1

HHROMATOGRAFIJA ROMATOGRAFIJA U ANALIZI I KONTROLI U ANALIZI I KONTROLI

LEKOVALEKOVA

HHROMATOGRAFIJA ROMATOGRAFIJA U ANALIZI I KONTROLI U ANALIZI I KONTROLI

LEKOVALEKOVAMira L. ZečevićMira L. Zečević

mzecevic@pharmacy.bg.ac.yu

2

Separacione metode analize

3

Razdvajanje

KomponenteSmeša

Analitička Identifikacija Određivanje Preparativna Koncentrisanje Prečišćavanje

Šta je hromatografija?

Hromatografija je fizičko-hemijska metoda separaciona pre svega, a sliži u ....

cilj

4

… razdvajanje komponenata se

postiže procesom stalne raspodele

molekula ili jona između pokretne

(mobilne) i neopokretne (stac.) faze.

5

prema fizičkoj prirodi mobilne i stacionarne faze,

prema obliku stacionarne faze,

prema mehanizmu razdvajanja i

prema tehnici rada

Podela hromatografskih metoda

6

Prema fizičkoj prirodi mobilne i stacionarne faze

stacionarna faza mobilna faza

čvrsta tečna

čvrsta gas

tečna tečna

tečna gas

7

… nezavisno od agregatnog stanja pojedinih faza

ili prirode sila koje prouzrokuju razdvajanje…

a) kolonska hr. (gasna, tečna i hromatografija sa

jonskim izmenjivačima)

b) planarna hr. (papirna, tankoslojna i elektroforeza)

Prema obliku stacionarne faze

8

Hromatografija se zasniva na različitim

ravnotežnim procesima (mehanizmima):

adsorpciji (adsorpciona hr.)

različitoj rastvorljivosti (particiona ili podeona hr.)

jonskoj izmeni (jonoizmenjivačka hr.) i

penetraciji kroz pore razl. vel. (gel ekskluziona hr.)

Prema mehanizmima razdvajanja:

9

Adsorpcija - interakcija ili vezivanje komponenti

uzorka na čvrstoj površini (na aktivnim mestima).

adsorpcija desorpcija

raspodela (razdvajanje)

Apsorpcija-Particija-(raspodela)-proces

raspodeljivanja, pri čemu komp. uzorka grade

homogene rastvore u svakoj od faza.

10

Jonska izmena - ravnotežna reakcija

stehiometrijske izmene jona između jona

fiksiranih za smolu i jona u rastvoru.

Penetracija kroz pore - ekskluzija

stac. faza je čvrsta porozna supstanca, najčešće gel

solvatisani molekuli većeg promera od pora ne

penetriraju kroz gel, a manji penetriraju

brzinom zavisnom od veličine

(gel-filtraciona ili gel-ekskluziona hr.)

11

hromatografija eluiranjem

Eluacija – proces u kome mobilna faza ispira sastojke

sa stacionarne faze.

Eluens – rastvarač (ili smeša) koji nosi komponente

smeše kroz stacionarnu fazu.

Eluat – rastvor koji izlazi iz kolone.

Prema tehnici rada

12

hromatografija istiskivanjem

… na stacionarnu fazu se nanosi rastvor uzorka, a zatim

dodaje rastvor pogodne supstance koja istiskuje

komponente uzorka i tako ubrzava njihovo kretanje.

frontalna analiza

… na stacionarnu fazu se stalno dodaje rastvor

uzorka tako da se samo komponenta koja se najbrže

kreće dobija u čistom stanju.

13

Adsorpciona hromatografija

• Tečno-čvrsta (hrom. na koloni i TLC)

• Gasno-čvrsta (GC)• Jonoizmenjivačka• Gel filtracija• HPLC

14

Adsorbciona hromatografija- Koeficijent

raspodele

Koeficijent raspodele

m

s

c

cK

cs – količina adsorbovane supst. po 1g stacionarne faze cm – koncentracija supstance u mobilnoj fazi

Linearna adsorpcina izoterma I dinamička ravnoteža

15

u idealnom slučaju K je const. u širokom opsegu

koncentracija – linearna hr. - Slika 1 (b) – simetričan pik

u praksi linearnost postoji samo sa nižim koncentracijama

supst. Nelinearnost K - Slika 1 (a) i (c)

(a) (b) (c)

k-nije konstantan: Cm›Cs, asimet.pik

k-nije konstantan

Cs›Cm, asimet.pik

k- konstantan

Cm=Cs

16

Kolonska hromatografija

tečna hromatografija stac. f. smeštena u cevi (koloni),

primenjena tehnika eluiranje

kretanje mobilne faze: pod uticajem zemljine teže

ili pod p

preparativna i analitička - kolone

17

Slika 2 - (a) Razdvajanje

smeše sastojaka A i B

eluacionom hrom. na koloni

(b) Izlazni zapis odgovora

detektora na različitim

stupnjevima eluacije

brzina kretanja komponenti = f(koeficijenti raspodele)

18

U osnovi hromatografskog razdvajanja je

razlika u osobinama komponenti smeše što

uslovljava kretanje različitim brzinama i

različitu raspodelu u stacionarnoj i mobilnoj

fazi.

... po kinetičkoj teoriji!

19

• K = 1, (50% supst. U mf i 50% supst. U sf.

• K =9, 90% supst. U sf. A 10% u mf.

• Supstanca sa većim K se zadržava duže u koloni

20

Da bi se supst. uspešno razdvajale neophodna je

dovoljna razlika u K dve supstance koji pokazuje

afinitet supstanci prema stacionarnoj fazi!

stepen adsorpcije zavisi od gustine i jačine aktivnih

mesta na površini adsorbensa kao i od veličine

površine

adsorpcija desorpcija

dinamička ravnoteža - raspodela između faza

21

Često se sve supstance ne mogu eluirati jednim

rastvaračem; drugi rastvarač ili smeše povećavaju

snagu eluacije!

razdvajanje (zone ili trake)..…analiza - detekcija

vizuelno, IR, VIS, UV spektrofotometrija, MS, NMR

intenzitet signala = f(koncentracija komponente)

povećanje pređenog puta bolje razdvajanje

povećanje pređenog puta širenje traka

(ne može se izbeći!)

22

Protok m.f. pospešuje razdvajanje traka i ono je brže od

njihovog širenja. Komponente se uspešno razdvajaju, pod

uslovom da je kolona dovoljno duga, tj. da ima dovoljan

broj teorijskih platoa. “Sposobnost” kolone da daje uske i oštre pikova

efikasnost kolone

broja teorijskih platoa (N)broja teorijskih platoa (N)visina ekvivalentna teorijskom platou (HEPT) visina ekvivalentna teorijskom platou (HEPT) ili (H)ili (H)redukovana visina hredukovana visina hasimetrija pika (As)asimetrija pika (As)

23

a površina pika kvantifikacija

kalibraciona kriva za svaku komponentu

sastav standarda približan sastavu uzorka

kontrolisani eksperimentalni uslovi

sertifikovani standardni materijali

metoda unutrašnjeg standarda

položaj pika detekcija -identifikacija

24

Podeona hromatografija

• Tečno-tečna (hrom. na papiru,TLC)

• HPLC (na koloni)• GC

25

Podeona hromatografija –

koeficijent raspodele• Razdvajanje na osnovu

različite rastvorljivosti komponenata smeše u dve tečne faze koje se ne mešaju - definisano podeonim koeficijentom

• Efikasnost i brzina razdvajanja zavisi od broja teorijskih platoa sf.

26

• Mehanizam interakcije između sf i komponente nije sasvim definisan.

• Moguće su sve međumolekulske sile: Van Der Waalsove, dipol-dipol, jon-jon, jon-dipol, H-veza, što znači da je osim različite rastvorljivosti prisutan i

• proces adsorpcije.