TRANSFECCIÓN

Ingeniería de Productos BiológicosUnidad Profesional Interdisciplinaria de Ingenierías Campus GuanajuatoInstituto Politécnico NacionalM.C. Guillermo Garibay Benítez

La transfección es un procedimiento que introduce ácidos nucleicos hacia las células.

La transfección sirve para estudiar la función de los genes o productos de los genes y producir proteínas recombinantes en células de mamífero.

Transfección estable: el material genético introducido tiene un gen marcador para la selección (transgenes) los cuales son integrados en el genoma huesped y sostienen la expresión incluso después de que la célula huésped se replica.

Transfección transitoria: Estos genes transitoria transfectados solo son expresados por un periodo de tiempo limitado y no son integrados al genoma,

Hay métodos biológicos, químicos y físicos.

El método ideal debe mostrar alta eficiencia de transfección, baja toxicidad de las células, efectos mínimos en la fisiología normal, y además de ser reproducible y fácil de usar

Diagrama de flujo de TransfecciónCultivo de tejidos. Conteo de Células

Resuspender las células en buffer de electroporación

Añadir ácidos nucleicos

Transfectar células

Células en Placa

AnalisisActividad del Gen

Reportero

Western Blot

Microscopía

Citometria de Flujo

PCR de tiempo

real

Expresión de proteína

Expresión de Gen

METODOS BIOLÓGICOS

El método más utilizado es la transfección mediada por virus

Es altamente eficiente, y es fácil de lograr una expresión sostenible de la expresión in vivo de transgenes debido a la naturaleza viral de la integración en el genoma huésped

Vectores Virales

Retrovirus: Virus Murino de Leucemia (MuLV) Virus de Inmunodeficiencia humana

(HIV) Virus limfotrópico de céluas T

humano (HTLV)Virus de ADN: Adenovirus Virus adeno-asociado (AAV) Virus de herpes simple (HSV)

Retrovirus: una clase de virus que puede crear copias de ADN de doble cadena a partir de sus genomas de ARN, estas copias pueden ser integradas en los cromosomas de las células huésped. El HIV es un retrovirus

Adenovirus: Una clase de virus con genomas de ADN de doble cadena que causan infecciones respiratorias, intestinales y de ojos en humanos. El virus del resfriado común es un adenovirusl

Virus adeno-asociados: Una clase de virus pequeño de una sola cadena de ADN que puede insertar su material genético a un sitio específico en el cromosoma 19.

Virus del Herpes simple: Una clase de virus de doble cadena de ADN que infecta un tipo de células en particular, las neuronas.

Vector Viral

Tamaño del Inserto de ADN

Tipo Celular

Expresión Inconveniencias

Retroviral 8 kb Celulas en División

Estable Sitios de inserción al azar

Lentivirus 9 kb Celulas en divisón y sin divisón

Estable Sitios de inserción al azar

Adenovirus 8 kb Celulas en divisón y sin divisón

Transitoria

Altamente inmunogenico

Vector Viral

Tamaño del Inserto de ADN

Tipo Celular

Expresión

Inconveniencias

Virus adeno-asociado (AAV)

5 kb Celulas en divisón y sin divisón

Estable, localización específica de sitio

Requiere la ayuda de un virus auxiliar para crecer, dificultad de remover el virus auxiliar

Virus de Herpes simpléx

30-40 kb

Celulas en divisón y sin divisón

Transitoria

No hay expresión de genes durante la infección latente

Virus Vaccinia

25 kb Celulas en divisón

Transitoria

Potenciales Efectos citopatologicos

El retrovirus murino de leucemia (retrovirus leukemia virus MLV) ha sido usado como un vector viral para establecer expresión sostenible de expresión de transgenes

MLV integra su ADN en el genoma huésped, por lo tanto el ADN integrado es expresado en el huésped.

El ADN del MLV se replica al mismo tiempo que el genoma de la célula huésped

Consecuentemente este se segrega en las células hijas, lo cual permite la expresión sostenible de la expresión del transgen

Desventajas Inmunogenicidad y citotoxicidad. Reacción inflamatoria Inserción de mutaciones, como los

vectores virales se integran en el genoma huésped al azar, esto puede causar una disrupción de genes encargados de suprimir tumores, activar oncogenes o interrumpir genes esenciales

El empaquetamiento del virus tiene un espacio limitado para un gen foráneo y mantener la infectividad

Métodos Químicos

Por lo general utilizan un polimero catiónico: fosfato de calcio, lípido catiónico o un aminoácido catiónico

Los químicos cargados positivamente forman complejos químicos/ácidos nucleicos con ácidos nucleicos cargados negativamente.

Estos complejos cargados positivamente son atraídos a las membranas cargadas negativamente.

EFICIENCIA DE LOS METODOS DE TRANSFECCIÓN QUÍMICOS

Depende: proporción de ácidos

nucleicos/químicos pH de la solución Condiciones de las membranas

celulares

Desventaja: eficiencia de transfección baja (comparada con los métodos de virus)

Ventajas: Baja citotoxicidad, sin mutagénesis, no hay acarreo de ADN extra y sin limitación de tamaño de los ácidos nucleicos

Lipid-Mediated Gene Delivery(Lipofección o Transfección de genes basados en liposomas)

Utiliza lípidos para causar que la célula absorba ADN exógeno.

Transferencia de material genético hacia las células utilizando liposomas, los cuales son vesículas que pueden fusionarse con la membrana celular ya que ambos están hechos de una membrana de fosfolípidos

Ventajas de los Lípidos

Desventajas

Entrega de ácidos nucleicos en una placa de cultivo con alta eficiencia

Facil de usar, pasos mínimos requeridos, adaptable a sistemas de métodos “high throughput”

Utilizar un lípido de alta actividad reducirá el costo del lípido y del ácido nucleico, y logrará resultados efectivos

No aplica para todos los tipos celulares

Fosfato de Calcio Este protocolo involucra el

mezclado del ADN con cloruro de calcio, añadiendo este de una manera controlada a una solución reguladora salina/fosfato, y permitir a la mezcla incubarse a temperatura ambiente.

Este paso genera un precipitado que es dispersado a las células en cultivo.

El precipitado es absorbido por las células vía endocitosis o fagocitosis.

Ventajas Desventajas

Económico. Alta eficiencia

(depende del tipo de célula).

Puede ser aplicado a un amplio intervalo de tipos celulares.

Puede ser usado para transfección transitoria y transfección estable.

Consistencia en el reactivo es crítica para la reproducibilidad.

Pequeños cambios en el pH (+/-0.1) puede compromoter la eficiencia de transformación.

Tamaño y calidad del precipitado son cruciales.

No se puede usar en medio RPMI, debido a la alta concentración de fosfato en el medio

Polímeros Catiónicos

Estos, a diferencia de los lípidos catiónicos no contienen una porción hidrofóbica y son completamente solubles en agua.

Estos tienen la habilidad de condensar mas eficientemente el ADN que los lípidos catiónicos.

DEAE-Dextran

El complejo positivo formado por ADN:polimero forma una asociación cercana con la membrana cargada negativamente.

Desventajas Desventajas

Económico. Fácil de realizar y

rápido. Puede ser aplicado a

una amplia variedad de tipos celulares

Altas concentraciones de DEAE-Dextran pueden ser tóxicas para las células.

Eficiencias de transfección varian con cada tipo celular.

Solo puede ser usada para transfección transitoria.

Métodos Físicos

Microinyección Biobalística Electroporación Transfección basada en laser

Microinyección

Inyección directa de ácidos nucleicos en el citoplasma o núcleos

Este método demanda especialización y es costoso.

Laborioso (una célula a la vez).

Biobalística

Emplea partículas de oro que se conjugan con ácidos nucleicos.

Estos conjugados son “disparados” a recipientes celulares a alta velocidad

Este método es directo y confiable pero causa daño físico a las muestras

1.Precipite el ADN en las partículas de oro2.Cargue el ADN/oro en los tubos3.Rote los tubos para cubrir de ADN/oro en

la superficie interna.4.Corte los tubos en cartuchos5.Cargue los cartuchos en la pistola de

genes6.Entregue el ADN a las células

1. Las partículas de oro recubiertas de ADN (microacarreador) son esparcidas sobre el área central de un disco de plástico fino (macroacarreador).

2. El disco cargado de ADN es colocado en un soporte dentro del equipo.

3. El sistema usa helio de alta presión, liberado por un disco de ruptura y vacío parcial para propulsar el macroacarreador cargado con el microacarreador hacia las células .

4. El macroacarreador es detenido a corta distancia por una pantalla de detención.

5. Las partículas de oro recubiertas de ADN continuan viajando hacia el objetivo para penetrar las células.

6. La cámara de muestra esta sujeta a vacio parcial.

Electroporación

Un pulso eléctrico corto causa una disrupción en la membrana celular y abre poros en la membrana, a través de los cuales los ácidos nucleicos pueden pasar.

Es capaz de transfectar una gran cantidad de células en un periodo corto de tiempo, una vez que las condiciones optimas de electroporación son alcanzadas

1. La electroporación expone a la célula a un campo eléctrico de alta intensidad que desestabiliza temporalmente a la membrana

2. Durante este tiempo la membrana es altamente permeable a moléculas exógenas presentes en el medio

3. El ADN se mueve hacia la célula a través de estos poros.

4. Cuando el campo eléctrico es apagado, los poros de la membrana se resellan, encerrando al ADN dentro de la célula

Ventajas Desventajas

No altera la estructura biológica o de función de las células.

Fácil de realizar. Alta Eficiencia. Puede ser aplicado a

un amplio número de tipos celulares

Mortalidad Celular

Factores que afectan la transfección

En la célula huésped: salud de la célula, cultivo celular

Del material genético: Calidad y cantidad del ADN

Salud Celular

Las células deben de crecer en medio adecuado con todos los factores necesarios

Los cultivos deben estar libres de contaminación

Medio fresco debe ser utilizado si este contiene componentes químicos inestables como timina

Las células deben ser incubadas a 37°C con un porcentaje de CO2 de 5 a 10% y un 100% de humedad relativa

Cultivo Celular

Muy pocas células causan que el cultivo celular crezca pobremente sin contacto el contacto de célula a célula.

Por el contrario, muchas células resultan en inhibición por contacto, haciendo a las células resistentes al consumo de ADN y otras macromoléculas.

Es decir, las células deben ser transfectadas a un 40 a 80% de confluencia.

Cultivo Celular

Las células en división asimilan el ADN mejor.

(El rompimiento y perforación de la membrana nuclear durante la mitosis habilita la entrega nuclear)

Cultivo Celular

El número de pasajes debe de ser bajo (<50)

Las características de las células pueden cambiar con el tiempo con líneas celulares inmortalizadas y las células pueden no responder a las mismas condiciones de transfección.

Calidad y Cantidad del ADN Usar plásmidos de ADN de alta calidad que estén libres de proteína, ARN y químicos para las transfecciones. (La remoción de endotoxinas debe ser parte del procedimiento de preparación).

Por lo general el ADN es suspendido en agua estéril o buffer TE a una concentración final de 0.2-1 mg/mL

La cantidad óptima de ADN puede variar dependiendo del tipo de ADN, método/reactivo de transfección, línea celular y número de células

Bibliografía www.biorad.com/transfection Tae Kyung Kim, James H. Eberwine, Mammalian

Cell Transfection: the present and the future, Anal Bioanal Chem (2010) 397:3173–3178, DOI 10.1007/s00216-010-3821-6

Sophie Mehier-Humbert, Richard H. Guy, Physical methods for gene transfer: Improving the kinetics of gene delivery into cells, Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 733– 753

Jian Yang, Ming Hong Shen, Polyetylene Gycol-Mediated Cell Fusion in Methods in Molecular Biology, vol. 325: Nuclear Reprogramming: Methods and Protocols Edited by: S. Pells © Humana Press Inc., Totowa, NJ