hromatografija - kolona i tanki sloj
TRANSCRIPT
![Page 1: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/1.jpg)
Hromatografija – kolona i tanki sloj
1. Adsorpciona hromatografija u koloni – spektrofotometrijsko odreñivanje β-karotena izdvojenog kolonskom adsorpcionom hromatografijom
-TEORETSKI PRINCIPI VEŽBE: str. 1-40 udžbenika
-PRAKTIČNI DEO: str. 45 udžbenika, uz modifikacije (modifikovana priprema kolone, upotreba rastvarača itd. – pogledati u svesci!)
-vid hromatografije: adsorpcioni
-tehnika: kolonska
2. Razdvajanje prehrambenih boja hromatografijom na tankom sloju
-TEORETSKI PRINCIPI VEŽBE : str. 1-40 udžbenika
-PRAKTIČNI DEO: sveska
-vid hromatografije: adsorpcioni
-tehnika: laminarna
![Page 2: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/2.jpg)
Adsorpciona hromatografija u koloni
Staklena kolona
Ventil koji otvara/zatvara kolonu
U suženi deo kolone stavi se parče vate, pa kolut filter papira, da bi se zadržala stacionarna faza, a istovremeno propustila tečna, mobilna faza sa komponentama koje se razdvajaju
Sipanje stacionarne faze u kolonu, pomoću špatule
Priprema kolone
![Page 3: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/3.jpg)
Priprema kolone
Vata
Kolut filter hartije
Al 2O3:Na2SO4:MgO = 3:2:1Adsorbens (stacionarna faza – u ovom slučaju polarna) u visini od ~ 5 cm
Od gore se stavi kolut filter hartije, pa se sve sabije staklenim štapićem
![Page 4: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/4.jpg)
Priprema kolone
Kroz kolonu se propusti čist n-heksan , izrazito nepolarni rastvarač, da proñe kroz celu visinu kolone. Nivo n-heksana se na kraju ostavi na nekoliko mm iznad gornje površine adsorbensa. Ovim postupkom se dodatno sabija i homogenizuje adsorbens, i istiskuju se mehurići vazduha.
2-3mm
![Page 5: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/5.jpg)
Priprema uzorka
U cilju oduzimanja vode iz biljnog materijala, maceriranje se vrši uz dodatak bezvodnog Na2SO4. Voda bi se zbog svoje polarnosti, vezivala za polarnu stacionarnu fazu, zasitila je i istiskivala komponente koje su adsorbovane.
Avan
tučak
Špatula sa praškastim bezvodnim Na2SO4
Biljni materijal odreñene mase (g), iz koga se izoluje β-karoten
![Page 6: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/6.jpg)
Bezvodni Na 2SO4 Polarni adsorbens, stacionarna faza
za pripremu kolone
![Page 7: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/7.jpg)
Priprema uzorka
Izgled biljnog materijala nakon maceriranja. Usled prisustva praškastog, bezvodnog Na2SO4 koji vezuje vodu, pripremljeni uzorak dobija izgled zelenog rastresitog praška
![Page 8: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/8.jpg)
Nanošenje uzorkana vrh kolone
Pripremljeni biljni uzorak se sipa na vrh pripremljene kolone
![Page 9: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/9.jpg)
Razvijanje (eluiranje)
Kao rastvarač (mobilna faza –nepolarna), koristi se 2%-ni aceton u n-heksanu
Hlorofili imaju polarne grupe, pa se vezuju za vrh polarnog adsorbensa (stacionarne faze). U mobilnoj nepolarnoj fazi se slabije rastvaraju od karotena, pa se ne pomeraju sa vrha kolone
β-karoten
β-karoten je nepolaran molekul, bolje se rastvara u nepolarnoj mobilnoj fazi (kreće se sa njom), a ne vezuje se za polarni adsorbens (stacionarnu fazu). Stoga se brže kreće kroz kolonu i izdvaja se u vidu narandžastog prstena
![Page 10: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/10.jpg)
β-karoten se skuplja u normalni sud od 100 ml koji je pričvršćen za donji kraj kolone preko šlifovanog kraja i ventila. Izdvajanje β-karotena se ubrzava primenom vakuum pumpe. Kada je kompletna narandžasta frakcija dobro isprana, sav β-karoten je izdvojen u normalnom sudu. Sud se dopuni do oznake od 100 ml (sa mobilnom fazom koja je korišćena za razdvajanje)
Sav β-karoten iz poznate mase biljnog materijala sada se nalazi rastvoren u 100 ml 2%-nog acetona u n-heksanu. Ovaj ekstrakt se sipa u kivetu spektrofotometra, očita se apsorbanca (na maksimumu za β-karoten u datom rastvaraču, merenjem spektra odredi se talasna dužina maksimuma apsorpcije) i izračuna koncentracija β-karotena prema formuli
Razblaživanje ekstrakta na poznatu V
![Page 11: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/11.jpg)
Primer zna čaja izbora rastvara ča (mobilne faze) za
razdvajanje komponenti
Korišćenjem čistog acetona kao mobilne faze, koji značajno jače rastvara hlorofile (aceton je polarniji od n-heksana), dolazi i do pomeranja hlorofila kroz kolonu – vidi se zelena zona pigmenata koji su istisnuti sa adsorbensa i kreću se sa mobilnom fazom. Da je aceton primenjen odmah, ne bi došlo do razdvajanja β-karotena, jer bi se rastvorili i hlorofili, tj. svi pigmenti bi zajedno izašli iz kolone.
Prsten hlorofila
Hlorofili izlaze iz kolone
Čist aceton
![Page 12: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/12.jpg)
Adsorpciona hromatografija na tankom sloju
Standardne prehrambene boje (9 kom.) koje se koriste u prehrambenoj industriji za farbanje različitih vrsta namirnica
![Page 13: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/13.jpg)
Prehrambene arome (uzroci). Cilj hromatografije je da se odredi koje od 9 standardnih boja su upotrebljene za bojenje ovih aroma
![Page 14: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/14.jpg)
Kapilara za ručno nanošenje uzoraka na hromatografsku ploču
![Page 15: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/15.jpg)
Adsorpciona hromatografija na tankom sloju
Staklena ploča sa nanesenim adsorbensom (silika gel-G), stacionarnom fazom
Imaginarna startna linija na koju se nanose uzorci
9 standardnih prehrambenih
bojaUzorci-arome
![Page 16: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/16.jpg)
Nivo rastvarača u komori za razvijanje treba da omogući kontakt rastvarača sa adsorbensom,
ali da bude ispod startne linije (ne sme da dodiruje nanešene mrlje uzoraka
Rastvarač se postepeno penje uz sloj adsorbensa, rastvara nanešene mrlje uzoraka i nosi ih u većoj ili manjoj meri u zavisnosti karakteristika uzoraka
Rastvarač (mobilna faza):
etanol (96%) : amonijak (25%) =
9 : 1
Rastvarač mora da bude zatvoren u komori, tako da se i
atmosfera u komori zasiti parama rastvarača.
![Page 17: Hromatografija - Kolona i Tanki Sloj](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050704/55cf94d7550346f57ba4c308/html5/thumbnails/17.jpg)
Standardi
Nakon sat vremena, analizira se razvijeni hromatogram:
Hromatogram: na osnovu računanja Rf vrednosti vrši se poreñenje standarda sa nepoznatim uzorcima i vrši identifikacija standarda koji su upotrebljeni za bojenje aroma. U ovm slučaju, pošto su uzorci vidljivi,
identifikacija je moguća i vizuelno.