2 1 4 x x x +

9 0 ‐ ‐ 0 ‐ + 0 + + 0 ‐ ‐ 1 1 1 3 x x x x

10 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 ‐ ‐ 0 0 0 0 <5 ‐ M,Su +

Tabelle6:ImmunreaktivitätgegenüberS100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37inPsA:Sy–positive

Synoviozyten in Prozent derGesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreaktivität in eingewanderten

Leukozyten im Synovialstroma: positive Zellen zu detektieren (+) oder nicht (‐); G – Immun‐

reaktivität in Leukozyten in Blutgefäßen: positive Zellen zu detektieren (+) oder nicht (‐);

Synovitisscore(E–AnzahlderZellschichten inMembranasynovialis,R–DichteresidenterZellen

imSynovialstroma,I–AnzahlinfiltrierterZellenimSynovialstroma,Ges.–Synovitisscoregesamt);

CRP (C‐reaktives Protein) im Blut inmg/l; Therapie der Patienten zum Zeitpunkt der Biopsie:

S–systemischeKortikosteroide,D–DMARD(disease‐modifyinganti‐rheumaticdrugs),N–NSAID

(non‐steroidalanti‐inflammatorydrugs),Su–Sulfasalazin,M–Methotrexat,x–keineInformation

inderPatientenaktevorhanden

30

Abbildung6: ImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9 inPsoriasis‐Arthritis (links:

S100A8inPräparat5‐SynovialisundStromapositiv;Mitte:S100A9inPräparat5‐Synovialis

und Stroma positiv; rechts: S100 A9 in Präparat 4 – Leukozyten in Blutgefäßen positiv),

Vergrößerungen jeweils 10x in oberer Reihe und 40x in unterer Reihe, die die jeweiligen

AusschnittederrotenBoxenzeigt

Abbildung 7: Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 und LL‐37 in Psoriasis‐Arthritis (links:

HNP1‐3inPräparat2‐Synovialispositiv;Mitte:HNP1‐3inPräparat3–StromaundBlutgefäße

positiv; rechts: LL‐37 in Präparat 5 ‐ Stroma positiv),Vergrößerungen jeweils 10x in oberer

Reiheund40xinuntererReihe,diediejeweiligenAusschnittederrotenBoxenzeigt

31

RheumatoideArthritis(RA)

S100A8,S100A9undHNP1‐3

S100 A8 konnte in 2 der 8 Präparate nachgewiesen werden. In einer Biopsie konnte

neben der Immunreaktivität eingewanderter Leukozyten im Synovialstroma eine

S100‐A8‐Expression in derMembrana synovialis detektiertwerdenmit 65%S100‐A8‐

positivenSynoviozyten.

Das gleiche Präparat zeigte Immunreaktivität gegenüber S100 A9 in der Membrana

synovialismitdurchschnittlich34%S100‐A9‐positivenZellen.S100A9wurdeebenfalls

in2von8RA‐Präparatennachgewiesen.

In insgesamt 5 von 8 Präparaten konnte Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 nach‐

gewiesen werden. Vor allem im Synovialstroma exprimierten eingewanderte Leuko‐

zytenHNP1‐3undineinemPräparatzeigtesichzusätzlicheineExpressioninSynovio‐

zytenmiteinemdurchschnittlichenAnteilderpositivenSynoviozytenvon55%.


reichtenvon0(keineSynovitis)bis5(hochgradigeSynovitis).Von6Patientenausder

Gruppe der RA lagen Daten zu ihren Therapien vor. 5 erhielten zum Zeitpunkt der

Biopsie DMARD („disease‐modifying antirheumatic drugs“), 4 NSAID („non‐steroidal

antiinflammatorydrugs“)und4systemischKortikosteroide.

Psoriasin,RNase7,hBD‐2,hBD‐3undLL‐37

IndenvorliegendenPräparatenderRAkonntekeineImmunreaktivitätgegenüberPso‐

riasin,RNase7,hBD‐2,hBD‐3undLL‐37nachgewiesenwerden.

Zusammenfassendwurde indenPräparatenderrheumatoidenArthritis Immunreak‐

tivitätgegenüberS100A8,S100A9undHNP1‐3identifiziert,diebeieinemPatientauch

eine Expression der drei AMP in Synoviozyten einschloss. Psoriasin, RNase 7, hBD‐2,

hBD‐3undLL‐37wurdenhingegennichtnachgewiesen.

32

#S100A8 S100A9 HNP1‐3 Synovitisscore

CRPTherapie

Sy St G Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N

1 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 0 0 0 x x x x

2 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 1 0 2 x x x x

3 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + + 0 2 1 3 57 ‐ ‐ +

4 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 + ‐ 2 2 1 5 29 ‐ M +

5 0 ‐ + 0 ‐ ‐ 0 ‐ + 0 0 0 0 11 + M ‐

6 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 1 0 2 55 + M +

7 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 2 2 4 5 + M +

8 0,65 + + 0,34 + + 0,55 + + 1 2 0 3 33 + M ‐

Tabelle7:ImmunreaktivitätgegenüberS100A8,S100A9undHNP1‐3inRA:Sy–positiveSynovio‐

zyten in Prozent derGesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreaktivität in eingewanderten Leuko‐

zytenimSynovialstroma:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);G–Immunreaktivitätin

LeukozyteninBlutgefäßen:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);Synovitisscore(E–An‐

zahl der Zellschichten inMembrana synovialis, R –Dichte residenter Zellen im Synovialstroma,

I–Anzahl infiltrierterZellen imSynovialstroma,Ges.–Synovitisscoregesamt);CRP (C‐reaktives

Protein) im Blut inmg/l; Therapie der Patienten zum Zeitpunkt der Biopsie: S – systemische

Kortikosteroide,D–DMARD(disease‐modifyinganti‐rheumaticdrugs),N–NSAID(non‐steroidal

anti‐inflammatorydrugs),M–Methotrexat,,x–keineInformationinderPatientenaktevorhanden

33

Abbildung8:ImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9inrheumatoiderArthritis(links:

S100A8inPräparat5–LeukozyteninBlutgefäßenpositiv;Mitte:S100A8inPräparat8–Syno‐

vialis und Stroma positiv; rechts: S100 A9 in Präparat 8 – Synovialis und Stroma positiv),

Vergrößerungen jeweils 10x in oberer Reihe und 40x in unterer Reihe, die die jeweiligen Aus‐

schnittederrotenBoxenzeigt

Abbildung9: Immunreaktivität gegenüberHNP1‐3 in rheumatoiderArthritis (links:HNP1‐3 in

Präparat 4 – Stroma positiv; rechts: HNP1‐3 in Präparat 8 – Synovialis und Stroma positiv),

Vergrößerungen jeweils 10x in oberer Reihe und 40x in unterer Reihe, die die jeweiligen Aus‐

schnittederrotenBoxenzeigt

34

Osteoarthrose(OA)

S100A9,HNP1‐3

EineExpressionvonS100A9undHNP1‐3konnteinallen4Präparatenidentifiziertwer‐

den.DieImmunreaktivitätwarjedochnurineingewandertenLeukozytenimSynovial‐

stroma oder in Leukozyten in Blutgefäßen zu detektieren, die Membrana synovialis

bliebinallenPräparatennegativ.


reichten von 0 (keine Synovitis) bis 5 (hochgradige Synovitis). Ein OA‐Patient erhielt

NSAID(„non‐steroidalantiinflammatorydrugs“)zumZeitpunktderBiopsie.

S100A8,LL‐37,Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3

In den vorliegendenPräparaten derOA konnte keinerlei Immunreaktivität gegenüber

S100A8,LL‐37,Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3nachgewiesenwerden.

Tabelle8:ImmunreaktivitätgegenüberS100A9undHNP1‐3inOA:Sy–positiveSynoviozytenin

Prozent der Gesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreaktivität in eingewanderten Leukozyten im

Synovialstroma:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);G– Immunreaktivität inLeuko‐

zyten inBlutgefäßen:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);Synovitisscore(E–Anzahl

derZellschichten inMembranasynovialis,R–DichteresidenterZellen imSynovialstroma,I–An‐

zahlinfiltrierterZellenimSynovialstroma,Ges.–Synovitisscoregesamt);CRP(C‐reaktivesProtein)

imBlutinmg/l;TherapiederPatientenzumZeitpunktderBiopsie:S–systemischeKortikosteroide,

D–DMARD (disease‐modifyinganti‐rheumaticdrugs),N–NSAID (non‐steroidalanti‐inflamma‐

torydrugs),x–keineInformationinderPatientenaktevorhanden

#S100A9 HNP1‐3 Synovitisscore

CRPTherapie

Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N

1 0 ‐ + 0 ‐ + 0 0 0 0 <5 x x +

2 0 ‐ + 0 + ‐ 1 1 0 2 8,7 ‐ ‐ ‐

3 0 + ‐ 0 + ‐ 2 2 1 5 <5 ‐ ‐ ‐

4 0 ‐ + 0 + + 1 1 0 0 <5 x x x

35

Abbildung 10: Immunreaktivität gegenüber S100 A9 und HNP1‐3 bei Osteoarthrose (links:

S100A9inPräparat2–Blutgefäßepositiv;Mitte:S100A9inPräparat3‐Stromapositiv;rechts:

HNP1‐3 inPräparat3, Stromapositiv),Vergrößerungen jeweils10x inobererReiheund40x in

untererReihe,diediejeweiligenAusschnittederrotenBoxenzeigt

Insgesamt konnte bei Osteoarthrose lediglich im Synovialstroma Immunreaktivität

gegenüberS100A9undHNP1‐3gezeigtwerden.DieMembranasynovialisbliebgänzlich

negativ. Immunreaktivität gegenüber S100 A8, LL‐37, Psoriasin, RNase 7, hBD‐2 und

hBD‐3warnichtzudetektieren.

GesundeSynovialis

S100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3

S100A8wurde in1von5gesundenSynovialispräparatengefunden. Immunreaktivität

zeigtenLeukozytenimSynovialstromasowiedieMembranasynovialismitdurchschnitt‐

lich16%positivenZellen.

IneinemanderenPräparatzeigtesichImmunreaktivitätfürS100A9imSynovialstroma

in eingewanderten Leukozyten. In der Membrana synovialis konnten jedoch keine

S100‐A9‐positivenZellenidentifiziertwerden.

36

HNP1‐3konntenin3von5Präparatennachgewiesenwerden.Hierzeigtensicheinzelne

positive Leukozyten im Synovialstroma und in Blutgefäßen.HNP1‐3‐positive Synovio‐

zytenkonnteninkeinemPräparatgefundenwerden.

In 1 von 5 Präparaten zeigten sich für hBD‐3 positive Zellen in Blutgefäßen. Die

MembranasynovialiszeigtekeineImmunreaktivität.

Psoriasin,RNase7,hBD‐2,LL‐37

IndenvorliegendenPräparatendergesundenSynovialiskonntekeineImmunreaktivität

fürPsoriasin,RNase7,hBD‐2undLL‐37nachgewiesenwerden.

Zusammenfassend konnte damit in gesunder Synovialis Immunreaktivität gegenüber

S100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3nachgewiesenwerden,wobeiSynoviozyteninder

Membrana synovialis nur in einem Präparat für S100 A8 positiv waren. Psoriasin,

RNase7,hBD‐2undLL‐37wurdennichtnachgewiesen.

#S100A8 S100A9 HNP1‐3 hBD‐3 Synovitisscore

CRPTherapie

Sy St G Sy St G Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N

1 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x

2 0,16 + ‐ 0 ‐ ‐ 0 + + 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x

3 0 ‐ ‐ 0 + + 0 + + 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x

4 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x

5 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x

Tabelle 9: Immunreaktivität gegenüber S100 A8, S100 A9, HNP1‐3 und hBD‐3 in gesunder

Synovialis: Sy – positive Synoviozyten inProzent derGesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreak‐

tivität ineingewandertenLeukozyten imSynovialstroma:positiveZellen zudetektieren (+)oder

nicht (‐);G – Immunreaktivität inLeukozyten inBlutgefäßen:positiveZellen zudetektieren (+)

oder nicht (‐); Synovitisscore (E –Anzahl der Zellschichten inMembrana synovialis,R –Dichte

residenterZellenimSynovialstroma,I–AnzahlinfiltrierterZellenimSynovialstroma,Ges.–Syno‐

vitisscore gesamt); CRP (C‐reaktives Protein) im Blut in mg/l; Therapie der Patienten zum

Zeitpunkt derBiopsie (S – systemische Steroide,D –DMARD (disease‐modifying anti‐rheumatic

drugs), N – NSAID (non‐steroidal anti‐inflammatory drugs)), x – keine Information in der

Patientenaktevorhanden

37

Abbildung11: ImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9 ingesunderSynovialis (links:

S100A8inPräparat2‐SynovialisundStromapositiv;rechts:S100A9inPräparat3–Leukozyten

inStromaundBlutgefäßenpositiv),Vergrößerungenjeweils10xinobererReiheund40xinunterer

Reihe,diedenjeweiligenAusschnittderrotenBoxzeigt

Abbildung 12: Immunreaktivität in gesunder Synovialis gegenüber HNP1‐3 und hBD‐3 in

gesunderSynovialis (links:HNP1‐3 inPräparat2 ‐StromaundGefäßepositiv;Mitte:HNP1‐3 in

Präparat 3 ‐ Stroma und Gefäße positiv; rechts: hBD‐3 in Präparat 5 ‐ Gefäße positiv), Ver‐

größerungen jeweils10x inobererReiheund40x inuntererReihe,diedie jeweiligenAusschnitte

derrotenBoxenzeigt

38

3.2.ErgebnisseHaut

ImmunhistochemiePsoriasisvulgaris

S100A8,S100A9

S100A8wurde in allenEpidermisschichten sowie inderDermis starkexprimiert.Die

EpidermisscoresbetrugenimMittelwert4insowohlläsionalerPsoriasishautalsauchin

nichtläsionalerPsoriasissowiedengesundenKontrollen.

FürS100A9zeigte sicheinehöhere Immunreaktivität inder läsionalenHautderPso‐

riasis‐Patienten im Vergleich zu den anderen Proben. Der Mittelwert der Epidermis‐

scores betrug in Psoriasis‐Läsionen 3,5, in den Proben der nicht‐läsionalen Psoriasis‐

HautunddengesundenKontrollenlagendieScoresbeidurchschnittlich2,25bzw.2,5.

Abbildung13:ExpressionvonS100A8 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐

riasishaut(b)vonPatientP3sowieindergesundenKontrolleK3(c),Vergrößerungjeweils10x

Abbildung14:ExpressionvonS100A9 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐


39

Einzelwerte Mittelwerte

Diagnose #S100A8 S100A9 S100A8 S100A9

E D E D E D E D

LäsionalePsoriasishaut

P1 4 +++ 4 ++

4 +++ 3,5 ++P2 4 +++ 4 +

P3 4 +++ 4 ++

P4 4 +++ 2 x

Nicht‐läsionalePsoriasishaut

P1 4 ++ 2 +

4 ++ 2,25 +P2 4 + 3 +

P3 4 ++ 2 x

P4 4 + 2 +

GesundeHaut

K1 4 + 4 +++

4 + 2,5 ++K2 4 + 2 0

K3 4 + 2 x

K4 4 ++ 2 x

Tabelle10: Immunreaktivität inHautprobengegenüberS100A8undS100A9–EinzelneWerte

der jeweiligen Präparate sowieMittelwerte derDiagnosegruppen läsionale, nicht‐läsionale Pso‐

riasishautundgesundeHaut;E–Epidermis,ImmunreaktivitätangegebenimEpidermisscore(von

0bis4Punkte);D–Dermis,Immunreaktivität indermalenLeukozyten(von0bis+++);x–keine

dermalen Leukozyteninfiltrate im Präparat vorhanden, P1‐4: Patienten 1‐4 – von jedem dieser

Patienten jeweils eine Probe aus läsionaler und eine aus nicht‐läsionaler Psoriasishaut; K1‐4:

gesunde Kontrollen der Patienten 1‐4, diemit diesen in Alter, Geschlecht und Lokalisation der

Biopsieübereinstimmen

40

HNP1‐3undLL‐37

HNP1‐3wurdenindenProbenderläsionalenPsoriasishautamstärkstenexprimiertmit

einemmittleren Epidermisscore von 1,5. Etwas schwächere Immunreaktivität zeigten

dienicht‐läsionalePsoriasishautmit0,75unddiegesundeHautmit0,5.DieDermiswar

ebenfallsindenPsoriasis‐Läsionenamstärkstengefärbt.

LL‐37wurdenurinderEpidermisderPsoriasispatientenexprimiert.Hierzeigtesichdie

ImmunreaktivitätinLeukozyteninfiltratenimStratumcorneumbeizweiläsionalenund

einer nicht‐läsionalen Psoriasishautprobe sowie in einigen dermalen Leukozyten. Die

gesundeHautbliebnegativ.

Abbildung15:Expression vonHNP1‐3 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐


Abbildung 16: Expression von LL‐37 in läsionaler Psoriasishaut (a) und nicht‐läsionaler Pso‐


41


Diagnose #HNP1‐3 LL‐37 HNP1‐3 LL‐37

E D E D E D E D


P1 1 +++ 0 0

1,5 +++ 0,5 0P2 1 + 0 0

P3 3 +++ 1 +

P4 1 +++ 1 0


P1 1 + 0 0

0,75 + 0,25 0P2 0 0 0 0

P3 1 0 0 +

P4 1 + 1 0

GesundeHaut

K1 1 + 0 0

0,5 + 0 0K2 1 + 0 0

K3 0 + 0 0

K4 0 0 0 0

Tabelle111:ImmunreaktivitätinHautprobengegenüberHNP1‐3undLL‐37–EinzelneWerteder

jeweiligenPräparatesowieMittelwertederDiagnosegruppen läsionale,nicht‐läsionalePsoriasis‐

hautundgesundeHaut;E–Epidermis,ImmunreaktivitätangegebenimEpidermisscore(von0bis

4Punkte);D–Dermis,ImmunreaktivitätindermalenLeukozyten(von0bis+++);P1‐4:Patienten

1‐4–von jedemdieserPatienten jeweilseineProbeaus läsionalerundeineausnicht‐läsionaler

Psoriasishaut;K1‐4:gesundeKontrollenderPatienten1‐4,diemitdieseninAlter,Geschlechtund

LokalisationderBiopsieübereinstimmen

42

Psoriasin(S100A7)undRNase7

Psoriasin konnte in allen Hautproben nachgewiesen werden. Die stärkste Immun‐

reaktivität zeigte sich jedoch in der Psoriasis vulgaris. Hier waren die Proben aus

Läsionen mit einem durchschnittlichen Epidermisscore von 3 stärker positiv als aus

nicht‐läsionalen Hautbiopsien der Patienten (Epidermisscore 1,75). Die gesunden

Kontrollen zeigtenhingegennur in einemPräparat eine leichtePositivität imStratum

corneum.

RNase 7 wurde ebenso in allen Gruppen nachgewiesen mit der stärksten Immun‐

reaktivität in denPsoriasisläsionen (Epidermisscore 2,5) und der schwächsten in den

gesundenKontrollen(Epidermisscore1,5).

Die Dermis zeigteweder in der Psoriasis noch in den gesunden KontrollenPsoriasin‐

oderRNase‐7‐positiveZellen.

Abbildung17:ExpressionvonPsoriasin in läsionalerPsoriasishaut(a)undnicht‐läsionalerPso‐


Abbildung18:ExpressionvonRNase7 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐


43


Diagnose #Psoriasin RNase7 Psoriasin RNase7

E D E D E D E D


P1 3 0 2 0

3 0 2,5 0P2 3 0 3 0

P3 3 0 2 0

P4 3 0 3 0


P1 3 0 2 0

1,75 0 1,75 0P2 1 0 2 0

P3 0 0 2 0

P4 3 0 1 0

GesundeHaut

K1 0 0 1 0

0,25 0 1,5 0K2 1 0 2 0

K3 0 0 1 0

K4 0 0 2 0

Tabelle12:ImmunreaktivitätinHautprobengegenüberPsoriasinundRNase7–EinzelneWerte

der jeweiligen Präparate sowie Mittelwerte der Diagnosegruppen läsionale, nicht‐läsionale

PsoriasishautundgesundeHaut;E–Epidermis, Immunreaktivitätangegeben imEpidermisscore

(von0bis4Punkte);D–Dermis,ImmunreaktivitätindermalenLeukozyten(von0bis+++);P1‐4:

Patienten1‐4–von jedemdieserPatienten jeweilseineProbeaus läsionalerundeineausnicht‐

läsionaler Psoriasishaut; K1‐4: gesunde Kontrollen der Patienten 1‐4, die mit diesen in Alter,

GeschlechtundLokalisationderBiopsieübereinstimmen

44

hBD‐2undhBD‐3

DieDefensinehBD‐2undhBD‐3ließensichnurinderEpidermisderPsoriasispatienten

nachweisen.HierwarendieLäsionendeutlichstärkerimmunreaktivalsdienicht‐läsio‐

nalenAreale:hBD‐2zeigteEpidermisscoresvon3in läsionalerund1,25innicht‐läsio‐

nalerPsoriasis,hBD‐3von1,75 in läsionalerund0,25innicht‐läsionalerPsoriasis.Die

gesunden Kontrollen zeigten keine Immunreaktivität. Die Dermis zeigteweder in der

PsoriasisnochindengesundenKontrollenhBD‐2‐oderhBD‐3‐positiveZellen.

Abbildung 19: Expression von hBD‐2 in läsionaler Psoriasishaut (a) und nicht‐läsionaler Pso‐


Abbildung 20: Expression von hBD‐3 in läsionaler Psoriasishaut (a) und nicht‐läsionaler Pso‐


45


Diagnose #hBD‐2 hBD‐3 hBD‐2 hBD‐3

E D E D E D E D


P1 3 0 1 0

3 0 1,75 0P2 3 0 2 0

P3 3 0 2 0

P4 3 0 2 0


P1 2 0 0 0

1,25 0 0,25 0P2 1 0 0 0

P3 1 0 0 0

P4 1 0 1 0

GesundeHaut

K1 0 0 0 0

0 0 0 0K2 0 0 0 0

K3 0 0 0 0

K4 0 0 0 0

Tabelle13: Immunreaktivität inHautprobengegenüberhBD‐2undhBD‐3–EinzelneWerteder

jeweiligenPräparatesowieMittelwertederDiagnosegruppen läsionale,nicht‐läsionalePsoriasis‐

hautundgesundeHaut;E–Epidermis,ImmunreaktivitätangegebenimEpidermisscore(von0bis

4Punkte);D–Dermis,ImmunreaktivitätindermalenLeukozyten(von0bis+++);P1‐4:Patienten

1‐4–von jedemdieserPatienten jeweilseineProbeaus läsionalerundeineausnicht‐läsionaler

Psoriasishaut;K1‐4:gesundeKontrollenderPatienten1‐4,diemitdieseninAlter,Geschlechtund

LokalisationderBiopsieübereinstimmen

46

Zusammenfassend wurde bei der Psoriasis vulgaris die stärkste Immunreaktivität

gegenüber S100 A8, S100 A9 undHNP1‐3 gezeigt. Auch die antimikrobiellen Peptide

Psoriasin, RNase 7, hBD‐2 und ‐3 sowie LL‐37 zeigten eine sehr hohe Positivität. Die

ImmunreaktivitätderläsionalenHauterreichtefastimmereinenhöherenepidermalen

Score als die nicht‐läsionale und die gesunde Haut. Die einzige Ausnahme bildet hier

S100A8,dasinallenPräparatenstarkexprimiertwurde.

Tabellarische Übersicht der einzelnen antimikrobiellen Peptide und ihrer Beurteilung

derjeweiligenImmunreaktivitätanhandderEpidermis‐Scores:

S100A8 S100A9 HNP1‐3 LL‐37 Psoriasin RNase7 hBD‐2 hBD‐3

Läsional 4 3,5 1,5 0,5 3 2,5 3 1,75

Nicht‐Läsional 4 2,25 0,75 0,25 1,75 1,75 1,25 0,25

Gesund 4 2,5 0,5 0 0,25 1,5 0 0

Tabelle14:VergleichderMittelwertederEpidermisscoresdereinzelnenAMP in läsionalerPso‐

riasishaut(n=4),nicht‐läsionalerPsoriasishaut(n=4)undingesunderHaut(n=4)

3.3. Vergleich der Immunreaktivität von AMP in Gelenk‐

probenmittelsFishertest

MithilfedesmodifiziertenexaktenFishertestswurdeuntersucht,obsichdieNachweise

derImmunreaktivitätderProbenvonPsoriasis‐Arthritis,rheumatoiderArthritis,Osteo‐

arthroseundgesunderSynovialisstatistischsignifikantvoneinanderunterschieden.Die

4DiagnosenwurdendabeigemeinsamaufHomogenitätderErgebnisseuntersucht.

Fürdie„gelenkpositiven“AMPhBD‐3,LL‐37,S100A8,S100A9undHNP1‐3wurdenalle3

beurteilten Parameter untersucht: Immunreaktivität in der Membrana synovialis, in

Leukozyten im Synovialstroma sowie in Leukozyten in Blutgefäßen.Mithilfe des Pro‐

gramms „R“ wurden die jeweiligen p‐Werte für alle Entitäten ermittelt. Alle p‐Werte

warengrößerals0,05.SomitkonntenkeinestatistischsignifikantenUnterschiedeinder

ImmunreaktivitätvonAMPzwischendenDiagnosengezeigtwerden.

47

p‐Wert

hBD‐3

Membranasynovialis –

LeukozytenStroma –

LeukozytenBlutgefäße 0,3333

LL‐37

Membranasynovialis –

LeukozytenStroma >0,999


S100A8

Membranasynovialis >0,999

LeukozytenStroma >0,999


S100A9


LeukozytenStroma 0,8789


HNP1‐3


LeukozytenStroma 0,8128


Tabelle15:Übersichtüberp‐Werte,diemitexaktemFishertestfürhBD‐3,LL‐37,S100A8,S100A9

und HNP1‐3 ermittelt wurden, um eine statistische Signifikanz zwischen Psoriasis‐Arthritis,

rheumatoiderArthritis,OsteoarthroseundgesunderSynovialiszuuntersuchen;„–“:keinp‐Wert

ermittelbar,daindieserGruppeallePräparatenegativwaren

3.4.ZusammenfassungderErgebnisse

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen an Hautproben von Psoriasis

vulgaris und Gelenkproben von Psoriasis‐Arthritis (PsA), rheumatoider Arthritis (RA)

undOsteoarthrose(OA)zeigteneinigeGemeinsamkeiten,unterschiedensichaberauch

inmehrerenPunkten.

Die Epidermis bei Psoriasis vulgaris zeigte starke Immunreaktivität gegenüber allen

untersuchten antimikrobiellen Peptiden Psoriasin, RNase 7, hBD‐2, hBD‐3, LL‐37,

S100A8,S100A9undHNP1‐3.DabeiproduziertennichtnureingewanderteLeukozyten

48

AMP,sondernvorallemauchdieKeratinozytenselbst.DesWeiterenwareindeutlicher

Unterschied der Psoriasisproben zu den gesundenHautproben zu erkennen: Die Epi‐

dermis in den Psoriasisläsionen zeigte eine deutlich stärkere AMP‐Expression als die

nichtläsionaleHaut der Psoriasispatienten.Amwenigsten Immunreaktivität konnte in

derHautdergesundenKontrollendetektiertwerden.

In der Synovialis wurde in der Membrana synovialis hingegen nur wenig Immun‐

reaktivität gefunden, die von den Synoviozyten ausging. Die Immunreaktivität wurde

hier vor allem in eingewanderten Leukozyten detektiert. Außerdem ließen sich nicht

alleuntersuchtenAMPindenProbenimmunhistochemischnachweisen.StarkeImmun‐

reaktivität war gegenüber S100 A8, S100 A9 und HNP1‐3 und in einzelnen Proben

gegenüberLL‐37 zu finden.Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3, die inderHaut sehr

stark exprimiertwurden, ließen sich in den Synovialisproben nicht nachweisen (Aus‐

nahme:einegesundeSynovialisprobemitfokalerImmunreaktivitätgegenüberhBD‐3).

Eine differenzielle Expression der Immunreaktivität bei RA im Vergleich zur

ImmunreaktivitätbeiPsAließsichnichterkennen.InbeidenArthritisformenwareine

ExpressionvonS100A8,S100A9undHNP1‐3sowievereinzeltvonLL‐37zudetektieren.

Die Immunreaktivität ging dabei vor allem auf eingewanderte Leukozyten zurück, in

einzelnenPräparatenwarenaberauchpositiveSynoviozytenzufinden.

InderOsteoarthrosehingegenwarennurvereinzeltpositiveLeukozyten imSynovial‐

stromaoder inBlutgefäßenzu identifizieren,dieImmunreaktivitätgegenüberS100A9

undHNP1‐3aufwiesen. Ähnlich verhielt es sich in den Präparaten der gesunden Pro‐

banden,indenennurvereinzeltfürS100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3positiveLeuko‐

zytenzufindenwarenunddieSynovialisgänzlichnegativwar.

Somit stellte sich die Gewebeexpression von AMP bei Psoriasisarthritis und rheuma‐

toiderArthritisimRahmenderanalysiertenimmunhistochemischenFärbungendeutlich

verstärkt im Vergleich zur Expression in Osteoarthrose und gesunder Synovialis dar.

Mehr Präparate der PsA und der RA zeigten Immunreaktivität und in diesen produ‐

ziertenmehrZellenindenBiopsienAMP.

Im Vergleich der AMP‐Immunreaktivität in Hautbiopsien der Psoriasis vulgaris und

Gelenkbiopsien der PsA fällt auf, dass bei beiden Krankheitsmanifestationen S100A8,

S100A9,HNP1‐3undLL‐37nachzuweisenwaren.Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3

hingegenwurdennurinderHautvonPsoriasisvulgarisexprimiert.

49

4.Diskussion

4.1.Methoden

Untersuchungsmethoden

Mithilfe der Immunhistochemie wurden 12 Hautproben und 27 Gelenkproben aufge‐

arbeitet und auf die Expression antimikrobieller Peptide systematisch untersucht. Die

ImmunhistochemiebietetmehrereVorteile.ZumeinenistdieindieserArbeitgewählte

indirekte Immunhistochemiesehrspezifisch fürdasAntigen,damehrereSchrittenot‐

wendigsind,umschlussendlicheinepositiveFärbungzuerzielen.Darüberhinauskann

dieABC‐MethodedurchdenAufbau großerKomplexe auch ein anfangskleines Signal

lichtmikroskopischsichtbarwerdenlassen(Hsu,Raineetal.1981).Sowirdnebender

SpezifitätauchdieSensitivitäterhöht.DieImmunhistochemiebietetaußerdemdenVor‐

teil,dassdieArchitekturdesGewebeserhaltenbleibtundderUntersuchergenaudetek‐

tierenkann,inwelchenzellulärenStrukturensichdieImmunreaktivitätbefindet.Nach‐

teilighingegenist,dassfürdieImmunhistochemieGewebebiopsienentnommenwerden

müssen, die, je nach Gewebe, invasive operative Eingriffe nötig machen. Hautproben

sindvergleichsweiseeinfachzugewinnen,imFallvonGelenkprobenabermüssendiese

überArthroskopienoderoffeneOperationengewonnenwerden.

Um Synovialisproben entzündlicher Gelenkerkrankungen zu erhalten, wurden in der

vorliegendenArbeitBiopsienbeiPatientenentnommen,diesichaufgrundnotwendiger

GelenkersätzeOperationenunterziehenmussten. Sokonnten insgesamt27Synovialis‐

proben gewonnen werden. Aufgrund der teilweise sehr langen und schweren Krank‐

heitsverläufeerhieltendiemeistenPatientenzumZeitpunktderSynovialisbiopsiever‐

schiedeneimmunsuppressiveTherapien.SomitistbeiderInterpretationdervorliegen‐

denErgebnissezubedenken,dassdiePatientenzumgroßenTeilsystemischbehandelt

wurden.UmeinemöglichsthoheAussagekraftüberdieEinflüssevonEntzündungauf

dieAMP‐Immunreaktivitätmachen zukönnen,wurdevoneinerunabhängigenPerson

beiallenProbenein„Synovitis‐Score“nachKrennetal.bestimmt(Krenn,Morawietzet

al.2006).DerSynovitisscorebeurteiltdieVerdickungderMembranasynovialis,dieAn‐

50

zahl der Leukozyteninfiltrate im subsynovialen StromaunddasVorhandensein einge‐

wanderterLeukozyten(LymphozytenundPlasmazellen).DieBeurteilungwurdeannur

mitHämalaungefärbtenPräparatendurchgeführt.

DerSynovitisscorekannunabhängigvonderDiagnosezurBeurteilungderEntzündung

inderSynovialisverwendetwerden,weshalbergutgeeignet ist fürdie Interpretation

derErgebnissedervorliegendenArbeit.ZudemmussfürdieAnwendungkeinespezielle

Färbungdurchgeführtwerden.Kritisch ist,dassbeigroßenPräparatendieErgebnisse

desSynovitisscoreserheblichvariierenkönnen.WirberücksichtigtendaherdieEmpfeh‐

lungdesAutorsderPublikation,ineinemsolchenFallinAnalogiezurBeurteilungneo‐

plastischerVeränderungendasArealmitdenstärkstenVeränderungenzuuntersuchen

(höchsterSynovitisscore).

BeurteilungderHautproben

UmdieEpidermisderHautprobenzubeurteilenwurdeein„IHC‐Score“verwendet(Ver‐

gleich 2.2. Beurteilung der Hautpräparate). Der IHC‐Score bietet die Möglichkeit, die

AMP‐ExpressionindeneinzelnenEpidermisschichtenzubeurteilen(Wittersheimetal.

2013). Durch die Vergabe von Punkten für immunreaktive Epidermisschichten ergibt

sich die Möglichkeit, Mittelwerte in Diagnosegruppen zu bilden, die für Vergleiche

herangezogen werden können. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass nicht zwischen

fokalerunddiffuseroderzwischenschwacherundstarkerImmunreaktivitätinnerhalb

derEpidermisschichtendifferenziertwerdenkannundUnterschiedeinnerhalbdesPrä‐

paratesinderBewertungnichtzumAusdruckgebrachtwerdenkönnen.

NebenderEpidermiswurdedie Immunreaktivität inderDermisbeurteilt,dieaufein‐

gewanderteLeukozytenzurückzuführenwar.HierwurdedieIntensitätderImmunreak‐

tivitätbewertet.UnterschiedeinnerhalbdesPräparateskonntennichtdirektzumAus‐

druck gebrachtwerden,weshalb dieUntersucher eine über das gesamte Präparat ge‐

mittelterepräsentativeAussagetrafen.

UmvalideErgebnissezuerhalten,beurteilten2unabhängigeUntersucherverblindetdie

Präparate,d.h.dieUntersucherkanntendieDiagnosenderPatientennicht.

51

BeurteilungderGelenkproben

Bei den Proben von Patienten mit Psoriasis‐Arthritis, rheumatoider Arthritis, Osteo‐

arthroseundgesunderSynovialiswurden3Gesichtspunktebeurteilt:

1. ImmunreaktivitätinSynoviozyteninderMembranasynovialis

2. ImmunreaktivitätinLeukozytenimSynovialstroma

3. ImmunreaktivitätinLeukozyteninBlutgefäßenderSynovialis

UmdieImmunreaktivitätderSynoviozytenzuquantifizieren,wurdendiepositivenund

negativenZellenbei100facherVergrößerungimLichtmikroskopvon2voneinanderun‐

abhängigenUntersuchernausgezählt.DieseMethode gibt dieMöglichkeit, die Immun‐

reaktivitätmöglichst objektiv zu quantifizieren. Bei der Interpretation der Ergebnisse

solltedennochkritischberücksichtigtwerden,dassnichtdiekomplettenPräparateaus‐

gezähltwerdenkonntenundauchdiePräparateselbstnurkleineAusschnitteeinesge‐

samtenGelenkeszeigen.

Die separate Beurteilung von immunreaktiven Leukozyten, die in das Stroma einge‐

wandertsind,undLeukozyteninBlutgefäßengibtHinweisedarauf,inwieferndieseTeil

derPathologiederSynovialitisseinkönnten.EingewanderteLeukozytenkönnteneher

eineRolle in der Pathogenese spielen als imBlut zirkulierende Leukozyten, die gege‐

benenfallsnurzufälligimPräparatzusehensind.

4.2.ErgebnisseGelenke

Psoriasis‐Arthritis(PsA)

DieantimikrobiellenPeptideS100A8undS100A9fandensichin7von10PsA‐Proben.

ImmunreaktivitätwarvoralleminLeukozytenimSynovialstromaundinLeukozytenin

Blutgefäßenzufinden.DesWeiterenzeigtesicheineInduktionvonbeidenAMPinder

Membrana synovialis in einem Präparat, in dem durchschnittlich 31% der Zellen

S100A8und14%S100A9exprimierten.NachVerteilungundMorphologiehandeltees

sichhierbeiumSynoviozyten.

DieseBeobachtungendeckensichmitdenAngabenzuS100A8undS100A9inPsAbei

Kane et al. (Kane et al. 2003): In dieser Arbeit wurden Proben von Patienten mit

PsA(n=14)undPatientenmitrheumatoiderArthritis(RA,n=11)immunhistochemisch

52

aufdieExpressionvonS100A8 undS100A9 untersucht. Immunreaktivität zeigte sich

vorallemimsynovialenStroma,dieMembranasynovialiszeigtenurvereinzeltpositive

Zellen.DieProbenderPsAzeigtendabeivorallemImmunreaktivitätinperivaskulären

Infiltraten,wohingegeninderRAdieseAssoziationzudenBlutgefäßennichterkennbar

warunddiepositivenZellenehervereinzeltimSynovialstromalagen.

IndervorliegendenArbeitlässtsicheinähnlicherTrenderkennen:InderPsAzeigten5

von10ProbenImmunreaktivitätgegenüberS100A8und/oderS100A9inBlutgefäßen,

indenProbenderRAwareneshingegennur2von8Proben.Aufgrundder geringen

FallzahlenkonnteeinestatistischeSignifikanznichtnachgewiesenwerden.

Neben der Expression von S100A8und S100A9 im Synovialisgewebewurden in der

Literatur zudemerhöhteKonzentrationendieser Proteine im Serumund in der Syno‐

vialflüssigkeit von PsA‐Patienten beschrieben (Aochi et al. 2011; Cretu et al. 2014).

Neben ihrerantimikrobiellenWirkungwerdenS100A8undA9 immunmodulatorische

Funktionen zugeschrieben, wobei hier bisher nur Erkenntnisse über RA vorliegen:

S100A8stimuliertinvitroSynoviozytenvonRA‐PatientenzurProduktionvonIL‐6und

fördert damit die Differenzierung der TH‐17‐Zellen (Lee et al. 2013). Damit trägt

S100A8 zum Fortschreiten der Pathogenese der RA bei, was sich auch in klinischen

Beobachtungenwiderspiegelt:HoheKonzentrationenvonS100A8undS100A9werden

miteinererhöhtenKrankheitsaktivitätderRAassoziiert,umgekehrtsprechenniedrige

LevelfüreineRemission(Kangetal.2014).Hinweisedarauf,dassS100A8undS100A9

auchinderPsAeineRollespielen,zeigendieErkenntnissevonAdemowoetal.:Inder

Synovialis von PsA‐Patienten, bei denen TNF‐α‐Inhibitoren keine oder nur schwache

Wirkungen zeigten und die Krankheitsaktivität entsprechend hochwar,wurden hohe

KonzentrationenvonS100A8undS100A9nachgewiesen (Ademowoet al. 2014).Die

selektiveInhibitionvonS100A8stelltdamitauchfürdiePsAeinenmöglichenTherapie‐

ansatzdar,deneszuerforschengilt.

Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 fand sich in 8 von 10 Präparaten der PsA, vor

allem in Leukozyten im Synovialstromaund inBlutgefäßen. In einemPräparatwurde

zudemeineHNP1‐3‐ExpressioninSynoviozytengezeigtmitdurchschnittlich25%posi‐

tivenZellen.

HNP1‐3wirdvoralleminneutrophilenGranulozytenund ineinigenmonozytärenund

lymphozytären Zellreihen exprimiert (Agerberth et al. 2000; Lehrer 2004; Riepl et al.

53

2010), was sich auch in einigen Präparaten dieser Arbeit zeigte. Viele der positiven

Zellenkonntenaufgrundder typischenMorphologiemitdemseptierten,polymorphen

Zellkern als neutrophile Granulozyten identifiziert werden. Die Granulozyten zeigten

sichdabeisowohl inBlutgefäßenalsauch imsynovialenStroma.Dasiedortvermehrt

imFalleinerEntzündung,besondersbeiderPsA(Kruithofetal.2005),zufindensind,

stelltdieseinemöglicheErklärungfürdiehoheImmunreaktivitätgegenüberHNP1‐3in

derPsAdar. ImVergleichzudenSynovitisscoresderPräparate fällt auf,dass4von5

Präparaten,die imSynovitisscorePunkte füreingewanderteLeukozyten („I“= inflam‐

matory infiltrate)erhielten,und4von6Präparaten,diePunkte füreineerhöhteZell‐

dichte im Synovialstroma („R“ = density of resident cells) erhielten, Immunreaktivität

gegenüber HNP1‐3 im synovialen Stroma zeigten. Damit zeigte sich eine mögliche

Assoziation derHNP1‐3‐Expression mit einer erhöhten Zelldichte im Synovialstroma,

einervermehrtenEinwanderungvonLeukozytenunddamiteinerverstärktenEntzün‐

dungsaktivitätinderSynovialis.

EbensowieHNP1‐3wird auchLL‐37vor allem von neutrophilen Granulozyten expri‐

miert.BeidenimmunhistochemischenFärbungenfürLL‐37zeigtensichebenfallsposi‐

tiveZellen,dieaufgrundihrespolymorphen,septiertenZellkernesalsneutrophileGra‐

nulozytenidentifiziertwerdenkonnten.LL‐37wurdeinsgesamtdeutlichschwächerex‐

primiertalsHNP1‐3undwarnurvereinzeltin2von10Präparatenzufinden.

AngabenzurExpressionoderProduktionvonLL‐37oderHNP1‐3inPsAsindbislangin

derLiteraturnichtvorhanden.DaLL‐37inderHautvonPatientenmitPsoriasisüberdie

BildungvonKomplexenmiteigenerDNAplasmazytoidedendritischeZellenaktivieren

kann und LL‐37 damit eine wichtige Rolle in der Pathogenese zugeschrieben wird

(Landeetal.2007),istvonhohemInteresseherauszufinden,inwiefernLL‐37diePatho‐

genesederPsAimGelenkvorantreibenkönnte.

RheumatoideArthritis(RA)

S100A8undS100A9wurdenjeweilsin2von8Präparatennachgewiesen.EinPräparat

schloss eine Expression in der Membrana synovialis ein mit 65% S100‐A8‐positiven

Synoviozytenund34%S100‐A9‐positivenSynoviozyten.

InderLiteraturfindensichbereitsmehrereUntersuchungenzuS100A8undS100A9bei

RA(Guetal.2002;Kane,Rothetal.2003;deSenyetal.2008;Bailletetal.2010;Lee,

54

Wooet al.2013).DieStudien zeigen,dassS100A8undS100A9 inRA inhohemMaß

produziert werden – im Serum, in Monozyten im peripheren Blut, in der Synovial‐

flüssigkeit und auch im Synovialisgewebe. Ferner konnte nachgewiesenwerden, dass

die gemessenenKonzentrationenvonS100A8undS100A9 im Serummit derKrank‐

heitsaktivitätderRAassoziiertsind,weshalbS100A8undS100A9aktuellalspotentielle

Marker sowohl für die Krankheitsaktivität der RA als auch für das Screening vor der

Diagnosestellungdiskutiertwerden(Kang,Wooetal.2014).

Besondersinteressantistdabei,dassdieKonzentrationvonS100A8undS100A9nicht

mit derAnzahl der neutrophilenGranulozyten in der Synovialflüssigkeit oder imBlut

derPatientenkorreliert(Baillet,Trocmeetal.2010),wieesbeianderenArthritidenmit

erhöhter S100A8‐ und S100A9‐Produktion in der Synovialflüssigkeit der Fall ist. Da

neutrophileGranulozytenS100A8undS100A9produzieren,wirddieProduktioninder

Synovialflüssigkeit bei den anderenArthritidenvor allemauf diese Zellpopulation zu‐

rückgeführt.BeiderRAhingegen,woauchbeiniedrigenZahlenvonneutrophilenGra‐

nulozytenhoheKonzentrationenvonS100A8undS100A9gemessenwurden,lässtsich

daher eine zusätzliche Produktion durch andere Zellen, beispielsweise Synoviozyten,

vermuten.

DieseVermutungließsichineinemPräparatdervorliegendenArbeitbestätigen,indem

sichImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9inderMembranasynovialiszeig‐

te(sieheauchAbbildung8,Präparat8,S.33).DieMorphologieundVerteilungderposi‐

tivenZellenlässtvermuten,dassessichumSynoviozytenhandelt,wobeiberücksichtigt

werdenmuss,dassdiepathologischenVeränderungenmitvermehrterZellzahlundein‐

gewandertenLeukozytentäuschenkönntenunddaherweitereUntersuchungenzurBe‐

stätigungderExpressionvonS100A8undS100A9inSynoviozytenvonnötensind.

Immunreaktivität gegenüberHNP1‐3war in5 von8Präparatennachweisbarundvor

allemauf in das Synovialstromaeingewanderte Leukozyten zurückzuführen. In einem

Präparatzeigte sichzusätzlicheineExpression inderMembranasynovialismiteinem

durchschnittlichen Anteil der positiven Synoviozyten von 55%. Diese Beobachtungen

decken sich mit den Angaben in der Literatur, wonach HNP1‐3 in RA vor allem im

synovialen Stroma in neutrophilen Granulozyten detektiert wurde und Immunreak‐

tivitätinSynoviozytennurvereinzeltvorhandenwar(Paulsenetal.2002;Riepl,Grassel

etal.2010).Dabeiisterkennbar,dassHNP1‐3 imVergleichzuOAinRAdeutlichindu‐

55

ziert ist (Riepl,Grasseletal.2010;Ahnetal.2013).DieAssoziationvonhohenHNP1‐

KonzentrationenmiterhöhtenCRP‐Werten,radiologischnachweisbarenErosionenund

positivemRheumafaktorbeidenRA‐Patienten gibtHinweise auf einemöglicheproin‐

flammatorische Wirkung von HNP1 (Ahn, Huang et al. 2013). Zudem führte die

Stimulation einerRA‐Synoviozyten‐KulturmitHNP1 zu einer Induktion von IL‐6, IL‐8

und den knorpeldestruierenden Matrix‐Metalloproteinasen MMP‐1 und MMP‐3 (Ahn,

Huang et al. 2013). AlsMechanismus der Induktion konnte die Phosphorylierung von

JNK(c‐JunN‐terminaleKinasen)undERK(extrazelluläreSignal‐regulierteKinase,syn.

MAPK=mitogen‐aktivierteProteinkinase)identifiziertwerden,dasichdieRA‐Synovio‐

zytennachGabevonJNK‐undERK‐InhibitorennichtvonHNP1stimulierenließen.So‐

mitwirktHNP1 in RA in vitro tatsächlich proinflammatorisch über die Induktion von

IL‐6undIL‐8undzugleichknorpeldestruierendüberdieInduktionvonMMP‐1und‐3.

Osteoarthrose(OA)

Inallen4Präparatenkonnteeine ImmunreaktivitätgegenüberS100A9nachgewiesen

werden,inLeukozyteninBlutgefäßenundinLeukozytenimSynovialstroma.DieMem‐

branasynovialisbliebinallenProbennegativ.

ImmunhistochemischeUntersuchungenzurExpressionvonS100A8undS100A9inOA

sindbislangnichtpubliziert,jedochwurdeperSpektrometrie(SELDI‐TOF‐MS–Surface‐

Enhanced Laser Desorption/Ionization Time‐Of‐Flight Mass Spectrometry) Synovial‐

flüssigkeitvonOA‐PatientenaufeineProduktionvonS100A8undS100A9untersucht

(Baillet,Trocmeetal.2010).NebenRAundanderenhochgradigenSynovialitiden(syste‐

mischerLupuserythematodes,M.Bechterew,Pseudogicht,juvenileidiopatischeArthri‐

tis)wurdenauchProbenvonPatientenmitOAuntersucht,umdieRAalshochgradige

SynovialitismitOAalsniedriggradigerSynovialitiszuvergleichen.EswurdeperSpek‐

trometrieeineProduktionvonS100A8undS100A9 inderSynovialflüssigkeitderOA

gefunden,die jedochdeutlichgeringerwaralsdie inderRA.GesundeProbenwurden

dabeinichtuntersucht,weshalboffenbleibt,inwieferndieinderOAgemessenenKon‐

zentrationenvondenphysiologischenabweichen.

Die indervorliegendenArbeitnachgewieseneExpressionvonS100A9 gingvorallem

aufLeukozyteninnerhalbderBlutgefäßluminazurück.DaLeukozyteninKapillarenim

VergleichzuresidentenZellenimGewebedurchdenBlutflussnureinerelativkurzeZeit

imGewebeverbringen,könntedieserklären,warumBailletetal.nurgeringeKonzen‐

56

trationendiesesAMPinderSynovialflüssigkeitvonOsteoarthroseprobenmessenkonn‐

ten.

WarumindervorliegendenArbeitkeinS100A8indenGelenkprobendetektiertwerden

konnte,könntefolgendermaßenerklärtwerden:1.WieimFallvonS100A9könnteauch

dieExpressionvonS100A8aufeinigewenigeLeukozyteninBlutgefäßenzurückgehen,

dieindenhistologischenSchnittennichterfasstwaren.2.DiebeiBailletetal.gemessene

ProduktionvonS100A8inOsteoarthrosegehtaufeineandereZellpopulationinderGe‐

lenkhöhleaußerhalbderSynovialiszurück.S100A8undS100A9werdenjedochinder

Regel von den gleichen Zelltypen gebildet, v.a. von neutrophilen Granulozyten und

Monozytenin frühenStadienund liegenextrazellulärvorallemzusammenalsHetero‐

dimer „Calprotektin“vor (Ehrchenetal.2009).Demnachkönnten indervorliegenden

Arbeit zufällig keine S100 A8‐positiven Zellen in den vorliegenden Schnitten erfasst

wordensein,wasbeieinerniedrigenFallzahlvonn=4möglichwäre.

S100A8undS100A9könnenaberauchgetrenntvoneinanderalsCalgranulinA(S100

A8)bzw.CalgranulinB(S100A9)vorliegen,wasamBeispielderPsoriasisläsionendeut‐

lichwird,indenenS100A8undS100A9zwarbeidevonsowohlKeratinozytenalsauch

vonneutrophilenGranulozytenexprimiertwerden,S100A8jedochvorrangigvonKera‐

tinozyten, S100A9 hingegen in höheremMaß von neutrophilen Granulozyten (Aochi,

Tsujietal.2011).Demnachkönnte inderOAgegebenenfallseinZelltypvorherrschen,

dereherS100A9exprimiert,wodurchindervorliegendenArbeitnurdiesesAMPdetek‐

tiertwurde.

HNP1‐3konnte inallen4PräparatenderOAnachgewiesenwerden, inLeukozyten im

Synovialstromaund/oderinBlutgefäßen.DieMembranasynovialiszeigtekeineImmun‐

reaktivität.

In der Literatur gibt es Vergleiche derHNP1‐3‐Expression vonOA als niedriggradiger

Synovialitis mit der von rheumatoider Arthritis als hochgradiger Synovialitis (Riepl,

Grasseletal.2010;Ahn,Huangetal.2013)undvonOAmitRA,pyogenerArthritisund

gesunder Synovialis (Paulsen,Pufe et al. 2002). Inder Synovialis zeigten sich immun‐

histochemischkeineUnterschiedezwischenOAundRA,inbeidenEntitätenfandensich

positive Zellen in der Membrana synovialis und in den darunter liegenden oberen

Schichten des Synovialstromas, diemithilfe derDoppel‐Immunfluoreszenz als neutro‐

phile Granulozyten charakterisiertwerden konnten. Unterschiede konnten nur in der

57

Konzentration vonHNP1‐3 in der Synovialflüssigkeit festgestellt werden, die deutlich

geringerinderOAwaralsinderRA(Riepl,Grasseletal.2010;Ahn,Huangetal.2013).

In der vorliegenden Arbeit war die Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 in der OA

geringer als in der RA und auch der PsA. Viele derHNP1‐3‐positiven Zellen konnten

durchdie typischeMorphologiemitdemseptierten,polymorphenZellkernalsneutro‐

phileGranulozyten identifiziertwerden.DieseBeobachtungkannerklären,warumdie

Immunreaktivität inderOAgeringerwarals inRAundPsA,da indergeringgradigen

SynovialitisderOAnurseltenneutrophileGranulozytenanzutreffensindimGegensatz

zudenhochgradigenEntzündungenPsAundRA(Kruithof,Baetenetal.2005;deLange‐

Brokaaretal.2012).

GesundeSynovialis

Immunreaktivität gegenüber S100 A8 und S100 A9wurde in jeweils einem Präparat

identifiziert,wobei in Synoviozytennur gegenüberS100A8 Immunreaktivität nachzu‐

weisenwar.

Immunhistochemische Untersuchungen zur Expression von S100 A8 und S100 A9 in

gesunden Synovialisproben finden sich nicht in der Literatur. Die Genexpression von

S100A8undS100A9 inmononukleärenZellenausdemperipherenBlut (nichtweiter

differenziert)wurdebeiGesundenmithilfe einesGen‐Microarraysuntersuchtundmit

RA‐undPsA‐Patientenverglichen(Gu,Marker‐Hermannetal.2002):DieRA‐undPsA‐

PatientenzeigteneinestarkerhöhteExpressionderGenevonS100A8undS100A9im

GegensatzzudenGesunden.

In denGelenkproben der vorliegendenArbeitwurde auch in der gesunden Synovialis

eineExpressionvonS100A8undS100A9detektiert.Dabeiistfraglich,inwieferndiese

ExpressionalsphysiologischzuwertenwaroderobdiewenigenPatienten,dieImmun‐

reaktivitätgegenüberS100A8undS100A9zeigten,eineReizungderSynovialishatten,

welche ggf. Grund für die Arthroskopiewar und dabei jedoch so schwach ausgeprägt

war,dasssichmakroskopischkeinePathologie feststellen ließ.SolcheineReizungder

SynovialiskönntezueinergeringenS100A8‐bzw.S100A9‐Expressiongeführthaben.

HNP1‐3 ließsich in3von5Präparaten inLeukozyten imSynovialstromaund inBlut‐

gefäßendetektieren, in Synoviozytenwurde keinHNP1‐3 exprimiert.Die Immunreak‐

tivität im Synovialstroma ging vor allem auf Granulozyten zurück, die vereinzelt im

58

Bindegewebezufindenwaren.PhysiologischerweiseistdieAnzahlneutrophilerGranu‐

lozyteningesundenGelenkengering,waserklärenkönnte,warumdieImmunreaktivität

gegenüberHNP1‐3indengesundenProbeneherspärlichwar.DieseErgebnissedecken

sich mit den Untersuchungen von Paulsen et al., bei denen ebenfalls einige wenige

GranulozytenimSynovialstromavonGesundenHNP1‐3exprimierten(Paulsen,Pufeet

al.2002).

4.3.TherapienderPatienten

DiespezielleMöglichkeit,GewebeprobenvonGelenkenverschiedenerArthritisentitäten

auf ihrevergleichendeExpressionanverschiedenenKlassenvonAMPzuuntersuchen,

ist in dieser Arbeit der Kooperationmit den Kollegen aus Leeds und Aachen zu ver‐

danken.WichtigzubeachtenbeiderBewertungderErgebnisseistdiemedikamentöse

Therapie,diediePatientenzumZeitpunktderBiopsieerhielten.HinweisezumEinfluss

vonMethotrexat(MTX),einemseitvielenJahreninderTherapieentzündlicherGelenk‐

erkrankungenetabliertenDMARD,findensichinderobenbereitserwähntenArbeitvon

DavidKane,inderProbenvonPsA‐Patienten,diesowohlvoralsauchnachBeginnder

MTX‐Therapie biopsiertwordenwaren, auf die Expression von S100A8 und S100A9

immunhistochemisch untersucht wurden (Kane, Roth et al. 2003). In den Präparaten

zeigten sich deutliche Reduktionen der AMP‐Expression unter der MTX‐Therapie, in

einigenPräparatenwarendieProteinesogargarnichtmehrnachweisbar.

In der vorliegendenArbeitwurdenmehrerePatienten zumZeitpunkt derBiopsiemit

MTXbehandelt.DarunterwareinPsA‐Patient,indessenProbekeineImmunreaktivität

gegenüberS100A8undS100A9nachgewiesenwurde.ObdiesanderMTX‐Behandlung

lag,bleibtoffen. InderGruppederRAwurdenmehrerePatientenmitMTXbehandelt.

EinigedieserProbenzeigtenhingegeneinemituntersehrstarkeExpressionvonS100A8

und S100 A9, darunter auch Immunreaktivität in Synoviozyten der Membrana

synovialis. Andere RA‐Präparate unter MTX‐Therapie wiederum zeigten keine

ExpressionderbeidenAMP.DamitstelltsichdieFrage,wiedieseUnterschiedezustande

kamen – warum exprimierten einige Patienten unter MTX‐Therapie S100 A8 und

S100A9undanderePatientennicht?Möglichwäre,dassgenaudiePatienten,dietrotz

MTX‐TherapieeineS100A8/A9‐Expressionzeigten,schlechtaufMTXansprachen.4der

59

5 RA‐Patienten zeigten unter MTX erhöhte CRP‐Werte und leicht‐ odermittelgradige

Synovialitiden imSynovitisscore.DaS100A8/A9bereitsalspotentielleMarker fürdie

KrankheitsaktivitätderRAbeschriebensind(Kang,Wooetal.2014),sollte inZukunft

ebenfalls eine Assoziation zumTherapieansprechen von z.B.MTX untersuchtwerden.

DieErforschungderMechanismen,diebeiArthritispatientenzurExpressionderproin‐

flammatorischenAMP S100A8und S100A9 trotzMTX‐Therapie führen, könntemög‐

licherweise neue Therapieansätze hervorbringen. Außerdem könnten möglicherweise

AMPalsBiomarker zurQuantifizierungderWirksamkeit genutztwerden:Regelmäßig

gemessene Konzentrationen der AMP (bevorzugt im Serum) könnten ein weiteres

Instrument zur Messung der Krankheitsaktivität und damit der Beurteilung des

Therapieerfolgesdarstellen.

Hinweise darauf, dass nicht generell davon ausgegangen werden kann, dass immun‐

suppressive Medikamente die AMP‐Expression hemmen, finden sich bei Riepl et al.

(Riepl, Grassel et al. 2010): Zunächst wurde erwartet, dass das immunsuppressive

Hormon Kortisol die Expression des proinflammatorischwirkendenHNP1‐3hemmen

würde. Untersuchungen der HNP1‐3‐Produktion von Synoviozytenkulturen zeigten

jedoch,dassKortisolwederalleindieProduktionmindertenochsynergistischeEffekte

zusammenmitNoradrenalin,dasHNP1‐3hemmt,erzeugte.

MitdenAngabenzudermedikamentösenTherapiederPatientenfindensichindervor‐

liegendenArbeitHinweise,welcheantimikrobiellenPeptide trotzverschiedenerMedi‐

kamente indenSynovialisprobenexprimiertwurden(VergleichTabellen6‐8,S.2929‐

34).Weitergehende Untersuchungen, möglichst an noch nicht therapierten Patienten,

sindaufgrunddergeringenFallzahlenunbedingterforderlich.

4.4.VergleichderGelenkerkrankungen

Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Unterschiede und Gemeinsamkeiten in der

Expression antimikrobieller Peptide zwischen den untersuchten Gelenkentzündungs‐

entitätenherauszufinden.BetrachtetmandievorliegendenErgebnissederAMP‐Expres‐

sionvonrheumatoiderArthritisundPsoriasis‐Arthritis,erkenntmanzunächstvieleGe‐

meinsamkeiten.BeideEntitätenzeigenkeineExpressionvonPsoriasin,RNase7,hBD‐2

undhBD‐3.GemeinsamistderPsAundderRAaußerdemdieImmunreaktivitätgegen‐

60

überS100A8,S100A9undHNP1‐3,diestärkeristalsdieImmunreaktivitätgegenüber

dengenanntenAMPinOAunddengesundenKontrollen(VergleichTabellen6‐9,S.29‐

36).LL‐37wurdenurinPsAdetektiert,jedocheherspärlichineinzelnenLeukozytenim

Synovialstroma.

AMP‐ExpressioninderMembranasynovialis

S100A8,S100A9undHNP1‐3wurdennichtnurimSynovialstromavonPsAundRAex‐

primiert,sondernwurdenauchinderMembranasynovialisinSynoviozytendetektiert.

AuchwenndieErgebnissenichtstatistischsignifikantwaren,fälltauf,dassdieExpres‐

sionvonS100A8,S100A9undHNP1‐3nurindenSynoviozytenvonPsAundRAzude‐

tektierenwar, inderOsteoarthroseunddergesundenSynovialis(mitAusnahmeeines

einzelnen S100 A8‐positiven Präparates) die Expression hingegen auf das Synovial‐

stromabeschränktwar.

Alle Synoviozyten‐positiven Präparate erhielten im Rahmen des „Synovitis‐Scores“ 1

oder2PunkteinderKategorie„VerdickungderMembranasynovialis“,umgekehrtließ

sich jedoch bei vielen anderen Präparaten, die ebenfalls 1 oder 2 Punkte für die Ver‐

dickung des Membrana synovialis erhielten, keine Immunreaktivität in Synoviozyten

nachweisen.DieVerdickungscheintalsoingewisserWeiseVoraussetzungfürdieAMP‐

Expression inSynoviozytenzusein, istabernichtalleinentscheidend. Indenanderen

KriteriendesSynovitisscores„DichteresidenterZellenimSynovialstroma“und„Anzahl

infiltrierterZellenimSynovialstroma“warkeineAssoziationzwischenAMP‐Expression

undeinerhohenPunktzahlimSynovitisscoreerkennbar.

In der Literatur wird die Expression einzelner antimikrobieller Peptide in der Deck‐

schichtderSynovialisebenfallsfürhochgradigentzündlicheSynovialitidenbeschrieben.

Bei Kane et al. zeigten die Epithelien von RA und PsA vereinzelt Immunreaktivität

gegenüberS100A8undS100A9,unterschiedensichdabeijedochnichtvoneinander.

S100A8undA9

Deutlich stärker als in derMembrana synovialiswar die Immunreaktivität gegenüber

S100A8undS100A9 imSynovialstroma.HierzeigtensichzudemUnterschiede inder

ExpressionderAMPzwischenPsAundRA:InderImmunhistochemiezeigtensichinder

PsA Infiltrate von S100‐A8‐und S100‐A9‐positiven Leukozyten vor allem perivasal. In

denProbenderRAexprimiertenhingegennureinzeln imStromaliegendeLeukozyten

61

S100A8und/oderS100A9.DieAssoziationzudenBlutgefäßen,wiesieinderPsAvor‐

herrschte,warinderRAnichtzuerkennen.EineUntersuchungvonYoussefetal.zeigt

dieAbhängigkeitderExpressionvonS100A8undS100A9vonderNähezurKnorpel‐

Pannus‐Region in der rheumatoiden Arthritis. Nah an dieser Junktionszone, wo be‐

sonders viele Phagozyten zu finden sind, ließ sich eine hohe Immunreaktivität de‐

tektieren.Weit entfernt von derKnorpel‐Pannus‐Region hingegenwurden in denRA‐

ProbennurwenigS100A8undS100A9exprimiert(Youssefetal.1999).

DaS100A8undS100A9vorallemvonPhagozytengebildetwerdenundimRahmenvon

EntzündungenalsproinflammatorischeZytokineagieren (Ehrchen, Sunderkotteret al.

2009), ist es nicht verwunderlich, dass in der Osteoarthrose, einer niedriggradigen

Synovialitis,wenigerImmunreaktivitätdetektiertwurdealsindenhochgradigenSyno‐

vialitidenPsoriasis‐ArthritisundrheumatoiderArthritis.

HNP1‐3

HNP1‐3wurdeinallenEntitätennachgewiesen,wobeidiestärksteImmunreaktivitätin

der Psoriasis‐Arthritis und der rheumatoiden Arthritis identifiziert wurde. In beiden

Arthritidenwaren imVergleichzurOsteoarthroseunddengesundenKontrollenmehr

HNP1‐3‐positive Leukozyten im Synovialstroma und in synovialen Blutgefäßen detek‐

tierbar, die Immunreaktivitätwar stärker in den einzelnen Zellen undnur in der PsA

und der RAwurdeHNP1‐3 im Synovialisepithel exprimiert. Signifikante Unterschiede

zwischendenPsA‐unddenRA‐Probenkonnten jedochnichtgefundenwerden. Inbei‐

den Gruppen ging die Immunreaktivität vor allem auf eingewanderte Leukozyten im

Synovialstroma zurück, die häufig aufgrund ihrerMorphologie als neutrophile Granu‐

lozytenidentifiziertwerdenkonnten.

Untersuchungen zur Expression vonHNP1‐3 in Psoriasis‐Arthritis sind bisher in der

Literaturnichtbeschrieben.Zur rheumatoidenArthritishingegen findensichmehrere

Untersuchungen, die allesamt erhöhte Konzentrationen vonHNP1‐3 in Synovialis und

SynovialflüssigkeitzeigtenundunsereErgebnissedamitbestätigten(Paulsen,Pufeetal.

2002; Bokarewa et al. 2003; Riepl, Grassel et al. 2010;Ahn,Huang et al. 2013). Auch

konnte einMechanismus, der zu einer erhöhten Expression dieses AMP führt, bereits

identifiziertwerden(Riepl,Grasseletal.2010):NoradrenalinkannimgesundenGelenk,

wenn es durch sympathischeNervenendigungen in hohenDosen freigesetztwird, die

HNP1‐3‐Expressionüberβ2‐Rezeptorenhemmen.DadieseNervenendigungeninderRA

62

durch die vorherrschende Entzündung geschädigt sind und damit die Noradrenalin‐

freisetzung vermindert ist, ist die Hemmung der HNP1‐3‐Expression über β2‐Rezep‐

toren, die nur bei hohenKonzentrationen stimuliertwerden, nichtmöglich.WieNor‐

adrenalin hemmt auch TNF‐α unter physiologischen Bedingungen die Expression von

HNP1‐3.DurchstetighoheTNF‐α‐KonzentrationeninderRAsinddieTNF‐α‐Rezeptoren

jedoch desensibilisiert und die Hemmung der HNP1‐3‐Expression ist damit abge‐

schwächt.DamitfehleninderRAzweiMechanismenzurHemmungderHNP1‐3‐Expres‐

sion.

Da HNP1‐3 selbst auch eine proinflammatorische Wirkung zugeschrieben wird

(Soehnlein et al. 2008;Presicce et al. 2009), liegt nahe,dass erhöhteHNP1‐3‐Konzen‐

trationenzueinererhöhtenKrankheitsaktivitätführenkönnen,wassichmitklinischen

Beobachtungendeckt.DemnachkorreliertbeiRA‐PatientendieHöhederHNP1‐3‐Kon‐

zentrationinderSynovialisflüssigkeitmitderLeukozytenzahlimBlut(Bokarewa,Jinet

al.2003)undistebensodeutlichhöher,wennbeidenPatientenradiologischErosionen,

ein CRP >2mg/dl im Blut oder ein positiver Rheumafaktor nachweisbar sind (Ahn,

Huang et al. 2013). Diese Assoziation von HNP1‐3 mit einer erhöhten Krankheits‐

aktivität inrheumatoiderArthritis istauchinderPsAdenkbar,daindervorliegenden

ArbeiteinedeutlicheInduktionvonHNP1‐3indenProbenderPsAdetektierbarwarund

allePatientenaufgrundihresschwerenKrankheitsverlaufesoperativGelenkersätzeer‐

haltenmussten.

IndervorliegendenArbeitwurdeImmunreaktivitätgegenüberHNP1‐3auchinBiopsien

beiOsteoarthrosedetektiert.BetrachtetmandiepositivenPräparateunterdemLicht‐

mikroskop, fällt auf, dass zwar in allen Präparaten positive Zellen zu finden sind, die

Immunreaktivität jedochdeutlichschwächer istals inderRAoderderPsA. InderOA

exprimierennur einzelneZellen imSynovialstromaHNP1‐3.WieauchbeiderRAund

derPsAsindvieledieserZellenaufgrund ihrer typischenMorphologiealsneutrophile

Granulozytenidentifizierbar,nuristdieAnzahlinderOAdeutlichgeringer.Daebenfalls

ingesundenProbenindervorliegendenArbeitsowieinderLiteratur(Paulsen,Pufeet

al.2002)einzelneHNP1‐3‐positiveGranulozyten imSynovialstromagefundenwurden,

stelltsichdieFrage,inwieferneineniedrigeHNP1‐3‐Expressionphysiologischistundob

HNP1‐3inderOsteoarthroseüberhauptvermehrtexprimiertwird.

63

LL‐37

LL‐37wurde in2PsA‐Probendetektiert, in rheumatoiderArthritishingegen fandsich

keinerleiImmunreaktivitätgegenüberdemCathelicidin.Dabeiseianzumerken,dassdie

Immunreaktivität gegenüberLL‐37 inderPsoriasis‐Arthritis nur inwenigenZellen zu

detektierenwar.InderLiteraturfindensichkeineUntersuchungenzurExpressionvon

LL‐37 in PsA, jedoch eine Publikation zu rheumatoider Arthritis (Paulsen, Pufe et al.

2002): Per RT‐PCR konnte LL‐37 in Synovialisproben von Patienten mit RA nachge‐

wiesen werden. Warum in der vorliegenden Arbeit mittels Immunhistochemie keine

Immunreaktivität nachgewiesen werden konnte, könnte folgendermaßen begründet

werden: LL‐37wird in vielen Epithelien des Körpers exprimiert, aber auch von ver‐

schiedenen Zellen des angeborenen Immunsystemwie natürlichen Killerzellen, Mast‐

zellenundneutrophilenGranulozyten (Vandammeetal.2012).Besondersdieneutro‐

philenGranulozytensindinrheumatoiderArthritisindenGelenkenineinerhohenZahl

zu finden, jedoch vor allem in der Synovialflüssigkeit und nicht in der Synovialis. Die

neutrophilen Granulozyten diapedieren von Chemokinen angelockt zunächst von den

BlutgefäßenderSynovialisindassynovialeStroma,wandernimAnschlussdaranjedoch

raschindieSynovialflüssigkeit(Harris1990).MitdergeringenAnzahlneutrophilerGra‐

nulozyten im Synovialisgewebe sinkt damit auch dieWahrscheinlichkeit, histologisch

ImmunreaktivitätgegenüberLL‐37nachzuweisen.

Zusammenfassend lässtsichfeststellen,dassdiehöchsteImmunreaktivitätgegen‐

übermehrerenAMP,vorallemS100A8,S100A9undHNP1‐3, indenProbenderPso‐

riasisarthritis und der rheumatoiden Arthritis detektiertwurde. In der Osteoarthrose

unddengesundenKontrollenwarenauchverschiedeneAMPnachweisbar,dieExpres‐

sionwar jedoch schwächer als in denhochgradigen Synovialitiden.Dabei überwiegen

dieGemeinsamkeitenvonRAundPsAin ihrerAMP‐Expression.Unterschiedekonnten

inderExpressionvonLL‐37(nurinPsAdetektiert)undS100A8/A9(beiPsAinAssozia‐

tion zu den Leukozyten in Blutgefäßen, bei RA vereinzelt im Synovialstroma liegende

positiveLeukozyten)festgestelltwerden.

Dass AMP vorwiegend in hochgradigen Synovialitiden exprimiertwerden, unterstützt

dieVermutung,dasseinigeAMP insterilenGelenkentzündungenwiederPsAundder

RAvorallemimmunmodulatorischeFunktionenerfüllenundaufgrunddesFehlensvon

Mikroben ihre antimikrobielle Wirkung eher im Hintergrund steht. Das Fehlen von

64

Mikroorganismenals InduktorenderAMP‐Expression,wiebeispielsweiseanderHaut,

woMikrobeninKeratinozyteneineExpressionvonAMPinduzierenkönnen(Vergleich

4.5.ErgebnisseHaut),lässtdenSchlusszu,dassinderSynovialisvonPsAundRAandere

InduktionsmechanismenzurExpressionvonAMP imVordergrundstehen.Dabeiwäre

es denkbar, dass IL‐17 eine Rolle spielt, denn IL‐17 ist in der PsA in hohemMaß zu

finden(Menonetal.2014)undkannzudemdieExpressionfolgenderAMPinKeratino‐

zyten induzieren: S100A8, S100A9,Psoriasin, hBD‐2undRNase 7 (Liang et al. 2006;

Simanski et al. 2013). In der vorliegenden Arbeit wurden in der PsA S100 A8 und

S100A9 nachgewiesen, was IL‐17 nach oben genannter Hypothese stimuliert haben

könnte. Fraglich ist jedoch,warumhBD‐2,PsoriasinundRNase7nicht auch induziert

wurden. Möglich ist, dass dafür der notwendige Induktionsmechanismus durch Bak‐

terienfehlte,dennauchinderphysiologischsterilenSynovialisistunterpathologischen

Bedingungen eine Induktion vonAMPdurchBakterienmöglich: In pyogenerArthritis

mitnachgewiesenemBefallvonStaphylococcusaureusoderStaphylococcusepidermidis

wurdeeineExpressionvonhBD‐2inderSynovialisimmunhistochemischnachgewiesen

(Varogaetal.2009).Denkbaristalso,dassindensterilenArthritidenPsAundRAdurch

proinflammatorischeZytokineimRahmenderEntzündungeineAMP‐Expressionstimu‐

liertwird,aufgrunddernichtvorhandenenbakteriellenNormalfloradasProfilderAMP

jedochandersistalsdasderHautbeiPsoriasis.

4.5.ErgebnisseHaut

S100A8undS100A9

Die beiden S100‐Proteine S100 A8 und S100 A9 werden in gesunder Haut nur in

geringemMaß,inPsoriasisläsionenhingegenstarkexprimiert(Kerkhoffetal.2012).Bei

S100A8 gehtdieExpression stärkeraufdieKeratinozyten selbst zurück,S100A9 hin‐

gegen wird vermehrt von neutrophilen Granulozyten exprimiert (Aochi, Tsuji et al.

2011).DieErgebnissedervorliegendenArbeitdeckensichgrößtenteilsmitdiesenAn‐

gaben.S100A9wurdeauchhierindenPsoriasisläsionenverstärktnachgewiesen(Epi‐

dermisscoredurchschnittlich3,5imVergleichzu2,25beinicht‐läsionalerHaut).Auchin

der Dermis waren in den Läsionenmehr S100 A9‐positive Zellen zu detektieren. Be‐

trachtetman die vorliegenden Ergebnisse zur S100A8‐Expression, findetman jedoch

65

UnterschiedezubisherigenArbeiten.IndendermalenLeukozytenlässtsichindenPro‐

ben der Psoriasisläsionen eine höhere S100 A8‐Expression als in den nichtläsionalen

odergesundenProbendetektieren.InderEpidermisjedochwurdeindervorliegenden

ArbeitinallenProbenImmunreaktivitätgegenüberS100A8inallenEpidermisschichten

nachgewiesen.BeiderBewertungderErgebnissemussdieAuswertungmittelsdesIHC‐

Scoresgenauerbetrachtetwerden:BeidenErgebnissenzurS100A8‐Expressionkönnte

der IHC‐Score an seine Grenzen stoßen, da er nicht berücksichtigt, wie stark oder

schwach die Immunreaktivität ist und ob sie fokal oder diffus in den einzelnen Epi‐

dermisschichten zu finden ist. Betrachtet man die Präparate dieser Arbeit im Licht‐

mikroskop,sofälltauf,dasszwarauchindennichtläsionalenundgesundenProbenalle

Epidermisschichten Immunreaktivität gegenüber S100 A8 aufweisen, die Immun‐

reaktivitätaberdeutlichschwächerals indenPsoriasisläsionenundzudemhäufignur

fokalausgeprägtist.WürdenStärkederExpressionsowiedieDifferenzierungzwischen

fokalunddiffuszusätzlichimIHC‐Scoreberücksichtigt,würdederScoreallerdingsun‐

übersichtlicher und schlechter für Vergleiche heranziehbar sein, da keineMittelwerte

mehr gebildet werden könnten. Deshalb wurden diese beiden Kriterien nicht in den

Scoreaufgenommen.

WelcheMechanismenzudererhöhtenExpressionvonS100A8undS100A9inPsoriasis‐

läsionenführen,istnichtabschließendgeklärt.EsgibtHinweise,dassIL‐22,IL‐17Aund

IL‐17F(inderPsoriasispathogenesezentraleproinflammatorischeZytokine)sowieein

Epithel‐assoziierterWachstumsfaktor (LEDGF, lens epithelium‐derived growth factor)

in Keratinozyten die Expression der AMP induzieren können (Liang, Tan et al. 2006;

Takeichietal.2010).S100A8undS100A9 selbst tragenwiederumüberverschiedene

MechanismenzurEntstehungderPsoriasisbei – siehemmendieDifferenzierungund

fördern die Proliferation der Keratinozyten und induzieren die Produktion der proin‐

flammatorischen Zytokine IL‐6, IL‐8 und TNF‐α, die wiederum weitere Immunzellen

anlocken(Nukuietal.2008).ZudemfördernsiedieAngiogenese, indemsieEndothel‐

zellen zur Proliferation und Formation neuer Blutgefäße anregen (Lee et al. 2012).

S100A8undS100A9fungierendamitalsproinflammatorischeZytokineinderPsoriasis‐

pathogeneseundkönntensomitaucheinneuestherapeutischesZieldarstellen.

66

HNP1‐3undLL‐37

Immunreaktivität gegenüberHNP1‐3war inder vorliegendenArbeit vor allem in den

Psoriasisläsionen detektierbar. Die Immunreaktivität ging dabei vorrangig auf einge‐

wanderteLeukozytenzurück.SozeigtezumeinendieDermisvielepositiveneutrophile

Granulozyten (im Lichtmikroskop durch die typische Morphologie identifiziert) und

anderepositivemononukleäreZellen,aberauchinderEpidermiswarImmunreaktivität

zu finden.Diesewar vor allem in Akkumulationen von neutrophilen Granulozyten im

Stratum corneum, den sogenannten Munroschen Mikroabszessen, nachzuweisen. In

einemPräparatwurdejedochauchImmunreaktivitätinKeratinozytendetektiert.Inder

LiteraturfindensichebenfallsHinweisedarauf,dassdieExpressionvonHNP1‐3inder

EpidermisnichtnuraufGranulozyten,sondernauchaufKeratinozytenzurückzuführen

ist (HarderundSchröder2005).ZweiUmständegaben inderArbeitvonHarderetal.

Hinweise auf die HNP1‐3‐Expression in Keratinozyten: Zum einen wurde Schuppen‐

materialvonchronischenPlaques,dieinderRegelkeineodernursehrwenigeneutro‐

phileGranulozytenenthalten,verwendetundzumanderenindenSchuppendieKonzen‐

trationen der Neutrophilen‐Marker Myeloperoxidase und Laktoferrin bestimmt, die

beidenuringeringerKonzentrationnachweisbarwaren.DieHNP1‐3‐Konzentrationwar

jedochhoch.DamitwurdeindieserArbeitgezeigt,dassdieHNP1‐3‐Expressionnichtauf

neutrophile Granulozyten zurückging, jedoch konnte nicht bewiesenwerden, dass die

HNP1‐3‐ExpressionaufdieKeratinozytenzurückzuführenwar.IneinemPräparatinder

vorliegendenArbeitkonntedieExpressionvonHNP1‐3inKeratinozytendetektiertwer‐

den,wobei sie in den hohenEpidermisschichten am stärksten und im Stratumbasale

nichtnachzuweisenwar.

LL‐37wurde indervorliegendenArbeitnur inderHautderPsoriasispatientendetek‐

tiert, die Proben der gesunden Kontrollen blieben gänzlich negativ. Die Immun‐

reaktivität ging sowohl auf neutrophile Granulozyten in Munroschen Mikroabszessen

zurück als auch aufKeratinozyten selbst undwar am stärksten inder läsionalenPso‐

riasishautnachweisbar.AuchinderDermiswurdeineinigenneutrophilenGranulozyten

eineLL‐37‐Expressionnachgewiesen.

DieseErgebnissedeckensichmitAngabeninderLiteratur,wonachinderPsoriasisdas

AMP LL‐37 induziert ist und vor allem von Keratinozyten und neutrophilen Granulo‐

zytenexprimiertwird(Frohmetal.1997). JedochkönnenauchandereZellenwieNK‐

ZellenoderT‐ZellendiesesAMPexprimieren(Agerberth,Charoetal.2000).LL‐37trägt

67

nichtnurmitseinerantimikrobiellenWirkunggegenübermehrerenGram‐positivenund

Gram‐negativenBakterien(Larricketal.1995)zur Immunabwehrbei.LL‐37 sollauch

maßgeblich die Entstehung der Psoriasis begünstigen können (Batycka‐Baran et al.

2014): Es kann mit körpereigener DNA aus zerfallenen Zellen Komplexe bilden, die

plasmazytoide Zellen über TLR‐9, der in gesunder Haut nur mikrobielle DNA bindet,

erkennen. Diese Bindung führt zur Aktivierung der plasmazytoiden dendritischen

Zellen, die daraufhin IFN‐α produzieren (Lande, Gregorio et al. 2007). IFN‐α aktiviert

myeloidedendritischeZellen,dieimaktiviertenZustanddieDifferenzierungvonTH‐1‐

und TH‐17‐Zellen induzieren, welche dann über Zytokine wie IL17‐A und –F, IL‐22,

TNF‐αund IFN‐γKeratinozytenweiter stimulieren können (Nestle et al. 2009). Somit

kann LL‐37 entscheidend zur Entstehung der Psoriasis beitragen, indem es die

AktivierungderplasmazytoidendendritischenZellenermöglicht.

PsoriasinundRNase7

Eine Expression von Psoriasin konnte in der vorliegenden Arbeit in den Proben der

PsoriasispatientenundauchindengesundenKontrollennachgewiesenwerden.Inden

Psoriasisläsionen wurde starke Immunreaktivität detektiert, in den nichtläsionalen

ProbenderPsoriasispatientenwardie Immunreaktivität etwas schwächerund inden

gesunden Kontrollen wurden nur fokal einige Psoriasin‐positiven Keratinozyten im

Stratumcorneumnachgewiesen.DieseAngabendeckensichmitAngabenausderLite‐

raturzurExpressionvonPsoriasin.PsoriasinwirdkonstitutivvongesunderHautexpri‐

miert,dieExpressionschwanktjedochstarkinAbhängigkeitvonderKörperlokalisation

(Gläseretal.2005).InderPsoriasishingegenistPsoriasinstarkinduziert,waszurerst‐

maligen Isolierung und weiteren Charakterisierung aus psoriatischen Keratinozyten

führte (Celis et al. 1990; Madsen et al. 1991). Die Funktionen des AMP sind dabei

vielfältig. Äußerst wichtig für den Schutz der gesunden Haut und besonders der

barrieregestörtenPsoriasishautistdieantimikrobielleFunktionvonPsoriasin.Bereitsin

sehr geringen Konzentrationen wirkt Psoriasin bakterizid gegen Escherichia coli, in

höherenKonzentrationenaußerdemgegenPseudomonasaeruginosaundStaphylococcus

aureus.AufPsoriasinwird,daesvongesunderHautkonstitutivgebildetwird,dienatür‐

liche Resistenz der Haut auf die Besiedlung von und Infektionen mit E. coli zurück‐

geführt (Gläser, Harder et al. 2005). Neben der antimikrobiellen Funktion werden

Psoriasinauch chemotaktischeWirkungen aufGranulozyten,MonozytenundLympho‐

68

zyten zugeschrieben (Wolf et al. 2008).Psoriasin stimuliert neutrophile Granulozyten

zur Produktion reaktiver Sauerstoffverbindungen und proinflammatorischer Zytokine

wie IL‐6, IL‐8 und TNF‐α (Zheng et al. 2008). Die Produktion von Psoriasin kann

wiederumselbstdurchproinflammatorischeZytokine induziertwerden: IL‐17A, IL‐22

undTNF‐α(Hegyietal.2012).EineHemmungvonPsoriasinkönntesomit theoretisch

einen möglichen therapeutischen Nutzen darstellen. Denkbar ist dabei jedoch, dass

nebenderproinflammatorischenWirkungauchdieantimikrobielleWirkungvermindert

würde,wasdiePsoriasisläsionengegebenenfallsanfälligermachenkönntefürInfektio‐

nen.

RNase 7 konnte in der vorliegenden Arbeit ebenfalls sowohl in Psoriasisläsionen als

auchinnichtläsionalerPsoriasishautsowieingesunderHautdetektiertwerden,wobei

die Immunreaktivität in der läsionalen Psoriasishaut am stärksten war. Diese

konstitutiveExpressionvonRNase7 ingesunderHautunddie induzierte inPsoriasis‐

läsionenwurden in der Literatur ebenfalls beschrieben (Harder et al. 2002).RNase7

kennzeichneteinestarkeantimikrobielleAktivitätsowohlgegenGram‐positiveErreger

(Staphylococcusaureus,Propionibacteriumacnes)alsauchgegenGram‐negativeErreger

(Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecium (einen vancomycin‐

resistentenStamm))sowiedenHefepilzCandidaalbicans(HarderundSchröder2002).

Die Konzentrationen, bei denen RNase 7 in vitro bereits antimikrobiell wirkt, sind

äußerstgering,wasRNase7zumpotentestenbisherbekanntenAMPmacht(Harderund

Schröder2002;HarderundSchröder2005).

Induzierbar ist RNase 7 durch IL‐1β, TNF‐α, IFNγ, IL‐17A und über den Kontakt mit

Bakterien (Harder und Schröder 2002; Simanski, Rademacher et al. 2013). Inwiefern

RNase 7 weitere immunmodulatorische Funktionen erfüllt und zur Pathogenese der

Psoriasisbeiträgt,istbisherunklar.

hBD‐2undhBD‐3

Die humanen β‐Defensine hBD‐2 und hBD‐3 wurden nur in der Haut der Psoriasis‐

patienten nachgewiesen – in der läsionalen Psoriasishaut war die Immunreaktivität

deutlich stärker als in der nichtläsionalen. Diese Ergebnisse decken sichmit Angaben

der Literatur, wonach hBD‐2 und hBD‐3 in Psoriasisläsionen stark induziert sind

(Harder, Bartels et al. 1997; Harder et al. 2001).Die Funktionen der Defensine sind

dabeivielfältig.ZumeinenhabensieantimikrobielleWirkungen:HBD‐2wirktvorallem

69

bakterizidgegenGram‐negativeBakterienwieEscherichiacoliundPseudomonasaerugi‐

nosa.Außerdem zeigt es eine antimikrobielleWirkung gegen Candida albicans, gegen

Gram‐positiveBakterienhingegenwirkthBD‐2nurinhohenKonzentrationenbakterio‐

statisch (Harder,Bartels et al. 1997). ImGegensatzdazu zeigthBD‐3bakterizideWir‐

kung gegen sowohl Gram‐negative als auch Gram‐positive Bakterien, darunter auch

multiresistente Erreger wieMethicillin‐resistente Staphylococcus‐aureus‐(MRSA)‐Stäm‐

meundVancomycin‐resistenteEnterococcus‐faecium‐(VRE)‐Stämme (Harder,Bartels et

al. 2001). Besonders in Hinblick auf die Pathogenese der Psoriasis zeigen hBD‐2 und

hBD‐3 weitere interessante immunmodulatorische Funktionen: Sie wirken chemo‐

taktischaufT‐ZellenunddendritischeZellen,hBD‐2zusätzlichaufMastzellenundhBD‐3

zusätzlich auf Monozyten/Makrophagen (Oppenheim et al. 2005). Dazu stimulieren

hBD‐2 und hBD‐3 Keratinozyten sowohl zur Differenzierung als auch zur Produktion

proinflammatorischerZytokinewie IL‐6, IL‐10undMCP‐1(monocytechemoattractant

protein1)(Niyonsabaetal.2007).DarüberhinausstimulierenhBD‐2und ‐3wieauch

LL‐37dieAufnahmevoneigenerDNAinKomplexendurchplasmazytoidedendritische

Zellen, diedadurch aktiviertwerdenunddiePathogenesederPsoriasisweiter voran‐

treiben(Tewaryetal.2013;Landeetal.2014).Dievielfältigenimmunmodulatorischen

Funktionen der β‐Defensine spiegeln sich in der klinischenBeobachtungwieder, dass

erhöhte Serumwerte von hBD‐2mit einer erhöhten Krankheitsaktivität der Psoriasis,

gemessenamPASI‐Score(PsoriasisAreaandSeverityIndex),assoziiertsind(Jansenet

al.2009).Somitzeigensich,wieauchbeiPsoriasin,Vor‐undNachteilederInduktionder

β‐Defensine:AufdereinenSeitekönnensiediePsoriasisläsionenmit ihrerantimikro‐

biellen Wirkung schützen, auf der anderen Seite können sie mit ihren proinflamma‐

torischenFunktionendiePathogenesevorantreiben.

4.6.VergleichHaut–Gelenk

ImVergleichderExpressionderantimikrobiellenPeptideinderHautderPsoriasisvul‐

garis mit der Expression in der Synovialis der Psoriasis‐Arthritis finden sich sowohl

UnterschiedealsauchGemeinsamkeiten.

Auffallend ist,dassPsoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3nur inderPsoriasisderHaut

detektiert wurden. In den PsA‐Proben hingegen wurde keinerlei Immunreaktivität

70

gegenüberdiesenAMPnachgewiesen. InderBetrachtungder Induktionsmechanismen

dieser AMP in der Haut fällt auf, dass neben verschiedenen proinflammatorischen

Zytokinen alle durch den Kontakt der Keratinozyten mit Bakterien induziert werden

können (Harder und Schröder 2002; Gläser,Harder et al. 2005;Harder und Schröder

2005). Da die Gelenkhöhle jedoch steril ist und die Synoviozyten somit keinen

Bakterienkontakt haben, ist dieser Induktionsmechanismus in der Psoriasisarthritis

nicht möglich. Interessant ist bei dieser Überlegung die Betrachtung der Unter‐

suchungenvonVarogaetal.:HierwurdeeineExpressionvonhBD‐2inSynovialisproben

vonPatientenmitpyogenerArthritisbeschrieben(Varoga,Klostermeieretal.2009).Bei

allen Patienten wurde Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis in der

Gelenkhöhle nachgewiesen – die nunmehr infizierte Synovialis wurde durch den

Bakterienkontakt zurExpression vonhBD‐2 stimuliert. Synoviozyten sinddemnach in

derLage,β‐Defensinezuexprimieren.ObdiesauchfürPsoriasinundRNase7zutrifft,ist

weiterhinunklar.FürPsoriasinbeispielsweisewäreesdenkbar,pyogeneArthritiden,die

durchEscherichia colihervorgerufenwurden, zu untersuchen, da diesesBakterium in

KeratinozytendieExpressionvonPsoriasininduziert(Gläser,Harderetal.2005).

NebenBakterien sind auch proinflammatorische Zytokine in der Lage, die Expression

vonAMPzuinduzieren,wiebeispielsweiseIL‐17,das inKeratinozytendiehBD‐2‐und

diePsoriasin‐Expressionstimuliert(Liang,Tanetal.2006).IL‐17wirdzwarauchinder

PsA in hohem Maß von CD‐8+‐T‐Zellen produziert (Menon, Gullick et al. 2014), nur

bleibt hier die Induktion vonhBD‐2undPsoriasin aus. Dieses Beispiel zeigt die Kom‐

plexität der AMP‐Induktion. Betrachtet man IL‐17 weiter, so fällt auf, dass es neben

hBD‐2 und Psoriasin weitere AMP in Keratinozytenkulturen induziert: S100 A8 und

S100A9.DiesebeidenAMPwiederumwurdennichtnurinderEpidermisderPsoriasis

vulgaris, sondern auch in der Synovialis der Psoriasis‐Arthritis in mehreren Proben

nachgewiesen.WährenddieImmunreaktivitätinderHautsowohlinderEpidermisals

auchinderDermisstarkwar,zeigtesichinderSynovialisdieExpressionvonS100A8

undS100A9vorallemimSynovialstromaineingewandertenLeukozyten.Synoviozyten

zeigtenhingegennur ineinemPräparat Immunreaktivität. In jedemFall istdie Induk‐

tionvonS100A8undS100A9besondersinteressantzubetrachten,dasichdieseAMPin

derPathogenesederPsoriasisalsstarkproinflammatorischwirkendeZytokinegezeigt

haben(VergleichS100A8undS100A9,S.64).DemnachstelltsichdieFrage,inwiefern

sieauchinderPathogenesederPsAproinflammatorischwirken.ErsteHinweisedarauf

71

gibt es bereits, da in experimentell induzierten Arthritiden S100A8 und S100A9 die

Produktion von knorpeldestruierenden MMP (Matrixmetalloproteinasen) stimulierten

undzudemS100A8undS100A9miteinervermehrtenKrankheitsaktivitätinderRAin

Verbindunggebrachtwerden(vanLentetal.2008;Kang,Wooetal.2014).Außerdem

vermindertMethotrexatbeiPsoriasispatientendieExpressionvonS100A8undS100A9

(Kane,Rothetal.2003),wasebenfalls indirekt füreineproinflammatorischeWirkung

derAMPimGelenksprechenkönnte.DennochsindgenaueInduktionsmechanismenin

denLeukozytenderPsAundauchindenSynoviozytenbisherunbekanntundsolltenin

derZukunftweitererforschtwerden.

HNP1‐3 und LL‐37, die vor allem von neutrophilen Granulozyten exprimiert werden,

wurden ebenfalls in der Psoriasis der Haut und in der Synovialis der PsA detektiert.

HNP1‐3wurdevorallemvonLeukozyten,dieinvielenFällenaufgrundihrertypischen

MorphologiealsneutrophileGranulozyten identifiziertwerdenkonnten,exprimiert. In

der Haut wurde zusätzlich in einem Präparat Immunreaktivität in Keratinozyten

nachgewiesen und auch in der Psoriasisarthritis zeigte sich in einer Probe eine In‐

duktioninSynoviozyten.AuchHNP1‐3wirdeineInduktionknorpeldestruierenderMMP

zugeschrieben(Ahn,Huangetal.2013),wobeidieseUntersuchungenbishernuranRA‐

Probengemachtwurden.

LL‐37wurdeebenfallsinderPsoriasisderHautsowiederSynovialisderPsAdetektiert.

Während die Immunreaktivität in der Haut sowohl auf neutrophile Granulozyten in

StratumcorneumundDermisalsauchaufKeratinozytenselbst zurückging, zeigten in

derSynovialisderPsAnureinzelneeingewanderteLeukozytenimSynovialstromaeine

LL‐37‐Expression.DaLL‐37 inderPathogenesederPsoriasis inderHautmitderAkti‐

vierungplasmazytoiderdendritischerZelleneinewichtige, initialeRollezugeschrieben

wird (VergleichHNP1‐3undLL‐37, S. 66), ist es von großem Interessedurchweitere

Untersuchungenzuverstehen,inwiefernLL‐37auchinderPsoriasisarthritiszurPatho‐

genesebeiträgt.

4.7.ZusammenfassungundAusblick

Psoriasiswird nach heutigemKenntnisstand als chronisch inflammatorische System‐

erkrankung angesehen, zu der neben den Hautläsionen verschiedene assoziierte Er‐

72

krankungengehören,u.a.diePsoriasis‐Arthritis(PsA).Da30%derPsoriasis‐Patienten

in Deutschland zusätzlich zu Hautläsionen eine Psoriasis‐Arthritis entwickeln, ist die

Erforschung von Unterschieden und Gemeinsamkeiten der beiden Ausprägungen von

hohemInteresse.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Expression antimikrobieller Peptide

(AMP)inderEpidermisvonPsoriasisläsionenundderSynovialisvonPsoriasis‐Arthritis

(PsA).UmdieErgebnissederAMP‐Expressionbesserinterpretierenzukönnen,wurden

neben denPsA‐Proben (n=10) auch Proben von Patientenmit rheumatoiderArthritis

(RA, n=8), Osteoarthrose (OA, n=4) sowie gesunden Kontrollen (n=5) gewonnen und

von den Patienten der Psoriasis‐Hautläsionen (n=4) zusätzlich Proben aus makro‐

skopisch gesunder Haut sowie Proben von Hautgesunden gleichen Alters, gleichen

Geschlechts und gleicher Lokalisation der Biopsie. Die arthroskopisch gewonnenen

Synovialisproben (n=27) und die bioptisch gewonnenen Hautproben (n=12) wurden

mithilfe der Immunhistochemie auf die Expression verschiedener Klassen von AMP

untersucht: Psoriasin (S100 A7), Ribonuklease 7 (RNase 7), die humanen β‐Defensine

hBD‐2 und hBD‐3, das Cathelicidin LL‐37, S100 A8 (Calgranulin A), S100 A9 (Calgra‐

nulinB) und die humanen α‐DefensineHNP1‐3 (humane neutrophile Peptide 1‐3).Die

Präparatewurden lichtmikroskopisch von 2 unabhängigen Gutachtern analysiert. Zur

BeurteilungderHautprobenwurdeeinEpidermisscore,derdieImmunreaktivitätinden

einzelnenSchichtenderOberhautbewertete,verwendet.WeiterhinwurdedieImmun‐

reaktivität in der Dermis beurteilt. Die Synovialisproben wurden nach 3 Gesichts‐

punkten analysiert: 1. Immunreaktivität in Synoviozyten der Membrana synovialis,

2.Immunreaktivität in eingewanderten Leukozyten imSynovialstromaund3. Immun‐

reaktivität in Leukozyten, die inBlutgefäßen zu erkennenwaren. Zudemwurde licht‐

mikroskopischvoneinemweiterenunabhängigenGutachterverblindet für jedeProbe

einSynovitisscorezurBeurteilungderEntzündungsaktivitätbestimmt.

DieErgebnissederUntersuchungenzeigteneinemitunterstarkeInduktionvonS100A8,

S100A9,HNP1‐3undLL‐37indenHautläsionenderpsoriatischenEpidermisundinder

SynovialisderPsA,dieaucheineExpressionvonS100A8,S100A9undHNP1‐3inSyno‐

viozytenderMembranasynovialiseinschloss.

Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3hingegenwurdennur in der Epidermis der Pso‐

riasis detektiert, die Synovialisproben zeigten keine Immunreaktivität. Die Synovialis‐

73

probenderrheumatoidenArthritiszeigteneinähnlichesExpressionsmusterwiedieder

PsA:S100A8,S100A9undHNP1‐3wurdenmitunterstarkexprimiert,sowohlimSyno‐

vialstromaalsauchinderMembranasynovialis.InderOsteoarthroseunddengesunden

KontrollenwardieExpressionderAMPschwächerundnurvereinzeltinLeukozytenim

Synovialstromazudetektieren.

In der Literatur wurde bereits berichtet, dass S100 A8 und S100 A9 mit ihren

proinflammatorischen Funktionen wie der Induktion der IL‐6‐, IL‐8‐ und TNF‐α‐

Produktion in Keratinozyten vorantreiben können. Im Gelenk können AMP ebenfalls

proinflammatorisch wirken: S100 A8, S100 A9 und HNP1‐3 können die Produktion

knorpeldestruierender Proteinasen sowie proinflamma‐torischer Zytokine in

experimentellenArthritideninduzieren.

Aufgrund der in dieser Arbeit nachgewiesenen Expression von S100A8, S100A9und

lässtsichdaherspekulieren,dassS100A8,S100A9undHNP1‐3auchdiePathogenese

derPsAmitihrenvielfältigenproinflammatorischenFunktionenvorantreibenkönnten.

DadieKonzentrationenvonS100A8undS100A9imSerumvonPsoriasispatientenvor

allemmitderKrankheitsaktivitätderPsAundwenigermitderStärkedesHautbefalls

(gemessenamPASI‐Score)assoziiertsind,istvongroßemInteresseherauszufinden,wo

unddurchwelcheZellendieseAMPgebildetwerden.HierliefertdievorliegendeArbeit

äußerst interessante Hinweise, da gezeigt werden konnte, dass die Immunreaktivität

gegenüberS100A8undS100A9vorallemaufverschiedene,entzündungsbedingtindas

SynovialstromaeingewanderteLeukozytenzurückzuführenwarundauchvereinzeltin

Synoviozyten in derMembrana synovialis eine Expression derAMPdetektiertwurde.

EinähnlichesExpressionsmusterwurdefürdievorwiegendvonneutrophilenGranulo‐

zytenexprimiertenAMPHNP1‐3nachgewiesen.

WieinderPsAwurdeauchinderRAImmunreaktivitätgegenüberS100A8,S100A9und

HNP1‐3 in vorwiegend entzündungsbedingt eingewanderten Leukozyten im Synovial‐

stromanachgewiesen,wobei ebenfalls auch inSynoviozytenderMembrana synovialis

eineExpressiondetektiertwurde.StatistischsignifikanteUnterschiede inderAMP‐Ex‐

pressionderPsAundderRAwurdennicht festgestellt.Auffälligwar jedoch,dassPsA

und RA als hochgradige Synovialitiden stärkere Immunreaktivität gegenüber den

genanntenAMPzeigtenalsdieOsteoarthroseunddiegesundenKontrollen.

74

EineAssoziationzwischenImmunreaktivitätundSynovitisscoreoderImmunreaktivität

undTherapiederPatientenwarinkeinerGelenkentzündungerkennbar.

Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3wurdennurinderHautderPsoriasisdetektiert.In

keiner der untersuchten Arthritiden der vorliegenden Arbeit wurden diese AMP ex‐

primiert.Dabereitsbekanntist,dassimFalleeinerbakteriellenInfektiondesGelenkes

hBD‐2 induzierbar ist, lässt sich vermuten, dass in der sterilen PsA die Induktion der

AMPdurchMikroorganismenausbleibtundBakteriennichtwieanderHautalspotente

Induktorenfungierenkönnen.

Die Erforschung der Pathogenese der Psoriasis an derHaut und amGelenk hat unter

anderemzumZiel,neueVerfahrenzuentwickeln,umbeiPatientenmiteinerPsoriasis

derHaut,wiesietypischerweiseinderKrankheitsgeschichtezunächstvieleJahreallein

auftritt,einebeginnendezusätzlichePsAfrühzeitigdiagnostizierbarzumachenunddie

Patienten einer effektiven Therapie zuzuführen. Idealerweise würde man dabei die

Diagnosestellenwollen,bevorersteBeschwerdenunddamitverbundeneSchädenam

Gelenkentstehen.EineMöglichkeitwäredieder„Screeningmarker“,diediePsAcharak‐

terisieren und von der Psoriasis der Haut abgrenzen könnten. In regelmäßigen Ab‐

ständen könnten dieseMarker aus dem einfach zu gewinnenden Blutserum von Pso‐

riasispatientenbestimmtwerden,umdieEntwicklungeinerPsAfrühzeitiganzuzeigen.

Zum Nachweis von Serumproteinen als Frühmarker einer PsA gibt es bereits erste

Studien. Bis zur klinischenAnwendbarkeit vonAMP als Screeningmarker ist derWeg

jedochnochweit:WeitereUntersuchungensolltenangestrebtwerden,daweiterhinun‐

klar ist, welche Funktionen AMP in der Pathogenese der PsA spielen und für welche

Entzündungsmechanismensiestehen.ErstwenndazuweitereErkenntnissevorliegen,

kann deutlich werden, was eine Erhöhung eines AMP im Serum im Sinne eines

Screeningmarkersbedeutet. ImnächstenSchrittmüsstenUntersuchungenzeigen,dass

eine Erhöhung der Screeningmarkermit einer erhöhtenKrankheitsaktivität, einer be‐

stimmten Komorbidität o. ä. assoziiert ist. Für S100 A8 und S100 A9 beispielsweise

konntebereits gezeigtwerden,dassdieKonzentrationen imSerumvor allemvonder

Krankheitsaktivität der PsA abhängen und weniger von der Stärke des Hautbefalls.

DemnachkönntenS100A8undS100A9alsScreeningmarkergeeignetseinoderauchals

MarkerzumTherapiemonitoring.

75

Ein weiteres Ziel der Erforschung von AMP und ihrer Wirkungen ist der Er‐

kenntnisgewinn zur therapeutischen Nutzbarkeit der Moleküle. Da für mehrere AMP

eineproinflammatorischeWirkunginGelenkenbeschriebenist,wäreesinteressantzu

untersuchen, inwiefern eine Hemmung die Entzündung und damit die Krankheits‐

aktivitätmildernkönnte.Kritischzubeachtenistdabeidiegleichzeitige,fürdieImmun‐

abwehräußerstwichtigeantimikrobielleFunktionderAMP,derenHemmungschwere

InfektionenzurFolgehabenkönnte.

ZusammenfassendzeigtdieseArbeit,dassdieSystemerkrankungPsoriasisnichtnurzu

einer Induktion von AMP an der Haut führen kann, sondern in der Psoriasisarthritis

ebenfallszueinerInduktionvonS100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37inderSynovialis.

Gleichzeitig zeigen sich Unterschiede zwischen Haut und Gelenk: Die AMP Psoriasin,

RNase7,hBD‐2undhBD‐3,dieinhohemMaßinderHautderPsoriasisexprimiertwer‐

den,ließensichnichtinderSynovialisderPsoriasisarthritisdetektieren.SogibtdieAr‐

beitHinweiseaufUnterschiedeundGemeinsamkeitenderhochaktivenundkomplexen

AMP,diemitihrenvielfältigenFunktionennichtnurwichtigeRolleninderPsoriasisder

Haut,sondernebenfallsinderPsoriasisarthritiseinnehmenkönnen.

76

Literaturverzeichnis

Ademowo,O.S.,B.Hernandez,etal.(2014)."Discoveryandconfirmationofaprotein

biomarkerpanelwithpotentialtopredictresponsetobiologicaltherapyinpsoriaticarthritis."AnnRheumDis.

Agerberth,B.,J.Charo,etal.(2000)."Thehumanantimicrobialandchemotacticpeptides

LL‐37andalpha‐defensinsareexpressedbyspecificlymphocyteandmonocytepopulations."Blood96(9):3086‐3093.

Ahn,J.K.,B.Huang,etal.(2013)."Theroleofalpha‐defensin‐1andrelatedsignal

transductionmechanismsintheproductionofIL‐6,IL‐8andMMPsinrheumatoidfibroblast‐likesynoviocytes."Rheumatology(Oxford)52(8):1368‐1376.

Aochi,S.,K.Tsuji,etal.(2011)."Markedlyelevatedserumlevelsofcalcium‐binding

S100A8/A9proteinsinpsoriaticarthritisareduetoactivatedmonocytes/macrophages."JAmAcadDermatol64(5):879‐887.

Baillet,A.,C.Trocme,etal.(2010)."Synovialfluidproteomicfingerprint:S100A8,S100A9

andS100A12proteinsdiscriminaterheumatoidarthritisfromotherinflammatoryjointdiseases."Rheumatology(Oxford)49(4):671‐682.

Batycka‐Baran,A.,J.Maj,etal.(2014)."Thenewinsightintotheroleofantimicrobial

proteins‐alarminsintheimmunopathogenesisofpsoriasis."JImmunolRes2014:628289.

Bokarewa,M.I.,T.Jin,etal.(2003)."Intraarticularreleaseandaccumulationofdefensins

andbactericidal/permeability‐increasingproteininpatientswithrheumatoidarthritis."JRheumatol30(8):1719‐1724.

Braff,M.H.,A.Bardan,etal.(2005)."Cutaneousdefensemechanismsbyantimicrobial

peptides."JInvestDermatol125(1):9‐13.Celis,J.E.,D.Cruger,etal.(1990)."Atwo‐dimensionalgelproteindatabaseofnoncultured

totalnormalhumanepidermalkeratinocytes:identificationofproteinsstronglyup‐regulatedinpsoriaticepidermis."Electrophoresis11(3):242‐254.

Clarkson,D.B.,Fan,Y.andJoe,H.(1993)."AnAlgorithmforPerformingFisher'sExactTest

inrxcContingencyTables."ACMTransactionsonMathematicalSoftware19:484‐488.

Coons,A.H.,Creech,H.J.,Jones,R.N.(1941)."Immunologicalpropertiesofanantibody

containingafluorescentgroup."ProcSocExpBiolMed47:200‐202.Cretu,D.,I.Prassas,etal.(2014)."Identificationofpsoriaticarthritismediatorsinsynovial

fluidbyquantitativemassspectrometry."ClinProteomics11(1):27.

77

deLange‐Brokaar,B.J.,A.Ioan‐Facsinay,etal.(2012)."Synovialinflammation,immunecellsandtheircytokinesinosteoarthritis:areview."OsteoarthritisCartilage20(12):1484‐1499.

deSeny,D.,M.Fillet,etal.(2008)."MonomericcalgranulinsmeasuredbySELDI‐TOFmass

spectrometryandcalprotectinmeasuredbyELISAasbiomarkersinarthritis."ClinChem54(6):1066‐1075.

Ehrchen,J.M.,C.Sunderkotter,etal.(2009)."TheendogenousToll‐likereceptor4agonist

S100A8/S100A9(calprotectin)asinnateamplifierofinfection,autoimmunity,andcancer."JLeukocBiol86(3):557‐566.

Fisher,R.andF.Yates(1948).Statisticaltablesforbiological,agriculturalandmedical

research.London,Oliver&Boyd:26‐27.Frohm,M.,B.Agerberth,etal.(1997)."Theexpressionofthegenecodingforthe

antibacterialpeptideLL‐37isinducedinhumankeratinocytesduringinflammatorydisorders."JBiolChem272(24):15258‐15263.

Gläser,R.,J.Harder,etal.(2005)."Antimicrobialpsoriasin(S100A7)protectshumanskin

fromEscherichiacoliinfection."NatImmunol6(1):57‐64.Gu,J.,E.Marker‐Hermann,etal.(2002)."A588‐genemicroarrayanalysisoftheperipheral

bloodmononuclearcellsofspondyloarthropathypatients."Rheumatology(Oxford)41(7):759‐766.

Harder,J.,J.Bartels,etal.(1997)."Apeptideantibioticfromhumanskin."Nature

387(6636):861.Harder,J.,J.Bartels,etal.(2001).Isolationandcharacterizationofhumanbeta‐defensin‐

3,anovelhumaninduciblepeptideantibiotic.JBiolChem.UnitedStates.276:5707‐5713.

Harder,J.,R.Gläser,etal.(2007)."Theroleandpotentialtherapeuticalapplicationsof

antimicrobialproteinsininfectiousandinflammatorydiseases."EndocrMetabImmuneDisordDrugTargets7(2):75‐82.

Harder,J.andJ.M.Schröder(2002).RNase7,anovelinnateimmunedefenseantimicrobial

proteinofhealthyhumanskin.JBiolChem.UnitedStates.277:46779‐46784.Harder,J.andJ.M.Schröder(2005)."Psoriaticscales:apromisingsourcefortheisolation

ofhumanskin‐derivedantimicrobialproteins."JLeukocBiol77(4):476‐486.Harris,E.D.,Jr.(1990)."Rheumatoidarthritis.Pathophysiologyandimplicationsfor

therapy."NEnglJMed322(18):1277‐1289.

78

Hegyi,Z.,S.Zwicker,etal.(2012).VitaminDAnalogCalcipotriolSuppressestheTh17Cytokine‐InducedProinflammatoryS100"Alarmins"Psoriasin(S100A7)andKoebnerisin(S100A15)inPsoriasis.JInvestDermatol.UnitedStates.132:1416‐1424.

Henes,J.C.,E.Ziupa,etal.(2014)."Highprevalenceofpsoriaticarthritisindermatological

patientswithpsoriasis:across‐sectionalstudy."RheumatolInt34(2):227‐234.Henseler,T.andE.Christophers(1995).Diseaseconcomitanceinpsoriasis.JAmAcad

Dermatol.UnitedStates.32:982‐986.Hsu,S.M.,L.Raine,etal.(1981)."Useofavidin‐biotin‐peroxidasecomplex(ABC)in

immunoperoxidasetechniques:acomparisonbetweenABCandunlabeledantibody(PAP)procedures."JHistochemCytochem29(4):577‐580.

Jansen,P.A.,D.Rodijk‐Olthuis,etal.(2009)."Beta‐defensin‐2proteinisaserumbiomarker

fordiseaseactivityinpsoriasisandreachesbiologicallyrelevantconcentrationsinlesionalskin."PLoSOne4(3):e4725.

Kane,D.,J.Roth,etal.(2003)."Increasedperivascularsynovialmembraneexpressionof

myeloid‐relatedproteinsinpsoriaticarthritis."ArthritisRheum48(6):1676‐1685.Kang,K.Y.,J.W.Woo,etal.(2014)."S100A8/A9asabiomarkerforsynovialinflammation

andjointdamageinpatientswithrheumatoidarthritis."KoreanJInternMed29(1):12‐19.

Kerkhoff,C.,A.Voss,etal.(2012)."NovelinsightsintotheroleofS100A8/A9inskin

biology."ExpDermatol21(11):822‐826.Krenn,V.,L.Morawietz,etal.(2006)."Synovitisscore:discriminationbetweenchroniclow‐

gradeandhigh‐gradesynovitis."Histopathology49(4):358‐364.Kruithof,E.,D.Baeten,etal.(2005)."Synovialhistopathologyofpsoriaticarthritis,both

oligo‐andpolyarticular,resemblesspondyloarthropathymorethanitdoesrheumatoidarthritis."ArthritisResTher7(3):R569‐580.

Lande,R.,G.Chamilos,etal.(2014)."Cationicantimicrobialpeptidesinpsoriaticskin

cooperatetobreakinnatetolerancetoself‐DNA."EurJImmunol.Lande,R.,J.Gregorio,etal.(2007)."Plasmacytoiddendriticcellssenseself‐DNAcoupled

withantimicrobialpeptide."Nature449(7162):564‐569.Larrick,J.W.,M.Hirata,etal.(1995)."Anti‐microbialactivityofhumanCAP18peptides."

Immunotechnology1(1):65‐72.Lee,D.G.,J.W.Woo,etal.(2013)."MRP8promotesTh17differentiationviaupregulation

ofIL‐6productionbyfibroblast‐likesynoviocytesinrheumatoidarthritis."ExpMolMed45:e20.

79

Lee,Y.,S.Jang,etal.(2012)."S100A8andS100A9aremessengersinthecrosstalkbetweenepidermisanddermismodulatingapsoriaticmilieuinhumanskin."BiochemBiophysResCommun423(4):647‐653.

Lehrer,R.I.(2004)."Primatedefensins."NatRevMicrobiol2(9):727‐738.Liang,S.C.,X.Y.Tan,etal.(2006)."Interleukin(IL)‐22andIL‐17arecoexpressedbyTh17

cellsandcooperativelyenhanceexpressionofantimicrobialpeptides."JExpMed203(10):2271‐2279.

Madsen,P.,H.H.Rasmussen,etal.(1991)."Molecularcloning,occurrence,andexpression

ofanovelpartiallysecretedprotein"psoriasin"thatishighlyup‐regulatedinpsoriaticskin."JInvestDermatol97(4):701‐712.

Mease,P.J.andA.W.Armstrong(2014)."Managingpatientswithpsoriaticdisease:the

diagnosisandpharmacologictreatmentofpsoriaticarthritisinpatientswithpsoriasis."Drugs74(4):423‐441.

Menon,B.,N.J.Gullick,etal.(2014)."Interleukin‐17+CD8+Tcellsareenrichedinthejoints

ofpatientswithpsoriaticarthritisandcorrelatewithdiseaseactivityandjointdamageprogression."ArthritisRheumatol66(5):1272‐1281.

Namimatsu,S.,M.Ghazizadeh,etal.(2005).Reversingtheeffectsofformalinfixationwith

citraconicanhydrideandheat:auniversalantigenretrievalmethod.JHistochemCytochem.UnitedStates.53:3‐11.

Nestle,F.O.,D.H.Kaplan,etal.(2009)."Psoriasis."NEnglJMed361(5):496‐509.Niyonsaba,F.,H.Ushio,etal.(2007)."Antimicrobialpeptideshumanbeta‐defensins

stimulateepidermalkeratinocytemigration,proliferationandproductionofproinflammatorycytokinesandchemokines."JInvestDermatol127(3):594‐604.

Nukui,T.,R.Ehama,etal.(2008)."S100A8/A9,akeymediatorforpositivefeedback

growthstimulationofnormalhumankeratinocytes."JCellBiochem104(2):453‐464.

Oppenheim,J.J.andD.Yang(2005)."Alarmins:chemotacticactivatorsofimmune

responses."CurrOpinImmunol17(4):359‐365.Paulsen,F.,T.Pufe,etal.(2002)."Antimicrobialpeptidesareexpressedandproducedin

healthyandinflamedhumansynovialmembranes."JPathol198(3):369‐377.Presicce,P.,S.Giannelli,etal.(2009)."Humandefensinsactivatemonocyte‐derived

dendriticcells,promotetheproductionofproinflammatorycytokines,andup‐regulatethesurfaceexpressionofCD91."JLeukocBiol86(4):941‐948.

R‐Core‐Team(2013).R:Alanguageandenvironmentforstatisticalcomputing.Vienna,

Austria,RFoundationforStatisticalComputing.

80

Reich,K.,K.Kruger,etal.(2009)."EpidemiologyandclinicalpatternofpsoriaticarthritisinGermany:aprospectiveinterdisciplinaryepidemiologicalstudyof1511patientswithplaque‐typepsoriasis."BrJDermatol160(5):1040‐1047.

Riepl,B.,S.Grassel,etal.(2010)."Tumornecrosisfactorandnorepinephrinelowerthe

levelsofhumanneutrophilpeptides1‐3secretionbymixedsynovialtissueculturesinosteoarthritisandrheumatoidarthritis."ArthritisResTher12(3):R110.

Shi,S.R.,R.J.Cote,etal.(2001)."Antigenretrievaltechniques:currentperspectives."J

HistochemCytochem49(8):931‐937.Simanski,M.,F.Rademacher,etal.(2013)."IL‐17AandIFN‐gammasynergisticallyinduce

RNase7expressionviaSTAT3inprimarykeratinocytes."PLoSOne8(3):e59531.Soehnlein,O.,Y.Kai‐Larsen,etal.(2008)."NeutrophilprimarygranuleproteinsHBPand

HNP1‐3boostbacterialphagocytosisbyhumanandmurinemacrophages."JClinInvest118(10):3491‐3502.

Takeichi,T.,K.Sugiura,etal.(2010)."OverexpressionofLEDGF/DFS70inducesIL‐6via

p38activationinHaCaTcells,similartothatseeninthepsoriaticcondition."JInvestDermatol130(12):2760‐2767.

Tewary,P.,G.delaRosa,etal.(2013)."beta‐Defensin2and3promotetheuptakeofselfor

CpGDNA,enhanceIFN‐alphaproductionbyhumanplasmacytoiddendriticcells,andpromoteinflammation."JImmunol191(2):865‐874.

vanLent,P.L.,L.Grevers,etal.(2008)."Myeloid‐relatedproteinsS100A8/S100A9regulate

jointinflammationandcartilagedestructionduringantigen‐inducedarthritis."AnnRheumDis67(12):1750‐1758.

Vandamme,D.,B.Landuyt,etal.(2012)."AcomprehensivesummaryofLL‐37,thefactotum

humancathelicidinpeptide."CellImmunol280(1):22‐35.Varoga,D.,E.Klostermeier,etal.(2009)."TheantimicrobialpeptideHBD‐2andtheToll‐

likereceptors‐2and‐4areinducedinsynovialmembranesincaseofsepticarthritis."VirchowsArch454(6):685‐694.

Werner,M.,A.Chott,etal.(2000)."Effectofformalintissuefixationandprocessingon

immunohistochemistry."AmJSurgPathol24(7):1016‐1019.Wittersheim,M.,J.Cordes,etal.(2013)."Differentialexpressionandinvivosecretionofthe

antimicrobialpeptidespsoriasin(S100A7),RNase7,humanbeta‐defensin‐2and‐3inhealthyhumanskin."ExpDermatol22(5):364‐366.

Wolf,R.,O.M.Howard,etal.(2008)."ChemotacticactivityofS100A7(Psoriasin)is

mediatedbythereceptorforadvancedglycationendproductsandpotentiatesinflammationwithhighlyhomologousbutfunctionallydistinctS100A15."JImmunol181(2):1499‐1506.

81

Yang,D.andJ.J.Oppenheim(2004)."Antimicrobialproteinsactas"alarmins"injointimmunedefense."ArthritisRheum50(11):3401‐3403.

Youssef,P.,J.Roth,etal.(1999)."Expressionofmyeloidrelatedproteins(MRP)8and14

andtheMRP8/14heterodimerinrheumatoidarthritissynovialmembrane."JRheumatol26(12):2523‐2528.

Zasloff,M.(2002)."Antimicrobialpeptidesofmulticellularorganisms."Nature415(6870):

389‐395.Zheng,Y.,F.Niyonsaba,etal.(2008)."Microbicidalproteinpsoriasinisamultifunctional

modulatorofneutrophilactivation."Immunology124(3):357‐367.

82

Danksagung

ZuerstmöchteichmichbeimeinerDoktormutter,FrauProf.Dr.med.RegineGläser,für

dieÜberlassungdiesesspannendenThemasunddieausgezeichneteBetreuungbedan‐

ken.DankihrerBegeisterung,ihrerMotivation,ihresEngagementsundihrerabsoluten

Zuverlässigkeit ist dieseArbeitmöglich geworden. Ich bin sehrdankbar, dass ichTeil

ihrerArbeitsgruppeseindurfte.

DesWeiterenmöchteichFrauChristelMartensen‐KerlfürdieexzellenteEinführungin

dieArbeitstechniken danken. Ihre stetigeHilfsbereitschaft und nette Zusammenarbeit

habendasGelingenderExperimenteermöglicht.

MeinDankgilt ebenfallsHerrnProf.Dr. rer.nat. JürgenHarder für seineDiskussions‐

bereitschaft,HilfeunddieimmerneuenIdeen.

FürdieBereitstellungderProbenunddieguteZusammenarbeitbeiderErstellungvon

VeröffentlichungenmöchteichProf.DennisMcGonagle,Dr.RichardCuthbertundKaren

HenshawausLeeds,England,danken.DievielenDiskussionenhabensehrvielSpaßge‐

macht.

SehrdankbarbinichAnne‐KathrinFiegefürdieHilfebeiderBeurteilungderPräparate,

ihreGeduldundMotivation.

EbensodankbarbinichHerrnProf.Dr.med.IvoLeuschnerfürdiefachkundigeMitbe‐

urteilungderSynovialispräparate.

Dankbar bin ich ebenfalls Herrn Dipl. Inform. Jürgen Hedderich für die fachkundige

BeratungimBereichStatistik.

Danken möchte ich außerdem Herrn Prof. Dr. med. Thomas Schwarz für die Bereit‐

stellungdesArbeitsplatzesinderUniversitäts‐HautklinikKiel.

FürdienetteAtmosphäre imLabormöchte ichaußerdemVera,Gela,BenteundSteffi

danken.

MeinDankgiltaußerdemmeinerFamilie–meinenElternundGeschwistern,diemich

immerunterstützen,undmeinemDaniel fürseinegeduldigeHilfe inallenLayout‐und

SoftwarefragenundseineUnterstützungundMotivation.MeinerTochterSophiamöchte

ich für ihre verlässlichen Schlaf‐ undWachphasen danken, diemir genug Zeit für die

ArbeitließenundFreudeindenPausengemachthaben.

83

Lebenslauf

PersönlicheDaten

HenrikeEdithTessieBierkarre,geb.Kosfeld

Geborenam20.April1987inWesterland/Sylt

SchulischeAusbildung

08/1993–07/1997 Hochtorgrundschule,NeustadtinHolstein

08/1997–01/2004 Kreisgymnasium,NeustadtinHolstein

01/2004–07/2004 HillcrestHighSchool,Hamilton,Neuseeland

07/2004–06/2006 AbituramOstseegymnasiumTimmendorferStrand

Hochschulausbildung

10/2006–12/2012 StudiumderHumanmedizinanderChristian‐Albrechts‐

UniversitätzuKiel

08/2008 ErsterAbschnittderärztlichenPrüfung

10/2009 BeginnderDoktorarbeitinderKlinikfürDermatologie,

UniversitätsklinikumKielbeiFrauProf.Dr.RegineGläser

Sommersemester2011 Erasmus‐AuslandssemesterinAmiens,Frankreich

PraktischesJahr2011/12 Dermatologie–UniversitätsklinikKiel

InnereMedizin–FlensburgerKliniken

Chirurgie–NorthernGeneralHospital,Sheffield,England

12/2012 ZweiterAbschnittderärztlichenPrüfung

ÄrztlicheWeiterbildung

Seit01/2015 AssistenzärztininderKlinikfürAnästhesiologiedes

StädtischenKlinikumsBraunschweig

84

Veroffentlichungen

Originalarbeit:

Henrike Bierkarre, Jürgen Harder, Richard Cuthbert, Paul Emery, Richard Reece, Ivo

Leuschner,UlrichMrowietz,JürgenHedderich,DennisMcGonagle,RegineGläser(2016):

DifferentialExpressionofAntimicrobialPeptidesinPsoriasisandPsoriaticArthritisasa

NovelContributoryMechanismsforSkinandJointDiseaseHeterogeneity,Scandinavian

JournalofRheumatology2016;45(3):188‐96.DOI10.3109/03009742.2015.1091497

Abstract:

H.Kosfeld, I. Leuschner, J.Harder,U.Mrowietz,R. Cuthbert,K.Henshaw,P. Emery,D.

Varoga,T.Pufe,R.Reece,D.McGonagleandR.Gläser(2011):Differentialexpressionof

antimicrobial peptides in synovial tissue of psoriatic arthritis indicating a diverse

pathogeneticconceptofskinandjointdisease?ExperimentalDermatology20:185‐18

Posterpräsentation bei der Jahrestagung der ADF (Arbeitsgruppe dermatologischer

Forschung)inTübingen

expression antimikrobieller peptide in der synovialis der ... · aqua dest. lat. aqua destillata,...

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