Facu l tad de C ienc ias

Desarrollo de nuevos métodos de vacunación basados en

la anafilotoxina C5a y la proteína extra A de la

fibronectina y péptidos sintéticos inhibidores de las

células T reguladoras

Francesc Rudilla Salvador

2011

F a c u l t a d d e C i e n c i a s

Desarrollo de nuevos métodos de vacunación basados en la

anafilotoxina C5a y la proteína extra A de la fibronectina y

péptidos sintéticos inhibidores de las células T reguladoras

Memoria presentada por D. Francesc Rudilla Salvador para aspirar al grado

de Doctor por la Universidad de Navarra

El presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección en el Departamento de Hepatología y Terapia Génica y autorizo su presentación ante el Tribunal que lo ha de juzgar.

Pamplona, 17 de Junio de 2011

Dr. Juan José Lasarte Sagastibelza

A mi mujer Sílvia

y a mi hijo Biel.

“Caminant sempre junts”

AGRADECIMIENTOS

Han sido muchas las personas que me han ayudado y apoyado antes y durante

la realización de esta tesis. El espacio para darles las más sinceras gracias se

hace corto. A todas ellas quiero darles las gracias y espero de todo corazón no

dejarme a nadie.

A la Clínica Universidad de Navarra por la formación especializada en

Inmunología que he recibido.

Por la formación académica que en ellas he adquirido, quiero expresar

mi más profundo y sincero agradecimiento a la Universidad de Navarra, a la

Universitat de Girona y a la Universitat Autònoma de Barcelona.

Al Dr. Jesús Prieto, por permitirme formar parte del equipo de la

División de Terapia Génica y Hepatología y por el gran entusiasmo que

muestra en los proyectos. Muchas gracias por su apoyo.

A mi director de tesis, el Dr. Juan José Lasarte, creador de este proyecto.

Gracias por confiar en mí y darme la oportunidad de trabajar con un equipo

humano extraordinario. Gracias por tu dedicación e ilusión en el trabajo, tus

brillantes ideas, tu optimismo y por tener siempre en cuenta mis opiniones.

A los Dres. Francisco Borrás y Pablo Sarobe, por todas las buenas ideas

que aportáis y porque siempre se puede contar con vuestra inestimable ayuda y

objetividad científica, muchas gracias.

Quiero expresar, también, mi gratitud y mi consideración más sincera a

la Dra Noelia Casares y al Dr Javier Dotor porque cuando más lo he necesitado

me han proporcionado una dosis de esperanza e ilusión. Muchas Gracias Noe,

muchas gracias Dotor.

Mi gratitud también para la Dra Laura Arribillaga y la Dra Maika

Durántez, por su estímulo y ayuda desinteresada.

Para Cristina Mansilla, Marta Martínez, Teresa Lozano y Lorea

Villanueva por ser unas excelentes compañeras de trabajo. Muchas gracias por

vuestro apoyo.

A todos los peptídicos, tengo la gran suerte de poder contar con vosotros

siempre que lo he necesitado, por eso esta tesis también es en parte vuestra.

Muchas gracias.

Al resto de mis compañeros del departamento y, en especial, a aquellos

con los que comparto planta gracias por hacer agradable el simple hecho de

estar. Gracias al Dr José Ignacio Riezu, por tener siempre una sonrisa. Muchas

gracias Edurne por tu ayuda en el trabajo realizado.

Quiero agradecer al Dr Rubén Pío por proporcionarme ratones C5aR ko

y al Dr Daniel Ajona por su entusiasmo y apoyo en el proyecto.

A la Dra Claude Leclerc, y a Catherine por su colaboración con los

ensayos con ratones TLR4 ko.

Al equipo del animalario, por ser un apoyo imprescindible para la

manipulación de los ratones.

Han sido prácticamente cinco años de trabajo tres de los cuales han sido

especialmente duros, por tener que combinar el trabajo como biólogo residente

(guardias incluidas) con la tesis doctoral y vivir lejos de la familia. Quiero

agradecer profundamente a mis padres Núria y Francisco por el apoyo que

constituyen en mi vida y por animarme siempre a mirar hacia delante sin

perder el presente. A mis hermanas Núria y Laia por el cariño que siempre me

han transmitido y por hacerme saber que siempre tendré cerca a mis hermanas.

A mis amigos y compañeros de viaje, gracias por ayudarme a crecer

como persona.

Mis últimas palabras de agradecimiento son para ti, Sílvia. Cada día

recibo mucho de ti, me apoyas incondicionalmente en todo aquello que me

propongo realizar y sin tu apoyo este proyecto no hubiese terminado. Muchas

gracias por ayudarme en todo aquello que has podido y gracias por permitirme

crecer a tu lado.

A todas aquellas personas que, aunque no he nombrado, han sido muy

importantes y necesarias. Muchas y muchísimas gracias.

ABREVIATURAS

Aa: aminoácido

AMPc: adenosín monofosfato cíclico

APC: célula presentadora de antígeno (del inglés antigen presenting cell)

as: antisentido (aplicado a los cebadores)

CFSE: carboxifluorescein succinimidil ester

CML: cultivo mixto leucocitario

CpG: regiones de DNA viral o bacteriano ricas en pares de citosina y guanina enlazados por fosfatos

Cpm: cuentas por minuto

DAF: factor acelerador de la degradación

DC: célula dendrítica (del inglés dendritic cell)

DIDS: ácido 4,4'-diisotiocianostilbeno-2,2'-disulfónico

DNA: ácido desoxirribonucléico (del inglés deoxyribonucleic acid)

DTc: determinante T citotóxico

DTh: determinante T helper

EDA: dominio extra A de la fibronectina (del inglés, extradomain-A fibronectin)

FBS: suero fetal bovino (del inglés foetal bovine serum)

FITC: isotiocianato de fluoresceína

FPLC: cromatografía liquida de proteína (del inglés Fast protein liquid chromatography)

GM-CSF: factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (del inglés, granulocyte-macrophage colony stimulatory factor)

HPPTLP: péptido señal de la pre-pro-tripsina humana (del inglés human preprotrypsin leader peptide)

Ig: inmunoglobulina

IL: interleucina

i.p.: intraperitoneal

IPTG: isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido

i.t.: intratumoral

i.v.: intravenosa

LB: linfocitos B

LPS: lipopolisacárido

LTc: linfocito T citotóxico

LTh: linfocito T helper

MC: medio completo

MHC: complejo principal de histocompatibilidad (del inglés major histocompatibility complex)

MyD88: factor de diferenciación mieloide 88 (del inglés myeloid differentiation factor 88)

NF-кB: factor de transcripción nuclear kappa de los linfocitos B (del inglés, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)

NK: célula asesina natural (del inglés natural killer)

NKT: linfocitos T asesinos naturales (del inglés natural killer T lymphocyte)

PAMP: patrones de moléculas asociados a patógenos (del inglés pathogen-associated molecular patterns)

PBS: tampón fosfato salino (del inglés phosphate buffered saline)

PCR: reacción en cadena de la polimerasa (del inglés polymerase chain reaction)

PE: ficoeritrina (del inglés phycoerythrin)

poly(I:C): ácido poliinosínico:policitidílico

PRR: receptores de patrones de reconocimiento (del inglés pattern recognition receptors)

RNA: ácido ribonucléico (del inglés ribonucleic acid)

s: sentido (aplicado a los cebadores)

TCR: receptor de células T (del inglés T cell receptor)

TLR: receptores tipo peaje (del inglés toll-like receptors)

TNF: factor de necrosis tumoral (del inglés tumor necrosis factor)

Treg: células T reguladoras

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN................................................................................................................................................. 1

1. Sistema inmunitario ......................................................................................................................................... 3

1.1. Inmunidad innata.................................................................................................................................... 3

1.1.1. Receptores Toll-like (TLR) y vías de señalización.......................................................................... 5

1.1.2. Sistema del complemento. Generalidades ...................................................................................... 9

1.1.2.1. Activación del complemento ................................................................................................... 10

1.1.2.1.1. Vía clásica del complemento ............................................................................................. 10

1.1.2.1.2. Vía de las lectinas................................................................................................................ 11

1.1.2.1.3. Vía alternativa o sistema properdina ............................................................................... 12

1.1.2.1.4. Rutas alternativas de la activación del complemento.................................................... 12

1.1.2.2. Funciones efectoras del complemento ................................................................................... 13

1.1.3. Interacción del complemento con los receptores Toll like (TLR)................................................. 16

1.2. Inmunidad adaptativa o adquirida .................................................................................................... 20

1.2.1. Respuesta humoral........................................................................................................................... 20

1.2.2. Respuesta celular.............................................................................................................................. 21

1.2.2.1. Linfocitos Th............................................................................................................................... 21

1.2.2.2. Linfocitos T citotóxicos ............................................................................................................. 22

1.2.2.3. Linfocitos T reguladores CD4+CD25+.................................................................................... 24

1.3. Activación de una respuesta inmunitaria .......................................................................................... 25

1.3.1. Presentación antigénica .................................................................................................................. 25

1.3.2. Células dendríticas .......................................................................................................................... 27

1.3.3. Señalización del calcio en la activación linfocitaria .................................................................... 30

2. Estrategias de vacunación .............................................................................................................................. 31

2.1. DNA desnudo ......................................................................................................................................... 35

2.2. Proteínas recombinantes de fusión basadas en el dominio extra A de la fibronectina (EDA). 36

2.2.1. El domino extra A de la fibronectina (EDA) ................................................................................ 37

2.3. Péptidos inhibidores de las células T reguladoras........................................................................... 39

2.4. Anafilotoxinas. Generalidades ............................................................................................................ 40

2.4.1. Efecto biológico de C5a................................................................................................................... 40

2.4.2. Receptores del fragmento C5a ....................................................................................................... 45

2.4.2.1. Receptor C5aR (CD88) .............................................................................................................. 46

2.4.2.2. Receptor C5L2 (GPR77) ............................................................................................................ 47

2.5. Adyuvantes.............................................................................................................................................. 48

OBJETIVOS........................................................................................................................................................... 51

MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................................... 55

2. Células............................................................................................................................................................... 57

2. Ratones.............................................................................................................................................................. 58

3. Antígenos.......................................................................................................................................................... 58

3.1. Péptidos.................................................................................................................................................... 58

3.1.1. Síntesis de péptidos......................................................................................................................... 58

3.1.2. Péptidos comerciales....................................................................................................................... 61

3.1.3. Análisis de interacción biomolecular............................................................................................ 61

3.2. Plásmidos de expresión......................................................................................................................... 61

3.2.1. Construcción .................................................................................................................................... 61

3.2.2. Transfección en células adherentes ............................................................................................... 63

3.2.2.1. Western blot ............................................................................................................................... 64

3.3. Proteínas recombinantes de fusión ..................................................................................................... 65

3.3.1. Construcción .................................................................................................................................... 65

3.3.2. Purificación....................................................................................................................................... 67

3.3.2.1. Purificación por afinidad.......................................................................................................... 68

3.3.2.2. Intercambio iónico..................................................................................................................... 69

3.3.2.3. Replegado y detoxificado ......................................................................................................... 69

3.3.3. Análisis de la pureza....................................................................................................................... 71

3.3.3.1. Geles SDS-PAGE y tinción con Azul de Coomassie ............................................................. 71

3.3.4. Ensayos de actividad....................................................................................................................... 72

3.3.3.1. Análisis de activación de monocitos ....................................................................................... 72

3.3.4.2. Análisis de maduración de células dendríticas ..................................................................... 72

3.3.4.2.1. Diferenciación DC ............................................................................................................... 72

3.3.4.2.2. Análisis in vitro de la maduración de las células dendríticas......................................... 73

3.3.4.2.2.1. Expresión de marcadores de maduración .................................................................. 74

3.3.4.2.2.2. Producción de citocinas ................................................................................................ 74

3.3.4.3. Presentación antigénica ............................................................................................................ 74

3.3.4.4. Migración celular....................................................................................................................... 75

4. Estudio in vitro de los intercambiadores de iones cloruro, calcio y potasio en la activación linfocitaria ........................................................................................................................................................ 75

4.1. Análisis de la expresión de mRNA por PCR quantitativa .............................................................. 75

4.2. Purificación de células T reguladoras................................................................................................. 76

4.3. Ensayos de proliferación celular.......................................................................................................... 76

4.4. Cinéticas de calcio intracelular ............................................................................................................ 76

5. Estudio de la apoptosis linfocitaria in vitro ............................................................................................... 77

5.1. Técnica de Tunel..................................................................................................................................... 77

6. Estudio de la respuesta inmunitaria en ratones......................................................................................... 78

6.1. Inmunización .......................................................................................................................................... 78

6.1.1. Plásmido ........................................................................................................................................... 78

6.1.2. Proteína............................................................................................................................................. 78

6.2. Estudio in vitro e in vivo de las respuestas inmunitarias inducidas............................................. 78

6.2.1. Aislamiento de esplenocitos........................................................................................................... 78

6.2.2. ELISPOT ........................................................................................................................................... 79

6.2.3. In vivo killing ..................................................................................................................................... 79

6.2.4. Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización C5aR.............................. 80

6.2.5. Depleción in vivo de células NK1.1 ............................................................................................... 80

6.3. Estudios in vivo de protección tumoral .............................................................................................. 81

6.3.1. Modelo tumoral ................................................................................................................................ 81

6.3.2. Estudios de protección de tumores ................................................................................................ 81

6.3.3. Estudios de tratamiento de tumores .............................................................................................. 82

7. Estadística ......................................................................................................................................................... 82

RESULTADOS ..................................................................................................................................................... 83

1. Implicación de los intercambiadores de Cl- y canales de Ca2+ en la activación celular de los linfocitos T efectores y T reguladores (CD4+CD25+FOXP3+) ................................................................ 85

1.1. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la acción de las células T reguladoras (CD4+CD25+FOXP3+)................................................................................. 85

1.2. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la expresión de mRNAs en los linfocitos T................................................................................................................ 90

1.3. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre el flujo de entrada de calcio en los linfocitos ................................................................................................................... 92

2. Desarrollo de péptidos inhibidores del intercambiador cloruro/bicarbonato AE2............................. 97

2.1. Síntesis de los péptidos y ensayos funcionales de selección de los péptidos inhibidores ...... 97

2.2. Ensayos de unión del péptido AE2-17 al bucle 3 del intercambiador AE2 .................................. 99

2.3. Efecto del péptido p17AE2 en la proliferación celular .................................................................. 102

2.4. Efecto del péptido p17AE2 en la apoptosis celular......................................................................... 106

3. Estudio del potencial inmunomodulador de las anafilotoxinas para el desarrollo de vacunas...... 107

3.1. Cribado con plásmidos de expresión................................................................................................ 107

3.2. Utilización del fragmento C5a como adyuvante de vacunación .................................................. 110

3.2.1. Purificación de las proteínas recombinantes de fusión ............................................................. 110

3.2.1.1. Purificación de EDA-SIINFEKL.............................................................................................. 113

3.2.1.2. Purificación de C5a-EDA-SIINFEKL ..................................................................................... 113

3.2.1.3. Purificación de EDA-SIINFEKL-C5a y SIINFEKLC5a......................................................... 115

3.2.2. Inducción de la producción de TNF-α por la línea THP-1........................................................ 117

3.2.3. Maduración de células dendríticas. ............................................................................................. 118

3.2.3.1. Estudio de la expresión de marcadores de superficie en las células dendríticas ............. 118

3.2.3.2. Inducción de citocinas y quimiocinas por las células dendríticas...................................... 120

3.2.4. Análisis in vitro de la quimiotaxis inducida por C5a ................................................................ 121

3.2.5. Presentación antigénica de EDA-SIINFEKL, EDA-SIINFEKL-C5a y SIINFEKL-C5a .......... 124

3.2.6. Inducción de la respuesta inmunitaria frente a SIINFEKL ...................................................... 125

3.2.7. Efecto de las proteínas recombinantes sobre la población de las células T reguladoras en la inducción de la respuesta inmunitaria ........................................................................................ 128

3.2.8. Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización TLR4............................ 130

3.2.9. Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización C5aR............................ 132

3.2.10. Inducción de la respuesta inmunitaria NK. ............................................................................. 134

3.2.11. Inducción de protección antitumoral y tratamiento de tumores establecidos .................... 137

DISCUSIÓN........................................................................................................................................................ 141

1. Estudio del desarrollo de inhibidores de la acción de las células T reguladoras .............................. 143

2. Estudio del efecto adyuvante de las proteínas del complemento......................................................... 147

CONCLUSIONES ............................................................................................................................................. 155

BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................................. 159

ANEXOS ............................................................................................................................................................... 179

INTRODUCCIÓN

Introducción

3

1. Sistema inmunitario

El sistema inmunitario está compuesto de muchos tipos celulares

interdependientes que en conjunto protegen al organismo contra bacterias,

parásitos, hongos, infecciones virales y frente al crecimiento tumoral. Muchos

de estos tipos celulares tienen funciones especializadas, pueden engullir

bacterias y parásitos o eliminar células tumorales o células propias del

organismo infectadas por virus. Por lo tanto, es un sistema que discrimina entre

lo propio y lo ajeno, permitiendo actuar de forma específica. Cuando esta

tolerancia inmunológica se altera, es decir, cuando falla la no respuesta a lo

propio y a lo no dañino, se generan respuestas frente a estructuras propias

dando lugar a procesos autoinmunes o bien procesos de hipersensibilidad

donde el sistema inmunitario responde de forma exagerada a estructuras

foráneas no patógenas, produciendo daño al organismo.

La respuesta inmunitaria está formada por dos tipos principales de

respuesta en función de la naturaleza de las estructuras de reconocimiento del

patógeno. Estas estructuras pueden ser genéricas (respuesta innata) o bien

específicas, utilizando receptores generados al azar que tienen un repertorio de

reconocimiento prácticamente ilimitado (respuesta adaptativa).

La interacción entre ambas formas de respuesta es esencial para una

respuesta inmunológica eficaz. Los mecanismos innatos son fundamentales

para la iniciación de las respuestas adaptativas y además permiten controlar el

tipo de respuesta inducida, por otra parte la respuesta innata también es

reclutada en la fase efectora de la respuesta adaptativa. Es importante destacar

que las interacciones entre ambas respuestas son muchas, complejas y

bidireccionales, formando parte de una única respuesta global de defensa.

1.1. Inmunidad innata

La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa contra las

infecciones. Comprende toda una serie de mecanismos de defensa constitutivos

y listos para movilizarse cuando se produzca una infección, preparados para

responder con gran rapidez. Se caracteriza por ser una respuesta no antígeno

Introducción

4

específica que reacciona inicialmente del mismo modo frente a una amplia

variedad de infecciones. Es una respuesta que no genera memoria

inmunológica, es decir, que en encuentros posteriores con el mismo patógeno

no se produce una respuesta mejorada y por lo tanto no es una respuesta

inmunitaria duradera.

Los mecanismos defensivos de la respuesta innata están formados por

barreras físicas como la piel, las mucosas, el ácido estomacal, el reflejo de la tos

entre otros y barreras químicas como la fiebre, la inflamación y el sistema del

complemento. El sistema del complemento constituye el mayor componente

humoral de la respuesta innata y actúa como mediador de varios mecanismos

de la respuesta adaptativa, entre ellos la citotoxicidad mediada por anticuerpos.

Además, la respuesta innata tiene un componente celular importante

cuyo mecanismo defensivo es la fagocitosis y la citotoxicidad celular. Las

poblaciones celulares responsables del desarrollo de una respuesta inmunitaria

innata son las células fagocíticas (macrófagos, neutrófilos, células dendríticas),

mastocitos, basófilos, eosinófilos y las células citotóxicas naturales o células NK

(del inglés natural killer). Las células de la respuesta innata también son

importantes mediadores en la activación del sistema inmune adaptativo. Un

ejemplo es la secreción de interferón gamma (IFN-γ) por parte de las células NK

(Mandelboim et al. 1998; Arase et al. 1996; Young and Hardy 1995); otro

ejemplo lo encontramos en las células dendríticas que presentan antígenos a las

células T, uno de los tipos celulares clave del sistema inmunitario adaptativo

(Guermonprez et al. 2002). Los determinantes reconocidos por los componentes

de la respuesta innata (no específica) difieren de los reconocidos por la

respuesta adaptativa (específica). Mientras que los componentes de la respuesta

adaptativa reconocen y reaccionan frente a un patógeno en particular, los

componentes del sistema inmunitario innato reconocen amplios patrones

moleculares que se encuentran en grupos de patógenos relacionados,

careciendo de un alto grado de especificidad. Los patrones moleculares

comunes reconocidos por el sistema inmunitario innato han sido llamados

patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, del inglés “pathogen

Introducción

5

associated molecular patterns”), y sus receptores se llaman receptores de patrones

de reconocimiento (PRR, del inglés pattern recognition receptors) (Medzhitov

2001; Janeway and Medzhitov 2002).

1.1.1. Receptores Toll-like (TLR) y vías de señalización

Los PRR se pueden dividir en tres clases dependiendo de su ubicación:

secretables, de membrana o citosólicos. Los PRR transmembrana incluyen

varios tipos de receptores, entre ellos destacamos la familia de los receptores

TLR (del inglés Toll-like receptors).

Los TLR son glicoproteínas transmembrana tipo I formadas por un

dominio extracelular N terminal rico en leucinas, contiene entre 15-30 LRR (del

inglés leucine-rich repeats) que media el reconocimiento de los PAMPs, un

dominio transmembrana y el dominio intracelular C terminal, conocido como

TIR (del inglés Toll/Interleukin-1 receptor) que está implicado en la transducción

de la señalización. El número de TLRs puede diferir en función de la especie, se

han identificado entre 10 y 12 TLRs funcionales en humanos y ratones

respectivamente. Los TLRs 1-9 están conservados en ambas especies. Los

PAMPs reconocidos por los TLR son lípidos, lipoproteínas, proteínas y ácidos

nucleicos derivados de una amplia gama de microbios, como bacterias, virus,

parásitos y hongos. Se localizan principalmente en células presentadoras de

antígeno profesionales (células mononucleares, dendríticas y macrófagos) y en

diferentes células epiteliales (Takeda et al. 2003; Akira and Takeda 2004).

Los TLRs se clasifican en dos tipos en función de su localización y sus

respectivos ligandos PAMPs. Por un lado, los TLR 1, 2, 4, 5 y 6 reconocen

principalmente productos bacterianos (lipoproteínas, lípidos y proteínas), por

lo que se expresan en la membrana. Y por otro lado, los TLR 3, 7, 8 y 9 que se

localizan en los endosomas, retículo endoplasmático, lisosomas y

endolisosomas donde reconocen ácidos nucleicos virales (Tabla 1).

Está descrita la existencia de una comunicación cruzada entre los TLRs y

las moléculas adaptadoras, lo que aumenta la especificidad y amplía el patrón

de PAMPs reconocidos por un mismo receptor (Latz et al. 2003; Martin et al.

Introducción

6

2005). Se ha observado que algunos de estos TLR forman heterodímeros (como

los formados por TLR1-TLR2) y homodímeros (TLR3-TLR3) (Kumar et al. 2009).

Tabla 1. Resumen de los diferentes TLR junto con sus principales características. Adaptado de

Kumar, Kawai et al 2009. (Kumar et al. 2009)

TLR Localización Principales PAMPs Vía de señalización

Factor de

transcripción Citocinas inducidas

TLR1/2 Superficie celular Triacil-lipopéptidos TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)

TLR2 Superficie celular Peptidoglicano, Hemaglutinina

TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)

TLR3 Endosomas virus RNAss, virus DNAds

TRIF NFкB, IRF3,7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN

TLR4 Superficie celular LPS TIRAP/MyD88, TRAM/TRIF

NFкB, IRF3,7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN

TLR5 Superficie celular Flagelina MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)

TLR6/2 Superficie celular Diacil-lipopéptidos TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)

TLR7 Endosomas virus RNAss MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN

TLR8 Endosomas virus RNAss MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN

TLR9 Endosomas virus DNAds, motivos CpG

MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6), IFN

TLR11 Superficie celular Profilin like protein MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF-, IL-6)

Cada receptor TLR produce efectos biológicos específicos tras el

reconocimiento de sus ligandos, debido al reclutamiento de moléculas

adaptadoras con dominios de unión TIR, como MyD88, TIRAP, TRIF y TRAM.

Las vías de señalización de los TLR se pueden clasificar en dos vías

distintas. La vía dependiente de My-D88 que conlleva la activación de NF-κB

con la posterior inducción de citocinas pro-inflamatorias (TNF- o IL-6) o la vía

dependiente de TRIF responsable de la inducción de interferón tipo I. La unión

de TLR1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 y 11 con sus respectivos ligandos recluta MyD88.

Además, TLR1, 2 y 6 lo hacen a través del adaptador TIRAP, que sirve de unión

entre los dominios TIR de los TLR y la molécula MyD88. TLR3 por su parte

recluta TRIF. El receptor TLR4 recluta a las cuatro moléculas adaptadoras

siendo capaz de señalizar a través de ambas vías, ya sea mediante la unión a

TIRAP que lleva al reclutamiento de MyD88, o a TRAM para activar la vía de

Introducción

7

señalización de TRIF. Para la inducción de citocinas pro-inflamatorias a través

de TLR4 es necesaria la activación de ambas vías de señalización (Figuras 1 y 2 )

(Kawai and Akira 2010).

Figura 1. Esquema de las vías de señalización de los TLR de membrana (Kawai and Akira 2010).

Figura 2. Esquema de las vías de señalización de los TLR intracelulares (Kawai and Akira 2010).

Introducción

8

Hay una creciente evidencia de que los receptores TLR juegan un papel

clave en la mediación de las respuestas sistémicas, a la invasión de patógenos

durante la sepsis, así como también en otras enfermedades inflamatorias y

autoinmunes. En consecuencia, se ha sugerido que el bloqueo de la función de

los TLR puede, en el futuro, traer nuevas posibilidades terapéuticas con el

objetivo de suprimir estados de inflamación. Algunos de los inhibidores

estudiados son variantes de las moléculas adaptadoras, ubiquitin ligasas,

deubiquitinasas, micro RNAs y reguladores transcripcionales (O'Neill and

Bowie 2007; Kawai and Akira 2010).

Por otra parte, la señalización de los TLR podría utilizarse para potenciar

el efecto terapéutico de las vacunas, puesto que la activación de la señalización

TLR provoca una activación rápida de la inmunidad innata mediante la

maduración de las células dendríticas (DC), producción de citocinas pro-

inflamatorias y citocinas antivirales, así como la expresión de moléculas co

estimuladoras y receptores de quimiocinas (Aderem and Ulevitch 2000; Kaisho

and Akira 2002; Werling and Jungi 2003). Además, está descrita la importancia

de la señalización TLR en células T efectoras y en células T reguladoras,

asociándose dichas vías a la diferenciación de las células T memoria (Pasare

and Medzhitov 2004; Salem et al. 2005), polarización de la respuesta Th1

(Schnare et al. 2001), pérdida temporal de la función supresora de las células T

reguladoras (reduciendo la expresión de Foxp3) (Hackl et al. 2011; Liu et al.

2006; Sutmuller et al. 2006), la generación de células Th17 o el bloqueo de la

conversión de las células T reguladoras promoviendo la respuesta autoinmune

(Chen et al. 2007; Abdollahi-Roodsaz et al. 2008). En definitiva, los TLR

permiten modular la respuesta celular T a través de la respuesta innata y

directamente por su acción en la respuesta adaptativa, permitiendo la inducción

de una inmunidad adaptativa eficaz. En este sentido se pueden considerar

receptores adyuvantes.

Introducción

9

1.1.2. Sistema del complemento. Generalidades

El complemento es un conjunto de proteínas termolábiles, la gran

mayoría plasmáticas y algunas de membrana, cuya función principal es

potenciar la inflamación, la fagocitosis y la lisis de los microorganismos. El

hepatocito es el principal productor de factores del complemento, también los

macrófagos activados en el foco inflamatorio, lo que es de gran importancia

porque así se garantiza la presencia de estos factores del complemento en el

foco inflamatorio. Las citocinas inflamatorias (IL-1, IL-6 y TNFα) y el IFNγ,

incrementan la síntesis de algunos factores del complemento en el hígado.

La gran mayoría de los factores del complemento son enzimas

proteolíticas. Cuando una de estas enzimas actúa sobre su sustrato, este se

escinde en dos fragmentos. Estos fragmentos se nombran igual que al sustrato

pero añadiéndoles una letra minúscula. Por ejemplo, C3 se escinde en dos

fragmentos, al mayor se le llama C3b y al menor C3a. Los dos fragmentos

resultantes tienen actividad biológica, si bien dichas acciones son distintas para

cada uno de ellos. Son un ejemplo, algunos pequeños péptidos con actividad de

anafilotoxinas, liberados durante la activación del complemento. El más potente

es el C5a, seguido por el C3a. Por lo tanto, durante la activación del

complemento tienen lugar una serie de reacciones en cascada, en cada reacción

se genera un producto activo, que además de determinar que la cadena prosiga

hasta la reacción siguiente, puede tener funciones biológicas en la defensa

frente a microorganismos.

El complemento es activado por tres vías distintas, la clásica, la de las

lectinas (MBL) y la alternativa (o properdina) (Vergani 1986) (Figura 3). Las tres

tienen en común la activación del componente C3 y por lo tanto confluyen en

una vía común de ataque a membrana, pero difieren en la naturaleza del

reconocimiento. La vía clásica es activada por anticuerpos liberados tras una

respuesta humoral. La vía de las lectinas es activada tras el reconocimiento e

interacción de patrones asociados a patógenos (PAMP´s) por proteínas lectinas.

Y por último, la vía alternativa se diferencia del resto debido a una activación

Introducción

10

espontánea de C3 con una tasa muy moderada (cuya activación y amplificación

ocurren solamente en presencia de ciertos agentes, principalmente bacterias) y a

su promiscuidad en interaccionar con un amplio rango de aceptores.

Figura 3. Vías de activación del complemento (Kemper and Atkinson 2007).

1.1.2.1. Activación del complemento

1.1.2.1.1. Vía clásica del complemento

Esta vía se activa tras la unión del componente C1q del factor C1, a la

fracción constante de las inmunoglobulinas IgG (clases IgG1, IgG2, IgG3) o IgM

(Holme and Whaley 1989). Estos anticuerpos deben formar el complejo

antígeno anticuerpo para que se produzca tal activación, en el caso de la IgG

que es una inmunoglobulina monomérica se necesitan al menos dos complejos

antígeno anticuerpo, mientras que en el caso de la IgM al ser pentamérica sólo

es necesario un complejo Ag-Ac. Las inmunoglobulinas solubles no activarán al

factor C1. También el C1q reconoce factores endógenos como células muertas,

proteínas de la matriz extracelular, pentraxinas, priones, depósitos amiloides y

DNA.

El factor C1 forma un complejo C1qr2s2 estabilizado por Ca2+. Tras la

unión del factor C1 con la región constante de la cadena µ de IgM o de la

Introducción

11

cadena γ de IgG, tendrá lugar una activación en secuencia de la actividad

proteolítica de los componentes C1r y C1s. C1r activa a C1s. Por acción de C1s,

con actividad serín proteasa, se escinde el fragmento C4, liberándose un

pequeño fragmento C4a y un C4b. C4a tiene una actividad anafilotoxina leve, y

C4b tiene actividad opsonina. En presencia de Mg2+, C2 forma un complejo con

C4b y se transforma en un nuevo sustrato para C1s, formándose el complejo

C4b2a con actividad C3 convertasa para escindir C3. La escisión de C3 implica

que se agrega C3b al complejo C4b2a formando la C5 convertasa (C4b2a3b). La

degradación de C4b2a es inducida por una proteína de unión a C4 (C4bp) o a

un receptor de C3b (C1R) en presencia del factor I.

C5 se escinde en C5a y C5b por la acción de la C5a convertasa. C5a es la

anafilotoxina más potente. En este momento empieza la segunda fase de

activación del complemento que consiste en el ensamblaje de los componentes

terminales. C6 se une a C5b y luego a C7, se insertan en la membrana

plasmática y posteriormente se une C8, causando una penetración en la

membrana plasmática y la inducción de la polimerización de C9 en membrana.

El resultado final es la formación del complejo de ataque a membrana (CAM) o

componente terminal del complemento (CTC), con la generación de un poro de

100 Å en la membrana plasmática que causa la osmólisis celular (Morgan 1989;

Bhakdi et al. 1990).

1.1.2.1.2. Vía de las lectinas

Es una vía análoga a la clásica que se activa por proteínas homólogas a

C1q: ficolinas y lectina de unión a manosa (MBL). Su activación es

independiente de anticuerpos. Estas proteínas reconocen específicamente

carbohidratos en la superficie de patógenos o células apoptóticas, como la

manosa y la N-acetil-glucosamina (GlcNac). Tras su unión con los

carbohidratos, la proteína de unión a manosa activa al complejo C1qrs. Otras

proteínas, las serín proteasas asociadas a MBL (MASP-1 y MASP-2) funcionan

de manera análoga a C1r y C1s, hidrolizando los componentes C4 y C2 para

formar la C3 convertasa (C4bC2a), que es común para ambas vías, la clásica y la

Introducción

12

de la lectina. Los fragmentos C3b generados presentan actividad opsónica,

estimulando la opsonización para el aclaramiento de microorganismos y

residuos celulares resultantes de la apoptosis.

1.1.2.1.3. Vía alternativa o sistema properdina

La vía alternativa se inicia por la interacción del componente C3 con

polisacáridos, su activación es independiente de anticuerpos, presenta un

mecanismo de acción distinto a la vía clásica y a la lectina. Constituye una

primera línea de defensa en la respuesta innata. Es la vía más primitiva.

Constituye un estado de activación permanente del componente C3, se

inicia tras la hidrólisis espontánea de C3 y en presencia de niveles bajos de C3.

En ausencia de microorganismos, la cantidad de C3b producida es inactivada

por el Factor H. En presencia de microorganismos, C3 se une a la superficie

invasora evadiendo la acción del Factor H, se forma un complejo con el Factor

B, el cual se fragmenta por acción del factor D en presencia de Mg2+. El

complejo C3bBb es altamente inestable y la vía alternativa no continúa sin la

presencia de una proteína circulante llamada properdina, que permite

estabilizar el complejo C3bBb. Se forma la C3 convertasa de la vía alternativa

(compuesta por C3bBb), que actuará enzimáticamente sobre moléculas de C3,

amplificando la cascada. Parte de este C3b se puede unir a la C3 convertasa y

formar la C5 convertasa de la vía alternativa (C3bBb3b) que activará a C6,

convergiendo en los mismos pasos no enzimáticos y de ensamblaje finales de la

vía clásica.

1.1.2.1.4. Rutas alternativas de la activación del complemento

Además de los tres principales mecanismos de activación del

complemento, hay varias rutas accesorias que permiten activar el sistema del

complemento en respuesta a varios estados.

La vía de “la lectina ligadora de manosa” (MBL) puede ser activada

directamente por la unión de lectina de unión a manosa (MBL) a

inmunoglobulina IgM que interacciona con antígenos isquémicos de células

Introducción

13

endoteliales en situación de daño por isquemia-reperfusión (McMullen et al.

2006).

En ausencia de C2 y C4 pero en presencia de componentes de la vía

alternativa es posible que complejos antígeno anticuerpo o oligonucleótidos

activen a C1 o lectina de unión a manosa (MBL) respectivamente (Selander et al.

2006).

Está descrito que las anafilotoxinas se pueden generar por la acción de

ciertas proteasas extrínsecas, el componente C3 puede ser degradado y activado

por proteasas como la trombina o la calicreína (Markiewski et al. 2007; Amara et

al. 2008), además el componente C5 puede degradarse por la trombina sin la

necesidad de la acción de C3 (Huber-Lang et al. 2006). Por lo tanto existe un

nexo entre el sistema del complemento y la cascada de coagulación. Asimismo,

las anafilotoxinas C3a y C5a se pueden generar directamente de los

componentes C3 y C5 respectivamente por proteasas que se presentan en

procesos alérgicos, en mecanismos que involucran la generación de radicales

libres y en la activación de la calicreína debido a la presencia de fibras de

amianto y de sílice (Maruo et al. 1997; Governa et al. 2000; Governa et al. 2005)

1.1.2.2. Funciones efectoras del complemento

El sistema de complemento funciona como una herramienta de vigilancia

inmunológica. En un ambiente sano, hay una actividad constitutiva y ligera del

complemento, asegurándose un sondeo que es llevado a cabo por la presencia

de proteínas solubles que reconocen estructuras propias y proteínas de

membrana reguladoras del complemento, de modo que se previene la

amplificación de la señal de activación del complemento. Un ejemplo de estas

proteínas de membrana es el factor DAF (factor acelerador de la degradación)

que está ampliamente distribuído y cuya función es inhibir la unión y facilitar la

disociación de C4b y C2a. De este modo, estos factores reguladores pueden

prevenir la lisis de las células autólogas vivas. En presencia de células

apoptóticas o de microorganismos bacterianos se produce un descenso de estos

factores reguladores, al mismo tiempo que las proteínas que reconocen los

Introducción

14

patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) amplifican la activación

del complemento. Tiene lugar la opsonización de la célula apoptótica o del

microorganismo por fragmentos del complemento y la posterior fagocitosis o la

formación del complejo de ataque a membrana que conlleva la lisis celular, la

señalización pro-inflamatoria mediada por la liberación de los fragmentos del

complemento con actividad biológica llamados anafilotoxinas, y además, se

induce una estimulación downstream de la respuesta inmune.

Por lo tanto tiene lugar una acción de reconocimiento, activación y

regulación del sistema del complemento, condicionada a la presencia de células

sanas, apoptóticas o microorganismos bacterianos.

Las proteínas reguladoras del complemento pueden ser solubles o de

membrana y ayudan al control del sistema de ataque del complemento

ajustando su severidad, propagación y destino en la célula diana. Ejercen su

acción en distintos puntos, tanto en la vía clásica como en la alternativa o de las

lectinas, centrándose fundamentalmente en la activación de C3.

El sistema del complemento tiene una diversidad de funciones biológicas

defensivas. Estas funciones se llevan a cabo por diferentes fracciones activas del

complemento que interaccionan con sus respectivos receptores de membrana.

Las acciones anafilotóxicas, quimiotáxicas y opsonizantes del

complemento lo convierten en un factor fundamental en la potenciación de la

inflamación, fenómeno básico en la defensa frente a la infección y a los procesos

tumorales. Las principales acciones del complemento son las siguientes:

Acción lítica: la lisis se produce como consecuencia de la formación del

CAM (complejo de ataque a la membrana), este complejo puede lisar bacterias

gram-negativas, parásitos, virus encapsulados, eritrocitos y células nucleadas.

Las bacterias gram positivas son bastante resistentes a la acción lítica del

complemento. Se conoce como citotoxicidad dependiente de complemento.

Respuesta inflamatoria. Acción anafilotóxica: como consecuencia de la

fragmentación de distintos componentes del complemento se generan unos

fragmentos activos llamados anafilotoxinas, estos son el C3a, C4a y C5a. Estas

Introducción

15

anafilotoxinas se unen a sus respectivos receptores induciendo la liberación de

mediadores de la inflamación. Estas sustancias aumentan la vasodilatación y la

permeabilidad de los vasos sanguíneos. Así mismo, inducen la extravasación de

los leucocitos al endotelio. C3a y C5a son potentes quimiotácticos para

neutrófilos, monocitos y macrófagos hacia el lugar de activación del

complemento. Causan una fuerte señalización inflamatoria a través de sus

receptores acoplados a proteínas G (Ames et al. 1996; Monk et al. 2007). C5a

también co-regula la fagocitosis mediada por inmunocomplejos, modulando la

expresión de los receptores de activación FcγRI/II y de inhibición FcγRIIB

(Shushakova et al. 2002; Kumar et al. 2006). La única regulación endógena de

C3a y C5a, es la pérdida de un residuo de arginina terminal mediada por la

actividad carboxipeptidasa, dando lugar a C5a desArg y C3a desArg (Bokisch

and Muller-Eberhard 1970). Estos productos son activos pero con un diferente

espectro de acción (Jalili et al. ; Ratajczak et al. 2006; MacLaren et al. 2008).

Opsonización: C3b es la principal opsonina del complemento. Los

antígenos recubiertos con C3b se unen a receptores específicos en células

fagocíticas facilitando la fagocitosis.

La neutralización de virus: C3b induce la agregación de partículas virales

formando una capa gruesa que bloquea la fijación de los virus a la célula. Este

agregado puede ser fagocitado mediante la interacción de receptores del

complemento y C3b en las células fagocíticas.

Eliminación de inmunocomplejos: Los inmunocomplejos (complejos

antígeno-anticuerpo circulantes) pueden ser eliminados de la circulación si el

complejo se une a C3b. Los eritrocitos tienen receptores del complemento que

interactúan con los complejos inmunes cubiertos por C3b y los lleva al hígado y

al bazo para su destrucción.

A continuación, mostramos una tabla resumen (Tabla 2) que muestra las

principales funciones efectoras del complemento, en función de la interacción

entre el fragmento del complemento y su receptor.

Introducción

16

Tabla 2. Resumen de los diferentes receptores de los fragmentos del complemento junto con sus

funciones y tipos celulares donde se expresan.

1.1.3. Interacción del complemento con los receptores Toll like (TLR)

Tras una infección se activan rápidamente dos mecanismos de la

respuesta innata, el sistema del complemento y la señalización a través de los

receptores TLR. Ambos proporcionan una primera línea de defensa y

constituyen un puente de unión entre la respuesta innata y la respuesta

Introducción

17

humoral y celular (Dunkelberger and Song 2010; Bhakdi et al. 1990). Coordinan

la respuesta innata en cooperación bidireccional, potenciando la respuesta

innata con acciones sinérgicas o bien regulando un exceso de respuesta

mediante acciones antagónicas (Hajishengallis and Lambris 2010).

La producción de algunas citocinas pro-inflamatorias, inducidas in vivo

por la señalización de los receptores TLR (principalmente TLR4, TLR2, TLR6 y

TLR9), están reguladas por el complemento a través de los receptores C5aR y

C3aR. Las vías de señalización de estos receptores TLR convergen con la

señalización de las anafilotoxinas C3a y C5a a nivel de MAP quinasas,

especialmente ERK1/2 y JNK (Zhang et al. 2007). La interacción de ambos

sistemas, se observa cuando al inhibir la vía de señalización de C5a, se confiere

protección frente a la sepsis que es inducida por altas dosis de LPS (Guo et al.

2004). Recíprocamente, la activación de los receptores TLR induce la expresión

de componentes del complemento y de sus receptores (Kaczorowski et al. 2010).

Como demostraron Zhang et al, los ratones knockout para el factor

acelerador de la degradación DAF, cuando son tratados con LPS, zymosan o

CpG, presentan aumentados los niveles en suero de citocinas pro-inflamatorias

como el factor de necrosis tumoral (TNFα), las interleucinas 1β (IL-1β) y 6 (IL-6)

pero también tienen disminuidos los niveles de la interleucina 12 (IL-12) en

comparación con ratones wild-type. Este fenotipo es mediado por las

anafilotoxinas C5a (en el caso del receptor TLR4) y C3a (en el caso del receptor

TLR9). También demostraron que tras la activación con LPS, estos ratones

knockout para DAF presentan mayor inducción del factor de transcripción NF-

кB y se incrementa la fosforilación de MAP quinasas como ERK y JNK. La

inmunización de estos ratones con distintos antígenos y en combinación con el

adyuvante completo de Freund (CFA) presenta una mayor respuesta T efectora

y de memoria. Además, estos ratones muestran susceptibilidad a procesos

autoinmunes y de inflamación (Zhang et al. 2007). Este es un ejemplo en el que

el complemento y los receptores TLR, promueven la inflamación y modulan la

inmunidad adaptativa.

Introducción

18

Sin embargo otros estudios afirman que el fragmento C5a inhibe la

señalización del TLR4. Según el estudio de Hawlisch et al, el fragmento C5a

regula negativamente la señalización mediada por TLR4 y por la molécula

CD40, inhibiendo la síntesis de citocinas inducidas por la familia de la citocina

IL-12 (IL-12, IL-23 e IL-27) en macrófagos activados. Esta disminución se

traduce en una respuesta Th1 disminuida in vitro e in vivo, observándose una

mayor respuesta Th1 en ratones deficientes del receptor C5aR, confiriéndose

una protección contra la infección por Leishmania major (Hawlisch et al. 2005).

Sin embargo, C5a no inhibe la producción de IL-12 mediada por TLR y por la

interacción entre la molécula CD40 y CD154 en células dendríticas humanas y

murinas. De hecho, en las células dendríticas, la activación de los receptores

C5aR y C3aR promueve la producción de las citocinas IL-12 y IL-23. Además,

los ratones deficientes en ambos receptores presentan un déficit en la

estimulación de la respuesta T in vivo e in vitro. La activación de los receptores

C5aR y C3aR da lugar a la activación de las proteínas ERK1/2 y así, mientras en

macrófagos se induce la inhibición de la producción de IL-12, en las células

dendríticas se produce el efecto opuesto. Una explicación del efecto producido

por el factor C5a al receptor TLR4 en la producción de IL-12 en las células

dendríticas, es la capacidad de C5aR para inhibir la señalización de la proteína

quinasa A (PKA) dependiente de AMPc, incrementando los niveles de TNFα y

disminuyendo la producción de IL-10 (Peng et al. 2009).

El complemento también puede modular la acción de los ligandos para

TLR9, como por ejemplo los oligodeoxinucleótidos CpG. Los CpG inducen la

maduración de las células presentadoras de antígeno (APC) a través de su

receptor TLR9. La inhibición del componente C3 del sistema del complemento

inhibe la acción de los CpG en las células dendríticas, influyendo

negativamente en la señalización TLR9. Es un ejemplo de una

inmunomodulación de la función CpG dependiente del complemento y del

receptor TLR9 (Mangsbo et al. 2009).

El bloqueo de la molécula CD14, co-receptor de TLR4 y TLR2, inhibe

algunas actividades del complemento, esto indica la existencia de un cierto

Introducción

19

grado de cooperación entre el complemento y la molécula CD14 (Lappegard et

al. 2009). Esta cooperación se podría atribuir a las interacciones extracelulares

entre la molécula CD14 y los receptores del complemento o bien a fragmentos

activos del complemento que podrían activar directamente la señalización de

los receptores TLR.

Hay evidencias de que la señalización de los TLR también puede afectar

a la expresión de los receptores del complemento y por lo tanto a su actividad.

Está descrito que la inducción de IL-6 a través del TLR4 induce un aumento de

la expresión de los receptores C5aR y C3aR (Koleva et al. 2002).

En la Tabla 3 se resumen las interacciones descritas entre el

complemento y los receptores TLR.

Tabla 3. Interacción entre el complemento y la señalización TLR. Adaptada de Hajishengallis y

Lambris (Hajishengallis and Lambris 2010).

Receptores

Función Puntos de interacción

Sistema experimental

C3aR

C5aR

TLR2

TLR4

TLR9

Inducción de TNFα, IL-1β e IL-6. Descenso de la respuesta Th1, aumento de la respuesta Th17.

MAPK (ERK1/2,JNK), PI3K

Macrófagos murinos,

monocitos humanos.

C3aR

C5aR CD14/TLR4

Aumento del estrés oxidativo, de la respuesta pro-inflamatoria y de la fagocitosis.

No descrito. Sangre periférica humana.

C3aR

C5aR

CR3

TLR9 Aumento de la expresión de marcadores de activación y maduración en APC.

No descrito. Sangre periférica humana.

C5aR TLR2 Inducción de AMPc. Adenilato ciclasa. Macrófagos murinos

C3aR

C5aR TLR4 Incremento de IL-12 e IL-23. ERK1/2 Dendríticas humanas y

murinas, modelo in vivo.

CR3 TLR2

TLR4

Inhibición IL-12, reclutamiento de TIRAP y aumento de algunas citocinas pro-inflamatorias.

ERK1/2 Macrófagos murinos y

monocitos humanos.

CR3 TLR2

Activación de la unión del ligando de CR3 a CR3.

Rac1, PI3K y citoesina 1 Macrófagos murinos y

monocitos humanos.

C5L2 TLR4 Inducción de HMGB1. MAPK Macrófagos murinos y modelos de sepsis murina.

Introducción

20

C5L2 TLR4 Inhibición de TNFα, aumento de IL-6 y CR3.

MAPK Neutrófilos murinos.

C5L2 TLR4 Inhibición de TNFα, IL-6 y CD86. ERK1/2 y Akt Macrófagos murinos.

gC1qR TLR4 Inhibición IL-12. PI3K Monocitos y células dendríticas humanas.

cC1qR TLR4 Aumento de la expresión de moléculas de coestímulo, de las citocinas TNFα, IL-12. Inducción de respuesta Th1.

NFкB Células dendríticas humanas.

CD46 TLR4 Descenso IL-12. Mecanismo postranscripcional

Monocitos y macrófagos humanos.

CD46 TLR4 Aumento de respuesta Th17.

Incremento de IL-12p35, IL-23p19, IL-12/ IL-23p40.

No descrito Células dendríticas humanas.

1.2. Inmunidad adaptativa o adquirida

La inmunidad adaptativa constituye una respuesta inmunitaria que tiene

lugar cuando la respuesta innata es evadida. Es una respuesta lenta pero muy

eficaz y selectiva ya que requiere del contacto previo con el agente patógeno

(sensibilización) y por lo tanto es antígeno específica. Es una respuesta que

genera memoria inmunológica, es decir, hay un incremento en la intensidad de

respuesta ante los subsiguientes contactos con el mismo antígeno y está

mediada principalmente por linfocitos.

Se caracteriza por presentar dos tipos de respuesta: la respuesta humoral

(mediada por anticuerpos) y la respuesta celular (mediada por linfocitos T

citotóxicos y linfocitos T colaboradores).

1.2.1. Respuesta humoral

Es la respuesta basada en la acción de los anticuerpos secretados por

activación antigénica con el objetivo de combatir patógenos extracelulares y sus

toxinas.

El linfocito B capta el antígeno a través de sus receptores y lo procesa

para presentarlo vía MHC de clase II a los lifocitos T colaboradores (Th), estos

linfocitos inducen la expansión clonal y diferenciación del linfocito B que

producirá anticuerpos específicos frente al antígeno. Cuando los antígenos son

Introducción

21

de naturaleza no proteica, no se requiere de la presencia de los linfocitos Th

para la activación de las células B. Estos anticuerpos pueden tener efecto

neutralizante del patógeno directamente o indirectamente a través de células

fagocíticas, activación del complemento o por unión de las células NK a la

fracción Fc de la inmunoglobulina.

1.2.2. Respuesta celular

Los linfocitos T son los responsables de la respuesta inmunitaria celular

permitiendo la destrucción de las células infectadas o células tumorales. Esta

respuesta presenta una fase de activación (expansión de las células T

citotóxicas), una fase efectora (encuentro y eliminación de la célula infectada o

tumoral) y una fase de contracción (apoptosis y memoria).

Los linfocitos T después de un proceso de selección tímica, donde forman

un repertorio de linfocitos T con un receptor clonal (TCR) que les permite

reconocer determinantes antigénicos presentados por moléculas MHC, migran

a los órganos linfoides secundarios donde tendrá lugar la presentación

antigénica mediante la interacción entre su receptor TCR (del inglés T Cell

Receptor) y el complejo MHC-antígeno (expresado en la superfície de las APC)

(Germain et al. 1988; McMichael 1979; Townsend and Bodmer 1989).

Dentro de esta población celular encontramos varias subpoblaciones,

entre las que destacan los linfocitos T CD4+ o colaboradores (Th) , los linfocitos

CD8+ o citotóxicos (Tc), los linfocitos T CD4+CD25 + reguladores (Treg), los

linfocitos Th17 y las NKT (del inglés natural killer T lymphocyte).

1.2.2.1. Linfocitos Th

Los linfocitos T colaboradores o helper (Th) fueron descritos por primera

vez por Mossman y Coffman, observaron que las células T podían dividirse en

dos subgrupos que llamaron las células Th1 y Th2 en función de su patrón de

producción de citocinas, interferón-γ, TNF- e IL-2 (células Th1) o interleucina-

4 (IL-4), IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 (células Th2) (Mosmann and Coffman 1989;

Cherwinski et al. 1987). Pero la relevancia entre la distinción de ambos subtipos

Introducción

22

fue descrita por Heinzel et al. (Heinzel et al. 1989), observaron que en ratones

una respuesta predominantemente Th1 permitía superar la infección por

Leishmania major mientras que una respuesta tipo Th2 no era capaz de combatir

dicha infección.

Estos linfocitos Th no presentan actividad citotóxica, pero controlan la

respuesta inmunitaria dirigiendo a otras células para que realicen esas tareas,

tienen efectos protectores y promotores de la función de las células B, T CD8+ y

macrófagos. Los linfocitos Th1 están asociados a respuestas inmunitarias

mediadas por linfocitos T citotóxicos, macrófagos y neutrófilos. Los linfocitos

Th2 están destinados a ayudar a las células B en la producción de anticuerpos y

a activar a los eosinófilos. Además, los linfocitos Th pueden tener un papel

antiviral directo a través de las citocinas que producen.

1.2.2.2. Linfocitos T citotóxicos

Los linfocitos T CD8+ (Tc) tienen su capacidad de actuación restringida

por las moléculas MHC-I por lo tanto se encargan de combatir las infecciones

intracelulares destruyendo las células infectadas, de eliminar células tumorales

o células dañadas por otras causas. El principal mecanismo efector utilizado es

la inducción de la apoptosis segregando una serie de moléculas inductoras de la

apoptosis (FasL, perforina, granzimas) (Harty et al. 2000; Pardoll 1993;

Zinkernagel and Althage 1977). Son los principales causantes del rechazo de

tejidos y órganos transplantados (Bothwell 1999; Onoe et al. 1997), estando

también implicados en fenómenos de autoinmunidad (Billet et al. 2006).

En virtud de un conjunto definido de receptores de homing como la

molécula CD62L y receptores de quimiocinas, como el receptor CCR7, los

linfocitos T CD8+, del mismo modo que los linfocitos T CD4+, circulan por el

torrente circulatorio hasta llegar a los órganos linfoides secundarios, donde

tiene lugar la presentación antigénica por las células dendríticas (DC) que

actúan como células presentadoras de antígeno profesionales. Los linfocitos Tc

tras este encuentro se expanden, proliferan y se diferencian a células efectoras.

Introducción

23

La activación del linfocito Tc tiene unos controles muy estrictos y, por lo

general, requiere una señal de activación muy fuerte por parte del complejo

MHC-I/DTc y de señales adicionales proporcionadas por las células T

colaboradoras (Bourgeois et al. 2002; Freeman et al. 1993; Linsley and Ledbetter

1993). Sin embargo, no siempre la ayuda CD4 es indispensable, existiendo

varios modelos de activación de linfocitos CD8 en donde las células CD4 no

participan (Bachmann et al. 1998; Lasarte et al. 1995).

Los linfocitos T CD8+ ejercen su función antiviral mediante mecanismos

no citolíticos con la producción de citocinas (IFN-, TNF- o IL-2) y a través de

mecanismos citolíticos que convergen en la inducción de apoptosis en la célula

diana por activación de caspasas. Uno de los mecanismos consiste en la

liberación de gránulos que contienen la molécula formadora de poros perforina

y la serín esterasa granzima B. El otro mecanismo implica la expresión de Fas

ligando (CD95L) y su interacción con la molécula Fas (CD95) expresada en la

superficie de la célula diana.

La gran mayoría de células efectoras tras cumplir con su cometido

entrarán en apoptosis celular, el resto formarán un pool de células memoria.

Estos linfocitos memoria tienen una vida larga pudiendo circular durante meses

o años y están preparados para desencadenar una respuesta inmunitaria rápida

y potente si se produce una nueva exposición con el mismo patógeno (Ahmed

and Gray 1996). De hecho, éste es el principal objetivo de las vacunas, generar

linfocitos memoria (T y B) de manera que el organismo responda de manera

rápida y eficaz frente al patógeno activo (Ahmed and Gray 1996).

Está descrito que se requiere la presencia de los linfocitos T CD4+ para la

generación de estos linfocitos T CD8+ memoria en respuestas inmunitarias

contra virus y bacterias (Shedlock and Shen 2003), así como en la erradicación

de tumores (Marzo et al. 2000), aunque las células T CD8+ memoria podrían

generarse en su ausencia, siendo menos eficaces que las generadas con su

ayuda (Janssen et al. 2003; Shedlock and Shen 2003). La población de los

linfocitos T CD8+ memoria se regula mediante mecanismos homeostáticos para

Introducción

24

mantener a lo largo del tiempo una representación de la misma.

Fundamentalmente dos citocinas son las responsables de la homeostasis de esta

población celular: la IL-7, que es esencial para su supervivencia, y la IL-15, que

se encarga principalmente de su proliferación para mantener una población

mínima de reserva (Surh and Sprent 2008).

1.2.2.3. Linfocitos T reguladores CD4+CD25+

A principios de los años 70 se describió por primera vez la presencia de

unos linfocitos T capaces de suprimir las respuestas inmunitarias. En 1995,

Sakaguchi y col. (Sakaguchi et al. 1995) encontraron que una población

minoritaria de células CD4+ (10%) que co-expresaban la cadena alfa del

receptor para la interleuquina 2 (CD25) era crucial para el control de las células

autorreactivas y la autoinmunidad in vivo. Desde entonces, muchos grupos han

demostrado que esta subpoblación de células CD4+CD25+, también conocidas

como células Treg o linfocitos Treg, son inmunosupresoras (Takahashi et al.

1998; Thornton and Shevach 1998). Estas células fueron identificadas primero

en ratones pero después han sido ampliamente caracterizadas en humanos

(Dieckmann et al. 2001; Jonuleit et al. 2001; Levings et al. 2001). Actualmente, la

existencia de una subpoblación inmunosupresora específica es aceptada

ampliamente por la comunidad científica y se busca la forma de manipular su

actividad para su uso clínico. La principal cuestión es cómo podría modularse

su actividad.

Los linfocitos Treg son esenciales para la protección frente a las

enfermedades autoinmunes y para la prevención del rechazo a los transplantes;

por ello, la posibilidad de potenciar su actividad tiene un gran potencial en el

tratamiento de las enfermedades autoinmunes y en los transplantes de órganos.

Sin embargo, debido a que los tumores expresan autoantígenos, los linfocitos

Treg pueden ser capaces de inhibir la activación de respuestas inmunitarias

frente al cáncer.

Varios grupos, han demostrado que la simple eliminación de las células

CD4+CD25+FOXP3+ (Treg) por la administración in vivo de anticuerpos

Introducción

25

deplecionantes facilita la inducción de inmunidad antitumoral y la protección

frente al desarrollo del cáncer (Casares et al. 2003; Onizuka et al. 1999; Shimizu

et al. 1999; Steitz et al. 2001; Sutmuller et al. 2001). Así, se cree que las células

Treg están continuamente frenando la activación de los linfocitos T efectores

para evitar procesos de autoinmunidad, pero dificultando a su vez la correcta

activación de una respuesta antitumoral cuando ésta es necesaria.

1.3. Activación de una respuesta inmunitaria

1.3.1. Presentación antigénica

Para que tenga lugar una activación específica de la respuesta

inmunitaria frente a un antígeno, es necesario que se de la presentación

antigénica (Mellman 2005), un proceso de reconocimiento molecular entre el

péptido expuesto por moléculas de MHC (complejo mayor de

histocompatibilidad) en las APC y el receptor TCR o BCR de linfocitos T y B

respectivamente. Para ello, el antígeno debe ser previamente capturado por la

APC y procesado hasta ser convertido en péptido. Además, se requieren señales

de coestímulo (interacción de factores solubles y proteínas de membrana) para

una activación eficaz del linfocito y por lo tanto de la respuesta inmunitaria

(Koch et al. 1996; Vazeux et al. 1992; Zhang et al. 1999; Zuckerman et al. 1998).

Esta interacción entre la APC y el linfocito se conoce como sinapsis

inmunológica.

Existen dos vías principales de presentación antigénica, la vía clase I y la

vía clase II, en función del origen y la vía de entrada del antígeno (Jensen 2007;

Villadangos and Schnorrer 2007) (Figura 4).

La vía clase I consiste en la presentación de antígenos endógenos

procedentes de proteínas propias, proteínas intracelulares derivadas de un

patógeno que ha infectado la célula o proteínas inducidas durante el desarrollo

de un tumor que son procesadas por el proteosoma. Tras la degradación de la

proteína en el proteosoma, los fragmentos peptídicos generados (determinantes

T citotóxicos) son transportados mediante un transportador dependiente de

ATP llamado TAP (del inglés, transporter associated protein) desde el citoplasma

Introducción

26

hasta el retículo endoplasmático, donde se unen a las moléculas MHC de clase

I. El complejo MHC-I/DTc pasa a través del Golgi antes de llegar a la superficie

celular, donde será presentado a los linfocitos CD8+ citotóxicos. Todas las

células nucleadas pueden presentar determinantes antigénicos mediante esta

ruta. En estos casos, la presentación de antígenos puede ocurrir en ausencia de

otras señales inmunoestimuladoras (como moléculas de coestímulo situadas

sobre las APC o señales emitidas por los LTh), por lo que este proceso puede

terminar en tolerancia.

La vía clase II es propia de las APC y consiste en la captación e

internalización en endosomas de los antígenos exógenos. Los antígenos se

procesan en el lisosoma por la acción de enzimas proteolíticas y los péptidos

resultantes del procesamiento antigénico se unen a moléculas MHC de clase II.

El complejo MHC-II/determinante T helper es transportado a la superficie

celular para ser presentado a los linfocitos T colaboradores (Th).

Ciertos antígenos exógenos a pesar de ser fagocitados por las APC

profesionales, son capaces de salir de los fagosomas y entrar en el citosol. De

esta forma son procesados por la ruta citosólica mediante mecanismos que

pueden ser tanto dependientes como independientes del proteasoma. Así, los

antígenos son presentados a través del MHC-I de la APC al LTc (Gil-Torregrosa

et al. 1998; Heath and Carbone 2001; Rock and Shen 2005). Este proceso se

conoce como cross-presentation (presentación cruzada).

Introducción

27

Figura 4. Esquema del procesamiento y presentación de los péptidos (Heath and Carbone 2001).

1.3.2. Células dendríticas

Las DC son células que derivan de las células madre hematopoyéticas de

médula ósea y han sido identificadas como las APC más eficaces. Actúan de

enlace entre la inmunidad innata y adaptativa permitiendo el inicio y la

modulación de la activación de ambas respuestas. Su papel principal es la

captura, procesamiento y presentación de antígenos a través del MHC a los

linfocitos T y, de este modo, activación de la respuesta inmunitaria mediante la

producción de citocinas y la inducción de la activación de los linfocitos.

Constituye una población celular heterogénea que controla tanto la

inmunidad como la tolerancia inmunológica. En sangre se distinguen dos tipos

de DC, en función de sus características fenotípicas (expresión diferencial de

marcadores de superficie) y funcionales (patrón diferencial de citocinas). Estas

células dendríticas son las DC mieloides y las DC plasmacitoides.

Las DC convencionales o mieloides (DCm), provienen de la línea

mieloide y su función principal es la presentación antigénica. Migran a los

tejidos periféricos, donde interceptan y capturan los patógenos, antes de su

migración a los ganglios linfáticos para activar la respuesta T (Belmonte et al.

Introducción

28

2007). Se caracterizan por su capacidad para producir citocinas como IL-12 y

TNF-α, con el objetivo de promover una respuesta de tipo Th1 y desarrollo de

linfocitos T citotóxicos. La segunda subpoblación de DC, de origen linfoide, se

denomina DC plasmacitoide (DCp). Se distinguen de las DCm por no expresar

CD11c y se caracterizan por su capacidad para producir grandes cantidades de

IFN-γ en respuesta a infecciones virales (Cella et al. 1999; Siegal et al. 1999; Sun

et al. 1998), cumpliendo de esta forma un importante papel en la respuesta

inmunitaria innata. Al contrario de las DCm, migran directamente de la sangre

a los tejidos linfáticos secundarios. El IFN de tipo I inducido por las DCp puede

activar las células NK y las células T CD8+, regular la producción de IL-12

mediada por las DCm, e intervenir en la diferenciación de células B en células

plasmáticas (Liu 2005). Otra función de las DCp es el procesamiento de

antígenos y su presentación a los linfocitos T. Sin embargo, las DCm son más

eficaces en esta función (Krug et al. 2003).

La capacidad de las DC para activar la repuesta inmunitaria depende de

su estado de maduración. Se encuentran ampliamente distribuidas como células

inmaduras en todos los tejidos, especialmente en los que interactúan con el

medio ambiente (epitelios de la piel y mucosas). La internalización de antígenos

extraños puede desencadenar su maduración y la migración desde los tejidos

periféricos a los órganos linfoides donde tendrá lugar la activación linfocitaria.

En estado inmaduro, poseen una gran capacidad fagocítica y expresan

un amplio espectro de receptores (TLR, receptores de quemoquinas entre otros).

Sin embargo, el nivel de expresión en la superficie celular de moléculas de

MHC, coestímulo y adhesión es muy bajo. La principal función de estas células

consiste en detectar la presencia de agentes extraños, capturarlos y

transportarlos a los nódulos linfoides. Si la DC reconoce señales de peligro sufre

un proceso de maduración que activa el proceso de migración a los nódulos

linfoides. Durante la migración, las DC maduras, presentan un cambio en su

morfología, aumentan su movilidad y se vuelven muy eficaces en la

presentación antigénica y en la estimulación de los linfocitos T vírgenes. Los

procesos de maduración y migración están íntimamente ligados y la completa

Introducción

29

maduración finaliza después de la migración. Tras el reconocimiento

antigénico, se produce un aumento en los niveles de expresión del ligando de

CD40 en la superficie del linfocito Th. Este ligando interacciona con la molécula

CD40 presente en la superficie de las DC, promoviendo su activación (Steinman

and Young 1991; Bennett et al. 1998). Estas interacciones inducen la expresión

de altos niveles de MHC y de moléculas de adhesión y coestímulo (CD40,

CD54, CD80, CD86) en la superficie de las DC, así como la producción de

citocinas pro-inflamatorias (IL-12, TNF-α) (Cella et al. 1999; Koch et al. 1996).

Los linfocitos T, tras ser activados, van a migrar desde los nódulos

linfoides a través de la circulación sanguínea hasta donde se encuentre el

antígeno para eliminarlo (Figura 5).

En resumen, la función efectora de las DC está influenciada por la etapa

de maduración, la concentración de antígeno, la vía de entrada antigénica, y el

microambiente de citocinas presente.

Figura 5. Esquema del proceso de activación de la respuesta inmunitaria adaptativa.

Maduración y migración

APC madura

Presentación del Ag a los linfocitos T

Tejidos periféricos

Entrada de Ag

Expresión de moléculas de coestímulo

y producción de citocinas

APC inmadura

Captura y procesamiento de Ag

Linfocitos T

Eliminación del antígeno

Ganglio linfático

Vasos inflamados

Introducción

30

1.3.3. Señalización del calcio en la activación linfocitaria

Los iones de Ca2+ funcionan como segundos mensajeros en todas las

células eucariotas, incluyendo células del sistema inmunitario. La entrada de

Ca2+ al interior celular es la señal crucial para la correcta activación de los

linfocitos, la realización de sus funciones efectoras, de diferenciación, la correcta

sinapsis entre células dendríticas y células T, así como, la exocitosis en células T

citotóxicas.

Un influjo de Ca2+ en el citosol ocurre después de la unión a

inmunorreceptores de superficie celular, por ejemplo la unión al BCR (B cell

receptor) o al TCR (T cell receptor) (van Leeuwen and Samelson 1999). En los

linfocitos el principal mecanismo de incremento de las concentraciones celulares

de calcio ocurre tras el vaciado de los depósitos intracelulares, mecanismo

conocido como SOCE (store operated calcium entry), con la participación de la

activación de los canales de liberación de calcio CRAC situados en la membrana

plasmática (Feske 2007) (Figura 6).

Figura 6. Mecanismo SOCE (store operated calcium entry) de Stefan Feske (Feske 2007).

Cuando tiene lugar el reconocimiento