MP 01240 蛍光 Ca2インジケーター

製品情報

2011 年 2 月 2 日改訂

蛍光 Ca2+インジケーター

はじめに

1989 年に発表されて以来 1、fluo-3 イメージングに

よって、Ca2+シグナル伝達の多くの基本プロセスの

空間的動態が明らかにされてきました 2-4。それに加

え、fluo-3 はフローサイトメトリー5、「ケージド (caged)」キレート剤、セカンドメッセンジャー、お

よび神経伝達物質の光活性化を行う実験 6, 7、および

細胞ベースの薬理学的スクリーニング 8 に広く利用

されてきています。これらの研究における fluo-3 の

も重要な特長として、吸収スペクトルがアルゴン

イオンレーザー源による 488 nm での励起に対応し

ていること、および Ca2+の結合により蛍光強度が著

しく増加することが挙げられます。 fluo-4 は fluo-3 の 2 個の塩素置換基をフッ素で置

き換えた類似体です。このごくわずかな構造変化に

よって 488 nm における蛍光励起が増大し、その結果

共焦点顕微鏡、フローサイトメトリー、およびマイ

クロプレートスクリーニングのシグナルレベルが向

上します。また、fluo-5F、fluo-5N、fluo-4FF は、Ca2+

への結合親和性を低下させた fluo-4 の類似体であり、

fluo-3 や fluo-4 の応答を飽和させる可能性のある 1 µM から 1 mM の範囲の細胞内カルシウムレベルを

検出するのに適しています。

fluo-4 dextran は、fluo-4 を生物学的に不活性なデ

キストランキャリアー（分子量 1 万）と結合させた

もので、不均一な線維束中の長い軸索投射によるシ

ナプス前終末における過渡 Ca2+の測定法として、新

規で大きな可能性を秘めたツールを提供します 9。

Molecular Probes には、fluo-4 iodoacetamide および

fluo-4 cadaverine という 2 種類の活性型 fluo-4 が含ま

れます。fluo-4 iodoacetamide は、タンパク質、ペプ

チド、およびチオール修飾表面などのスルフィドリ

ル基と反応し、ユニークな蛍光性の Ca2+感受性プロ

ーブを形成します。アミン基を持つ fluo-4 cadaverineは、アルデヒド、ケトン、および活性エステルと反

応します。

試薬 Fluo-3、Fluo-4、Fluo-5F、Fluo-5N、および Fluo-4FF

fluo-3、fluo-4、fluo-5F、fluo-5N、および fluo-4FFは、水溶性塩、デキストラン、カダベリン、あるい

はチオール反応性のヨードアセトアミド、さらに細

胞浸透性のアセトキシメチル（AM）エステルとし

て提供しています。以下に詳細を示します。 Fluo 製品 1 mg 塩 • F1240 および F3715 Fluo 製品 500 µg 塩 • F14200、F14221、F14203、および F23980 Fluo-4 dextran • Fluo-4 dextran は、5 mg 単位の固体状で提供して

います。（F14240 および F36250） Fluo-4 cadaverine • Fluo-4 cadaverine は、500 µg 単位で提供していま

す。（F36201） Fluo-4 iodoacetamide • Fluo-4 iodoacetamide は、500 µg 単位で提供してい

ます。（F36200） Fluo-3, AM • F1241 は、1 mg 単位の固体状で提供しています。 • F1242 は、50 µg 入りのバイアル 20 本のセットで

提供しています。 • F14218 は、DMSO 中 1 mM の既成溶液 1 mL とし

て提供しています。 • F14242 は、ハイスループットスクリーニング用

に大量の提供が可能です。1 mg 入りのバイアル

40 本のセットで提供しています。 • F23915は、HPLC純度規格98%以上のFluoroPure™

グレード製品で、50 µg 入りのバイアル 10 本セッ

トで提供しています。

ひと言 製品受領後直ちに下記の条件下で保

存してください。 • -20˚C 以下 • 乾燥条件 • 遮光

蛍光 Ca2インジケーター 2

Fluo-4, AM • F14201 は 50 µg 入りのバイアル 10 本のセットで

提供しています。 • F14202 はハイスループットスクリーニング用に

大量の提供が可能です。1 mg 入りのバイアル 5本のセットで提供しています。

• F14217はDMSO中 1 mM の既成溶液 500 µLとし

て提供しています。 • F23917 は HPLC 純度規格 98%以上の FluoroPure™

グレード製品で、50 µg 入りのバイアル 10 本セッ

トで提供しています。 Fluo-5F, AM、Fluo-5N, AM、および Fluo-4FF, AM • それぞれ 50 µg 入りのバイアル 10 本のセットで

提供しています（F14222、F14204、および F23981）。 MP 01240 蛍光 Ca2+インジケーター

以上の製品は、受領後直ちに乾燥・遮光条件下、

-20˚C 以下で保存してください。AM エステルは（特

に溶液中において）加水分解を受けやすい試薬です

が、お届けしたバイアル中で 低 6 ヵ月間は保存可

能です。 AM エステルは無水ジメチルスルホキシド

（DMSO）を用いて溶液とし、分解による細胞内ロ

ーディング能の損失を防ぐため、直ちに（1 週間以

内に）使用してください。AM エステルの DMSO ス

トック溶液は、冷凍状態で遮光・乾燥条件下におい

て保存してください。塩のストック溶液は、蒸留水

あるいは水溶性バッファーを用いて調製し、冷凍状

態（-20˚C 以下）で遮光条件下において保存してく

ださい。上記のストック溶液は、 低 6 ヵ月間は安

定です。 AM エステルが分解しているかどうかを、以下に

示す蛍光光度計を用いた簡単な試験で確認すること

ができます。少量の AM エステルストック溶液を一

定量採り、カルシウムフリーバッファーで 終濃度

が約 1 µM となるように希釈します。この溶液をキ

ュベットに移し、適正な波長設定にて（485 nm 励起、

520 nm 放射）、蛍光度を測定します。カルシウムを

各試薬の飽和濃度まで（fluo-3 および fluo-4 におい

ては 5 µM 以上、fluo-5F、fluo-5N、および fluo-4FFにおいては 1 mM 以上）加え、再び蛍光度を測定し

ます。両者の蛍光度に有意な差は生じないはずです

（注：いずれの蛍光度も極めて低いはずです）。カル

シウム添加による蛍光度（2 回目の測定値）の著し

い増加は、AM エステルの一部が加水分解されてい

ることを示します。

特性

fluo-3、fluo-4、およびそれらの誘導体はすべて、

Ca2+に結合すると大きな蛍光度増加を示します。UV光励起型インジケーターである fura-2 および indo-1で見られるようなスペクトルシフトは起こりません。

Ca2+結合による蛍光度増加は通常 100 倍を超えます10。fluo-3 および fluo-4 の物理的および分光学的特性

を表 1 に示しています。fluo-5F、fluo-5N、および

fluo-4FF の特性は、イオン解離定数が高い点を除い

て、fluo-4 によく似ています。表１と同条件下で測

定した fluo-5F、fluo-5N、および fluo-4FF のイオン解

離定数 Kd (Ca2+)は、それぞれ 2.3 µM、90 µM、およ

び 9.7 µM です。fluo-4 dextran に関しては、Kd (Ca2+)が遊離型のインジケーターと比較して幾分高く、高

アフィニティ型の Kd (Ca2+)は約 600 nM、低アフィニ

ティ型の Kd (Ca2+)は約 3 µM です（各バッチに関す

る値はラベルに印刷されています）。 アプリケーション 細胞ローディングのガイドライン

水溶性塩型 Ca2+インジケーターの細胞ローディン

グには、マイクロインジェクション 7、パッチピペ

ット溶液への添加 11、あるいは当社の Influx™飲作用

細胞ローディング試薬（I14402）を使用することが

可能です。fluo-4 dextran は、濃度 20% w/v（200 µg/µL）までの水溶液として、マイクロインジェクションを

用いた細胞ローディングに使用可能です。fluo-4 の

蛍光度は、Ca2+が存在しない場合は本質的に弱いた

め 9、標識細胞の初期同定にレファレンスマーカー

（例えば、Texas Red で標識した分子量 1 万のデキス

トランである D 1828）を同時に注入する必要が生じ

る可能性があります。細胞浸透性 AM エステルを用

いて細胞ローディングを行う場合の、入門ガイドを

以下に示します。さらに詳しい方法に関しては、他

の文献等 12, 13をご参照ください。

蛍光 Ca2インジケーター 3

表 1. fluo-3 と fluo-4 の比較

* Ca2+の解離定数は、100 mM KCl、10 mM MOPS、および 0～10

mM CaEGTA を含む pH 7.2 の溶液中 22 C で算出。Molecular Probes の The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition (2005) においては、fluo-3の Kdは 390 nM と報告されています。† 100 mM KCl、10 mM MOPS、39.8 µM の遊離 Ca2+を含む pH 7.2 の溶液中での値。‡ QY は、蛍光量子収率を表します。J Biol Chem 264, 8171 (1989) に報告されている fluo-3 の QY は 0.18 です。§ 溶液アッセイ

での Ca2+結合による蛍光強度の増加。

1. DMSO ストック溶液（1～5 mM）の一定量を、

終濃度が 1～5 µM になるように、生理的緩衝液で希

釈します。非イオン性洗浄剤である Pluronic® F-127を添加することで、非極性の AM エステルを水溶性

溶媒に分散させることができます。これは少量の

AMエステルのDMSOストック溶液の一定量を同量

の 20% (w/v) 濃 度 の Pluronic の DMSO 溶 液

（P3000MP）と混合し、ローディング溶媒で希釈し

て Pluronic の 終濃度を約 0.02%とするという簡単

な操作で実行可能です。Molecular Probes は、10% (w/v)滅菌水溶液 30 mL（P6866）あるいは 2 g の固体

（P6867）の Pluronic F-127 をご用意しています。 2. 脱エステル化したインジケーターの流出を減ら

すため、有機アニオントランスポーターの阻害剤で

あるプロベネシド（1～2.5 mM）あるいはスルフィ

ンピラゾン（0.1～0.25 mM）を細胞培地に添加する

ことも可能です 12, 14。スルフィンピラゾンおよびプ

ロベネシドのストック溶液は、必然的に非常に強い

アルカリ性であるため、これらを添加した溶媒の pHを再調整することが重要です。 3. 細胞は通常、AM エステルと共に 20～30˚C で 15～60 分間インキュベーションされます（注 A）。正

確なローディング濃度、時間、および温度は経験的

に決定する必要がありますが、一般には、十分なシ

グナル対ノイズ比を持つ蛍光シグナルを得るために

必要な、 小限の色素濃度を使用することが推奨さ

れています。AM エステルのローディング技術にお

ける問題点である細胞内区画化は、一般にインキュ

ベーション温度を下げることで軽減されます。

4. 蛍光度の測定を開始する前に、細胞をインジケー

ターフリー溶媒（該当する場合は、アニオントラン

スポーター阻害剤を含む溶媒）で洗浄し、細胞表面

に非特異的に結合している色素を除去し、その後さ

らに 30 分間インキュベーションし、細胞内の AMエステルを完全に脱エステル化します。インジケー

ターの流出によるバックグラウンド蛍光は、実験開

始の直前に抗フルオレセイン抗体（A889）を細胞外

溶媒に添加することで消すことが可能です 15。 表 2. Molecular Devices の FLIPR システムにおける fluo-4

および fluo-3 を用いた並列性能値比較

* ラットのムスカリン性 M1 受容体で安定的に形質転換した

CHO 細胞に、fluo-3 AM および fluo-4 AM を Molecular Devices社のプロトコールに従ってローディング。但しローディング

溶媒中のインジケーター濃度およびインキュベーション時間

は記載値に変更しました。† マイクロプレートのバックグラ

ウンドを差し引いた、相対蛍光度。‡ 細胞はムスカリン性ア

ゴニストであるカルバコール（50 µM）を添加して刺激しまし

た。§ 刺激型蛍光度と基底蛍光度の比。

レスポンスキャリブレーション 吸光（蛍光励起）、および蛍光放射の 大波長を表

1に示してあります（fluo-5F、fluo-5N、および fluo-4FFにおける波長は、基本的に fluo-4 と同じです）。蛍光

顕微鏡アプリケーションでは、 fluo-3 の検出に

Omega®バンドパスフィルターセット XF104 あるい

は XF23、および Chroma®セット 41028 あるいは

31001 を推奨しています。fluo-4、fluo-5F、fluo-5N、

および fluo-4FF の検出には Omega セット XF100 あ

るいは XF23、および Chroma セット 41001 あるいは

31001 を推奨いたします。Omega フィルターは

Omega Optical 社（www.omegafilters.com）、Chromaフ ィ ル タ ー は Chroma Technology 社

（www.chroma.com）から提供されています。 レスポンスキャリブレーションは、遊離 Ca2+の正

確な濃度が既知の溶液中における、テトラカルボン

酸型インジケーターの蛍光度を測定して行うことが

できます。Molecular Probes の Calcium Calibration Buffer Kitsには、EGTA Ca2+緩衝 16,17を利用した、種々

の簡便なフォーマットのキャリブレーション溶液が

用意されています。イオン解離定数（Kd）は、以下

の式を用いて算出してください。

特性

基底蛍光度 †

刺激型蛍光度 † ‡

増加倍率§

インジケーター/濃度/時間*

蛍光 Ca2インジケーター 4

ここで、Fmin はカルシウム非存在下でのインジケー

ターの蛍光度を、Fmax はカルシウム飽和時のインジ

ケーターの蛍光度を、そして F は中間のカルシウム

濃度における蛍光度を表します。Kd が既知の場合、

同式を用いて測定値 F から実験サンプルの[Ca2+]free

が得られます。 蛍光インジケーターのカルシウム結合特性および

分光学的特性が、細胞環境によって極めて顕著に異

なり得るという事実を認識することは重要です。例

えば、通常のインジケーターおよび Ca2+濃度条件下

において、核質内での fluo-3 の蛍光度は、細胞質内

の2倍であることが知られています 18。さらに、fluo-3や fluo-4 のような BAPTA 型のインジケーターは、

種々の重金属陽イオン（例えば、Mn2+、Zn2+、Pb2+)と、Ca2+よりも著しく高い親和性で結合します。カ

ルシウム測定におけるこれら重金属イオンの存在に

よる摂動は、重金属選択性キレーターである TPEN（T1210）を用いて制御することが可能です 19。細胞

内インジケーターの in situ レスポンスキャリブレー

ションでは、通常 in vitro 実験での結果より有意に高

い Kd値が得られます 10。in situ キャリブレーション

は、ローディングした細胞を A-23187 (A1493)や4-bromo A-23187 (B1494)の様なイオノフォア、ある

いはイオノマイシン（I24222）の存在下で、コント

ロールされた Ca2+バッファーに曝露することにより

行います 15。イオノフォアの存在下で、2 mM の Mn2+

を細胞外溶媒に加えることにより、細胞内インジケ

ーターを Mn2+で飽和させるという代替方法も使用

できます 12,20。この場合、Mn2+で飽和したインジケ

ーターの蛍光度（FMn）との既知の数式関係から Fmin

および Fmax を算出します（注 B）。 細胞内インジケーター濃度のばらつきによって、

細胞間の Ca2+非依存性の蛍光度に有意な差が存在す

ると、fluo-3、fluo-4、および一連のインジケーター

を用いた Ca2+の定量測定の障害となります。Ca2+結

合によるスペクトルシフトが存在しないため、これ

らのばらつきをレシオメトリック検出法で除外する

ことは不可能です 21。この問題は、スペクトル的に

差のある一対のインジケーター（通常 fluo-3 と Fura Red™）を、両インジケーターの相対的な細胞内濃度

が細胞間で一定になる様に、細胞に同時にローディ

ングすることで解決されます 22,23。時間に応じたCa2+

の変化を、別途に求めた Ca2+の基底濃度（刺激前濃

度）に対して、キャリブレーションすることができ

ます 24。 ハイスループットスクリーニング

96ウェルおよび 384ウェルのマイクロプレートを

用いた細胞内 Ca2+測定は、ハイスループット薬理学

的スクリーニングには欠かせないツールです 8,25,26。

マイクロプレートウェル内の細胞サンプルの AM エ

ステル型インジケーターによるローディングは、本

稿の細胞ローディングのガイドラインに記載された

方法と基本的には同様の方法によって行われます。

Molecular Devices の FLIPR™（Fluorometric Imaging Plate Reader）システムにおける fluo-4 および fluo-3を用いた測定値の同時比較から、fluo-4 は形質転換

CHO 細胞内でのカルバコール刺激による Ca2+活性

に相当する蛍光反応を、fluo-3 の半分のローディン

グ濃度およびインキュベーション時間で達成するこ

とが示されています。fluo-3 AM を直接 fluo-4 AM に

置き換えると（即ち、同一のローディング法を用い

ると）蛍光シグナルは少なくとも 2 倍に増加します

（表 2）。 チオール反応 チオール反応性 fluo-4 iodoacetamide に関する反応

条件は、製品情報シート Thiol-Reactive Probes, mp00003 に記載されています。当該文献のコピーは、

当社のウェブサイト（probes.invitrogen.com）、カスタ

マーサービス、あるいはテクニカルサービスから入

手可能です。 注 [A] 付着した培養液はローディングのために取り

除く必要はありません。 [B] 本法のアプリケーションを記載した文献では、

一般に fluo-3 においては FMn = Fmax/5 および

Fmax/Fmin = 40 と仮定しています。一方、現在の

生産バッチを用いると、一般に Fmax/Fmin は、100を超える値が得られています（表 1）10。

蛍光 Ca2インジケーター 5

製品リスト 現在の価格は、当社のウェブサイトあるいは当社カスタマーサービス部から入手いただけます。 カタログ番号 製品名 サイズ

蛍光 Ca2インジケーター 6