MiraGRDI[A

GENETI^KOIN@ENJERSTVO USLU@BI ^OVJEKA

Geneti~ko in`enjerstvo zauzima va`no mjesto u `ivotu ~o-vjeka. Nakon Mendelove genetike bilja i otkri}a antibioti-ka, ono predstavlja najzna~ajniji razvojni napredak. Pojampokriva {irok raspon promjena geneti~kog materijala (ma-nipuliranje genima na molekularnoj razini) kod `ivih or-ganizama, primjenom modernih metoda molekularne bio-logije. Te su metode revolucionarno uzdignule davno zna-ne procese biotehnologije koja uklju~uje opremanje bio-lo{kih procesa mikroba te biljnih i `ivotinjskih stanica.Biotehnologija je od davnina u slu`bi ~ovjeka (~ovjek pe~ekruh, proizvodi pivo, sir itd.). Metode moderne moleku-larne biologije, naro~ito geneti~ko in`enjerstvo, otvorile sunove mogu}nosti u mnogim industrijama. Primjena gene-ti~kog in`enjerstva vrlo je raznolika i u dana{nje vrijemenezamjenjiva.

1. U medicini se koristi u lije~enju raznih bolesti ljudii `ivotinja:– proizvodnja cjepiva protiv raznih bolesti– proizvodnja ~istih humanih produkata u komercijalnim

koli~inama (inzulin, eritropoetin, hormoni rasta i dr.)– proizvodnja postoje}ih antibiotika pomo}u ekonomi~ni-

jih metoda– proizvodnja novih antibiotika, koji nisu dostupni dru-

gim putem– razvoj dijagnosti~kih kitova– popravak “gre{ke” u genu – genska terapija.

2. U poljoprivredi i sto~arstvu geneti~ko se in`enjer-stvo koristi za proizvodnju jeftinije, kvalitetnije i zdravijehrane:– uzgoj biljaka i `ivotinja pobolj{ane hranjive vrijednosti

za pove}anje `ivotnog standarda– poja~ati osobinu prirodnu za odre|eni organizam (po-

ve}ati brzinu rasta)– proizvesti sjeme biljaka otporno na razne bolesti i kukce,

{to }e smanjiti kori{tenje {tetnih herbicida i pesticida. 43

3. Pro~i{}avanje industrijskih otpada.4. Dobivanje goriva iz otpada.5. Dekontaminacija tla.U ovom ~lanku bit }e opisani neki proteini – humani

produkti, koji se proizvode metodama geneti~kog in`enjer-stva, a primjenjuju se u klini~ke svrhe. Da bi se neki prote-in mogao proizvesti geneti~kim in`enjerstvom, potrebnoje poznavati njegovu primarnu strukturu ili moramo znatigen koji kodira taj protein.

Tehnologija geneti~kog in`enjerstva

Ho}e li `iva stanica obaviti specifi~an i upotrebljiv zadatakna predvi|en i kontroliran na~in, odre|uju njezini gene-ti~ki parametri, odnosno upute sadr`ane u skupini kemij-skih poruka nazvane gen. Gen sadr`i sve informacije u du-gom lancu kemijske molekule, koja odre|uje prirodu orga-nizma (da li je on ameba, drvo, `ivotinja ili ~ovjek), ~ijekarakteristike su individualne. Detaljne geneti~ke informa-cije jedinstvene su za individuu, isklju~uju}i identi~ne bli-zance. Geni se naslje|uju s generacije na generaciju tako dakopija naslje|uje razne osobine od svojih roditelja. Te ke-mijske instrukcije odre|uje kodiraju}i sustav, koji se nalaziu supstanciji nazvanoj deoksiribonukleinska kiselina (DNA).Gen je zapravo segment DNA s porukom kodiranom unjegovoj kemijskoj strukturi. Pojedini geni, kao dijelovilanca DNA, smje{teni su uzdu` lanca te odre|uju karakte-ristike i funkcije pojedinog organizma. Poreme}aji (nedo-staci) pojedinih gena mogu uzrokovati poreme}aje u orga-nizmu i one su korijen raznih geneti~kih bolesti.

Razvoj geneti~kog in`enjerstva omogu}ilo je manipu-liranje specifi~nim genima na molekularnoj razini tako dase koriste laboratorijske procedure na materijalu uzetom iz`ivih organizama. Taj materijal mo`e biti zamijenjen uistom organizmu ili mo`e biti stavljen u neki drugi orga-nizam.

Metodama geneti~kog in`enjerstva mogu}e je uzeti ge-ne iz biljnih i `ivotinjskih stanica i prenijeti ih u mikroor-ganizme (bakterije ili kvasce), koje je lagano uzgojiti u veli-kim koli~inama. Produkti koji su bili dostupni u malimkoli~inama iz biljaka i `ivotinja sada su dostupni u veli-kim koli~inama iz brzorastu}ih mikroorganizama. Te me-tode tako|er omogu}uju da se odr`e odre|ene karakteristi-ke biljnih i `ivotinjskih vrsta. Dakle, `eljeni gen jedne bilj-ke, `ivotinje ili mikroorganizma mo`e biti ugra|en u nekudrugu, nesrodnu vrstu. Metode geneti~kog in`enjerstvaomogu}uju razvoj razli~itih karakteristika znatno br`e iuspje{nije nego {to je to mogu}e posti}i konvencionalnimmetodama.44

Mira Grdi{aGeneti~ko in`enjerstvou slu`bi ~ovjeka

Geneti~ki kod

Da bi se poduzela takva geneti~ka manipulacija, potrebnoje poznavati geneti~ki kod zapisan u molekuli DNA, kojaje dvolan~ana molekula, umotana u spiralu, nazvana uzvoj-nica (helix) (Slika 1). Formirana je od dva lanca nukleoti-da, koji su me|usobno povezani vodikovim vezama iz-me|u baza suprotnih lanaca. Nukleotidi su gra|eni oddu{ikovih baza (purinske: adenin (A) i gvanin (G); pirimi-dinske: timin (T) i citozin (C)), {e}erne komponente (de-oksiriboza u DNA i riboza u RNA) i fosfata. Vodikove ve-ze stvaraju se izme|u komplementarnih baza: A-T i G-C.Svaki gen je segment DNA-lanca koji kodira za odre|eniprotein. Da bi se mogao kontrolirati proces proizvodnjeproteina, potrebno je razumjeti pojedinosti kodiraju}eg su-stava DNA. Takve DNA-molekule sadr`e informacije zasve proteine sintetizirane u stanici.

Slika 1.Struktura DNA: Nukleotidi seve`u i formiraju lanac.Nukleotidi jednog lanca ve`use s nukleotidima drugog lancai formiraju molekulu DNA.Molekule DNA povezane su shistonima – globularnimproteinima. Molekula DNAobi~no je istegnuta, nalik nakonopac sa zrncima, nazvanakromatin. Tijekom dijeljenjastanica kromatin se kondenziratvore}i tjele{ca nazvanakromosomi.

Prepisivanje koda

Da bi do{lo do sinteze proteina, informacija sadr`ana umolekuli DNA (geneti~ki kod) prepisuje se u aminokiseli-ne u proteinima, posredstvom ribonukleinske kiseline –mRNA (Slika 2A). Molekula DNA prvo se odmota, zatimse lanci odvoje i stanica stvara kopiju odgovaraju}ega dije-la DNA u obliku jednolan~ane molekule nazvane mRNA.Tako sintetizirana mRNA putuje do stani~nih organela,tzv. ribosoma, gdje slu`i kao kalup za sintezu proteina (Sli-ka 2B). Geneti~ki kod za sintezu proteina ~ita se iz baza usekvenci mRNA. Svaka sekvenca od 3 baze u lancu DNAjest kemijski kod za jednu aminokiselinu. Za taj kod ve`ese transportna RNA (tRNA), za koju je vezana odre|enaaminokiselina i pomo}u nje se aminokiseline, jedna pojedna, dodaju u protein (Slika 2C). Kodiraju}i sustav jeuniverzalan i bazi~no je isti u svim sisavcima, biljkama imikroorganizmima.

Proteini, sli~no kao i DNA, duga~ke su molekule na-lik na lanac. Sastavljeni su od 20 razli~itih aminokiselina.Proteini su molekule gra|ene od nekoliko desetina do vi{estotina aminokiselina, ali s izrazito mnogo razli~itih fun-kcija. Proteini se presavijaju i umotavaju u nebrojene vari-jacije trodimenzionalnih oblika (Slika 3). Tijelo ~ovjekaposjeduje oko 30.000 razli~itih proteina, koji imaju raznefunkcije u `ivotu ~ovjeka. Njihova funkcija mo`e bitistrukturalna ili fiziolo{ka. Tako hemoglobin ima fizio-lo{ku ulogu prijenosa kisika u organizmu. Aktin i miozinme|usobno djeluju i omogu}uju pokretanje mi{i}a. Inzu-lin kontrolira uzimanje {e}era iz krvi. Kolagen je struktu-ralni protein, na|en na mnogim mjestima, uklju~uju}inokte i zglobove.

Danas su poznate aminosekvence mnogih proteina.Ako je poznat protein, mo`e se odrediti gen koji ga kodi-ra. Poznavanje strukture proteina ili gena koji ga kodiraprijeko je potrebno za njegovu proizvodnju geneti~kimin`enjerstvom.

46

Slika 2.Transkripcija – translacija –sinteza proteina

A: Nakon transkripcije DNA umRNA, molekula mRNA izlaziiz jezgre i ulazi u citoplazmustanice, gdje se ve`e naribosome.

B: Transkripcija je proceskojim se informacija DNAkopira u strukturu mRNA.Translacija je proces kojim seporuka u mRNA koristi zasintezu proteina.

C: Molekule transfer RNA(tRNA) nose specifi~nuaminokiselinu i stavljaju je usekvencu proteina, koja jeodre|ena kodonima umolekuli mRNA. Teaminokiseline me|usobno seve`u peptidnim vezama iformiraju polipeptidni lanacproteina.

Rekombinantna DNA-tehnologija

Znanost se nije zaustavila samo na poznavanju gena. Poka-zalo se da je potrebno kopirati taj gen i ubacivati ga u dru-ge stanice, koje se mogu jednostavno uzgojiti pomo}u po-stoje}ih mikrobiolo{kih tehnika, ili u stanice drugih bilja-ka ili `ivotinja, gdje je doti~ni protein potreban. Da bi seto postiglo, kori{tene su nove biokemijske tehnike, pa ispecijalni enzimi za cijepanje DNA u odabranim to~kama,48

Mira Grdi{aGeneti~ko in`enjerstvou slu`bi ~ovjeka

Slika 3.Struktura proteina:

A: Primarna struktura – slijedaminokiselina.

B: Sekundarna struktura –presavijanje proteina kao

posljedica stvaranja vodikovihveza.

C: Tercijarna struktura –nastaje kao posljedica

interakcije polipeptida injegove neposredne okoline.

D: Kvarterna struktura –predstavlja protein sastavljen

od podjedinica.

ubacivanje novog segmenta i njegovo spajanje u lanacDNA doma}ina (Slika 4). Rezultat takve manipulacije jesttzv. rekombinantna DNA (ima ugra|eni segment koji pri-je nije imala). Segment gena jednostavnije se ubacuje po-mo}u bakterijskih plazmida – malih cirkularnih DNA, ko-je su znatno manje od bakterijskog kromosoma. Neki odtih plazmida mogu jednostavno prije}i od jedne stanice dodruge, ~ak i ako su stanice daleko na evolucijskoj skali.Koriste}i “specijalni rez i ubacivanje” pomo}u enzima, mo-gu}e je ubaciti gene iz jednog organizma u bakterijski plaz-mid, zatim se rekombinantni plazmid ubacuje u mikroor-ganizam, gdje }e se izravno sintetizirati `eljeni protein.

49

Mira Grdi{aGeneti~ko in`enjerstvo

u slu`bi ~ovjeka

Slika 4.Rekombinantna DNA.

Segment molekule DNA (gen~iji je produkt neki odre|eniprotein) ugradi se u plazmidnivektor (bakterije ili kvasca).Tako dobivena rekombinantnaDNA unese se u stanicemikroorganizama, gdje }eizravno sintetizirati `eljeniprotein (humani inzulin i drugiproteini dobivaju se na tajna~in).

Geni iz raznih eukariotskih stanica su izrezani i zatimklonirani (uba~eni) u bakterije pomo}u tehnika restrikcij-skih endonukleaza i reverzne transkripcije. Bakterija kojasadr`i rekombinantnu DNA sposobna je proizvoditi euka-riotski protein. Prvi eukariotski protein dobiven u bakteri-jama jest proinzulin, iz kojeg se dobio inzulin. Inzulin jeprotein gra|en od dva polipeptidna lanca (� i �), me|u-sobno povezana vodikovim vezama. Izlu~uje ga gu{tera~a,a on stimulira uzimanje glukoze iz krvi putem glukoneo-geneze (sinteza glukoze u jetri), sintezu proteina i lipoge-nezu. Pove}ano uzimanje glukoze iz krvi u stanice mi{i}a iadipocita (masne stanice) posljedica je pove}anja brojatransportera za glukozu. Inzulin tako|er pove}ava aktiv-nost enzima u jetri koji poti~u sintezu glikogena i triglice-rida. Poti~e rast mnogih stanica, odnosno djeluje kao ~im-benik rasta (IGF). Poreme}aji u fiziolo{koj funkciji inzuli-na izazivaju {e}ernu bolest ili dijabetes. Za tu je bolest ka-rakteristi~na abnormalna funkcija ili regulacija inzulin-skog receptora, posljedica toga jest nedovoljna aktivnostinzulina i produ`ena povi{ena razina glukoze u krvi. Ve-}ina pacijenata s ranim dijabetesom ima poreme}aj u sin-tezi inzulina, a stanje se pobolj{a davanjem injekcija inzu-lina. Koristi se humani inzulin, proizveden geneti~kimin`enjerstvom.

Interferon je glikoprotein koji izlu~uju razne stanice(limfociti, fibroblasti) nakon infekcije virusom. Otkrivenje na temelju zapa`anja da su virusom zara`eni pojedincirezistentni na infekcije drugim virusima. Interferon oslo-bo|en iz stanice reagira s receptorom na plazma-membra-ni druge stanice i blokira njezinu infekciju virusom (me-hanizam se ne zna). Budu}i da se sintetizira i izlu~uje umalim koli~inama, njegovo dobivanje geneti~kim in`enjer-stvom od op}eg je zna~enja. Potiskuje umno`avanje veli-kog broja RNA-virusa i DNA-virusa. Tako|er se pokazaloda potiskuje rast nekih tumorskih stanica. Opisane su trivrste interferona:

– alfa-interferon (leukociti)– beta-interferon (fibroblasti)– gama-interferon (limfociti)Klini~ki se koristi protiv viralnih infekcija i odre|e-

nih tumora. Interferon spre~ava proliferaciju virusa uglav-nom inhibicijom sinteze proteina u inficiranim stanicama.Limfocitni interferon tako|er modulira imuni odgovor.

Eritropoetin je polipeptid ~ija je fiziolo{ka uloga re-gulacija razvoja crvenih krvnih stanica. Sintetizira se i ot-pu{ta iz bubrega i jetre animalnih i humanih stanica kaoodgovor na manjak kisika. Prekursorske eritroidne staniceodgovaraju na stimulaciju hormona kroz povr{inski recep-50

Mira Grdi{aGeneti~ko in`enjerstvou slu`bi ~ovjeka

tor tako da sazrijevaju u zrele eritrocite. Pove}an broj eri-trocita pove}ava sposobnost dovo|enja kisika u tkiva, pase smanjuje i otpu{ta eritropoetin. To je jedan od na~inakontrole eritropoeze. Poreme}aji u sintezi toga hormonareguliraju se davanjem humanog eritropoetina, proizvede-noga geneti~kim in`enjerstvom.

Somatotropin je hormon rasta, a izlu~uje ga adenohi-pofiza. Stimulira rast i sintezu somatomedina, koji se pakizlu~uje u jetri a poti~e rast hrskavice (ima aktivnost sli~nuinzulinu).

Fuzijski proteini (CD4-imunoadhezin, kimeri~ni pro-teini) za lije~enje leukemija

Cjepiva (za tumore, hepatitis B, malarija, DNK-cjepi-va, konjugirana cjepiva)

Antigeni (HIV2-env antigen, strogo specifi~an za ami-nokiseline 309-702 HIV2)

Humani faktori rasta (IGF-1) koriste se za lije~enjeTurnerovog sindroma, Downova sindroma, tumora moz-ga, leukemija, daje se osobama niskog rasta te odraslimosobama s manjkom faktora rasta

Faktori VIII, IX i drugi rekombinantni produkti krvikoriste se u lije~enju hemofilije

U Tablici 1 navedeni su komercijalni nazivi proizvo-da dobivenih geneti~kim in`enjerstvom u eukariotskimstani~nim kulturama, a koriste se u klini~ke svrhe. Tablica2 prikazuje rekombinantne proteine, koji su jo{ u kli-ni~kim istra`ivanjima.

Zbog sna`nih potencijala geneti~kog inj`enjerstva po-stoji bojazan za pravilnu kontrolu i regulaciju procesa injihovih produkata. Naime, upotreba biljaka i `ivotinja spromijenjenim geneti~kim karakteristikama mogla bi ugro-ziti okolinu naru{avaju}i postoje}u ravnote`u izme|u or-ganizama. Ta je ravnote`a dinami~na. Budu}i da su muta-cija gena i promjena polo`aja unutar kromosoma normal-ni doga|aji u `ivim organizmima, stalno se pojavljuju or-ganizmi s novim svojstvima (biljke i `ivotinje). Pro{irenjedjelokruga tih zbivanja omogu}ilo je geneti~ko in`enjer-stvo primjenom transgeni~nih tehnologija. Stoga je prijekopotrebno ispitati sva svojstva transgeni~nog organizma,prije no {to on napusti laboratorij ili staklenik.

Name}u se i sljede}a pitanja:– Je li geneti~ko in`enjerstvo eti~no?– Je li eti~no promijeniti geneti~ki materijal bilo kojeg

`ivog organizma?– Je li eti~no promijeniti geneti~ki materijal selektivnim

uzgojem?– Je li dobit geneti~kog in`enjerstva ve}a od rizika? 51

Mira Grdi{aGeneti~ko in`enjerstvo

u slu`bi ~ovjeka

– Je li pravilno da se geneti~ki modificirani organizmi pa-tentiraju? Je li taj tip patenta razli~it od drugih?

– Da li bi odr`avanje geneti~kog in`enjerstva trebalo bitistrogo regulirano zakonom ili treba postojati neki drugina~in?

I tehnologija i eti~ka strana trebaju se razvijati isto-dobno. Treba imati na umu i potrebe i `elje za dosti-gnu}em. Bilo bi pogre{no ne prihvatiti mogu}nost proiz-vodnje vitalnih humanih proteina (inzulin, eritropoetin,cjepiva, ~imbenici rasta, faktor zgru{avanja krvi iz mlijekaovce) potrebnih u lije~enju, ako to mo`emo, kao i dobi-vanje geneti~ki modificiranih organa `ivotinja za trans-plantaciju kod ljudi (srce svinje). Stoga geneti~ko in`enjer-stvo nedvojbeno zauzima nezamjenjivo mjesto u `ivotudana{njeg ~ovjeka.

Produkt(originalno ime) Protein Lije~enje

Aktivase/Actilyse plazminogenaktivator (tPA)

tromboliza u infarktumiokarda i plu}nojemboliji

Epogen/Procrit/Eprex eritropoetin(Epo) stimulacija eritropoeze

(AIDS, anemija, kroni~nebubre`ne bolesti)Epogin/Recormon eritropoetin

(Epo)

Saizen ~imbenik rasta(hGH)

nedostatak ~imbenikarasta

GenHevac B Pasteur cjepivo zahepatitis B(HbsAg) prevencija infekcije

hepatitisom BHB Gamma cjepivo zahepatitis B(HbsAg)

Granocyte ~imbenik zastimulaciju rastakolonijagranulocita(G-CSF)

neutropenije (manjakneutrofila) povezane npr.s transplantacijomko{tane sr`i, odnosno sintenzivnom kemo-terapijom citotoksi~nimlijekovima

Recombinate faktor VIII(80 + 90 kDa) krvarenja kod

hemofilije AKogenate faktor VIII(80 + 90 kDa)

Pulmozyme DNase I smanjenje gusto}ebronhalnog sekreta uoboljelih od cisti~nefibroze52

Tablica 1.Proizvodii dobiveni geneti~kimin`enjerstvom koji se koriste u

klini~ke svrhe

Mira Grdi{aGeneti~ko in`enjerstvou slu`bi ~ovjeka

Protein Klini~ka primjena

sCD4 AIDS

sCD4-IgG AIDS

gB, gD (HSV) cjepivo za herpes virus

gp120, gp160 (HIV) cjepivo za HIV

tPA muteins tromboliza

monoklonska protutijela:her2, CD52

zlo}udni tumor

CD4 autoimunost, transplantacija

TNF� sepsa

CD20 limfomi B-stanica

TAC transplantacija

CD18 hemoragi~ni {ok

leukotrien multipla skleroza

CF54, CD7 reumatoidni artritis

interferon beta (IFN �) multipla skleroza

hormon stimulacije {titnja~e (TSH) rak {titnja~e

topljiv komplement receptor-1(sCR-1)

akutni respiratorni distressindrom (ARDS)

transformiraju}i ~imbenik rastabeta (TGF-�)

mehani~ke ozljede mekog tkiva

glukocerebrozidaza Gaucherova bolest (tip I)

~imbenik za stimulaciju rastakolonija makrofaga (M-CSF)

tumor, hiperkolesterolemija

ko{tani morfogenetski protein 2(BMP-2)

cijeljenje prijeloma kostiju

hormon stimulacije folikula (FSH) bolesti policisti~nih jajnika

interleukin 6 (IL-6) trombocitopenija (manjaktrombocita)

LITERATURAHole, V. J. Jr. (1993), Human Anatomy & Physiology, Wheatley, C. H.(ed.), Wm. C. Brown, Dubuque, I. A.

Goeddel, D. V. (ed.) (1990), Vol. 185 Gene expression technology (arti-cles 21, 24, 34), Methods in Enzymology, Academic Press. Inc.

Stryer, L. (1988), Biochemistry, W. H. Freeman and Company, New York.

Seeley, R. R., Stephens, T. D., Tate, P. (1995), Anatomy & Physiology, Cal-lanan, R. J. (ed.), Mosby-Year Book Inc., St. Louis, MO.

Stateva, L. Recombinant proteins, http://www.bi.umist.ac.uk

Giangrande, P. L. F. Recombinant blood products for the treatment of patientswith haemophilia, http://www.medicine.ox.ac.uk

Lubinecki, A. S., Lupker, J. H. (1994), Purified protein products ofrDNA technology expressed in animal cell culture.

Kisner, D. L., Snyth, J. F. (eds.) (1985), Interferon alpha-2: pre-clinical andclinical evaluation, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, Dordrecht,Lancaster. 53

Tablica 2.Rekombinantni proteini izstanica eukariota u klini~kimistra`ivanjima

Mira Grdi{aGeneti~ko in`enjerstvo

u slu`bi ~ovjeka