HROMATOGRAFIJA

SEPARACIONE TEHNIKE -razdvajanje jedne kompomente iz višekomponentnog sistema taloženje i ceđenje destilacija kristalizacija ekstrakcija centrifugiranje hromatografske tehnike

HROMATOGRAFIJA različita raspodela komponenti između dve faze od

kojih je jedna pokretna (mobilna), a druga nepokretna (stacionarna);

komponente se zadržavaju u nepokretnoj, odnosno pokretnoj fazi različito vreme i kreću se kroz sistem različitim brzinama;

posle izvesnog vremena komponente se razdvajaju, pri čemu komponente koje su više vremena u nepokretnoj fazi putuju sporije i obrnuto.

Princip razdvajanja

Razdvajanje komponenata smeše pomoću dve faze: nepokretne (stacionarne) i pokretne (mobilne) na osnovu različitog afiniteta komponenata prema stacionarnoj i mobilnoj fazi

Nernstov zakon raspodele: koeficijent raspodele, K= cs/cm

K zavisi od prirode supstance, stac. i mob. faze i temperature, a ne zavisi od koncentracije

FAZE

NEPOKRETNA FAZA ⇒ čvrsta ili tečna naneta na čvrst nosač

POKRETNA FAZA ⇒ gasovita ili tečna

HROMATOGRAFIJA - PODELA

hromatografija

adsorpciona podeona

gasna tečna gasna tečna

tečna gas

Stacionarna faza: čvrsta tečna

Mobilna faza: gas tečna

PRINCIP RAZDVAJANJA

Adsorpcione – različita, reverzibilna adsorpcija komponenti na nepokretnoj fazi

Podeone – delimično, selektivno rastvaranje komponenti u nepokretnoj fazi

HROMATOGRAFIJA

Ruski botaničar Cvet otkrio je princip razdvajanja pigmenta iz lišća primenom adsorpcije

1903. izložio je svoje otkriće Biološkom društvu Varšavskog udruženja prirodnih nauka

Zeleni hlorofil nije samo zelen i nije samo hlorofil!

HROMATOGRAFIJA u koloni

Preparativna hromatografija u koloni

U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač

Preparativna hromatografija u koloni

U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač

Preparativna hromatografija u koloni

U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač

Preparativna hromatografija u koloni

U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač

Analitička hromatografija u koloni

Preparativna hromatografija

Gasna hromatografija (Gas Chromatography - GC)

Pokretna faza ⇒ gas Nepokretna faza ⇒

tečnost naneta na čvrst nosač

Princip ⇒ podeona hromatografija (najrastvorljivije komponente najsporije putuju)

Osnovni delovi GC

Izvor gasa nosača sa regulatorom pritiska i protoka

Injektor (sistem za unošenje uzorka) Hromatografska kolona u termostatu Detektor Sistem za registraciju signala iz

detektora (računar i pisač)

Gasni hromatograf (GC)

Gasni hromatograf – princip rada

pritisak gasa se smanjuje pomoću regulatora pritiska gas ulazi u komoru za ubrizgavanje uzorka koja se nalazi na

povišenoj temparaturi u komoru se, pomoću šprica, ubrizgava uzorak koji može biti tečan

ili gasovit uzorak trenutno isparava i biva ponesen u struji gasa nosioca cela smeša ulazi u kolonu u koloni se nalazi punjenje koje predstavlja čvrst nosač na koji je

naneta tečna faza u koloni dolazi do raspodele komponenti između gasne i tečne

faze, prema KOEFICIJENTU RASPODELE K za svaku komponentu postoji odgovarajući koeficijent raspodele,

jer je rastvorljivost različita

Pokretna faza u GC

Izbor gasa zavisi od tipa detektora He H2 N2

Injektor -komora za ubrizgavanje uzorka

KOMORA ZA UBRIZGAVANJE UZORKA

uzorak mora trenutno da ispari temperatura komore mora biti viša od temperature

ključanja najneisparljivije komponente obično je temperatura komore za 50oC viša od

temperature kolone, da proces ne bi bio povratan ako uzorak ne ispari trenutno, dolazi do razvlačenja

pikova količine uzorka su 1-50 µl

Kolone za GC

Kolone - pakovane (punjene) i kapilarne

1-5 m 10-150 m

KOLONA

spiralno savijena kraća (staklena) ili duža (metalna) cev ako je metalna, napravljena je od nerđajućeg čelika,

bakra ili aluminijuma optimalna dužina je 70cm do 2m savijene su spiralno radi uštede u prostoru efikasnost kolone raste sa njenom dužinom, ali se otpor

povećava, tako da se mora naći optimalna dužina analitičke kolone su duže i uže (φ=6mm) preparativne kolone su kraće i šire (φ do 20mm)

KOLONA

analitičke kolone su namenjene hemijskoj analizi kod preparativnih kolona cilj je prolaz što više uzorka

kroz kolonu kako bi se dobilo potrebno jedinjenje u koloni se nalazi punjenje čvrstog nosača na koji je

naneta tečna faza nosač se meša sa određenom količinom tečne faze

rastvorene u pogodnom rastvaraču (pentan, aceton, CH2Cl2)

blagim zagrevanjem rastvarač otparava

Osobine čvrstog nosača

velika specifična površina (1m2/g) hemijska inertnost dobro prijanjanje tečne faze termička stabilnost mehanička čvrstoća dobijanje u vidu ravnomernih okruglih čestica često se koristi diatomejska zemlja (87% SiO2,

Fe2O3, Al2O3, CaO, K2O, H2O) – porozan materijal

Osobine i izbor tečne faze

neisparljiva na radnoj temperaturi termički stabilna posedovanje odgovarajućeg koeficijenta raspodele K za

komponente u uzorku hemijska inertnost prema analiziranoj supstanci (ako

reaguje, to mora biti brzo i reverzibilno) od tečne faze zavisi uspešnost razdvajanja uzorak se mora rastvarati u tečnoj fazi («Slično se u

sličnom rastvara.») izbor se vrši na osnovu polarnosti (standard skvalen

C30H50 ima polarnost 0)

Stacionarne faze

Stacionarnu fazu karakteriše:

• Polarnost • Maksimalna dozvoljena temperatura

Otvorene (kapilarne) kolone

nemaju čvrsti nosač, već je tečna faza naneta na zidove kolone

uske staklene cevi φ = 0,25-1,00 mm dužina 30-300 m visoka moć razlaganja je posledica dužine kolone

(nema otpora protoku) brze analize potrebne su male količine uzoraka vrlo su efikasne u razdvajanju

PRINCIP RAZDVAJANJA

Podeona hromatografija ⇒ slično se u sličnom rastvara

komponente putuju kroz sistem samo kada se nalaze u pokretnoj fazi

najrastvorljivija komponenta najduže putuje, jer je najduže u nepokretnoj fazi

razdvojene komponente stižu do detektora, što se registruje u formi signala koji se zove PIK

Rezolucija

Hromatogram

x-osa ⇒ RETENCIONO VREME – vreme zadržavanja

Na osnovu retencionog vremena identifikujemo jedinjenja.

Na osnovu površine pikova vrši se kvantitativna analiza.

Uticaj temperature

na nižoj temperaturi rastvorljivost je veća i razdvajanje je efikasnije

viša temperatura potrebna je da bi sve komponente iz uzorka bile u gasovitoj fazi i da vreme zadržavanja u koloni ne bi bilo previše dugo

na povišenoj temperaturi slabije je rastvaranje i postoji mogućnost otparavanja tečne faze

tipičan opseg: 50-300oC

Programiranje temperature

ako analizirana smeša obuhvata komponente sa velikim rasponom temperatura ključanja, tada bi prvi pikovi bili vrlo uski, poslednji vrlo široki, a vreme analize bilo bi veoma dugo

zato u ovakvim slučajevima rad pri izotermskim uslovima nije pogodan

tada se primenjuje programiranje temperature, tj. povećavanje u određenim vremenskim intervalima i razmaci između pikova su približno jednaki, a vreme analize je kraće

Program t

Svojstva detektora za GC

Dobra osetljivost Velika stabilnost i reproduktivnost Linearan odgovor za širok opseg konc. Temperaturski opseg 20-400 0C Brz odgovor koji ne zavisi od protoka Lak za rukovanje Nedestruktivan

Detektori za GC

Na bazi termičke provodnosti (TCD) Plameno-jonizujući (FID) Merenje elektronskog zahvata (ECD) Plameno-fotometrijski (FPD) Atomski-emisioni (AED) Foto-jonizacioni (PID)

Detektor na bazi termičke provodnosti (katarometar)

katarometar je jednostavan i univerzalan (primenljiv na sve supstance);

nije destruktivan; manje je osetljiv od drugog tipa; odgovor detektora je proporcionalan

koncentraciji.

Detektor na bazi termičke provodnosti

termičke provodljivosti gasa-nosioca i komponenti iz uzorka treba da budu što različitije

organska jedinjenja imaju bliske vrednosti termičke provodljivosti

N2 je blizak organskim supstancama, dok su vrednosti H2 i He znatno veće

zato su H2 i He znatno bolji nego N2, kada je u pitanju katarometar

kod N2 je znatno smanjena osetljivost

Detektor na bazi termičke provodnosti (TCD)

Detektor na bazi termičke provodnosti

ceo sistem je termostatiran vlakna se greju električnom strujom do iste temperature kada preko vlakna prelazi gas-nosilac, on hladi vlakno u

zavisnosti od svoje termičke provodljivosti temperatura određuje otpor žice kada kroz vlakna protiče samo gas-nosilac, temperatura i otpor

žice su uravnoteženi kada u struji gasa naiđe uzorak, komponenta koja se nalazi u

uzorku ima različitu termičku provodljivost od gasa-nosioca tada se menja temperatura žice u tom kraku, a time i njen otpor neuravnoteženost otpora dve žice izaziva električni signal koji se

registruje kao pik.

Plameno-jonizujući detektor (FID)

• sagorevanje uzorka u plamenu H2-vazduh

• dobijaju se CHO+ joni u plamenu • joni se kreću ka katodi • broj jona je proporc. broju C

atoma ili molarnoj masi uzorka • ne reaguje na neorganska

jedinjenja uključujući N2, okside azota, H2S, SO2, CO, CO2, H2O, a reaguje na sve organske supstance.

Plameno-jonizujući detektor (FID) gas-nosilac je vodonik plamen funkcioniše kao anoda između katode i anode postoji otpor, tj. nema toka struje kada

nema jona koji bi tu struju prenosili smeša vodonika i uzorka dolazi do plamenika i H2 gori u struji

vazduha organska supstanca sagoreva u plamenu, pri čemu se formiraju

joni njihovim kretanjem uspostavlja se struja koja se registruje kao

signal ovaj detektor je veoma osetljiv (10-12 g/ml) skoro je univerzalan mana je što je skup i destruktivan

Idealan detektor –MASENI SPEKTROMETAR Univerzalan (registruje MS spektar) Osetljiv na 1-100 pg jedinjenja Brz (prikupljanje podataka znatno kraće od

vremena eluiranja jedinjenja) Pouzdana kvalitativna analiza (MS i MS/MS) Pouzdana kvantitativna analiza (površina pika)

tR

Rezime - razdvajanje u GC zavisi od:

isparljivosti komponente (isparljivije brže) rastvorljivosti komponente (rastvorljivije sporije) polarnosti komponente i kolone (polarnije sporije) temperature kolone (veća temperatura-brže) brzine gasa (optimalna brzina) dužine kolone (duža kolona-duže putovanje)

PRIMENA GC

razdvajanje kvalitativna analiza kvantitativna analiza preparativni rad prečišćavanje (kontrola čistoće)

Kvalitativna analiza

osnov za identifikaciju je retenciono vreme retenciono vreme je karakteristično za

određenu supstancu u određenoj koloni ako dve supstance imaju isto ili slično

retenciono vreme, treba analizu proveriti sa drugim tipom kolone

pouzdanija metoda za identifikaciju ⇒ masena spektrometrija

Kvantitativna analiza površina ispod pika proporcionalna je koncentraciji

odgovarajuće supstance najpre se formira kalibracioni dijagram

Preparativni rad i prečišćavanje (Kontrola čistoće)

cilj ⇒ dobijanje čiste komponente za dalji rad kada se pojavi pik željene komponente, ona se na

izlazu, kroz staklenu cevčicu, uvodi u suvi led i kondenzuje se