상백피 추출물의 생물전환과 티로시나제 저해 효과의...

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Ⅰ. 서 론

미용적인 이유에서 피부 착색에 대한 관심이 높아지고 미백

기능성 화장품의 소비가 증가함에 따라 합성화학물질에 대한

문제점이 이슈화되고 있으며, 생활수준의 향상과 소비자들의

인식 변화 등으로 인한 트랜드에 맞는 천연물 소재 개발 요구

도 증가하고 있다(김명곤 등, 2011; 유민정, 2011; Lee & Im,

2011). 이에 따라 생물전환에 의한 신규 다 기능성 화장품 소재

의 원료 발굴이 주목되고 있다.

화장품 소재의 미백기능은 멜라닌 생성과 관련되어 있다. 피

부 착색의 중요한 요인으로 작용하는 멜라닌은 자연계에 널리

존재하는 천연 색소로 인간의 피부에서는 티로시나제에 의해

아미노산인 티로신으로부터 생성되는 도파퀴논을 거쳐 생합성

된다(Pawelek & Kornor, 1982). 멜라닌 색소는 적당량 존재

할 경우 피부를 보호하는 긍정적인 면을 가지고 있으나 과잉 존

재할 경우 기미, 주근깨, 피부반점 등을 유발하게 된다. 또한 멜

라닌의 전구물질의 독성으로 인해 세포의 사멸과 피부암 발생

촉진 등의 부작용을 일으키기도 한다(이계영 등, 2012). 따라서

인체에 부작용이 적은 천연물질을 이용한 멜라닌 생성 억제 및

활성산소 소거 기능을 가진 미백화장품의 개발의 욕구가 증가

되고 있다(한정선 등, 2012).

미백효과에 대한 연구는 티로시나제 활성억제, 도파 산화 억

제, 각질층 제거 촉진 및 자외선 차단에 대한 연구, 세포독성에

관한 연구, 활성산소제거에 대한 연구 등으로 이루어지고 있다.

피부에서의 색소침착 방지를 위한 미백소재에 대한 물질은 첫

상백피 추출물의 생물전환과 티로시나제 저해 효과의 비교김은주1*, 문지선2, 최태부2 1열린사이버대학교 뷰티디자인학과, 2건국대학교 생물공학과

Inhibition of Tyrosinase by Bio-conversioned Morus alba ExtractEun-Joo Kim1*, Ji-Sun Moon2, Tae-Boo Choe2 1Department of Beauty Design, Open Cyber University 2Department of Biological Engineering, Konkuk University

Abstract Skin lightening is one of the most important effect of functional cosmetics, especially for the asian women. For this reason, many kinds of inhibitors of melanin synthesis by melanocyte have been developed since a decade ago. Although many kinds of melanogenesis inhibitors such as arbutin, ascorbic acid, extract of Licorice root or Morus alba and niacinamide were recommended as the standard component of the skin whitening cosmetics by Korean Food and Drug Administration, they are not always satisfactory to the many users. Mulberroside A, a main component of extract of Morus alba balk, can be converted into an aglycan named oxyresveratrol having a strong antioxidant and anti-melanogenesis effect using β-glucosidase. However, the glucose hydrolysis process using a soluable β-glucosidase is not suitable to convert Mulberrosie A into oxyresveratrol in a large scale procss because of the low reaction rate and high price. In this work, we developed a bioconversion process of oxyresveratrol production from Morus alba extract using enzyme named Accellerase®, which is an immobilized enzyme on the solid particle, and compared the tyrosinase inhibition effect of the extracts of before and after the bioconversion process. It was found that the inhibition effect of Morus alba extract to the mushroom tyrosinase was greatly increased by the bioconversion process and this effect was synergized when the extract was used with arbutin together.

Keywords: Bio-conversion, Morus alba extract, Tyrosinase, Inhibition, Cosmetics

Kor. J. Aesthet. Cosmetol.,Vol. 11 No. 5, 845-854, October 2013

*Corresponding author: Eunjoo Kim, Department of Beauty Design Open Cyber University, 3F, 102, SK HUB B/D, 89-4, Gyeongun-Dong 1, Jongno-Gu, Seoul, Republic of KoreaTel.:+82 2 2197 4178, Fax: +82 2 2197 4114E-mail: [email protected]

Received October 22, 2012; Revised October 4, 2013;Accepted October 12, 2013; Published October 30, 2013

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째, 멜라닌 합성의 주효소인 티로신의 산화를 촉매하는 티로시

나제의 작용을 억제하는 물질로는 알부틴, 코직산, 상백피 추

출물, 닥나무 추출물, 감초 추출물 등이 있고(박대중과 이장천,

2008; 박서영 등, 2009), 둘째, 멜라닌 생합성 장소인 멜라닌

세포의 기능을 저하시키기 위해 차단하는 물질로는 비타민 C등

이 있으며, 셋째, 각질세포를 벗겨내어 멜라닌 색소를 제거하

는 물질로는 alpha hydroxy acid (AHA), beta hydroxy acid

(BHA), 아미노산, 살리실산, 레틴산 등이 있다(Grove et al.,

1991). 넷째, 멜라닌 세포 자체를 사멸시키는 물질로는 하이드

로퀴논이 다섯째, 활성산소 제거 물질로는 비타민 E, 비타민 C

등이 있고, 마지막으로 자외선을 차단하는 물질에는 옥틸디메

틸 파바, 이산화티탄, 감마오리자놀, 옥시벤존 등이 사용되고

있다(박효정, 2010).

비타민 C, 비타민 E, 구아바 추출물 등이 경구를 통한 미백물

질로 보고된 원료이고, 비타민 E는 피부 색소침착 개선 작용이

보고되어 있어 그 작용기전은 생체 내에서 생긴 활성산소 및 지

질과산화물을 비타민 E가 제거하는 라디칼 소거능으로써의 활

동과 글루타치온을 증가시켜 멜라닌 생성을 억제하는 것으로

알려져 있다. 비타민 C의 경우도 피부 미백기능과 관계를 가지

고 있으며, 멜라닌 색소 생성 억제작용과 콜라겐 생성 작용이

있다. 특히, 비타민 C의 경우는 멜라닌이 합성되는 중간체인 도

파퀴논을 도파로 환원시켜 멜라닌 생성을 억제하며, 또한 강력

한 라디칼 소거작용으로 환원된 글루타치온을 산화시켜 티로시

나아제의 활성을 억제하는 것으로 보고되었다(박효정, 2010).

종래에 미백제로는 아스코르빅산, 알부틴 및 코직산이 유효성

분으로 허가되어 있으며, 근래 미백제로서 연구·개발되어 보

고되는 것으로는 DL-α-tocopheryl ferulate, 안정형 비타민 C

유도체들, AHA, 3,5-dicaffeoy-l-quinate 등이 있다(박수남

등, 2001).

현재까지 다양한 피부 보호제 및 미백제가 개발되어 사용되

고 있으나 여러 가지 문제점이 제기되고 있다. 하이드로퀴논은

기미, 주근깨, 반점 및 임신기 과색소침착과 같은 과잉 색소증

치료에 국부적으로 사용되고 있는데 멜라닌세포의 변성 또는

치사를 일으키거나 세포의 기능을 손상시키는 등의 부작용을

나타낸다(Maeda & Fukada, 2001). 코직산은 현재 알부틴, 아

스코르빅산 등과 함께 식품의 갈변방지제, 화장품, 의약품용 미

백제 성분으로 사용되고 있으나 사용 중의 변색, 물질자체의 불

안정성 등의 문제점이 제기되고 있다(Lee & Go, 1996). 이에

따라 독성이 없는 미백제의 개발이 요구되고 있어 천연물에 대

한 미백효능 연구가 활발해 지고 있다(강정란과 유선미, 2009;

오수정과 모정희, 2011; 한영숙과 정은선, 2003; Curto et al.,

1999). 천연 기능성 미백 소재의 개발은 토종한방 원료의 효소

및 미생물을 이용한 발효와 생물전환기법을 이용한 신소재 개

발동향이 등이 있으며 신소재 개발과 관련한 선행 연구사례는

다음과 같다(양서진, 2012).

박효정(2010)은 효소 처리한 발효 홍삼 추출물 화장품이 피

부 보습력 및 장벽기능을 향상시켜 유의적인 미백 효과 및 홍

반 억제와 주름 개선 효과를 보고하였으며, 배유경(2012)은 유

산균주를 이용한 발효공정을 적용하여 오배 추출물을 제조하

였다. 김미진(2010)은 상백피 추출물로부터 생물전환에 의한

oxyresveratrol을 생산하여 보고하였으며, 최은영(2011)은 발

효 상백피 추출물을 포함하는 화장품이 중년 여성 피부에 미치

는 영향을 발표하였고, 김동현(2009)은 유산균을 이용하여 활

성 이소플라본 함량이 증가함을 보고 하였다.

많은 연구자들에 의해 연구된 미백물질로 상백피 추출물의

특허 출원이 가장 많은 것으로 보고되고 있다. 특히, 상백피 추

출물 중 주요 미백 성분으로는 mulberroside A와 그 생물전환

체인 oxyresveratrol이 가장 관심대상으로 관련한 선행 연구사

례가 있는데 이 중 oxyresveratrol은 mulberroside A 보다 효

소 활성 저해 효과가 크며 최근에는 resveratrol보다 뛰어난 티

로시나제 저해 활성을 갖는 것으로 보고되고 있어 피부 미백제

로 사용 가능성이 높아지고 있다. 이에 본 연구에서는 상백피

추출물에 들어있는 mulberroside A와 같은 배당체를 효소를

이용하여 비배당체인 oxyresveratrol로 전환시켰을 때의 생물

전환에 대한 반응조건을 조사하여 생물전환 생산조건을 제안함

과 추출물의 티로시나제 저해 효과에 대한 변화를 살펴보고, 알

부틴과 동시 사용 시의 티로시나제 저해 상승효과를 조사하여

그 유용성을 밝히는데 본 연구의 목적이 있다.

Ⅱ. 연구방법

1. 시약

실험에 사용된 시약은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-

hydr azyl), BHT (Butylated Hydroxy Toluene), DNS

(3,5-dinitrosalocylic acid), glucose, Caffeic acid, Quercetin,

arbutin, pyrogallol, griess reagent, tris-HCl buffer (tris

[hydroxymethyl] amino-methane+EDTA), aluminium

nirate, potassium acetate, sodium phosphate buffer, DMEM

(Dulbecco‘s modified Eagle’s medium), α-MSH (α-melanocyte

stimulating hormone), L-Tyrosine, fetal bovine serum,

penicillin, streptomysin, formaldehyde, oxyresveratrol,

arbutin, theophilline, PBS (phosphate buffered saline solution)

를 Sigma (USA)로 부터 구입하여 사용하였으며, 그 외의 기타 시

약은 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 microplate

reader (Synergy-HT, BIO-TEK Instruments, USA), CO2

incubator (MCO 175, Sanyo, Japan), pH meter (Orion, 520A,

USA), 냉동건조기 등을 사용하였다.


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2. 세포 배양

B16-F10 (melanoma cells) 세포는 한국세포주은행에서

구입하여 사용하였으며 세포배양은 10% fetal bovine serum

과 penicillin/streptomysin (100 IU/ 50 ㎍/㎖)을 함유한

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 용액으로

37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

3. 상백피 시료의 제조

본 연구에서 사용된 실험재료는 미백효과가 있는 것으로 알

려져 있는 한방재료인 상백피를 서울시 제기동 경동시장(제천

산, 안동산)에서 구입하여 건조시킨 후 잘게 자른 다음 불순물

을 제거 후, 상백피 무게의 10배에 해당하는 70% 에탄올을 가

해서 상온에서 72시간 추출한 후 9,000 rpm으로 15분간 원심

분리하여 상층액을 Whatman No.2 여과지로 여과시키고 멸

균 필터지로 필터링 한 다음 회전 증발하여 감압기(EYELA,

Japan)로 처리하고 동결 건조한 후 사용하였다.

2개의 당을 포함하고 있는 mulberroside A를 β-glucosidase

를 이용하여 가수분해하여 생물전환시켜 oxyresveratrol를 생

산하며, 효율성 높은 효소를 탐색하기 위하여 생물전환율 계산

에 사용한 방식은 아래와 같다.

생물전환율(%) = (1- 반응 후 MA의 농도/반응 전 MA의 농도)×100

4. 상백피 생물전환

상백피의 생물전환을 위하여 사용된 효소로 β-glucosidase

(Sigma,USA 0395, 500 units), Novozym (Ⓡ 33095),

Accellerase (Ⓡ 1500)의 세 가지 효소를 사용하였으며, 상백피

추출물의 생물전환을 위한 효소 반응 조건은 온도, pH, 효소

별로 수행하였으며, 반응 조건은 다음과 같다. 500 ㎖의 삼각

플라스크에 상백피 추출물 400 ㎎, sodium phosphate buffer

(pH 6.0) 200 ㎖, 그리고 효소 β-glucosidase, Novozym,

Accellerase 5 ㎕를 각각 혼합한 후 40℃, 150 rpm으로 24시

간 반응하였다. 반응이 완료되면 효소 반응 정지를 위해 100℃

의 끓는 물에서 2분간 반응 후 냉각하였다

2개의 당을 포함하고 있는 mulberroside A를 β-glucosidase

를 이용하여 가수분해하여 생물전환시켜 oxyresveratrol를 생

산하며, 효율성 높은 효소를 탐색하기 위하여 생물전환율 계산

에 사용한 방식은 아래와 같다.

생물전환율(%) = (1- 반응 후 MA의 농도/반응 전 MA의 농도)×100

5. HPLC을 이용한 상백피 추출물 성분분석

HPLC (Waters, USA)를 사용하여 Wang 등의 방법을 수정 보

완한 gradient solvent system으로 분석하였다. 분석 시 사용된

colum은 Agilent Eclipse XDB-C18 (5 ㎛, 4.6×250 ㎜)을 사용

하였고, flow rate는 1.0 ㎖/min이었고, injection volume은 10

㎕ 해주었으며, temperature은 25℃로 하였다(Table 1).

6. Polyphenol 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법을 수정하여 Folin-

reagent가 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브

덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 정량하였다. 각 추출

물 0.2 ㎖에 3차 증류수 5 ㎖를 가한 후 Folin-reagent 시

약을 0.5 ㎖씩 차례로 가한 다음 실온에 3분간 방치한 후 2%

Na2CO

3용액 1 ㎛을 혼합하고 다시 실온에 1시간 방치한 다음

microplate reader를 이용하여 729 ㎚에서 흡광도를 측정하였

다. 표준 곡선은 caffeic acid (Sigma, USA)를 이용하였다.

7. Flavonoid 함량 측정

총 프라보노이드 함량은 Moreno의 방법을 이용하여 측정

하였다. 각 추출물 0.5 ㎖ 농도의 시료액에 10% aluminium

nirate 0.1 ㎖와 1 M potassium acetate 0.1 ㎖ 및 ethanol

4.3 ㎖를 차례로 가하고 혼합하여 실온에서 40분간 방치한 후

microplate reader를 이용하여 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였

다. 표준 곡선은 quercetin (Sigma, USA)를 이용하였다.

8. DPPH radical 소거능 측정

DPPH 라디칼은 매우 안정한 자유 라디칼(free radical)이다.

이 라디칼을 소거하는 정도로서 항산화 작용을 평가하였다. 시료

추출은 96 well plate에 에탄올에 녹인 100 μM 1,1-diphenyl-

2-picryl- hydrazyl (DPPH) 용액 180 ㎕ 와 상백피 에탄올 추출

물을 20 ㎕씩 96 well plate에 첨가하고 37℃에서 20분간 방치 후

microplate reader를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

표준 곡선은 Ascorbic acid (Sigma, USA)를 이용하였다.

DPPH radical scavenging activity (%) = (Ac-As)/Ac×100

Ac : 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도

As : 시료를 첨가한 반응구의 흡광도

Flow 1.0 ㎖/min

Wave 328 ㎚

Oven temp 25℃

Solvent 2% acetic acid in waterACN (acetonitrile)

Column Agilent Eclipse XDB-C18 (5 ㎛, 4.6×250 ㎜)

Injection 10 ㎕

Gradient

Time 2% acetic acid ACN

0 95 5

21 45 55

31 45 55

36 95 5

37 Stop

Table 1. Component analysis of Morus alba extract using HPLC

상백피 추출물의 생물전환과 티로시나제 저해 효과

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9. Tyrosinase 저해능 측정

티로시나제 활성 측정 시 기질은 L-Tyrosine을 사용하였

다. L-Tyrosine를 기질로 사용할 때 반응이 신속하게 일어나

므로 효소의 양을 줄여서 실험하였다. 효소액은 mushroom

tyrosinase (5.8 ㎎ solid; 4276 units/㎎ solid, Sigma) 1 ㎎

/20 ㎖를 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0)에 녹여 사용하였

다. 상백피 추출물을 농도별로 25, 50, 100, 250, 300 ㎍/㎖

을 준비하였다. 기질 농도로 L-Tyrosine은 1 ㎎/㎖을 sodium

phosphate buffer (0.5 M, pH 6.0)로 완전히 녹이고 티로시나

제는 0.5 ㎖ 당 100 units의 농도로 준비하였다. L-Tyrosine 1

㎎/㎖을 100 ㎕, 각각의 시료 50 ㎕, 티로시나제를 50 ㎕를 96

well plate에 순서대로 분주한 후 37℃에서 10분간 반응시킨

후 microplate reader를 이용하여 475 ㎚에서 흡광도를 측정

하였다. 대조군으로 arbutin을 sodium phosphate buffer (0.1

M, pH 6.0)로 단계적으로 희석하여 100, 200, 300 ㎍/㎖농도

로 실험군과 동일하게 첨가하였다.

10. Melanin 생성 저해능 측정

B16-F10 melanoma 세포를 이용하여 상백피 추출물의 멜

라닌 생성 저해능을 측정하였다. 96 well plate에 B16-F10 세

포를 2×103 cells/well의 농도로 분주하고, 세포가 바닥에 부

착할 수 있도록 24시간 동안 배양하였다. 세포 부착 확인 후 멜

라닌 생성을 촉진하기 위하여 혈청 5% 와 α-MSH 10 nM 포함

된 배지로 갈아준 후, 상백피 추출물을 각 농도별로 처리 후 72

시간 배양하였다. 양성대조군으로 알부틴을 배양용 배지에 용

해하여 사용하였으며 분비된 멜라닌의 양은 microplate reader

를 이용하여 490 ㎚에서 측정하였고 멜라닌 생성량을 α-MSH

무처리군과 비교하여 백분율로 표시하였다.

11. 자료분석 및 통계적 유의성 검정

실험 결과는 평균±표준편차로 표기하였으며, 통계적 유의성

은 non-paired Student’s t- test로 검정하였다.

Ⅲ. 연구결과 및 고찰

1. 상백피 추출물의 생물전환

70% 에탄올을 이용한 상백피 추출물의 HPLC 결과는

Figure 1과 같다. 추출물에는 mulberroside A가 57.3%로

대부분을 차지하였고 소량의 resveratrol, oxyresveratrol,

oxyresveratrol-2-D-glucopyranosid, oxyresveratrol-3’

-D-glucopyranoside를 포함하고 있다(Table 2).

Muberroside A의 농도는 상백피 생산 지역에 따라 매우 큰

차이를 보였으며 안동 산의 경우 50%를 상회하였으나, 제천 산

의 경우 17-20% 선을 유지하였다(Data not shown). 상백피

추출물에 효소를 첨가하여 10시간 동안 생물전환하였을 때 결

과는 Figure 2와 같으며, mulberroside A가 oxyresveratrol로

전환되는 것을 확인할 수 있었다. 반응 10시간 후 생물전환율은

β-glucosidase를 이용했을 때 19.8%, NovozymⓇ을 이용했을

때 25.4%, AccelleraseⓇ를 이용했을 때 96.1%로, AccelleraseⓇ

효소를 이용한 경우가 가장 높아, 이후 실험에서는 Accellerase

Ⓡ를 생물전환 효소로 선정하여 사용하였다(Table 3).

Table 3. Composition (%) of Morus alba extracted with 70% ethanol and treated with various enzymes for 10 hr or 24 hr (37℃ pH 7.0)

Reaction time 10 hr 24 hr

Composition MA 3-OR OR MA 3-OR OR

No enzyme 57.3 (0)* 2.1 3.1 - - -

β-glucosidase 45.92 (19.8) 9.99 3.16 41.25 (28.0) 7.34 4.44

NovozymeⓇ 42.73 (25.4) 10.74 3.03 40.42 (29.4) 15.53 1.88

AccelleraseⓇ 2.19 (96.1) 3.96 48.26 2.18 (96.2) 3.54 51.64

Component % About RT (min)

Mulberroside A (MA) 57.3 8

Oxyresveratrol-2-D-glucopyranoside (2-OR) 3.4 9

Oxyresveratrol-3’-D-glucopyranoside (3’-OR) 2.1 10

Oxyresveratrol (OR) 3.1 14

Resveratrol (R) 1.6 16

Table 2. Composition (%) of Morus alba extracted with 70% ethanol


Figure 1. HPLC profile of Morus alba extracted with 70% ethanol.

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AccelleraseⓇ는 endoglucanase, exoglucanase, hemi-

cellulase, beta-glucosidase 등과 같은 효소를 포함하고 있는

혼합효소이다. Figure 3과 Figure 4 및 Figure 5는 각각 시간

에 따른 생물전환율의 변화와 온도 및 pH가 생물전환율에 미

치는 영향을 보여주는 것이다. 생물전환율은 반응 1시간 이후

부터 꾸준히 상승하여 반응 10시간 만에 정점에 도달하였다

(Figure 3). 최적 온도는 40℃ 전, 후이며 그 이상에서는 부산

물이 많이 생성되었고(Figure 4), 최적 pH는 5.0~6.0 사이인

것으로 나타났다(Figure 5). AccelleraseⓇ의 상품 카탈로그에

따르면 이 효소의 최적 pH는 5.0이고 최적온도는 50℃ 인 것으

로 보고하고 있어 본 연구 결과는 다소 차이가 있다.

2. 생물전환 후 항산화활성의 변화

식물 추출물들이 화장품 성분으로 이용될 때 갖는 중요한 특

징 중 하나는 높은 항산화활성이다. 최근 미생물에 의해 발효

된 화장품 성분들이 발효 후 항산화활성이 증가된다고 보고하

고 있으나(최은영, 2011), 생물전환을 통해 배당체의 당이 제거

된 비배당체들의 항산화활성에 대해서는 조사된 바가 없다. 따

라서 본 연구에서는 상백피 추출물의 생물전환 전, 후에 보이는

항산화활성의 변화에 대하여 조사하였다. Figure 6에서 볼 수

있듯이 DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노

이드 함량에는 큰 변화가 없었으며 생물전환 후 항산화활성은

전반적으로 감소하는 경향을 나타내었다.

이는 유산균을 이용한 발효 상백피 추출물의 경우 균주에 따

라 DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드

함량이 증가하는 것으로 보고된 것(최은영, 2011)과는 차이가

있다. 또한 발효 상백피의 경우 상백피를 먼저 발효 한 후 추출

물을 획득한 경우로, 본 연구에서와 같이 상백피 추출물을 다시

효소를 이용하여 생물전환하는 경우와는 차이가 있다.

따라서 전자의 경우에는 상백피가 발효과정을 거치면서 조직


Figure 2. HPLC profile of Morus alba extracted with 70% ethanol and treated with various enzymes for 10 hr.(A) not-treated, (B) ß-glucosidase, (C) Novozyme, (D) Accellerase (37℃ pH 7.0).

Figure 3. Time course of bioconversion yield of Morus alba extracted with 70% ethanol and treated with various enzymes (37℃ pH 7.0).

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이 와해되어 이 후 추출과정에서 생리활성 성분들의 수율이 증

가하거나(최은영, 2011), 발효과정에서 생성된 유산균 자체가

항산화활성 증가에 기여한 것이라고 판단된다(김현수과 함준

상, 2003).

3. 생물전환 상백피 추출물의 티로시나제 저해

상백피 추출물을 AccelleraseⓇ라는 효소를 이용하여 배

당체들을 비배당체 형태로 바꾸었을 때 반응시간에 따른

mushroom tyrosinase에 대한 저해율의 변화는 Figure 7과 같

다(추출물 농도 20 ㎍/㎖).

Mushroom tyrosinase에 대한 상백피 추출물의 저해율은

mulberroside A 함량이 높은 안동 산의 경우, 생물전환 전에

는 29%에서 생물전환 후(24시간 반응) 79%까지 증가하였으

나, mulberroside A 함량이 낮은 제천 산의 경우, 생물전환

전 22%에서 생물전환 후 47%까지 증가하여 차이를 나타내었

다. 이러한 결과로부터 mulberroside A의 농도가 mushroom

tyrosinase에 대한 저해율을 결정하는 중요 인자임을 알 수

있었고, 또한 mulberroside A가 oxyresveratrol로 전환되면

tyrosinase에 대한 저해율이 증가함을 알 수 있었다. 이는 배


Figure 4. Temperature effect on the HPLC profile of Morus alba extracted with 70% ethanol and treated with Accellerase for 5hr (pH 7.0). (A) 37℃, (B) 40℃, (C) 45℃, (D) temperature effect on the bio-conversion yield.

Figure 5. pH effect on the HPLC profile of Morus alba extracted with 70% ethanol and treated with Accellerase for 5hr (37℃). (A) pH 5.0 (B) pH 6.0 (C) pH 7.0 (D) pH effect on the bioconver-sion yield.

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당체인 mulberroside A보다 비배당체인 oxyresveratrol의

tyrosinase 저해 효과가 월등히 높기 때문이다. 김미진(2011)

의 연구에 따르면 mushroom tyrosinase에 대한 mulberroside

A 의 IC50 값은 53.6 μM (13.4 ㎍/㎖)이고 oxyresveratrol

의 IC50

값은 0.49 μM (0.119 ㎍/㎖)로서 oxyresveratrol이

mulberroside A보다 약 109배 더 강한 저해력을 가졌다고 할

수 있다. Figure 8은 상백피 추출물 농도에 따른 티로시나제 저

해율의 변화를 나타낸 것으로 생물전환 전 IC50 값은 40.5 ㎍/

㎖이고 생물전환 후 IC50 값은 6.5 ㎍/㎖으로서 약 6.2배 증가

하는 결과를 나타냈다. 결론적으로 생물전환 전보다 생물전환

후가 티로시나제에 대한 저해율이 월등히 증가함을 알 수 있다.

4. Arbutin과 oxyresveratrol의 티로시나제 저해 상승효과

미백화장품에 가장 많이 사용되는 알부틴의 경우 일반적으

로 2%(20 ㎎/㎖) 농도로 첨가하게 되지만 피부를 통과하여 실

제 멜라닌 세포에 전달되어 티로시나제를 억제할 수 있는 알

부틴의 농도는 이보다 매우 낮은 수준일 것이다. 따라서 멜

라닌 세포내의 실제 알부틴 농도를 1/200에서 1/1,000 수준


Tota

l fla

vono

idTo

tal P

olyp

heno

l

DPP

H ra

dica

l sc

aven

ging

act

ivity

(%)

0

20

40

60

80

100

Before bioconversion

After bioconversion

0 0 .1 0 .3 0 .5Morus abla Extract (%)

0

20

40

60

80

100

Before bioconversion

After bioconversion


0

20

40

60

80Before bioconversion

After bioconversion


Figure 6. Change of antioxidant activity of Morus alba extracted with 70% ethanol and treated with Accellerase for 10 hr. (A) DPPH radical scavenging activity, (B) Polyphenol equivalent to Caffeic acid, (C) Flavonoid equivalent to Quercetin

(A)

(B)

(C)

Figure 8. Change of tyrosinase inhibition activity with the concentration of Morus alba extract. Morus alba was extracted with 70% ethanol and bioconversioned using Accellerase®. Before; IC

50 40.5 ㎍/㎖, After; IC

50 5.6 ㎍/㎖.

Figure 7. Change of tyrosinase inhibition activity with the reaction time of Morus alba extract (20 μg/㎖). Morus alba was extracted with 70% ethanol and bioconversioned using Accellerase®. Control: no inhibitor.

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인 20-100 ㎍/㎖로 가정했을 경우, 실제로 알부틴에 의한 멜

라닌 생성 저해 효과는 크지 않을 것으로 예상된다. 따라서

본 연구에서는 알부틴이 저 농도로 존재하는 상황에서 소량의

oxyresveratrol을 첨가할 경우 티로시나제에 대한 저해효과

를 조사하여 보았다. Figure 9는 알부틴 100 ㎍/㎖ 농도에서

oxyresveratrol의 농도를 5-50 ㎍/㎖로 동시에 처리하였을 때

티로시나제에 대한 저해효과가 단독으로 처리하였을 때보다 상

승효과를 나타내는 것을 보여주고 있다.

알부틴 100 ㎍/㎖ 농도에서 티로시나제 저해율은 16.7%이고

oxyresveratrol의 농도를 5 ㎍/㎖로 첨가하였을 때 티로시나제

저해율은 66.7%이지만 두 물질을 동시에 첨가할 경우 저해율

은 98%까지 증가하였다. 이것은 단순히 두 물질에 의한 저해효

과를 산술적으로 합한 수치인 83.4% 보다 높은 저해율을 보임

으로써 결론적으로 알부틴과 oxyresveratrol을 동시에 사용시

티로시나제에 대한 저해효과가 단독으로 사용하였을 때 보다

높은 상승효과를 나타냈다.

5. 멜라닌 생성 저해능 측정

B16-F10에서 70% 에탄올 상백피 추출물의 세포 독성 측정

결과, 높은 농도 50 ㎍/㎖에서 세포 생존율을 다소 감소하였으

나 대체로 97-98%선을 유지하였고 생물전환 후의 상백피 추

출물의 세포독성 측정결과는 오히려 세포가 약간 씩 증가하는

결과를 나타내어 생물전환 전과 후 모두 세포 생존율에 크게 영

향을 주지 않는다고 판단하여 세포 실험들은 50 ㎍/㎖의 농도

범위에서 실시하였다. 또한 알부틴의 경우 높은 농도에서도 세

포 생존율이 유지되었고 oxyresveratrol의 세포생존율은 높은

농도 20 ㎍/㎖에서 다소 감소하였으나 대체로 90%선을 유지하

여 본 세포독성 평가 결과 실험 범위내에서 문제가 없는 것으로

확인되었다(Data not shown). 때문에 B16-F10 세포를 이용

한 멜라닌 생성 억제 효과 실험에서는 상백피 추출물 50 ㎍/㎖,

oxyresveratrol 20 ㎍/㎖이하를 사용하여 실험하였다.

α-MSH를 이용하여 멜라닌 생성을 유도하였으며, 알부틴

20 ㎍/㎖을 단독으로 첨가한 경우와 알부틴과 oxyresveratrol

(2~20 ㎍/㎖)을 동시에 첨가한 경우 멜라닌 생성 억제에 대

한 결과는 Figure 10 (A)와 같다. 알부틴만을 첨가하였을 때

멜라닌 생성 억제율은 4.7%에 불과하였으나, oxyresveratrol

과 함께 첨가한 경우에는 16.5%에서 20%까지 증가하여 저

농도의 oxyresveratrol 만으로도 멜라닌 생성 억제율을 3배

이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 생물전환 전, 후의 상

백피 추출물을 이용하여 이와 유사한 실험을 실시한 결과는

Figure 10 (B)와 같다. 생물전환 전의 상백피 추출물의 경우 멜

라닌 생성 억제율은 거의 나타나지 않다가 20 ㎍/㎖에서 저해

율 17.8%를 나타내었고, 생물전환 후의 상백피 추출물은 저

농도에서도 충분히 멜라닌 생성 억제능을 나타내었으나 20 ㎍

/㎖에서 저해율은 22.6%로 생물전환 전과 후의 차이가 농도


Figure 9. Inhibition of tyrosinase activity by arbutin, oxyresver-atrol respectively or by both of them. 100 or 200 ㎍/㎖ arbutin was treated with indicated concentration of oxyresveratrol in B16-F10.

Figure 10. Combination effects of oxyresveratrol and Morus alba extract with arbutin. (A) Change of melanin contents in B16-F10 with the oxyresver-atrol and arbutin. 20 ㎍/㎖ arbutin was treated with indicated concentration of oxyresveratrol in α-MSH-treated B16-F10. (B) Change of melanin contents in B16-F10 with the Morus alba extract and arbutin. Morus alba was extracted with 70% etha-nol and bioconversioned using Accellerase. 20 ㎍/㎖ arbutin was treated with indicated concentration of Morus abla Extract in α-MSH-treated B16-F10.

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가 증가할수록 줄어들었다. 또 생물전환 후의 상백피 추출물

을 알부틴과 함께 첨가한 경우에는 오히려 멜라닌 생성 억제율

이 감소하는 경향을 나타내었으며 20 ㎍/㎖에서는 31.2%로 멜

라닌 생성 억제능이 다시 회복하는 결과를 보였다. 즉 알부틴

과 순수 oxyresveratrol을 함께 첨가하는 실험에서는 저농도

oxyresveratrol에서 멜라닌 생성 억제능이 크게 증가하는 결과

와는 달리 생물전환 후 상백피 추출물을 알부틴과 동시 첨가하

는 실험에서는 오히려 저농도에서 멜라닌 생성 억제 효과가 감

소하다가 추출물의 농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성 억제율

이 다시 증가했다는 결과이다. 이러한 상반된 결과를 보이는 이

유로는 알부틴과 순수 oxyresveratrol을 함께 첨가한 경우에는

세포 내에서 두 가지 물질이 서로 다른 위치에서 tyrosinase를

억제하기 때문인 것으로 해석할 수 있으며, 알부틴과 생물전환

상백피 추출물을 동시에 첨가한 경우에는 알부틴과 추출물에

들어 있는 성분 중 일부가 서로 간섭하여 tyrosinase 저해작용

을 방해할 수 있으나 추출물의 농도가 증가함에 따라 상대적으

로 알부틴의 농도가 낮아져 이러한 효과도 점차로 사라진 것으

로 보인다. 따라서 저농도의 생물전환 상백피 추출물에서는 알

부틴과의 상승효과를 기대하기 힘들지만 충분히 농도가 증가하

면 다시 상승효과가 나타나는 것으로 생각할 수 있다.

Ⅳ. 결 론

본 연구에서는 트랜드에 맞는 천연물 소재 개발 요구가 증가함

에 따라 피부 미백에 도움을 주는 천연물질로 최근 특허 출원이

가장 많은 상백피를 이용하여 미백 화장품에 적용 가능한 기능성

화장품 신소재 개발을 하고자, 70% 에탄올 상백피 추출물과 생

물전환에 의한 상백피 추출물을 제조하여 성분분석 하였다.

70% 에탄올 상백피 추출물의 주 성분은 mulberroside A

로 두 개의 당을 포함하고 있는 배당체이다. 두 개의 당이 모

두 잘라진 비배당체인 oxyresveratrol로 생물전환 시의 최

적 반응 조건을 조사하기 위하여 β-glucosidase, Novozym,

Accellerase 효소로 10시간 처리한 결과 가장 효율성 높은 생

물전환 효소로 Accellerase가 탐색되었다. Accellerase에 의한

생물전환 최적 온도 조건을 결정하기 위하여 pH 7.0에서 5시

간 동안 Accellerase를 처리한 결과, 생물전환율은 45℃가 가장

높았으나, 45℃이상에서는 부산물 생산이 증가하여 최적 반응

온도를 40℃로 결정하였다. 37℃에서 5시간 동안 Accellerase

로 처리할 때 최적 pH는 pH 5.0와 pH 6.0로 결정하였다. 다

른 효소들의 최적 온도와 pH가 모두 달라 공통적인 온도는

37℃로, pH는 7.0로 하여 실험하였으며, 이와 같은 실험으로

Accellerase 의 경우에는 pH 5.0~pH 6.0, 온도는 40℃가 최

적인 것으로 나타났다.

70% 에탄올 상백피 추출물과 생물전환 상백피 추출물의 황

산화 활성의 변화를 조사하기 위해 caffeic acid를 표준물질로

하여 총 폴리페놀 함량을, quercetin을 표준물질로 하여 총 플

라보노이드 함량을 측정 하였다. 상백피 추출물 생물전환 전,

후 의 항산화 활성은 비교물질에 비해 큰 차이를 나타내지 않

았으며, 70% 에탄올 상백피 추출물과 생물전환 상백피 추출물

의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 생물전환 전인 70% 에

탄올 상백피 추출물과 생물전환 상백피 추출물의 두 경우 모두

DPPH 라디칼 소거능이 컨트롤 비타민 C에 비해 다소 감소되

는 것으로 항산화력을 확인 하였다. 또한, 상백피 추출물의 티

로시나아제 저해 효과를 실험한 결과에서도 mulberroside A의

농도가 mushroom tyrosinase에 대한 저해율을 결정하는 중요

인자이고, mulberroside A가 oxyresveratrol로 전환되면 티로

시나제에 대한 저해율이 증가함을 알 수 있었다. 이는 배당체인

mulberroside A보다 비배당체인 oxyresveratrol의 티로시나제

저해 효과가 월등히 높기 때문이다.

알부틴과 oxyresveratrol을 동시 사용 시의 티로시나아제에

대한 저해 효과를 실험한 결과, 단독으로 사용 하였을 때와 비

교해서 높은 저해율을 나타냈으며, 동시 사용 시의 티로시나아

제 저해 효과는 산술적으로 합친 숫자보다 높은 저해 상승효과

를 나타내어 미백효과를 일정 수준 이상으로 기대할 수 있을 것

으로 판단되었다. B16-F10 세포를 이용하여 멜라닌 생성 억제

효과를 실험한 결과, 저농도에서 알부틴 단독, oxyresveratrol

단독으로 각 각 사용 시 보다, 알부틴과 oxyresveratrol 동시

사용 시의 멜라닌 생성 억제 효과가 더 많은 것으로 나타났으

나, 농도가 높아짐에 따르는 상승효과와 생물전환 후와 알부틴

동시 사용 시의 상승효과에서는 멜라닌 생성이 기대 이상으로

더 많이 감소하지는 않는 것으로 나타나 이에 대한 추가적인 연

구가 필요할 것으로 판단된다.

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