visokopritisna tečna-hromatografija

VISOKOPRITISNA TEČNA HROMATOGRAFIJAHigh Pressure Liquid Chromatography-HPLC hromatografija

Potreba za ubrzanjem procesa razdvajanja i određivanja uz istovremeno povećanje efikasnosti dovelo je do razvoja tehnike koja je prema uslovima rada dobila najčešći naziv:

- Visokoperformantna tečna hromatografija (HPLC-High Performance Liquid Chromatography)

-Tečna hromatografija velikih brzina (HSLC-High Speed Liquid Chromatography)

-Visokoefikasna tečna hromatografija (HELC-High Effiency Liquid Chromatography)

VISOKOPRITISNA TEČNA HROMATOGRAFIJA High Pressure Liquid Chromatography-HPLC hromatografija

HPLC je:

Brza: mobilna faza (rastvarač) se kreće pod dejstvom visokog pritiska (~ 300 bara)

Efikasna: male čestice kojim se pakuje kolona imaju veliku specifičnu površinu za interakciju između stacionarne faze i molekula koje se razdvajaju

Osjetljiva: detektuju se vrlo male koncentracije


Ovaj vid hromatografske analize može da se izvodi kao: podeona, adsorpciona, jonoizmjenjivačka, hromatografija na molekulskim sitima (rjeđe) i afinitetna hromatografija (rjeđe)

Ovaj vid hromatografske analize izvodi se samo kao kolonska tehnika

Analizirani uzorci – organska jedinjenja (i teško ispraljiva)


Kako je HPLC kolonska tehnika hromatografije, nameće se poređenje sa standardnom kolonskom hromatografijom (tabela 1)

Tabela 1. Osnovne osobine standardne kolonske tehnike i VPTH

Veličina Standardna kolonska tehnika

VPTH

Brzina mobilne fazeu (cm/s)

0,05 1

Prečnik čestica d (μm) 100 1-10

Zapremina probe V (μl) 1000-50000 10-50

Pad pritiska u koloni∆p (bar)

<1 do 300

Prečnik kolone dk (mm) 20 3

Dužina kolone (mm) 50-100 ~300


HPLC je hromatografska tehnika kod koje je najčešće:

Mobilna faza: tečnost (rastvarač), npr. voda ili organski rastvarači; mora da zadovolji sledeće uslove: - ne mijenja karakteristike kolone - nema primjesa - rastvara uzorak - ima mali viskozitet - kompatibilna sa detektorom

Stacionarna faza: - granulisana čvrsta supstanca - tečnost nanesena kao tanak sloj na granule čvrstog nosača i nerastvorna u tečnosti koja predstavlja mobilnu fazu


Podjela u zavisnosti od polarnosti stacionarne i mobilne faze:

HPLC normalnih faza-stacionarna faza – polarna-Mobilna faza – nepolarna-Uzorak – polaran

-Kolona –punjena polarnim SiO2 ili-Stacionarna faza – npr. voda, trietilglikol,... vezani za SiO2 ili Al2O3

-Mobilna faza – npr. heksan, izopropiletar,...

- uzorak – polarne komponente uzorka se duže zadržavaju na polarnoj stacionarnoj fazi (putuju sporije) nego manje polarne komponente

HPLC reversnih faza-Stacionarna faza – nepolarna- mobilna faza – polarna - uzorak – nepolaran

- kolona – punjena modifikovanim SiO2 (nepolaran) ili- Stacionarna faza – npr. neki ugljikovodonik (npr. n-oktil ili n-oktadevil) vezan za SiO2 -Mobilna faza – npr. voda, metanol, smjesa alkohola i vode,...-Uzorak – nepolarne komponente uzorka manje vremena provode u mobilnoj fazi a više u stacionarnoj fazi; polarne komponente uzorka se duže zadržavaju u mobilnoj fazi (putuju brže) i prve se eluiraju


Hromatografsko razdvajanje reversnih faza

Redosled opadanja polarnosti komponenti:

ŽutaCrvenaPlava


Šematski prikaz HPLC sistema

ŠEMA APARATURE ZA VISOKOPRITISNU TEČNU HROMATOGRAFIJU


R-rezervoar za rastvarač ili eluent (mobilna faza)

F-filter

PU-pumpa visokog pritiska

PO-prigušivač oscilacija

M-manometar

DR-ventil za ispuštanje nepotrebne tečnosti (drain)

T-termostat

PK-pretkolona

K-kolona

I-injektor

D-detektor

A-pojačivač signala

P-pisač


R - rezervora za rastvarač ili eluent (mobilna faza) koji mora biti bez čvrstih suspendovanih čestica i bez rastvorenog gasa; čestice se uklanjaju filtracijom kroz ultrafiltere, dok se rastvoreni gas uklanja ključanjem u vakuumu uz pomoć ultrazvuka ili barbotiranjem helijuma

F – filter služi za uklanjanje slučajno prisutnih suspendovanih čestica prečnika oko 10 µm

PU – pumpa; služi da obezbjedi ulazni pritisak mobilne faze (najčešće između 30-300 bara) uz odgovarajući protok mobilne faze (najčešće oko 1 ml/min); relativno visok ulazni p postiže se pumpama različite konstrukcije, najčešće klipne pumpe

PO – prigušivač oscilacija; pumpe sa naizmjeničnim kretanjem klipa imaju jako veliki nedostatak - pulsiranje


M – manometar za mjerenje ulaznog pritiska

DR – ventil za ispuštanje nepotrebne tečnosti i za uklanjanje gasa iz prethodno opisanih dijelova

T – termostat; ima funkciju samo u slučaju korištenja vida hromatografije na izmjenjivačima jona; u svim ostalim slučajevima kolona je smještena na spoljnoj strani instrumenta i nalazi se na sobnoj temperaturi


I – injektor služi za unošenje uzorka u sistem; najkritičniji dio aparature za HPLC jer treba da omogući uzimanje probe pri visokom unutrašnjem pritisku bez promjene režima strujanja (bez promjene protoka)

pri nižim ulaznim p (do 70 bara) može se koristiti rješenje sa septumom (zaptivena guma na ulazu u injektor) kao kod GH (injekcioni špric)

dok za više p se koristi rješenje kao što je gasna slavina ili petlja (koja se pomjera ručno ili pomoću elektromagneta); može se koristiti rješenje septuma i gasne slavine; zapremina uzorka 10-50 µl

Uzorak se u petlju unosi putem mikrolitarskog šprica tako što se iglom probode zaptivena guma (septum) na ulazu u ijnektor

Prebacivanjem odgovarajućeg ventila, mobilna faza se usmjerava kroz petlju, povlači uzorak sa sobom i unosi ga u kolonu


PK – predkolona; ima iste karakteristike kao i kolona; ranije ona je obezbjeđivala zasićene mobilne faze stacionarnom fazom; danas PK ima zadatak da ukloni sve eventualne nečistoće unijete sa uzorkom i onemogući začepljenje kolone; PK ima dužinu od samo nekoliko cm

K – kolone; najčešće imaju standardne dimenzije 3 mm x 300 m; izrađene su od nerđajućeg čelika ili tantala; na oba kraja imaju specifične navrtke (nut) namijenjen za spajanje kolone sa metalnim kapilarama za dovod i odvod tečnosti (mobilne faze)


D – detektor; služi za detekciju komponente i za prevođenje signala mase (koncentracije) u električni signalA – pojačivač signala; P – pisač ( kod savremenih uređaja računar sa odgovarajućim softverom)Detektor; najprimjenjeniji detektori kod HPLC su:1.UV i VIS detektor (preko 70%)2.Detektori na bazi mjerenja fluorescencije (~15%)3.Detektori na bazi mjerenja indeksa refrakcije (~5%)4.Elektrohemijski detektori (~5%)5.Svi ostali detektori (<5%)


1. UV i VIS detektori mjere apsorbanciju pri konstantnoj talasnoj dužini (ili rasponu talasnih dužina) koristeći protočne kivete kroz koje protiče eluat (rastvarač+komponenta) i eluent (rastvarač).Osjetljivost ovog detektora 10-10g/ml.

2. Detektor na bazi mjerenja indeksa refrakcije, univerzalni detektor, prati razliku indeksa refrakcije mobilne faze prije ulaska i poslije izlaska iz kolone. Osjetljivost oko 10 -7 g/ml. Nedostaci:manja osjetljivost i velika temperaturna zavisnost.

3. Fluorimetrijski detektori-kako većina prirodnih supstanci fluorescira, ovaj detektor ima značajnu primjenu uanalizi prirodnih proizvoda (npr. Vitamina B). Osjetljivost 10 -9 g/ml.

4. Elektrohemijski detektori grade se na različitim principima (konduktometrija, polarografija, voltametrija, ...).Osjetljivost 10-8 g/ml, temperaturna zavisnost 1,5-2%.Pomoću njih se prije svega detektuju supstance koje su jonogene ili mogu da reaguju sa radnim elektrodama različitih osobina.

HROMATOGRAM

Kvalitativna analiza – retenciono vrijeme (tR) ili retenciona zapremina (VR)

Kvantitativna analiza – površina ispod pika, koja se može mjeriti geometrijski (približno izračunavanje) i automatski (elektronski integrator)

-Razdvajanje i određivanje alkaloida kofein, morfin, heroin, prokain, kokain,...

-Analitika lijekova – određivanje sadržaja u farmaceutski doziranim oblicima

-Biohemija – analiza materijala biološkog porijekla; urin i žučna kiselina, određivanje sadržaja lijekova u krvi, plazmi, urinu,...

-Toksikološka hemija – određivanje alkohola u krvi

-Sanitarna hemija – analiza hrane

Fotografija aparata

ZADACI

1. Neka smjesa spojeva stavljena je u Erlenmajerovu tikvicu u kojoj je bilo 6 ml silikagela i 40 ml rastvarača sa 100 mg neisparljivog spoja. Nakon miješanja smjesa je ostavljena da stoji neko vrijeme, a onda je iz smjese uzet alikvot od 10 ml koji je potom uparen do suvog. Ostatak je izvagan i masa je iznosila 12 mg. Izračunati koeficijent raspodjele, K=cs/cm spoja u ovom eksperimentu.

RAD: -u ravnotežnim uslovima eluens (mobilna faza) sadrži: 12 x 40/10 = 48,0 mg spoja - u ravnotežnim uslovima stacionarna faza sadrži: 100 – 48 = 52,0 mg spoja - K predstavlja omjer masa u 1 ml svake od faza u ravnoteži, pa je: K = (52/6)/(48/40) = 7,2

ZADACI2. Sledeći podaci odgovaraju za podeonu hromatografiju:

Na hromatogramu uzorka (analizirane smjese) sa komponentama A, B, C i D mogu se očitati sledeći podaci:

Izračunati: a) broj tavana (N) za svaki pik; b) srednju vrijednost standardnog odstupanja za N; c) visinu tavana (H) za kolonu

Dužina kolone 24,7 cm

Brzina protoka 0,313 ml/min.

Vm 1,37 ml

Vs 0,164 ml

Vrijeme zadržavanja

(min.)

Širina pika (min.)

nezadržavani 3,1 -

A 5,4 0,41

B 13,3 1,07

C 14,1 1,16

D 21,6 1.72

ZADACI

Rad:a)

252331,252372,1

6,2116

236497,236316,1

1,1416

247204,247207,1

3,1316

27765,277541,04,516

16

2

2

2

2

2

D

C

B

A

R

N

N

N

N

wtN

253475,25334

4

1 i

iNN

2776 2776-2534=242 58564

2472 -62 3844

2364 -170 28900

2523 -11 121

iN NNi 2)( NN i

1752534

17557,17414

914291

2

Nn

NNs i

b)

914292 NN i

c) cmcmNLH 0097,0

25347,24

ZADACI

3. Iz hromatograma smjese butilnih alkohola (korekcije osjetljivosti detektora dobijene su u odvojenim eksperimentima sa poznatim količinama čistih alkohola) dobijeni su sledeći podaci o površinama:

Odredite sastav analizirane smjeseRad:

Alkohol Površ. pika (cm²)

Faktor odziva detektora

Redukovana površina

(cm²)

n-butil 2,74 0,603 4,54=2,74/0,603

i-butil 7,61 0,530 14,36

s-butil 3,19 0,667 4,78

t-butil 1,66 0,681 2,44

Σ= 26,12

%0,910012,26/44,2%

%0,1810012,26/78,4%%0,5510012,26/36,14%%45,1710012,26/54,4%

xtBxsBxiBxnB

100 %

visokopritisna tečna-hromatografija

Technology