TEKNOLOGI FERMENTASI

FERMENTASI

• (BIOKIMIA) :Merupakan aktivitas mikroorganisme untuk memperoleh energi yang diperlukan untuk metabolisme dan pertumbuhannya melalui katabolisme anaerobik.

• (PENGERTIAN LUAS): Aktivitas metabolisme mikroorganisme baik aerobik maupun non aerobik dimana terjadi transformasi kimia dari substrat organik

TEKNOLOGI FERMENTASI

• Sebagai ilmu teknik terapan yang mendasari industri fermentasi, melalui pemanfaatan secara terpadu berbagai cabang ilmu.cabang ilmu.

• Teknik produksi makanan fermentasi, asam amino, vitamin, antibiotik, biomassa sampai teknik penanganan limbah

TEKNOLOGI FERMENTASI

1. FERMENTASI.Kultivasi mikroorganisme dibawah kondisi opimal untuk produksi metabolit/ enzim/ mikroorganisme yang diharapkan

2. RECOVERY PRODUK.

Ekstraksi & purifikasi produk biologis (sentrifugasi, filtrasi, kromatografi, elektroforesis,)

• TEKNIK BIOPROSES

• Tahapan yang dilakukan sebelum proses fermentasi

– Formulasi media

– Homogenasi

– Sterilisasi

– Inokulasi kultur

– Pemanenan, pemurnian dan pengemasan

– Bioproduk siap dipasarkan

BIOPRODUK

Biomassa : ragi roti, makanan ternak, PST, vaksin

Produk intra/ekstraseluler : enzim

Metabolit primer/sekunder : as.amino, vit, antibiotika, nukleotida, pigmen

Biokonversi, produksi asam asetat dari etanol, aseton dari isopr opanol

FLAVOUR/AROMA HASIL MIKROBA

• Kacang tanah & aroma bakar• Senyawa kimia tetra metil pirazine • Bacillus subtilis

• Buah & kelapa• Buah & kelapa• Lactone• Saccharomyces• Sporobolomyces

• Aroma mentega• Diasetil leuconoctoc sp• Streptococcuc sp

Aroma MawarGeraniolCeratocytis sp

Pemilihan Media Fermentasi

• Kebutuhan nutrien mikroba adalah faktor penting yang mempengaruhi jumlah atau mutu produk.

• Pemilihan: media sebagai pendukung utama laju pertumbuhan biomassa, pemeliharaan sel atau inducer pertumbuhan biomassa, pemeliharaan sel atau inducer pembentukan produk metabolit.

• Nutrien diperoleh dari alam contoh MOLASES

SUMBER SUBSTRAT SEBAGAI NUTRIEN MIKROBA

• Medium Alamiah– Limbah industri/bahan baku belum diolah– Mudah diperoleh, biaya murah– Molases, air kelapa, ampas pabrik tapioka, kulit

nanas.

• Medium Sintetis– Medium terdiri senyawa murni, mudah diatur,

kegagalan proses fermnetasi bisa dicegah, namunbiaya mahal.

PERTIMBANGAN PEMILIHAN MEDIA FERMENTASI

• 1.TIDAK MENGHASILKAN PRODUK SAMPING

• 2.TIDAH MENGINHIBISI

• 3. KUALITAS KONSISTEN

• 4. KETERSEDIAN TERJAMIN• 4. KETERSEDIAN TERJAMIN

• 5. RECOVERY PRODUK MUDAH DAN MAKSIMAL

• 6. PENANGANAN LIMBAH MUDAH

• 7. BIAYA MURAH

KOMPONEN MEDIUM FERMENTASI

• 1. KARBON (sumber energi) : pati, gula, bahan selulosik, hidrokarbondan metanol

• 2. NITROGEN: garam organik atau anorganik, hidrolisat kasein,

• 3. OKSIGEN, HIDROGEN

• 4. FOSFOR, SULFUR, KALIUM, MAGNESIUM

• 5. MIKRONUTRIEN

• 6. INDUCER

• 7. BUFFER

TEHNIK STERILISASI

• 1. PANAS

– A.Sterilisasi Basah

• Bertekanan atau tidak

• Autoklaf 121oC,15 menit.; Air mendidih 100 oC, • Autoklaf 121 C,15 menit.; Air mendidih 100 C, 30 menit; pasteurisasi 65oC, 30 menit atauBlanching

– B.Sterilisasi Panas Kering

• Pijar diatas api; oven 170oC,1 jam (alat gelas, logam); oven 150oC, 2 jam (vaselin, parafin)

• 2. BAHAN KIMIA

• Etilen oksida, uap formaldehid, alkohol 70oC, asambenzoat, nipagin, nipasol

• Sinar atau steriliasi radiasi: UV, sinar X atau Co-60, ultrasonik

• Membran atau strerilisasi filtrasi contoh filter bakteri(untuk larutan/cairan); filter serat

• Destruksi mikroba dengan uap panas mengikuti kinetika“FIRST ORDERFIRST ORDER”

• dN = k N atau Nt = e -kt

dt No

N = jumlah mikroba yang hidupt = Waktu sterilisasit = Waktu sterilisasiK = laju kematian

No = jumlah mikroba awalNt = jumlah mikroba yang hidup setelah sterilisasi selama

waktu t

Hubungan antara rasio mikroba hidup dalam populasi dan waktusterilisasi pada suhu letal

(Stanbury & Whitaker,1984 )

• Nt/No

• t

• Laju kematian (k) tergantung Fisiologi atau morfologi selmikroba.

• Contoh endospora Bacillus lebih tahan dibandingkan selvegetatifnya

• Bacillus stearothermphilus paling tahan terhadap panas. • paling tahan terhadap panas. Sebagai patokan dalm pengujian berbagai prosedursterilisasi

Waktu & suhu sterilisasi berbagai mikroba(Crueger dan Crueger, 1982)

Sel Waktu sterilisasi (menit)

Suhu sterilisasi (oC)

Sel vegetatif 5-10 60Sel vegetatif

Spora kapang

Spora bakteri

Bacillus stearothermphilus

5-10

15

5-10

15

60

80

121

121

Apa Yang Terjadi Bilamana Produk FermentasiTercemar Organisme Asing:

– 1. Medium mampu mendukung pertumbuhan mikrobaprodusen & pencemar

– 2. fermentasi kontinu, mikroba pencemar dapat– 2. fermentasi kontinu, mikroba pencemar dapatmengganti posisi produsen dalam fermentasi

– 3. Mikroba pencemar menghasilkan produk yang dapatmenggangu ekstraksi hasil akhir

– Fermentasi yang tercemar phage menyebabkan lisis

CARA MENGATASINYA

• 1. Inokulum murni

• 2. Mensterilkan media pertumbuhan

• 3.Mensterilkan fermentor & bahan yang digunakan.• 3.Mensterilkan fermentor & bahan yang digunakan.

• 4.Mempertahankan kondisi akseptis

• 5. Fermentasi terproteksi; pH sangat rendah, resin hop inhibitor mikroba

STERILISASI MEDIUM

• Proses mahal. bukan hanya peralatan, tenaga, namun merusak nutrien/ gizi (yang labil terhadappanas)

• a. Atraksi komponen nutrien medium– Mailard reaction (adanya karbonil & gugus amino protein)– Sterilisasi terpisah

• b. Perusakan komponen yang labil terhadap panas– As. amino, vitamin– Pengubahan suhu & waktu sterilisasi

METODE FERMENTASI

• 1.FERMENTASI MEDIA PADAT• Teknologi fermentasi tradisional (tempe, oncom)• Sistem terbuka dan tidak terkontrol

• 2.FERMENTASI MEDIA CAIR: • 2.FERMENTASI MEDIA CAIR: • 1.Sistem TERTUTUP (BATH)

•• 2. KONTINU (Open System)

• 3. Sistem tertutup (BATH) dg penambahan substratselang waktu tertentu (FED BATH)

• 1. FERMENTASI SISTEM TERTUTUP (BATCH PROCESS)

• Pertumbuhan jumlah mikroba diamatidengan mengukur jumlah sel ataukonsentrasi biomassa

• Tidak ada penambahan substrat setelahinokulasi kedalam medium steril di fermentorkecuali oksigen (udara steril ), anti buih, asam/basa

• Pertumbuhan sel pada fase. eksponensial

dx = µ x dt

x = konsentrasi biomassa (g/l)t = laju inkubasi (jam)µ = laju pertumbuhan spesifik (jam -1)

ATAU X = X e µt ATAU Xt = Xo e µt

� Xo = konsentrasi biomassa awal� Xt = konsentrasi biomassa setelah waktu t

� µ tergantung jenis mikroba & kondisi kultur, media (panjang rantai molekulsubstrat)

Tabel 4.1 hal 59

Laju pertumbuhan vs kons. nutrien. Pertumbuhan maks pada substrat berlebih & sebaliknya

µ = µ maks SKs + S

KsA

B

• Fermentasi BATH digunakan untuk memproduksibiomassa, metabolit primer/sekunder

• 1.Produksi BIOMASSA (kondisi fermentasi harusoptimal) sehingga meningkatkan populasi sel

• 2.Produksi METABOLIT PRIMER (memperpanjang fase• 2.Produksi METABOLIT PRIMER (memperpanjang faseeksponensial)

• 3.Produksi METABOLIT SEKUNDER (mempersingkat f. eksponensial & memperpanjang f. stasioner)

• 2. FERMENTASI KONTINYU

• Nutrien (volume tertentu) ditambahkan ke fermentorbersamaan pula dg dikeluarkannya cairan dari fermentor dg volume yang sama.

• Penambahan medium baru “STEADY STATE”Konsentrasi sel, nutrien, produk, laju pertumbuhan, tidakberubah dengan bertambahnya waktu fermentasiberubah dengan bertambahnya waktu fermentasi

– Sistem CHEMOSTAT: pertumbuhan sel dikontrol dg konsentrasi substrat terbatas dalam medium

– Sistem TURBIDOSTAT: pertumbuhan/konsentrasi seldipertahankan konstan dg cara memonitor kekeruhan.Gbr 4.3 & 4.5 hal 66

Pertumbuhan spesifik dipengaruhi rasio laju aliran medium (F) & volume kultur

(V) , Rasio ini dikenal dengan :D = laju dilusi/ Dilutio n Rate

D = FV

Perubahan sel pada waktu tertentu:

dx = sel yang tumbuh – sel yang keluardt

atau dx = µx - Dxdt

Steady State ( Konsentrasi Sel konstan)

dx = 0 atau µx = Dx atau µ = Ddt

Laju pertumbuhan dipengaruhi laju dilusi

KONTINU

•• EKONOMIS/PRODUKTI

VITAS TINGGI

• KONSENTRASI PRODUK DALAM CAIRAN FERMENTASI CAIRAN FERMENTASI LEBIH RENDAH DARIPADA BATH, BIAYA RECOVERY TINGGI

• Tabel 4.2

APLIKASI SISTEM KONTINU(PRODUKSI ENZIM)

• Aplikasi nutrien terbatassesuai mekanisme catabolitrepression dg caramenumbuhan paa sumberkarbon terbatas

• Produktivitas kontinulebih tinggi dari batch

karbon terbatas

• Manipulasi lingkunganpertumbuhan kultur & nutrienterbatas yg sesuai (perubahanpermeabilitas dinding sel)– Bacillus sp. ( pada medium dg

Mg terbatas)

• FED-BATH (Yoshida et al., 1973)

• Penambahan medium baru secara teratur dalam kulturtertutup (batch) tanpa mengeluarkan cairan darifermentor

• Konsentrasi sisa substrat dipertahankan pada tingkatrendah (menekan efek represi) & efek toksik komponenrendah (menekan efek represi) & efek toksik komponenmedium dpt dihindari

• Aplikasinya adalah fermentasi penicillin

FASE PERTUMBUHAN MIKROBA

• 1.FASE ADAPTASI– Fase pertama pertumbuhan mikroba– Periode adaptasi terhadap substrat & lingkungan. – Sel mulai membesar & belum terjadi pembelahan sel

• Lama adapatasi DIPENGARUHI:- Medium lingkungan pertumbuhan. Medium & lingkungan yang - Medium lingkungan pertumbuhan. Medium & lingkungan yang

sama dg asal mikroba adaptasi cepat- Jumlah inokulum

• Fase adapatasi lambat karena:– Kultur dari medium kaya nutrien ke nutrien terbatas– Mutan baru menyesuaikan diri dengan lingkungannya– Kultur yang dipindahkan dari fase statis ke medium baru

dengan komposisi sama seperti sebelumnya.

• 2.FASE PERTUMBUHAN AWAL– Pembelahan sel rendah/waktu generasi panjang– Fase ini dengan fase permulaan dikenal dengan “fase Lag

atau phase of adjustment”

• 3.FASE PERTUMBUHAN LOGARITMIK– Pembelahan sel paling tinggi, waktu generasi pendek– Waktu generasi dipengaruhi spesies, medium & – Waktu generasi dipengaruhi spesies, medium &

lingkungan selama pertumbuhan– Kebutuhan energi lebih banyak– Sel paling sensitif terhadap lingkungan– Produk yang dihasilkan senyawa essensial untuk

pertumbuhan– Jenis metabolit yang memiliki ekonomi tinggi: asam amino,

asam nukleat, lipid, karbohidrat, protein, nukleotida

• G = t

• 3,3 log { b }• B

• G = waktu generasi• G = waktu generasi• t = Selang waktu antara pengukuran jumlah sel didalam

populasi pada suatu saat dalam fase log (B) dan pada suatu titikwaktu kemudian (b)

• B = Populasi awal• Log = log 10• 3,3 = Faktor konversi log 2 menjadi 10

• Escerichie coli waktu genarasi 15-20 menit

• 4.FASE PERTUMBUHAN LAMBAT

• Kecepatan pembelahan sel berkurang dan jumlah selyang mati bertambah

• Nutrisi dalam medium berkurang

• Adanya metabolit yang mungkin toksik atau• Adanya metabolit yang mungkin toksik ataumenghambat pertumbuhan mikroba tersebut

• Perubahan pH

• Dengan penambahan nutrien dan penetralan hasilyang bersifat toksik fase logaritmit dapatdiperpanjang (F pertumbuhan lambat ditunda)

• 5. FASE PERTUMBUHAN STASIONER (STATIS)

• Jumlah mikroba yang dihasilkan dari pembelahan samadengan jumlah yang mati

• Ukuran sel pada fase ini lebih kecil karena sel tetapmembelah meski rendah nutrisi

• Sel tahan terhadap kondisi ekstrim• Sel tahan terhadap kondisi ekstrim

• Panjang fase ini tergantung kepekaan bakteri terhadapperubahan medium

• Menghasilkan senyawa non essensial untukpertumbuhan/metabolisme sel

SINTESIS METABOLIT SEKUNDER SELAMA PERTUMBUHAN SEL

produk

pertumbuhan

• Metabolit • sekunder (g/L)

• waktu (jam)

produk

• 6.FASE MENUJU KEMATIAN & FASE KEMATIAN

• Kedua fase ini dikenal sebagai “ fase Menurun”

• Kecepatan sel yang mati meningkat & kecepatanpembelahan sel nol

• Nutrisi dalam medium habis• Nutrisi dalam medium habis

• Energi cadangan dalam sel habis

• Secara teoritis sejumlah kecil sel masih tetap bertahandalam jangka waktu tertentu E. coli 1bulan; Pneumococcussp. Bertahan 2-3 hari

Aktivitas Metabolisme Mikroba

• Kebutuhan energi mikroba• Pemecahan karbohidrat (glikolisis,

katabolisme aerobik, katabolismeanaerobik)anaerobik)

GLIKOLISIS ( Mayerhof & Embden )

Katabolisme Aerobik Piruvat

Katabolisme Anaerobik

• Tergantung spesies mikroba ( Streptococcus lactis) membentuk asam laktat

• Yeast (Pembentukan alkohol )

KETERATURAN METABOLISME

• 1. INDUKSI• Enzim terbentuk jika tersedia substrat yang strukturnya

mirip dg substrat dalam medium pertumbuhan (inducer).

• Contoh induksi OLEH JACOB & MONOD (1961). P 30

• 2. REPRESI KATABOLIT• 2. REPRESI KATABOLIT• Penurunan laju sintesa enzim ttt, karena memfermentasi

sumber C yang cepat dicerna (tjd penurunan cAMP).

• Bacillus strearothermophilus pada gliserol meningkatkanproduksi α-amilase (25 kali) daripada pada medium glukosa

Skema mekanisme induksi enzim

R= regulator, P= protein promotor, O= operator , S= gen struktural

•• R P O S DNA•

•• RNA • RNA • polimerase

• represor

• RNA polimerase; enzim katalis transkripsi DNA mjd mRNA

• Tanpa inducer. Represor protein berikatan O RNA polimerase tidak dapat berpindah sehingga tidak terjadi pembentukan enzim

Skema mekanisme induksi enzim

R= regulator, P= protein promotor, O= operator , S= gen struktural

•• R P O S DNA•

• RNA polimerase• RNA polimerase

represor

•

• Inducer

• Represor inaktif

mRNA

ENZIM

transkipsi

BIOSINTESA METABOLIT

• Metabolit Primer

– Produk yang disintesa selama f. pertumbuhaneksponensial

– Senyawaan antara yang terbentuk akibat katabolisme(glikolisis, asam sitrat, s.pentosa)

• Metabolit Sekunder

– Produk yang disintesa selama f. stasioner

PENUMPUKAN PRODUK AHKIR

• Akumulasi produk akhir salah satu cabang dapat terjadi jika produksi produk akhir cabang lain ditekan

• Biosintesis lisin, aspartokinase dihambat lisin & treonintreonin

• Pada mutan auksotrop C. glutamicummemproduksi lisin 50 g/L. Pada mutan tsb tjd defisiensi homoserin dihidrogenase, produksi treonin rendah sehingga tidak terjadi penghambatan aspartokinase)

• Pada beberapa organisme terjadi dekarboksilasi lisin menjadi kadaverin

FERMENTASI LISIN OLEH C. glutamicum

ASPARTATASPARTOKINASE

• ASPARTIL FOSFAT

• ASPARTAT SEMIALDEHID

» HOMOSERIN DEHIDROGENASE» (defisinesi)

» HOMOSERIN

LISIN TREONIN (rendah)

• ISOLEUSIN

METABOLIT PRIMER YANG MERUPAKAN PRODUK ANTARA

• Membatasi produk akhir ( E ) maka tjd akumulasi produk antara ( C ) terjadi pada mutan auksotrop enzim C terbatas & suplai suboptimum konsentrasi E utk pertumbuhannya

• Enzim a1 Enzim b Enzim c Enzim d

• A → B → C → D → E

• Produksi inosin monofosfat (IMP) Corynebacterium glutamicum & Brevibacterium ammoniagenes, defisiensi S-AMP sintase dpt produksi IMP 13 g/L (p.47. tek fermentasi)

Modifikasi metabolisme

�Modifikasi lingkungan metabolisme

�Genetika (mutasi, rekombinasi genetika)

CONTOH MODIFIKASI LINGKUNGAN

• Fermentasi alkohol oleh Saccharomyces cerivisiaemembentuk gliserol (3.8%), penambahan Na sulfit (mengikat asetaldehid) menurunkan produksi etanol dan menaikkan gliserol (90%). (p. 44)

• Modifikasi permeabilitas membran. • Modifikasi permeabilitas membran. Corynebacterium glutamicum yang menghasilkan glutamat dapat diatur dg membatasi biotin dalam medium pertumbuhannya.

• Kons biotin optimum untuk produksi glutamat :1- 5 µg/L medium

• FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PERTUMBUHAN MIKROBA

• 1. NUTRIEN : sumber Karbon,Nitrogen,vitamin & mineral

• 2 . AIR : reaktan dalam berbagai reaksi, bagian terbesar penyusun sel (70%)

• Kebutuhan mikroba akan aw minimal berbeda-beda

– Bakteri = 0,95– Khamir = 0,88– Jamur = 0,80– Bakteri halofil = 0,75– Bakteri osmofilik =0,60

• Suhu• Pola pertumbuhan bakteri dipengaruhi suhu• Data pertumbuhan mikroba

Kelompok mikrobaSuhu pertumbuhan ( oC)

minimum optimum maksimumKelompok mikroba minimum optimum maksimum

Psikotropil -5 - 0 5-15 16-20

Mesofil 10-20 20-40 40-45

Termofil 25-45 45-60 60-80

• pH

• Mikroba umumnya tumbuh pada pH kisaran 3-6

• Bakteri pH optimumnya; 6,5-7,5

• Pada pH kurang dari 5,0 atau diatas 8,55 bakteri tidak dapat hidup kecuali bakteri asam laktat dan pengoksidasi sulfurpengoksidasi sulfur

• Khamir pH optimum 4-4,5 dan tumbuh pada kisaran 2,5-8,5

• Jamur pH optimum: 5-7 dan tumbuh pada kisaran 3-8,5

SEKIAN

Materi Tugas (Presentasi)

• Fermentasi (optimasi produksi) modifikasi medium, rekayasa genetika,permebilias membran, induksi,dll– Enzim– Vitamin– Antibiotika– Antibiotika– Hormon– protein

• Teknik penangan limbah sec bioteknologi• Aplikasi immobilized sel atau enzim untuk industri

• Oksigen• Aerobik• Anaerobik• Anaerobik fakultatif• Jamur dan khamir• Bakteri bersifat aerobik atau anaerobik• Bakteri bersifat aerobik atau anaerobik

Bacterial growth: batch culture

Batch culture: Lag phase

no Lag phase:Inocculum from exponential phase grown in the same media

Lag phase:

Inocculum from stationary culture (depletion of essential constituents)Inocculum from stationary culture (depletion of essential constituents)After transfer into poorer culture media (enzymes for biosynthesis)Cells of inocculum damaged (time for repair)

Batch culture: exponential phase

Exponential phase = log-phase

„midexponential“: bacteria often used for functional studies

Maximum growth rates

„midexponential“: bacteria often used for functional studies

Batch culture: stationary phase

Bacterial growth is limited:

- essential nutrient used up- build up of toxic metabolic products in media

Stationary phase:Stationary phase:

- no net increase in cell number- „cryptic growth“- energy metabolism, some biosynthesis continues- specific expression of „survival“ genes

Batch culture: death phase

Bacterial cell death:

- sometimes associated with cell lysis- 2 Theories:

- „programmed “: induction of viable but non-culturable- gradual deterioration :

- oxidative stress: oxidation of essential molecules- oxidative stress: oxidation of essential molecules- accumulation of damage- finaly less cells viable

Measurement of microbial growth

A. Weight of cell massB. number of cells:

- Total cell count- Viable count- Dilutions- turbidimetric

total cell count

A. Sample dried on slideB. Counting chamber:

Limitations:- dead/live not distinguished- small cells difficult to see- precision low- phase contrast microscope- not useful for < 106/ml- not useful for < 106/ml

viablecell countsynonymous: plate count, colony count1 viable cell � 1 colonycfu = colony forming unitAdvantage: high sensitivity; selective mediaOptimal: 30 – 300 colonies per plate (� plate appropriate dilutions)

spread plate method:

pour plate method:Bacteria must withstand 45°C briefly

dilutionsExample:3 h culture of E. coli in L-brothHow do I determine the actual number?

Turbidimetric measurements

Relationship between OD and cfu/ml must be established experimentallyExponential culture of E. coli in L-broth: 1 OD = ca. 2-3 x 109 cfu/ml

Turbidimetric measurements

Kle

tt un

its

Two typical growth curves in batch culture

Kle

tt un

its

1 Klett unit = OD/0.002

Limits of sensitivity at high bacterial density„rescattering“� more light reaches detector

Continuous culture: the chemostat

steady state = cell number, nutrient status remain constant

Control:1. Concentration of a limiting nutrient2. Dilution rate3. Temperature� Independent control of:

- Cell density- Growth rate

Continuous culture: the chemostat

1. Concentration of a limiting nutrient

Results from a batch culture

Continuous culture: the chemostat

2. Dilution rate

Factors affecting microbial growth

• Nutrients• Temperature• pH• Oxygen• Oxygen• Water availability

Factors affecting microbial growth: Temperature

3 cardinal temperatures:

Usually ca. 30°C

Factors affecting microbial growth: Temperature

Arrhenius equation:

Maximum temperature

- Covalent/ionic interactions weaker at high temperatures.- Thermal denaturation (covalent or non-covalent)- heat-induced covalent mod.: deamidation of Gln and Asn- Thermal denaturation: reversible or irreversible.

Thermal protein inactivation:

- Missense mutations: reduced thermal stability (Temp.-sens. mutants)- Heat shock response: proteases, chaperonins (i.e. DnaK ~ Hsp70)

Genetics:

Factors affecting microbial growth: TemperatureMinimal temperature:

Proteins:- Greater α-helix content- more polar amino acids- less hydrophobic amino acids

Membranes:- temperature dependent phase transition

Thermotropic Gel: Hexagonal arranged

- homoviscous adaptation

�

„Fluid mosaic“

Membrane proteinsinactive (mobility/insertion)

Protein function normal

Tm

Growth at low Temperatures: „Homoviscous adaptation“

Homoviscous adaptation = adjustment of membrane flu idity

- lowered Tm- More cis-double bonds- Reduced hydrophobic interactions

- high Tm- Few cis double bonds- optimal hydrophobic interactions

Fatty acid composition of plasma membrane as % total fatty acidsE. coli grown at: 10°C 43°CC16 saturated (palmitic) 18 % 48 %C16 cis-9-unsat. (palmitoleic) 26 % 10 %C18 cis-11-unsat. (cis-vaccinic) 38 % 12 %

- thermophiles- mesophiles

„Temperature classes“ of organisms

Psychrophilic vs. Psychrotolerant

Psychrophiles

Maximum: <20°COptimum: <15°CMinimum: <0°CHabitats:

- deep sea

Psychrotolerant

Maximum: >20°COptimum: 20-40°CMinimum: <0-4°CHabitats: much more abundant than psychrophiles

- soil in temperate climate

Sierra Nevada

- glaciers- soil in temperate climate- foods- grow slowly even in fridge!

Chlamydomonas nivalisThe snow algaered spores

Limit: Freezing- Inhibits bacterial growth- freezing: often liquid pockets- many bacteria survive- cryoprotectants (DMSO, glycerol)

Growth at high temperatures

<65°C

Thermophilic:optimum > 45°CSoil in sun often 50°CFermentation: 60-65°C

<65°C

Hyperthermophilic:optimum > 80°COnly in few areas:Hot springs: 100°CSteam vents 150-500°CDeep sea hydrothermal vents

Growth at high temperaturesMolecular adaptations in thermophilic bacteria

- Protein sequence very similar to mesophils- 1/few aa substitutions sufficient- more salt bridges- densely packed hydrophobic cores

Proteins

lipids- more saturated fatty acids- hyperthermophilic Archaea: C40 lipid monolyer

lipids

- sometimes GC-rich- potassium cyclic 2,3-diphosphoglycerate: K+ protects from depurination- reverse DNA gyrase (increases Tm by „overwinding“)- archaeal histones (increase Tm)

DNA

Bacterial growth: pH

Most

(extremes: pH 4.6- 9.4)

Most natural habitats

Growth at low pH

Fungi: - often more acid tolerantthan bacteria (opt. pH5)

Obligate acidophilic bacteria:Thiobacillus ferrooxidans

Obligate acidophilic Archaea:SulfolobusThermoplasma

Most critical: cytoplasmic membraneDissolves at more neutral pH

Bacterial growth: high pH- Few alkaliphiles (pH10-11)- Bacteria: Bacillus spp.- Archaea- often also halophilic- Sometimes: H+ gradient replaced by Na+ gradient (motility, energy)- industrial applications (especially „exoenzymes“):

-Proteases/lipases for detergents (Bacillus licheniformis)-Proteases/lipases for detergents (Bacillus licheniformis)-pH optima of these enzymes: 9-10

Buffers in bacterial culture media

pH range buffer system1.1 - 3.5 glycine/HCl2.2 - 4.0 KH-phtalate/HCl3.6 - 5.6 Na-acetate/acetic acid5.0 - 8.0 KH2PO4/Na2HPO45.0 - 6.6 Na-citrate/NaOH7.2 - 9.0 TRIS/HCl7.2 - 9.0 TRIS/HCl8.5 - 12.9 glycine/NaOH9.2 - 10.7 Na2CO3/NaHCO310.9 - 12.0 Na2HPO4/NaOH

Küster Thiel, Rechentafeln für die chemische Analytik, 1982, Walter de Gruyter Sambrook et al., 1989, Molecular cloning, 2nd ed.

Bacterial growth: Osmosis

Water acitvity Osmotic pressure

aw =ppo

aw: rel. Water activityp: vapor pressure of a solutionp : vapor pressure of water

p =n x R x T

V

p: osmotic pressuren: number of dissolved particlesR: universal gas constant

p0: vapor pressure of waterR: universal gas constantT: temperatureV: volume of the solution

low awhigh aw high plow p

Semipermeable membrane

Bacterial growth: Osmosis

Soil: water activity = 0.9 – 1.0In general: bacteria normally have higher osmotic pressure than environment

= „positive water balance“Osmophiles : - grow in presence of high sugar concentrationXerophiles - grow in „dehydrated“ environments

Bacterial growth: HalophilesHalophiles: - requirement for Na+

- grow optimally in media with low water activity- Mild: 1-6 % NaCl- Moderate: 6-15 % NaCl- extreme: 15 – 30% NaCl

most other organismswould be dehydrated

Bacterial growth at low aw: compatible solutes

Strategy: increase internal solute concentration

a. Pump inorganic ionsb. Synthesize organic solutes

Solute must be „compatible“ with cellular processes

Bacterial growth: OxygenO2 as electron sink for catabolism � toxicity of Oxygen species

Aerobes : growth at 21% oxygenMicroaerophiles : growth at low oxygen concentrationFacultative aerobes : can grow in presence and absence of oxygenAnaerobes : lack respiratory systemAerotolerant anaerobesObligate anaerobes : cannot tolerate oxygen (lack of detoxification)Obligate anaerobes : cannot tolerate oxygen (lack of detoxification)

Bacterial growth: toxic forms of Oxygen

triplet oxygen : ground statesinglet oxygen : reactive

inactivated by carotenoidsproduced by light, biochemically

Bacterial growth: Oxygen detoxificationCatalase assay

Bacterial growth: Anaerobes

Methods to exclude/reduce oxygen:

- Closed vessels- reducing agents (i.e. thioglycolate broth)- anaerobic jar (H2-generation + Pd catalyst)- glove box (oxygen free gas) ai

r

air

air

air

air

obl.

aero

be

obl.

anae

robe

fac.

aer

obe

mic

roae

roph

ile

aero

tole

rant

anae

robe

The world largest fermenter

121

There may be biological waste treatment in larger vessels, but the world's largest fermenter is shown in these photos taken from Chemical and Engineering News. The fermenter is 200' high and 25 ft diam. The first photo (Chem. Eng. News, 10-Apr-78) shows the fermenter being transported on vehicles with tank treads.

Laboratory chemostat and industrial fermenter

122

Labatt Breweries - London, Ontario New Vertical Fermenter

Applikon laboratory chemostat at Kluyverlab, Delft University of Technology