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HER2 IQFISH pharmDx (Dako Omnis)

Referência GM333

4.ª edição

O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é um ensaio de hibridização de fluorescência direta in situ (FISH) concebido para a determinação quantitativa da amplificação do gene HER2 em amostras de tecido de cancro da mama fixadas em formol e impregnadas em parafina (FFPE) e em amostras FFPE provenientes de doentes com adenocarcinoma metastático gástrico ou da junção gastroesofágica.

O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é indicado, em conjunto com o HercepTest™, para a avaliação de doentes para os quais esteja a ser considerado o tratamento com Herceptin™.

O frasco contém reagente suficiente para 20 testes.

Reagentes acessórios a utilizar em conjunto com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis):

Referência Nome do produto

GM300 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis)

GM301 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis)

GM302 ISH Pepsin (Dako Omnis)

GM303 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis)

GM304 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis)

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Índice

Página Finalidade ....................................................................................................................... 3

Princípio de Procedimento - Mama ................................................................................. 4

Reagentes - Mama.......................................................................................................... 5

Precauções - Mama ........................................................................................................ 6

Conservação - Mama ...................................................................................................... 7

Preparação das Amostras - Mama .................................................................................. 7

INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO - Mama ........................................................................ 8

A. Preparação dos Reagentes - Mama ........................................................................... 8

B. Procedimento de Coloração - Mama ......................................................................... 10

Controlo de Qualidade - Mama ..................................................................................... 11

Interpretação da Coloração - Mama .............................................................................. 12

Limitações - Mama ........................................................................................................ 13

Características de Desempenho – Mama ..................................................................... 14

Resolução de problemas - Mama .................................................................................. 23

Anexo 1 - Mama ............................................................................................................ 25

Anexo 2 - Mama ............................................................................................................ 27

Resumo e Explicação - Gástrico ................................................................................... 28

Princípio de Procedimento - Gástrico ............................................................................ 28

Reagentes - Gástrico .................................................................................................... 29

Precauções - Gástrico ................................................................................................... 30

Conservação - Gástrico ................................................................................................ 31

Preparação das Amostras - Gástrico ............................................................................ 32

INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO - Gástrico................................................................... 32

A. Preparação dos Reagentes - Gástrico ...................................................................... 32

B. Procedimento de Coloração - Gástrico ..................................................................... 35

Controlo de Qualidade - Gástrico .................................................................................. 36

Interpretação da Coloração - Gástrico........................................................................... 38

Limitações - Gástrico .................................................................................................... 40

Características de Desempenho - Gástrico ................................................................... 40

Resolução de problemas - Gástrico .............................................................................. 48

Anexo 3 - Gástrico ........................................................................................................ 50

Anexo 4 - Gástrico ........................................................................................................ 52

Anexo 5 - Gástrico ........................................................................................................ 53

Referências ................................................................................................................... 54

Explicação dos símbolos ............................................................................................... 56

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Finalidade Para utilização em diagnóstico in vitro.

O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é a sonda de hibridização para a fluorescência direta automatizada no ensaio de hibridização in situ (FISH) em instrumentos Dako Omnis e é concebido, em conjunto com os dispositivos reagentes acessórios, para a determinação quantitativa da amplificação do gene HER2 em amostras de tecido de cancro da mama fixadas em formol e impregnadas em parafina (FFPE) e em amostras FFPE provenientes de doentes com adenocarcinoma do estômago, incluindo a junção gastroesofágica.

O HER2 IQFISH pharmDxé indicado, em conjunto com o HercepTest™, para a avaliação de doentes para os quais esteja a ser considerado o tratamento com Herceptin™ (trastuzumab) (consultar o folheto informativo do Herceptin™).

Para doentes com cancro da mama, os resultados do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) destinam-se à utilização em conjunto com as informações clinicopatológicas atualmente empregues para uma estimativa do prognóstico de doentes com cancro da mama de estádio II e positivo para nódulos. O adenocarcinoma da junção gástrica ou gastroesofágica é também referido como cancro gástrico neste documento. Para a aplicação no cancro da mama, consulte as páginas 4-27.

Para a aplicação no cancro gástrico, consulte as páginas 28-53. Importante: repare nas diferenças para o tecido do cancro da mama e tecido do cancro gástrico, especialmente na secção Interpretação da coloração.

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Resumo e Explicação - Mama O gene humano HER2 (também denominado ERBB2 ou NEU) encontra-se localizado no cromossoma 17 e codifica a proteína HER2 ou p185HER2. A proteína HER2 é uma tirosina cinase do recetor da membrana com certa homologia com o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR ou HER1) (1-2). O gene HER2 encontra-se presente em duas cópias em todas as células diploides normais.

Numa fração dos doentes com cancro da mama, a proteína HER2 é amplificada, como parte do processo de transformação maligna e desenvolvimento do tumor (3-8). A amplificação do gene HER2 resulta geralmente na hiperexpressão da proteína HER2 na superfície das células do cancro da mama (9).

A amplificação do gene HER2 e/ou a hiperexpressão da sua proteína foram já demonstradas em 20-25% dos cancros da mama (10). Esta suprarregulação encontra-se associada a um mau prognóstico, um aumento do risco de recorrência e uma diminuição da sobrevivência. Vários estudos têm demonstrado que o estado da HER2 se correlaciona com a sensibilidade ou resistência a certos regimes quimioterapêuticos (11).

A demonstração de uma hiperexpressão elevada da proteína HER2 ou de uma amplificação do gene HER2 é essencial para iniciar a terapia com Herceptin™, um anticorpo monoclonal da proteína HER2. Estudos clínicos demonstraram que os doentes cujos tumores têm uma hiperexpressão elevada da proteína HER2 e/ou uma grande amplificação do gene HER2 retiram mais benefícios do Herceptin™ (12).

Este produto [HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis)] é uma mistura de sondas IQISH para FISH direta automatizada, para a deteção da amplificação do gene HER2. Este produto deve ser utilizado em conjunto com os reagentes acessórios no instrumento Dako Omnis e deriva do ensaio de amplificação do gene HER2 de execução manual, HER2 IQFISH pharmDx™, referência K5731.

Princípio de Procedimento - Mama O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é uma mistura de sondas IQISH, composta por uma mistura de sondas de ADN marcado com Texas Red, abrangendo uma região de 218 kb, incluindo o gene HER2, no cromossoma 17 e uma mistura de sondas de ácido péptido nucleico (APN) marcado com fluoresceína (13) que têm por alvo a região centromérica do cromossoma 17 (CEN-17). A hibridização específica dos dois alvos resulta na formação de um sinal fluorescente vermelho distinto em cada locus do gene HER2 e um sinal fluorescente verde distinto em cada centrómero do cromossoma 17.

A avaliação da amplificação do gene HER2 utilizando o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é um método totalmente automatizado no instrumento Dako Omnis. É possível selecionar três diferentes protocolos de coloração do HER2 FISH validados no software da estação de trabalho Dako Link Omnis. Os protocolos diferem apenas a nível do tempo de digestão da pepsina: consequentemente, pode ser escolhida uma digestão da pepsina durante 10 minutos (o protocolo Curto), 15 minutos (o protocolo Médio) ou 20 minutos (o protocolo Longo) (consultar mais abaixo). O protocolo Médio é recomendado para a análise inicial.

Após a coloração no Dako Omnis, as amostras são montadas com Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e cobertas com uma lamela. Utilizando um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados (consultar Anexo 2), localizam-se as células tumorais e efetua-se a contagem dos sinais vermelho (HER2) e verde (CEN-17). A seguir, calcula-se o rácio HER2/CEN-17. As células normais contidas no corte de tecido analisado servirão como controlo positivo interno da coloração.

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Para mais informações, consultar a secção Interpretação da coloração.

Consulte o(s) guia(s) do utilizador do Dako Omnis para instruções detalhadas sobre o carregamento e descarregamento de lâminas, tampas ISH (Dako Omnis), reagentes, líquidos dos reservatórios grandes e resíduos.

Reagentes - Mama O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e os reagentes acessórios podem ser encomendados em separado como reagentes únicos. Materiais fornecidos

HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis): mistura pronta a usar de 1,6 mL, composta por sondas de ADN HER2 marcado com Texas Red e sondas de APN CEN-17 marcado com fluoresceína, fornecida em solução tampão de hibridização IQISH. O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é enviado em gelo seco. Para garantir que o reagente não foi exposto a temperaturas elevadas durante o transporte, deve verificar-se se o gelo seco ainda se encontra presente aquando da receção do reagente. Os frascos de reagente, com conteúdo congelado, devem ser conservados e tratados numa posição vertical em todas as ocasiões.

O frasco de reagente contém uma esfera de metal revestida a ouro que permite a mistura do reagente utilizando o dispositivo de mistura Dako Omnis (consultar o guia do utilizador do dispositivo de mistura Dako Omnis). É importante que o reagente seja cuidadosamente misturado antes de ser carregado no Dako Omnis. Materiais necessários, mas não fornecidos

Reagentes acessórios Os seguintes reagentes são necessários no instrumento Dako Omnis para a realização da análise da amplificação do gene HER2 com HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis):

ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 mL, concentrado 20x; a diluir numa proporção de 1:20 num reservatório grande Dako Omnis de 3,5 L (referência GC109). O produto contém um agente antimicrobiano e uma cor inerte verde para uma identificação fácil e rápida.

ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 mL de etanol a 96% (pronta a usar).

ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 mL de solução de pepsina A (pronta a usar), pH 2,0; contém estabilizador e um agente antimicrobiano. A pepsina é enviada acondicionada em gelo seco. Para garantir que o reagente não foi exposto a temperaturas elevadas durante o transporte, deve verificar-se se o gelo seco ainda se encontra presente aquando da receção do reagente.

ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 mL de tampão soro-citrato sódico concentrado 20x; a diluir numa proporção de 1:20 num reservatório grande Dako Omnis de 3,5 L (referência GC109). O produto contém um agente antimicrobiano, um detergente e uma cor inerte verde para uma identificação fácil e rápida.

Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 mL de meio de montagem de fluorescência (pronto a usar), com DAPI.

Embora os reagentes referidos acima não sejam fornecidos com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis), eles são brevemente descritos de seguida. Consulte as instruções de utilização de cada dispositivo para obter informações adicionais. Reagentes e dispositivos adicionais Dako Omnis, referência GI100

Tampão de lavagem (20x) (Dako Omnis), referência GC807

Clearify™, referência GC810

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Dispositivo de mistura Dako Omnis, referência GC116

Tampa ISH, referência GC102

ISH Cleaning Solution, referência GC207

Lamelas de vidro para montagem (24 mm x 50 mm)

Consulte os guias básico e avançado do utilizador do Dako Omnis para a utilização de reagentes e dispositivos adicionais. Microscópio e acessórios

Filtros para microscópio de fluorescência: DAPI e filtro duplo FITC/Texas Red ou monofiltros FITC e Texas Red - consultar Anexo 2 para detalhes. O uso do filtro DAPI com uma ampliação alta afeta negativamente a intensidade do sinal. Devem ser evitados tempos de exposição longos.

O microscópio de fluorescência com uma lâmpada de mercúrio de 100 watts deve ser utilizado como fonte de luz. Não se recomenda a utilização de outras fontes de luz com estes filtros.

Pasta de lâminas de microscópio (tabuleiro em cartão para 20 lâminas com cobertura articulada ou semelhante).

Precauções - Mama 1. Para utilização em diagnóstico in vitro.

2. Para utilizadores profissionais.

3. O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) contém carbonato de etileno a ≥10-<25% e ≥3-<5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) está marcado:

Atenção H319 Provoca irritação ocular grave. P280 Usar proteção ocular ou facial. P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar

cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar.

Como regra geral, as pessoas com idade inferior a 18 anos não estão autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser cuidadosamente instruídos sobre o procedimento de trabalho adequado, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consultar a ficha de dados de segurança para obter informações adicionais.

4. As amostras de tecido, antes e depois da sua fixação, bem como todos os materiais expostos às mesmas, devem ser manipulados tal como potencialmente infeciosos e devem ser descartados com as devidas precauções (14). Nunca pipetar os reagentes com a boca e evitar o contacto da pele e membranas mucosas com os reagentes e as amostras. Se os reagentes entrarem em contacto com áreas sensíveis, lavar com grandes quantidades de água.

5. Minimizar a contaminação microbiana do reagente para evitar resultados incorretos.

6. Métodos de fixação dos tecidos e espessura das amostras diferentes dos especificados poderão afetar a morfologia dos tecidos e/ou a intensidade do sinal.

7. O reagente foi idealmente diluído. Uma maior diluição poderá resultar numa quebra do desempenho.

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8. Utilizar equipamento de proteção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. Consultar a Ficha de Dados de Segurança do Material (FDSM) para obter informações adicionais.

9. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais, nacionais e comunitárias.

Conservação - Mama Conservar o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) a <−18 °C (−18 °C a −25 °C é o intervalo recomendado) no escuro. Manter o frasco de reagente descongelado numa posição vertical em todas as ocasiões. A congelação e a descongelação do reagente até um máximo de 10 vezes não afetam o desempenho. Não deixar este componente à temperatura ambiente.

HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e os reagentes acessórios: ISH pepsina (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) poderão ser afetados negativamente pela exposição ao calor. Não deixar estes componentes à temperatura ambiente. O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e o reagente acessório Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) poderão ser afetados negativamente pela exposição a níveis de luz excessivos. Não conservar estes componentes nem realizar a análise a uma luz forte como, por exemplo, a luz solar direta. Conservar os reagentes acessórios ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) no escuro a 2-8 °C. Conservar a ISH Pepsin (Dako Omnis) a −18-8 °C. A tampa do frasco, incluindo a tampa com abertura da parte superior, deve ser fechada em todos os reagentes durante a conservação. As soluções diluídas (solução de trabalho ISH Stringent Wash Buffer e solução de trabalho ISH Pre-Treatment Solution) podem ser conservadas a 2-8 °C durante 30 dias.

Não utilizar quaisquer reagentes após o fim da data de validade impressa no recipiente do reagente. Durante a conservação, a tampa do reagente, incluindo a tampa com abertura da parte superior, deve ser fechada. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá validar o desempenho do reagente (15).

Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Portanto, convém avaliar células normais no corte de tecido analisado. Se for observado um padrão de fluorescência inesperado que não possa ser explicado e caso se suspeite de um problema com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) ou com os seus reagentes acessórios, contacte a Assistência técnica Dako. Estabilidade de utilização no instrumento Dako Omnis A estabilidade de utilização do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e dos reagentes acessórios ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis) é de 80 horas. A estabilidade de utilização da ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluída e do ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) é de 7 dias. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis. A utilização de reagentes fora do prazo irá resultar num aviso do equipamento Dako Omnis; todas as lâminas coradas com o reagente fora do prazo irão mudar para o estado "suspeito" e o registo das lâminas na estação de trabalho irá identificar a utilização de um reagente fora do prazo.

Preparação das Amostras - Mama As amostras resultantes de biopsias, excisões ou resseções devem ser manuseadas de modo a preservar o tecido para a análise FISH. Devem empregar-se, em todas as amostras, métodos padrão de processamento de tecidos para a coloração imunocitoquímica (16). Cortes impregnados em parafina Somente tecidos preservados em formol neutro tamponado e impregnados em parafina são adequados para utilização. As amostras devem, p. ex., ser bloqueadas a uma espessura de

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3 ou 4 mm e fixadas durante 18 a 24 horas em formol tamponado neutro. Os tecidos são então desidratados numa série graduada de etanol e xilol, seguindo-se a sua infiltração com parafina

derretida, mantida a uma temperatura não superior a 60 C. Os tecidos devidamente fixados e impregnados conservar-se-ão por um período indefinido antes de serem seccionados e

montados em lâminas, caso sejam conservados em local fresco (15-25 C) (16-17). Não são adequados outros agentes de fixação. As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de 4-6 µm. As lâminas necessárias para a análise de amplificação do gene HER2 e para a verificação da presença do tumor devem ser preparadas ao mesmo tempo. Recomenda-se um mínimo de dois cortes em série, um corte para a presença do tumor, colorida com hematoxilina e eosina (coloração H&E) e um corte para a análise de amplificação do gene HER2. Recomenda-se a montagem dos cortes de tecido em Dako FLEX IHC Microscope Slides, referência K8020. Superfrost Plus slides (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) são também adequadas. Garantir que as lâminas de vidro não ultrapassaram a data de validade. As amostras devem ser

analisadas num período de <6 meses após o seccionamento, quando conservadas a 2-25 C.

NOTA: as amostras de tecido têm de ser colocadas no vidro dentro da área definida de coloração da lâmina. Consulte o guia básico do utilizador do Dako Omnis para obter as dimensões da área de coloração da lâmina.

INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO - Mama

A. Preparação dos Reagentes - Mama A.1 HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) O frasco do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) contém uma esfera de metal revestida a ouro que é utilizada para mistura. Antes do carregamento do frasco no Dako Omnis, o reagente deve ser descongelado e cuidadosamente misturado, uma vez que a fase se separa durante a congelação.

Utilizar o dispositivo de mistura Dako Omnis para a mistura de sondas.

Seguir o procedimento abaixo para a mistura de sondas no dispositivo de mistura Dako Omnis e consultar o guia do utilizador do dispositivo de mistura para obter detalhes adicionais.

1. Retirar o frasco do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) do congelador.

2. Carregar o frasco no dispositivo de mistura Dako Omnis.

3. Ligar o dispositivo de mistura e garantir que a luz verde de estado está acesa.

Selecionar o programa "Descongelar + misturar". Importante: os frascos conservados a uma temperatura inferior a −25 °C devem ser descongelados (apenas imediatamente) antes de carregar o frasco no dispositivo de mistura Dako Omnis, devendo ser utilizado o programa "Misturar".

4. Remover o frasco do dispositivo de mistura.

5. Abrir a tampa com abertura da parte superior, virar para trás e encaixar na posição de corte (consultar o guia básico do utilizador do Dako Omnis para detalhes).

6. Carregar de imediato o frasco no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no instrumento Dako Omnis. No caso do uso da funcionalidade de carregamento de reagente durante o processo de coloração, garantir que o período de tempo desde a mistura até à aspiração do frasco no Dako Omnis corresponde a, pelo menos, 10 minutos.

A sonda HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) pode ser redescongelada e utilizada até 10 vezes.

Misturar sempre a mistura de sondas HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) imediatamente antes de carregá-la no instrumento. Não agitar. A estabilidade de utilização total do ISH HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é de 80 horas, quando conservado no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada

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pelo software Dako Omnis (consultar acima). Após o período de tempo no instrumento Dako Omnis, o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) deverá ser imediatamente transferido para < −18 °C (−18 °C a −25°C é o intervalo recomendado). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Preparar uma solução de trabalho, diluindo o concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) a 1:20 do seguinte modo:

1. Encher um reservatório grande de 3,5 L Dako Omnis, assinalado com PTB (etiqueta azul), até à linha de enchimento com água desionizada (3,325 L). Ter o cuidado de colocar o reservatório grande numa superfície horizontal antes de o encher.

2. Deitar os 175 mL de um frasco de concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) no reservatório grande.

3. Retirar a etiqueta destacável do frasco de concentrado e colocá-la no reservatório grande. Apertar a tampa do reservatório grande e, com cuidado, inverter o reservatório grande 2 ou 3 vezes.

4. Utilizar o leitor de códigos de barras portátil Dako Omnis para identificar o reagente (efetuar a leitura da etiqueta destacável e do reservatório grande).

5. Colocar imediatamente o reservatório grande no equipamento Dako Omnis.

A solução diluída pode ser utilizada no período de 7 dias quando conservada no equipamento Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis (consultar acima). A solução diluída não utilizada pode ser conservada a 2-8 °C durante 30 dias. Após a conservação a frio, garantir que a solução diluída é ajustada até pelo menos 18 °C antes do carregamento no Dako Omnis.

NOTA: eliminar a solução diluída, caso esta fique turva. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Preparar uma solução de trabalho, diluindo o concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) a 1:20 do seguinte modo:


2. Deitar os 175 mL de um frasco de concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) no reservatório grande.



5. Colocar imediatamente o reservatório grande no instrumento Dako Omnis. A solução diluída pode ser utilizada no período de 7 dias quando conservada no equipamento Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis

(consultar acima). A solução diluída não utilizada pode ser conservada a 2-8 C durante até 30 dias. Após a conservação a frio, garantir que a solução diluída é ajustada até pelo menos 18 °C antes do carregamento no Dako Omnis.

NOTA: eliminar a solução diluída, caso esta fique turva. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) A ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) é um reagente pronto a usar. Antes de carregar no Dako Omnis, abrir a tampa com abertura da parte superior, virar para trás e encaixar na posição de corte.

A estabilidade de utilização total da ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) é de 80 horas quando conservada no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no

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Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis (consultar acima). Após a conclusão do processo, a ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) pode ser transferida para a temperatura de conservação (2-8 °C) para preservar o tempo de estabilidade de utilização. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) A ISH Pepsin (Dako Omnis) é um reagente pronto a usar. Antes de carregar no Dako Omnis, garantir que o reagente é descongelado e abrir a tampa do frasco com abertura da parte superior, virar para trás e encaixar na posição de corte.

A estabilidade de utilização total da ISH Pepsin (Dako Omnis) é de 80 horas, quando conservada no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis (consultar acima). Após a conclusão do processo, a ISH Pepsin (Dako Omnis) deve ser transferida para a temperatura de conservação a −18-8 °C para preservar o tempo de estabilidade de utilização. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) O Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) é um meio de montagem pronto a usar utilizado fora do instrumento Dako Omnis. Transferir o Fluorescence Mounting Medium para a temperatura de conservação (2-8 °C) imediatamente após a sua utilização. A.7 Acessórios adicionais Os seguintes acessórios devem ser adicionalmente carregados no Dako Omnis: água desionizada, tampão de lavagem diluído 20x (Dako Omnis), referência GC807, Clearify™, referência GC810, ISH Cleaning Solution, referência GC207 e tampa ISH (Dako Omnis), referência GC102, conforme especificado no(s) guia(s) do utilizador do Dako Omnis.

B. Procedimento de Coloração - Mama B.1 Notas do procedimento O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é a sonda de hibridização para a fluorescência direta automatizada no ensaio de hibridização in situ (FISH) no instrumento Dako Omnis e é, em conjunto com os reagentes acessórios GM300, GM301, GM302, GM303 e GM304 (GM304 fora do instrumento), concebido para a determinação quantitativa da amplificação do gene HER2. Antes da utilização, o utilizador deve ler atentamente todas as instruções e familiarizar-se com todos os componentes e as suas precauções.

O procedimento de coloração automatizada de FISH no Dako Omnis inclui a desparafinação de cortes de tecido, a recuperação de alvo, a digestão de pepsina, a hibridização e a lavagem rigorosa. As lâminas são descarregadas na estação de saída seca. Todas as etapas do protocolo estão pré-programadas no software Dako Omnis.

Consultar o(s) guia(s) do utilizador do Dako Omnis para obter instruções sobre o carregamento de lâminas, tampa ISH, reagentes, etc. Três protocolos HER2 IQFISH validados: HER2 IQFISH Pepsina Curto, HER2 IQFISH Pepsina Médio e HER2 IQFISH Pepsina Longo, que apenas diferem no tempo de digestão da pepsina, estão pré-programados no software Dako Omnis e podem ser selecionados para cada uma das cinco lâminas no suporte de lâminas. Isto permite a otimização da digestão do tecido, o que pode depender de condições pré-analíticas. O protocolo HER2 IQFISH Pepsina Médio é considerado o protocolo padrão. Os diferentes protocolos de coloração podem ser vistos na estação de trabalho Dako Link Omnis.

Além disso, o utilizador pode optar por utilizar um Template IQFISH protocol. As condições ideais poderão variar dependendo do tipo de amostras e do método de preparação, devendo ser validadas por cada laboratório. B.2. Procedimento de pré-coloração

1. Escolher o protocolo HER2 IQFISH a aplicar a cada lâmina a partir do software na estação de trabalho Dako Link Omnis, em protocolos IQFISH.

2. Imprimir etiquetas de lâminas e afixá-las nas lâminas de vidro.

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3. Colocar as lâminas no suporte de lâminas. Consultar o guia do utilizador básico do Dako Omnis para detalhes. Um suporte de lâminas tem capacidade para suportar entre uma e cinco lâminas. Recomenda-se a coloração de, pelo menos, duas lâminas num processo de coloração do HER2 IQFISH.

4. Carregar o suporte de lâminas no Dako Omnis.

5. Carregar a tampa ISH (uma tampa ISH por suporte de lâminas) no Dako Omnis.

6. Garantir que os reservatórios grandes com fluidos estão no equipamento e são registados pelo instrumento Dako Omnis. Fluidos de reservatórios grandes: Clearify™ (agente de limpeza), ISH Pre-Treatment Solution diluída (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer diluído (Dako Omnis) e Tampão de lavagem diluído (Dako Omnis).

7. Carregar a ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), a ISH Pepsin (Dako Omnis) e o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) recentemente misturado e ISH Cleaning Solution no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes). Garantir que todas as tampas com abertura da parte superior dos frascos estão abertas.

8. Seguir as instruções apresentadas no ecrã tátil e tocar em "Done" (Concluído) para iniciar o procedimento de coloração.

B.3. Procedimento de coloração O procedimento de coloração do HER2 IQFISH no instrumento Dako Omnis (resumido na tabela 1) pode ser monitorizado na estação de trabalho Dako Link Omnis: Tabela 1. Descrição geral simplificada das etapas do protocolo de coloração do HER2 IQFISH.

Etapa Reagente Tempo e temperatura

Remoção de cera Clearify™ (agente de limpeza) 10 minutos, 38 °C

Recuperação do alvo

ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis)

15 minutos, 97 °C

Lavagem ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis)

2 x 3 minutos, 32 °C

Digestão* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minutos, 15 minutos ou 20 minutos

Secagem 15 minutos, 45 °C

Desnaturação 10 minutos, 66 °C

Hibridização HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis)

75 minutos, 45 °C

Lavagem rigorosa ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis)

10 minutos, 61 °C

* É possível escolher três tempos de digestão da pepsina validados utilizando os protocolos HER2 IQFISH acima indicados.

Caso não estejam iminentes colorações de ISH adicionais, transferir todos os reagentes para as temperaturas de conservação recomendadas. B.4. Procedimento de pós-coloração Descarregar as lâminas e aplicar até 30 µL do Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), contendo DAPI, na área alvo da lâmina. O corte de tecido deve estar totalmente coberto pelo Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Aplicar uma lamela de vidro.

NOTA: as lâminas poderão ser analisadas 15 minutos depois ou no período de 7 dias após a montagem. Contudo, se as lâminas ficarem expostas à luz ou a temperaturas elevadas, dar-se-á o esmorecimento da amostra. Para minimizar o esmorecimento, conservar as lâminas num local

escuro a −18-8 C.

Controlo de Qualidade - Mama 1. Os sinais devem ser evidentes, distintos e fáceis de avaliar.

2. As células normais permitem um controlo interno do processo de coloração.

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• As células normais devem ter 1-2 sinais verdes claramente visíveis, o que indica que a sonda de APN CEN-17 se hibridizou efetivamente na região centromérica do cromossoma 17.

• As células normais devem ter ainda 1-2 sinais vermelhos claramente visíveis, o que indica que a sonda de ADN HER2 se hibridizou efetivamente no(s) gene(s) HER2.

• Devido ao seccionamento do tecido, algumas células normais terão menos do que os dois sinais de cada cor antecipados.

• A não deteção de sinais nas células normais indica a falha do ensaio e os resultados devem ser considerados inválidos.

3. A morfologia nuclear deverá estar intacta quando avaliada utilizando um filtro DAPI. Numerosas células fantasma e uma fraca morfologia nuclear geral indicam uma sobredigestão da amostra, resultando em perda ou fragmentação dos sinais. Tais amostras devem ser consideradas inválidas.

4. Um mínimo de 20 células tumorais deve ser avaliável.

5. Quaisquer diferenças na fixação, processamento e impregnação dos tecidos no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade nos resultados, sendo necessária a avaliação regular de controlos internos.

Interpretação da Coloração - Mama

Tecido avaliável Apenas devem ser analisadas amostras de doentes com carcinomas invasivos. Nos casos em que, na mesma amostra, é visível carcinoma in situ e carcinoma invasivo, apenas a componente invasiva deve ser classificada. Evitar áreas de necroses e áreas onde os limites nucleares sejam ambíguos. Não incluir núcleos que requeiram uma avaliação subjetiva. Omitir núcleos com sinais de fraca intensidade e não específicos ou fundo elevado.

Contagem dos sinais Localizar o tumor, dentro do contexto da lâmina corada com H&E e avaliar a mesma área na lâmina corada com FISH. Examinar várias áreas de células tumorais, a fim de detetar a possibilidade de heterogeneidade. Selecionar uma área com uma boa distribuição de núcleos. Iniciar a análise no quadrante superior esquerdo da área selecionada e, examinando-a da esquerda para a direita, contar o número de sinais que se encontrem dentro dos limites nucleares de cada núcleo avaliado de acordo com as orientações fornecidas a seguir (consultar ainda o Anexo 2).

- Focar para cima e para baixo para localizar todos os sinais nos núcleos individuais.

- Contar dois sinais que sejam do mesmo tamanho e se encontrem separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro do sinal como sendo apenas um sinal.

- Nos núcleos que contenham níveis elevados de amplificação do gene HER2, os sinais de HER2 podem estar posicionados muito próximo uns dos outros, formando aglomerações de sinais. Nestes casos, o número de sinais de HER2 não pode ser contado, devendo antes ser calculado. Deve prestar-se uma atenção especial aos sinais verdes, já que as aglomerações de sinais de HER2 podem cobrir os sinais verdes, tornando impossível a sua visualização. Em caso de dúvida, examinar os sinais verdes com a ajuda de um filtro FITC específico.

Não incluir na classificação os núcleos sem sinais ou com sinais de apenas uma cor. Classificar apenas os núcleos com um ou mais sinais FISH de cada cor. Guia de contagem de sinais

1

Não contar. Os núcleos encontram-se sobrepostos e nem todas as áreas dos núcleos se encontram visíveis.

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2 Dois sinais verdes: não classificar os núcleos com sinais de apenas uma cor.

3 Contar como sendo 3 sinais verdes e 12 vermelhos (estimativa da aglomeração).

4 Contar como sendo 1 sinal verde e 1 vermelho. Dois sinais que sejam do mesmo tamanho e estejam separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro de um sinal contam-se como se fossem apenas um sinal.

5 Não contar (núcleos com digestão insuficiente ou excessiva).

Sinais em falta no centro dos núcleos (núcleos de forma anelar).

6 Contar como sendo 2 sinais verdes e 3 sinais vermelhos. Dois sinais que sejam do mesmo tamanho e estejam separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro de um sinal contam-se como se fossem apenas um sinal.

7 Contar como sendo 1 sinal verde e 5 vermelhos.

8 Contar como sendo 3 sinais verdes (1 verde desfocado) e 3 sinais vermelhos.

9 Aglomeração de sinais vermelhos obscurecendo os sinais verdes, examinar os sinais verdes com um filtro FITC específico ou não contar.

Registar as contagens numa tabela, tal como indicado no Anexo 1.

Contar 20 núcleos por amostra de tecido, sempre que possível pertencendo a áreas diferentes do tumor (18).

Calcular o rácio HER2/CEN-17, dividindo para tal o número total de sinais vermelhos de HER2 pelo número total de sinais verdes de CEN-17.

Deve considerar-se que as amostras que contenham um rácio HER2/CEN-17 igual ou superior a 2 têm o gene HER2 amplificado (3, 18-20).

Os resultados que se situem no ou perto do ponto de corte (1,8-2,2) devem ser interpretados com cuidado.

Se o rácio se encontrar no limite aceitável (1,8-2,2), contar 20 núcleos adicionais e recalcular a relação para os 40 núcleos.

Em caso de dúvida, classificar novamente a lâmina da amostra. Em casos limite, justifica-se uma troca de impressões entre o patologista e o médico de tratamento.

Limitações - Mama 1. Apenas para utilização automatizada em instrumentos Dako Omnis.

ou

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2. É necessária uma formação especializada para a seleção e fixação de tecido e preparação de lâminas e para a interpretação da coloração de IQFISH. A interpretação das colorações do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) não deve ser realizada por indivíduos com daltonismo.

3. Os resultados do FISH dependem da manipulação e processamento dos tecidos antes da sua coloração. Fixação, lavagem, secagem, aquecimento, seccionamento incorretos ou contaminação com outros tecidos ou líquidos poderão influenciar a hibridização das sondas. Os resultados inconsistentes podem dever-se a variações nos métodos de fixação e impregnação ou a irregularidades inerentes aos tecidos.

4. O desempenho do ensaio HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) não foi avaliado em amostras de tumor mamário com microcalcificações.

5. É da responsabilidade do utilizador validar o Template IQFISH protocol.

Características de Desempenho – Mama

Eficácia da hibridização A eficácia da hibridização do HER2 IQFISH pharmDxfoi investigada através de 180 cortes de tecido fixados em formol e impregnados em parafina, testados em três centros de estudo. Os 180 cortes de tecido puderam ser enumerados de acordo com as orientações de enumeração de produtos. A eficácia da hibridização foi de 100%.

Os rácios HER2/CEN-17 calculados e utilizados em estudos das características de desempenho baseiam-se na contagem de sinais em 20 núcleos através das orientações de classificação indicadas na secção Interpretação da coloração destas instruções de utilização.

Sensibilidade analítica A sensibilidade analítica do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi investigada em 20 amostras de tecido diferentes de carcinoma da mama (10 amostras com amplificação do gene HER2 e 10 amostras sem amplificação). O rácio entre o número de sinais HER2 e sinais CEN-17 foi calculado com base na contagem de sinais em 20 núcleos de células normais na amostra de tecido. O rácio HER2/CEN-17 para células normais identificado em 20 amostras de tecido de carcinoma da mama encontrava-se entre 0,97 e 1,11.

Especificidade analítica As extremidades das sondas de ADN HER2 no HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foram sequenciadas e mapeadas para confirmar uma cobertura total de 218 kb, incluindo o gene HER2.

As sondas de APN CEN-17 no HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foram testadas por FISH, individualmente e em conjunto, para confirmar a sua hibridização específica na região centromérica do cromossoma 17.

Para excluir a hibridização cruzada noutros cromossomas além do cromossoma 17, foram efetuados estudos em expansões da metáfase, em conformidade com os procedimentos normais de CQ da Dako. Foram avaliadas, no total, 275 expansões da metáfase com sinais distintos, para analisar a hibridização específica das misturas das sondas de ADN HER2 e de APN CEN-17. Nos 275 casos, a hibridização foi específica para o cromossoma 17. Não se observou a hibridização cruzada em loci de outros cromossomas em nenhum dos 275 casos. A especificidade da sonda foi então de 100% (275 de 275).

Para medir a capacidade do ensaio de IQFISH para identificar unicamente as substâncias HER2 e CEN-17 alvo, sem a interferência de outras substâncias, foram realizados estudos em amostras de tecido de carcinoma da mama, ao omitir as sondas de HER2 e de CEN-17 da mistura de hibridização e ao utilizar apenas a solução tampão de hibridização. Foram avaliadas, no total, 20 amostras quanto à presença de sinais não relacionados com a mistura de sondas. Não foi observada a deteção de outros alvos cromossómicos ou de interferência com substâncias estreitamente relacionadas em nenhuma das 20 amostras.

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Estudos de robustez A robustez do ensaio HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testada ao variar a concentração da sonda de APN, o tempo de recuperação de alvo, o tempo de incubação da pepsina, o tempo de desnaturação, o tempo de hibridização e o tempo e a temperatura da lavagem rigorosa. Os diferentes parâmetros foram testados em cinco amostras de tecido FFPE de cancro da mama (foram representadas amostras de tecido amplificadas e não amplificadas).

Todos os parâmetros foram testados tanto abaixo como acima das definições de protocolo padrão, com exceção da concentração da sonda de APN e da temperatura da lavagem rigorosa, para as quais a definição de protocolo padrão foi incluída na configuração.

Os parâmetros de teste foram:

Concentração da sonda de APN: testado a 100% e a +/-17%.

Tempo de recuperação de alvo: testado a 13 min e 45 seg e a 16 min e 15 seg.

Tempo de incubação da pepsina: testado a 14 min e 45 seg e a 16 min e 15 seg.

Tempo de desnaturação: testado a 9 min e 45 seg. e a 10 min e 45 seg.

Tempo de hibridização: testado a 70 min e a 80 min.

Tempo de lavagem rigorosa: testado a 8 min e 45 seg e a 11 min e 15 seg.

Temperatura de lavagem rigorosa: testado a 59 C, a 61 C e a 63 C.

As três concentrações de sondas de APN foram avaliadas numa conceção de experiência fracionada (ferramenta JMP, SAS), que foi realizada com 12 protocolos de coloração diferentes, conforme indicado na tabela 2.

Tabela 2. Foram utilizados doze protocolos de coloração diferentes no estudo de robustez.

N.º do protocolo

de robustez

Parâmetro de teste

Tempo de recuperação de alvo (min)

Tempo da

pepsina (min)

Tempo de desnaturação

(min)

Tempo de hibridização

(min)

Tempo de

lavagem rigorosa

(min)

Temperatura de lavagem rigorosa (0C)

Conc. de APN na mistura

de sondas

1 16,25 16,25 9,75 80 8,75 59 83%

2 13,75 14,75 10,75 70 8,75 59 100%

3 16,25 14,75 9,75 70 8,75 63 100%

4 13,75 14,75 10,75 80 8,75 61 83%

5 13,75 14,75 9,75 80 11,25 59 117%

6 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 83%

7 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 100%

8 16,25 14,75 9,75 70 11,25 61 83%

9 13,75 16,25 9,75 70 8,75 61 117%

10 16,25 16,25 10,75 70 11,25 59 117%

11 16,25 16,25 10,75 80 11,25 61 100%

12 16,25 14,75 10,75 80 8,75 63 117%

As cinco amostras de tecido foram coradas com os 12 protocolos.

A leitura para o estudo de robustez foi a intensidade do sinal e a qualidade da morfologia. Todos os protocolos produziram coloração em todas as amostras de tecido (60 no total) com sinais claros, distintos e fáceis de avaliar, sendo, portanto, adequados para a enumeração de sinais.

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Além disso, o efeito da espessura do tecido sobre os resultados do ensaio HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testado ao variar a espessura dos cortes de amostras de tecido FFPE de cancro da mama.

No total, foram testados cinco cortes consecutivos de cinco amostras de carcinoma da mama humano com diferentes espessuras (3, 4, 5, 6 e 7 µm) com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis). O coeficiente médio de variação do rácio HER2/CEN-17 foi de 5,8% (num intervalo de 4,3% a 7,1%).

Reprodutibilidade No âmbito da reprodutibilidade de dia para dia e de lote para lote em laboratório, estes foram testados com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis). O estudo foi concebido como um estudo interno, cego e aleatorizado dos rácios HER2/CEN-17 através de cortes de oito amostras diferentes de cancro da mama, fixadas em formol e impregnadas em parafina, com diferentes níveis de amplificação do gene HER2. As oito amostras foram testadas com HercepTest™ e representaram duas amostras com HER2 IHC 0/1+, duas amostras com HER2 IHC 2+, duas amostras com HER2 IHC 3+ e duas amostras com um rácio HER2/CEN-17 FISH predeterminado entre 1,5 e 2,5, obtido através do HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731). Cada amostra foi corada com três lotes diferentes de HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) em cinco dias não consecutivos. Foram processadas, no total, 240 colorações de tecido para todo o estudo, uma vez que cada combinação foi corada em duplicados. A variação nos rácios entre os dias e os lotes é ilustrada na figura 1. Os dados foram analisados com a transformação Box-Cox, através de um modelo de efeito aleatório, de modo a obter homogeneidade na variação dos dados. Estimou-se que o coeficiente total de variação era de 4,3% e foi considerado que a variação de dias e lotes contribuiu com 1,5% e 0%, respetivamente.

Figura 1. Rácios HER2/CEN-17 obtidos num estudo de reprodutibilidade em laboratório sobre o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis), incluindo resultados finais de reprodutibilidade de lote para lote e de dia para dia.

Além disso, a reprodutibilidade de dia para dia e de instalação para instalação do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testada externamente num estudo estratificado e cego em três instalações (uma instalação nos EUA e duas na Europa) em cortes de tecido de 12 amostras diferentes de cancro da mama, fixadas em formol e impregnadas em parafina. Três amostras foram de HER2 IHC 0/1+, três amostras foram de HER2 IHC 2+, três amostras foram de HER2 IHC 3+ e três amostras tiveram o rácio HER2/CEN-17 FISH predeterminado entre 1,5 e 2,5, obtido através do HercepTest™ e do HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731), respetivamente. As amostras foram coradas e analisadas nas instalações de estudo. Cada amostra foi corada, no mínimo, cinco vezes em cinco dias não consecutivos e classificada por um observador em cada instalação. 192 cortes foram corados e incluídos na análise estatística. Os dados foram analisados através da transformação Box-Cox e calcularam-se os componentes de variação. O coeficiente total da variação, baseado no limite superior de confiança de 95%, foi de 15%. A variação do rácio HER2/CEN-17 para o dia e a instalação é apresentada na figura 2.

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Figura 2. Gráfico de variabilidade dos rácios HER2/CEN-17 em unidades não transformadas, obtido num estudo de reprodutibilidade de dia para dia e de instalação para instalação do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) em amostras de tecido de cancro da mama.

O ensaio HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testado para a reprodutibilidade de observador para observador, como parte de um estudo de comparação de métodos realizado internamente, através de três observadores, para classificar de forma independente as amostras coradas. A reprodutibilidade foi testada em 140 amostras diferentes de carcinoma da mama humano com estado do gene HER2 não amplificado ou amplificado. Os dados foram analisados através da transformação Box-Cox. O coeficiente médio de variação de observador para observador foi de 9%. Repetibilidade A repetibilidade em laboratório do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testada através de cortes consecutivos de oito amostras de carcinoma da mama humano com estado do gene HER2 não amplificado ou amplificado. Os tecidos foram testados em duplicados em cinco dias não consecutivos com três lotes diferentes, num total de 240 lâminas (120 cortes em duplicado). O modelo de efeitos aleatórios utilizado para a análise de dados resultou numa variação atribuível a dias e lotes (conforme indicado no estudo interno de reprodutibilidade). A variação residual é igual à variação entre as réplicas e, portanto, à repetibilidade. O limite superior de confiança de 95% para o coeficiente de repetibilidade da variação foi de 4,4%. Estudos de comparação de métodos

Comparação dos resultados do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) com os resultados do HER2 IQFISH pharmDx™

O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi comparado com o HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731) num estudo comparativo em 140 amostras de tecido humano de carcinoma da mama. As amostras consistiram em 77 casos de HER2 não amplificado e 63 casos de HER2 amplificado com a classificação conhecida do HercepTest™, conforme mostrado na tabela 3.

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Tabela 3. Distribuição de amostras com base na classificação do HercepTest™ e na classificação do HER2 FISH (estado do gene HER2), obtida com o HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731).

Classificação de coloração do HercepTest™

0 1+ 2+ 3+ Total

n 27 11 53 49 140

Estado do gene HER2 FISH

Amplificado 2 0 13 48 63

Não amplificado 25 11 40 1 77

Número total de amostras testadas com FISH

27 11 53 49 140

Os resultados da tabulação cruzada do estado do gene HER2, obtidos através dos dois ensaios com o cálculo do acordo de percentagens globais (APG), do acordo de percentagens positivas (APP) e do acordo de percentagens negativas (APN), são mostrados na tabela 4. A correlação entre os rácios HER2/CEN-17 com os dois ensaios é mostrada na figura 3. Tabela 4. Tabulação cruzada do estado do gene HER2, obtida através do HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731) e do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis).

Estado do gene HER2 (K5731) Total

Não amplificado

Amplificado

Estado do gene HER2 (Dako Omnis)

Não amplificado

77 0 77

Amplificado 0 63 63

Total 77 63 140

APG: 100% APP: 100% APN: 100%

Figura 3. Correlação entre os rácios HER2/CEN-17 através do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e do HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731) em 140 amostras de cancro da mama (ajuste linear: y = 0,11 + 0,95*x; R2 = 0,97. Ponderado com variação inversa para permitir o ajuste linear).

Os rácios HER2/CEN-17 foram transformados em logaritmos para análise. O intervalo de confiança de 95% para a diferença média entre os dois métodos de coloração com o rácio HER2/CEN-17 = 2 foi considerado ser [0,002; 0,031]. Isto significa que não é esperada uma diferença superior a 3% com 95% de confiança.

A raiz do erro médio quadrático (RMSE) foi considerada ser de 9%, indicando o tamanho da flutuação média em torno do valor médio.

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Comparação dos resultados do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) com os resultados do kit de sondas de ADN HER-2 PathVysion

O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi comparado com o kit de sondas de ADN HER-2 PathVysion num estudo comparativo em 140 amostras de tecido humano de carcinoma da mama. As amostras consistiram em 80 casos de HER2 não amplificado e 80 casos de HER2 amplificado com a classificação conhecida do HercepTest™, conforme mostrado na tabela 5. Tabela 5. Distribuição de amostras com base na classificação do HercepTest™ e na classificação do HER2 FISH (estado do gene HER2), obtida com o HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731).


0 1+ 2+ 3+ Total

n 28 10 54 48 140





28 10 54 48 140

Os resultados da tabulação cruzada do estado do gene HER2, obtidos através dos dois ensaios com o cálculo do acordo de percentagens globais (APG), do acordo de percentagens positivas (APP) e do acordo de percentagens negativas (APN), são mostrados na tabela 6. A correlação entre os rácios HER2/CEN-17 com os dois ensaios é mostrada na figura 4. Tabela 6. Tabulação cruzada do estado do gene HER2, obtida através do kit de sondas de ADN HER-2 PathVysion e do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis).

Estado do gene HER2 (PathVysion) Total

Não amplificado

Amplificado


Não amplificado

80 0 80

Amplificado 0 60 60

Total 80 60 140

APG: 100% APP: 100% APN: 100%

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Figura 4. Correlação entre os rácios HER2/CEN-17 através do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e do PathVysion em 140 amostras de cancro da mama (ajuste linear: y = 0,01 + 0,98*x; R2 = 0,96. Ponderado com variação inversa para permitir o ajuste linear). Os rácios HER2/CEN-17 foram transformados em logaritmos para análise. O intervalo de confiança de 95% para a diferença média entre os dois métodos de coloração com o rácio HER2/CEN-17 = 2 foi considerado ser [0,001; 0,031]. Isto significa que não é esperada uma diferença superior a 3% com 95% de confiança.

A raiz do erro médio quadrático (RMSE) foi considerada ser de 10%, indicando o tamanho da flutuação média em torno do valor médio. Utilidade clínica na seleção de doentes para o tratamento com Herceptin™ (trastuzumab) O kit HER2 FISH pharmDxfoi investigado em estudos comparativos, tanto com o kit de sondas de ADN HER-2 PathVysion, como com o Dako HercepTest™. Os resultados do teste HER2 FISH estão disponíveis para um total de 940 amostras de cancro da mama. Comparação dos resultados do kit HER2 FISH pharmDxcom os resultados do teste do kit de sondas de ADN HER-2 PathVysion

Foram realizados três estudos que comparam os resultados do teste do kit HER2 FISH pharmDxcom os resultados do teste do kit de sondas de ADN HER-2 PathVysion (consultar a tabela 7). Os estudos foram realizados em locais geograficamente separados e não ocorreu uma sobreposição na utilização de amostras. Foram testadas, no total, 328 amostras. Tabela 7. Resumo de dados dos estudos de comparação de métodos FISH.

Designação do estudo

Estudo de concordância

(amostras dinamarquesas,

N=190)


(amostras japonesas, N=52)


(amostras francesas, N=86) (21)*

Concordância (intervalo de confiança de 95%)

93,68% (90,22% - 97,14%)

96,15% N/A

Acordo de percentagens positivas (intervalo de

confiança de 95%)

86% (77,34% - 95,08%)

97% N/A

Acordo de percentagens negativas (intervalo de

confiança de 95%)

97% (94,05% - 99,89%)

96% N/A

* Os dados de comparação foram fornecidos no artigo, mas o ensaio HER2 FISH não foi identificado.

Surgiram, no total, 12 resultados de teste discrepantes entre o teste do kit HER2 FISH pharmDxe o teste da sonda de ADN HER-2 PathVysion™ para as amostras clínicas dinamarquesas (consultar a tabela 8).

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Tabela 8. Resumo dos dados para os 12 resultados de teste discrepantes.

HER2 FISH (positivo)/PathVysion (negativo) HER2 FISH (negativo)/PathVysion (positivo)

N.º de ID

Rácio HER2 FISH

Rácio PathVysion

Classificação do

HercepTest

N.º de ID

Rácio HER2 FISH

Rácio PathVysion

Classificação do

HercepTest

160 2,10* (1,82-2,51)

1,51 (1,39-1,68)

2+ 234 1,68 (1,38-1,83)

2,02* (1,84-2,29)

2+

208 3,61 (2,95-4,73)

1,62 (1,51-1,82)

2+ 284 1,44 (1,07-1,83)

2,21* (1,94-2,64)

2+

306 2,20* (1,79-2,24)

1,33 (1,18-1,44)

1+ 423 1,7 (1,52-1,95)

2,15 (2,02-2,45)

1+

846 2,58 (2,06-3,50)

1,51 (1,42-1,76)

2+ 474 1,44 (1,16-1,83)

2,55 (2,38-3,26)

2+

735 1,68 (1,40-1,99)

2,03* (1,89-2,19)

2+

746 1,05 (0,96-1,18)

4,53 (4,27-5,17)

3+

837 1,52 (1,48-1,79)

2,15 (2,10-2,67)

3+

881 1,83* (1,15-2,69)

2,68 (2,39-3,14)

2+

* O IC dos rácios médios de logaritmos incluiu 2,0. Os números entre parênteses são o IC de 95%.

Nesta análise de discrepâncias, foram utilizados rácios de logaritmos. O intervalo de confiança de 95% foi calculado para os 60 rácios de logaritmos, a partir dos núcleos que foram utilizados para calcular o rácio de sondas de ADN HER-2 PathVysion. Para as 4 instâncias em que o kit HER2 FISH pharmDxfoi positivo e a sonda de ADN HER-2 PathVysion foi negativa, nenhum intervalo incluiu o valor crítico de 2. Das 8 instâncias em que o kit HER2 FISH pharmDxfoi negativo e a sonda de ADN HER-2 PathVysion foi positiva, o IC de 95% de 3 (n.º 234, 284 e 735) incluiu o valor crítico de 2. Do mesmo modo, o intervalo de confiança de 95% foi calculado para os rácios de logaritmos, a partir dos núcleos que foram utilizados para calcular o rácio do kit HER2 FISH pharm Dx™. Para as 4 instâncias em que o kit HER2 FISH pharmDxfoi positivo e a sonda de ADN HER-2 PathVysion foi negativa, 2 incluíram o valor crítico de 2 (n.º 160 e 306). Das oito instâncias em que o kit HER2 FISH pharmDxfoi negativo e a sonda de ADN HER-2 PathVysion foi positiva, o IC de 95% de 1 (n.º 881) incluiu o valor crítico de 2.

Comparação dos resultados do kit HER2 FISH pharmDxcom os resultados do HercepTest™ Foram realizados quatro estudos para comparar os resultados do kit HER2 FISH pharmDxcom os do HercepTest™. Foram comparadas, no total, 940 amostras, ao utilizar o resultado da classificação da coloração 3+ como um resultado IHC positivo no ensaio do HercepTest™ (consultar a tabela 9). Tabela 9. Resumo do kit HER2 FISH pharmDxe estudos de comparação IHC (HercepTest™).

Designação do estudo

Amostras clínicas

dinamarquesas (N=682)

Amostras japonesas

(N=52)

Estudo francês (N=86)

(31)

Estudo piloto dinamarquês (N=120) (22)

Concordância (intervalo de confiança de 95%)

93,11% (91,21% - 95,01%)

96,15% 87,21% 93,33%

Acordo de percentagens positivas (intervalo de confiança de 95%)

91% (87,39% - 94,57%)

96% 87% 84%

Acordo de percentagens negativas (intervalo de confiança de 95%)

94% (92,12% - 96,46%)

96% 87% 97%

Cancro da mama

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Os dados de distribuição do HercepTest™ e os resultados do teste HER2 FISH para as amostras clínicas dinamarquesas são apresentados na tabela 10. Tabela 10. Distribuição do estado do HER2 pelo HercepTest™ e pelo kit HER2 FISH pharmDx™.


0 1+ 2+ 3+ Total

n 221 267 84 248 820

% 27 33 10 30 100%




Número total de amostras testadas com FISH 106 253 79 244 682

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Resolução de problemas - Mama

Problema Causa provável Ação sugerida

1. Sinais inexistentes ou fracos

1a. Os reagentes foram expostos a temperaturas elevadas durante o transporte ou a conservação

1a. Verificar as condições de conservação. Garantir que estava presente gelo seco quando foram recebidas as remessas de mistura de sondas IQISH e pepsina. Garantir que os reagentes foram conservados conforme especificado.

1b. O microscópio não funciona corretamente

- Conjunto de filtros inadequado

- Lâmpada inapropriada - Lâmpada de mercúrio

demasiado velha - Lentes do coletor sujas

e/ou partidas - Óleo de imersão

inadequado

1b. Examinar o microscópio e verificar se os filtros utilizados são adequados para usar com os fluorocromos da mistura de sondas e se a lâmpada de mercúrio é correta e não está a ser utilizada para além do seu prazo de validade (consultar Anexo 2). Em caso de dúvida, contactar o fornecedor local do microscópio.

1c. Sinais fracos

1c. Evitar utilizar o microscópio durante longos períodos e minimizar a exposição a fontes de luz fortes.

1d. Tampões incorretamente identificados

1d. Substituir tampões dos reservatórios e garantir um registo (na estação de trabalho) e identificação (no ecrã tátil) corretos dos tampões dos reservatórios. Consultar o guia do utilizador básico do Dako Omnis para detalhes adicionais. Tenha em atenção: a ISH Pre-Treatment Solution é verde e a ISH Stringent Wash Buffer é amarela.

2. Áreas sem sinal 2. Bolhas de ar retidas durante a montagem

2. Evitar bolhas de ar. Caso sejam observadas, bater levemente com os fórceps para as eliminar.

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3. Coloração de fundo excessiva

3a. Fixação inapropriada do tecido

3a. Certificar-se de que apenas são utilizados cortes de tecido impregnados em parafina e fixados em formol.

3b. Exposição prolongada do corte hibridizado à luz forte

3b. Evitar utilizar o microscópio durante longos períodos e minimizar a exposição à luz forte.

4. Morfologia deficiente do tecido

4a. Tratamento incorreto da pepsina

4a. Mudança para outro dos três protocolos de coloração diferentes. Garantir que a ISH Pepsin (Dako Omnis) é conservada à temperatura correta.

4b. Tratamento demasiado longo com pepsina ou corte de espessura muito fina poderão resultar no aparecimento de células fantasma ou células tipo donut

4b. Experimentar um protocolo de coloração com tempo de incubação mais curto da pepsina. Garantir que a espessura do corte corresponde a 4-6 µm.

5. Elevado nível de fluorescência automática verde na lâmina, incluindo áreas sem tecido FFPE

5. Utilização de lâminas de vidro expiradas ou não recomendadas

5. Escolher lâminas de vidro conforme especificado. Garantir que as lâminas de vidro não ultrapassaram a data de validade.

NOTA: se o problema não for atribuído a qualquer uma das causas acima ou se a ação corretiva sugerida falhar em resolver o problema, chamar a Assistência técnica Dako para a resolução do problema.

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Anexo 1 - Mama

HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis), referência GM333

Esquema de classificação

ID de registo do processo de coloração: __________

Data do processo: __________________

Lote do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis): ____________ ID da amostra: ________________

Contar os sinais em 20 núcleos

N.º do núcleo

Classificação do HER2

(vermelho)

Classificação do CEN-17

(verde)

N.º do núcleo


(vermelho)


(verde)

1 11

2 12

3 13

4 14

5 15

6 16

7 17

8 18

9 19

10 20

Total (1-10)

Total

(11-20)

Para determinação do rácio HER2/CEN-17, contar o número de sinais de HER2 e o número de sinais de CEN-17 nos mesmos 20 núcleos e dividir o número total de sinais de HER2 pelo número total de sinais de CEN-17. Se o rácio HER2/CEN-17 se encontrar no limite aceitável (1,8-2,2), contar mais 20 núcleos e calcular novamente o rácio para os 40 núcleos.

Os resultados que se situem no ou perto do ponto de corte (1,8 a 2,2) devem ser interpretados com cuidado (consultar o guia de contagem).

HER2 CEN-17 Rácio HER2/CEN-17

Classificação total (1-20)

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Contar os sinais em 20 núcleos adicionais

N.º do núcleo


(vermelho)


(verde)

N.º do núcleo


(vermelho)


(verde)

21 31

22 32

23 33

24 34

25 35

26 36

27 37

28 38

29 39

30 40

Total (21-30)

Total

(31-40)

Calcular o rácio HER2/CEN-17 com base nos 40 núcleos contados.



Rácio < 2: não se observou uma amplificação do gene HER2

Rácio ≥ 2: observou-se uma amplificação do gene HER2

Data e assinatura do técnico:

Data e assinatura do patologista:

Para as diretrizes de classificação: consultar a secção Interpretação da coloração.

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Anexo 2 - Mama


Especificações do microscópio de fluorescência

A Dako recomenda o seguinte equipamento para utilização com o HER2 IQFISH pharmDx™, (Dako Omnis), GM333: 1. Tipo de microscópio

• Microscópio de epifluorescência.

2. Lâmpada

• Lâmpada de mercúrio de 100 watts (manter um registo sobre o tempo de iluminação).

3. Objetivas

• Para a análise do tecido, aplicam-se as objetivas com óleo de imersão 16x ou 20x.

• Para uma maior ampliação de potência e contagem dos sinais, apenas são recomendadas objetivas com óleo de imersão, por exemplo, 100x.

4. Filtros Os filtros são individualmente concebidos para fluorocromos específicos, devendo ser escolhidos em conformidade com os mesmos. A Dako recomenda a utilização de um filtro DAPI específico, em combinação com um filtro duplo Texas Red/FITC de alta qualidade.

• Filtro DAPI

• Filtro duplo Texas Red/FITC

• Poderão ser utilizados filtros individuais Texas Red e FITC para confirmação e contagem.

Fluorocromo Comprimento da onda de excitação

Comprimento da onda de emissão

FITC 495 nm 520 nm

Texas Red 596 nm 615 nm

Os filtros são específicos de cada tipo de microscópio e a utilização de filtros adequados é crucial para a interpretação dos resultados. Caso deseje obter informações detalhadas, contacte o fornecedor do seu microscópio ou o seu representante da Dako.

5. Óleo

• Óleo não fluorescente.

Precauções

• Não se recomenda a utilização de uma lâmpada de mercúrio de 50 watts.

• Não se podem utilizar filtros de rodamina.

• Não se recomendam os filtros triplos.

Um microscópio não otimizado pode causar problemas na interpretação dos sinais fluorescentes. É importante que a fonte de luz não tenha expirado, que esteja devidamente alinhada e a focar corretamente.

O cliente deve monitorizar e acompanhar as recomendações do fabricante relativamente à lâmpada de mercúrio. O microscópio deve ser mantido e a lâmpada de mercúrio deve ser colocada em alinhamento antes da interpretação dos resultados.

Dever-se-á tentar expor a amostra ao mínimo de luz de excitação possível, de modo a minimizar o esbatimento da fluorescência.

Recomendamos que o cliente discuta a preparação do seu microscópio específico com o seu fabricante antes de iniciar o processo de hibridização de fluorescência in situ ou que consulte a correspondente literatura.

Cancro gástrico

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Resumo e Explicação - Gástrico O gene humano HER2 (também denominado ERBB2 ou NEU) encontra-se localizado no cromossoma 17 e codifica a proteína HER2 ou p185HER2. A proteína HER2 é uma tirosina cinase do recetor da membrana com certa homologia com o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR ou HER1) (1-2). O gene HER2 encontra-se presente em duas cópias em todas as células diploides normais.

A hiperexpressão da proteína HER2 e a amplificação do gene HER2 no cancro gástrico foram demonstradas num grande número de estudos [revistos em (23)]. É possível detetar a positividade HER2 em aproximadamente 20% dos doentes, com IHC ou FISH (23). Estudos pré--clínicos efetuados in vitro e in vivo demonstraram que o trastuzumab (Herceptin™) é eficaz em diferentes modelos de cancro gástrico, o que levou ao início de vários estudos clínicos (23-27).

Todos os doentes incluídos no estudo de fase III BO18255 (ToGA, "Um estudo de fase III sem dupla ocultação, aleatorizado e multicêntrico do traustuzumab, em combinação com uma fluoropirimidina e cisplatina versus quimioterapia isoladamente como terapêutica de primeira linha em doentes com cancro gástrico avançado HER2 positivo"), promovido pela Hoffmann-La Roche AG, foram selecionados através do Dako HercepTest™ (IHC) e do kit Dako HER2 FISH pharmDx(FISH) com positividade HER2 definida como IHC 3+ ou FISH+ (HER2/CEN-17 ≥ 2,0). O estudo demonstrou a utilidade clínica tanto do HercepTest™ (IHC) como do kit HER2 FISH pharmDx(FISH) para a avaliação do estado do HER2 em doentes com adenocarcinoma gástrico ou da junção gastroesofágica avançado para os quais está a ser ponderado um tratamento com trastuzumab (28).

Não foram inscritos doentes cujos tumores não apresentavam uma amplificação do gene mas com uma hiperexpressão forte a fraca da proteína HER2 [FISH(-)/IHC 2+]. Por conseguinte, não é claro se os doentes cujos tumores não apresentam uma amplificação do gene mas apresentam uma hiperexpressão da proteína HER2 [ou seja, FISH(-), IHC 2+ ou 3+] beneficiariam do tratamento com Herceptin™. O estudo demonstrou ainda que a amplificação do gene (FISH) e a hiperexpressão da proteína (IHC) não estão assim tão correlacionadas como sucede com o cancro da mama. Por conseguinte, não se deve utilizar apenas um método para determinar o estado do HER2.

Este produto [HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis)] é uma mistura de sondas IQISH para FISH direta automatizada, para a deteção da amplificação do gene HER2. Este produto deve ser utilizado em conjunto com os reagentes acessórios no instrumento Dako Omnis e deriva do ensaio de amplificação do gene HER2 de execução manual, HER2 IQFISH pharmDx™, referência K5731.

Princípio de Procedimento - Gástrico O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é uma sonda IQISH, composta por uma mistura de sondas de ADN marcado com Texas Red, abrangendo uma região de 218 kb, incluindo o gene HER2 no cromossoma 17 e uma mistura de sondas de ácido péptido nucleico (APN) marcado com fluoresceína (13) que têm por alvo a região centromérica do cromossoma 17 (CEN-17). A hibridização específica dos dois alvos resulta na formação de um sinal fluorescente vermelho distinto em cada locus do gene HER2 e um sinal fluorescente verde distinto em cada centrómero do cromossoma 17.

A avaliação da amplificação do gene HER2 utilizando o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é um método totalmente automatizado no instrumento Dako Omnis. É possível selecionar três diferentes protocolos de coloração do HER2 FISH validados no software da estação de trabalho Dako Link Omnis. Os protocolos diferem apenas a nível do tempo de digestão da pepsina: consequentemente, pode ser escolhida uma digestão da pepsina durante 10 minutos (o protocolo Curto), 15 minutos (o protocolo Médio) ou 20 minutos (o protocolo Longo) (consultar mais abaixo). O protocolo Médio é recomendado para a análise inicial.

Cancro gástrico

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Após a coloração no Dako Omnis, as amostras são montadas com Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e cobertas com uma lamela. Utilizando um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados (consultar Anexo 5), localizam-se as células tumorais e efetua-se a contagem dos sinais vermelho (HER2) e verde (CEN-17). A seguir, calcula-se o rácio HER2/CEN-17. As células normais contidas no corte de tecido analisado servirão como controlo positivo interno da eficácia do pré-tratamento e da hibridização.

Para mais informações, consultar a secção Interpretação da coloração.

Consulte o(s) guia(s) do utilizador do Dako Omnis para instruções detalhadas sobre o carregamento e descarregamento de lâminas, tampas ISH (Dako Omnis), referência GC102, reagentes, líquidos dos reservatórios grandes e resíduos.

Reagentes - Gástrico O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e os reagentes acessórios podem ser encomendados em separado como reagentes únicos. Materiais fornecidos

HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis): mistura pronta a usar de 1,6 mL, composta por sondas de ADN HER2 marcado com Texas Red e sondas de APN CEN-17 marcado com fluoresceína, fornecida numa solução tampão de hibridização IQISH. O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é enviado em gelo seco. Para garantir que o reagente não foi exposto a temperaturas elevadas durante o transporte, deve verificar-se se o gelo seco ainda se encontra presente aquando da receção do reagente. Os frascos de reagente, com conteúdo congelado, devem ser conservados e tratados numa posição vertical em todas as ocasiões. O frasco de reagente contém uma esfera de metal revestida a ouro que permite a mistura do reagente utilizando o dispositivo de mistura Dako Omnis (consultar o guia do utilizador do dispositivo de mistura Dako Omnis). É importante que o reagente seja cuidadosamente misturado antes de ser carregado no Dako Omnis. Materiais necessários, mas não fornecidos

Reagentes acessórios Os seguintes reagentes são necessários no instrumento Dako Omnis para a realização da análise da amplificação do gene HER2 com HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis):

ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 mL, concentrado 20x; a diluir num reservatório grande Dako Omnis de 3,5 L (referência GC109). O produto contém um agente antimicrobiano e uma cor inerte verde para uma identificação fácil e rápida.

ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 mL de etanol a 96% (pronta a usar).

ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 mL de solução de pepsina A (pronta a usar), pH 2,0; contém estabilizador e um agente antimicrobiano. A pepsina é enviada acondicionada em gelo seco.

Para garantir que o reagente não foi exposto a temperaturas elevadas durante o transporte, deve verificar-se se o gelo seco ainda se encontra presente aquando da receção do reagente.

ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 mL de tampão soro-citrato sódico concentrado 20x; a diluir numa proporção de 1:20 num reservatório grande Dako Omnis de 3,5 L (referência CG109). O produto contém um agente antimicrobiano, um detergente e uma cor inerte verde para uma identificação fácil e rápida.

Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 mL de meio de montagem de fluorescência (pronto a usar), com DAPI.

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Embora os reagentes referidos acima não sejam fornecidos com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis), eles são brevemente descritos de seguida. Consulte as instruções de utilização de cada dispositivo para obter informações adicionais. Reagentes e dispositivos adicionais Dako Omnis, referência GI100

Tampão de lavagem (20x) (Dako Omnis), referência GC807

Clearify™, referência GC810

Dispositivo de mistura Dako Omnis, referência GC116

Tampa ISH, referência GC102

ISH Cleaning Solution, referência GC207

Lamelas de vidro para montagem (24 mm x 50 mm)

Consulte os guias básico e avançado do utilizador do Dako Omnis para a utilização de reagentes e dispositivos adicionais. Microscópio e acessórios Filtros para microscópio de fluorescência: DAPI e filtro duplo FITC/Texas Red ou monofiltros FITC e Texas Red - consultar Anexo 5 para detalhes. O uso do filtro DAPI com uma ampliação alta afeta negativamente a intensidade do sinal. Devem ser evitados tempos de exposição longos.

O microscópio de fluorescência com uma lâmpada de mercúrio de 100 watts deve ser utilizado como fonte de luz. Não se recomenda a utilização de outras fontes de luz com estes filtros.

Pasta de lâminas de microscópio (tabuleiro em cartão para 20 lâminas com cobertura articulada ou semelhante).

Precauções - Gástrico 1. Para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Para utilizadores profissionais. 3. O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) contém carbonato de etileno a ≥10-<25% e ≥3-<5%

sodium chloride. HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) está marcado:

Atenção H319 Provoca irritação ocular grave. P280 Usar proteção ocular ou facial. P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar

cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar.

Como regra geral, as pessoas com idade inferior a 18 anos não estão autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser cuidadosamente instruídos sobre o procedimento de trabalho adequado, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consultar a ficha de dados de segurança para obter informações adicionais.

4. As amostras de tecido, antes e depois da sua fixação, bem como todos os materiais expostos às mesmas, devem ser manipulados tal como potencialmente infeciosos e devem ser descartados com as devidas precauções (14). Nunca pipetar os reagentes com a boca e evitar o contacto da pele e membranas mucosas com os reagentes e as amostras. Se os reagentes entrarem em contacto com áreas sensíveis, lavar com grandes quantidades de água.

5. Minimizar a contaminação microbiana do reagente para evitar resultados incorretos.

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6. Métodos de fixação dos tecidos e espessura das amostras diferentes dos especificados poderão afetar a morfologia dos tecidos e/ou a intensidade do sinal.

7. O reagente foi idealmente diluído. Uma maior diluição poderá resultar numa quebra do desempenho.

8. Utilizar equipamento de proteção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. Consultar a Ficha de Dados de Segurança do Material (FDSM) para obter informações adicionais.

9. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais, nacionais e comunitárias.

10. Devido à natureza heterogénea das amostras de cancro gástrico, é importante efetuar um exame completo de toda a amostra para avaliar a distribuição dos sinais antes de selecionar a área para enumeração dos sinais.

11. Não é recomendada a avaliação de amostras muito pequenas (ou seja, as amostras devem ter uma morfologia intacta e núcleos suficientes para enumeração).

12. Se a análise HER2 FISH for realizada numa amostra de biopsia, deve proceder-se à análise de várias (7-8) biopsias avaliáveis de diferentes regiões do tumor para assegurar uma determinação fiável do estado do HER2.

13. Para a identificação de todos os núcleos de tecido numa amostra de biopsia, é importante inspecionar a lâmina corada com H&E.

14. A amplificação do gene HER2 e a hiperexpressão da proteína HER2 não estão tão bem correlacionadas no cancro gástrico como no cancro da mama. Por conseguinte, não se deve utilizar apenas um método para determinar o estado do HER2.

Conservação - Gástrico Conservar o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) a <−18 °C (−18 °C a −25 °C é o intervalo recomendado) no escuro. Manter o frasco de reagente descongelado numa posição vertical em todas as ocasiões. A congelação e a descongelação do reagente até um máximo de 10 vezes não afetam o desempenho. Não deixar estes componentes à temperatura ambiente.

O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e os reagentes acessórios ISH Pepsin (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) poderão ser afetados negativamente pela exposição ao calor. Não deixar estes componentes à temperatura ambiente.

O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e os reagentes acessórios Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) poderão ser afetados negativamente pela exposição a níveis de luz excessivos. Não conservar estes componentes nem realizar a análise a uma luz forte como, por exemplo, a luz solar direta.

Conservar os reagentes acessórios ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) no escuro a 2-8 °C. Conservar a ISH Pepsin (Dako Omnis) a −18-8 °C. A tampa do frasco, incluindo a tampa com abertura da parte superior, deve ser fechada em todos os reagentes durante a conservação.

As soluções diluídas (solução de trabalho ISH Stringent Wash Buffer e solução de trabalho ISH Pre-Treatment Solution) podem ser conservadas a 2-8 °C durante 30 dias.

Não utilizar os reagentes após o fim da data de validade impressa no recipiente do reagente. Durante a conservação, a tampa, incluindo a tampa com abertura da parte superior, deve ser fechada. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá validar o desempenho do reagente (15).

Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Portanto, convém avaliar células normais no corte de tecido analisado. Se for observado um padrão de fluorescência inesperado que não possa ser explicado e caso se suspeite de um problema com o HER2 IQFISH pharmDx™, contacte a Assistência técnica Dako.

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Estabilidade de utilização no instrumento Dako Omnis A estabilidade de utilização do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) e dos reagentes acessórios - ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis) - é de 80 horas. A estabilidade de utilização da ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluída e do ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) é de 7 dias. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis. A utilização de reagentes fora do prazo irá resultar num aviso do equipamento Dako Omnis; todas as lâminas coradas com o reagente fora do prazo irão mudar para o estado "suspeito" e o registo das lâminas na estação de trabalho irá identificar a utilização de um reagente fora do prazo.

Preparação das Amostras - Gástrico As amostras de adenocarcinoma gástrico ou da junção gastroesofágica resultantes de biopsias, excisões ou resseções devem ser manuseadas de modo a preservar o tecido para a análise FISH. Devem ser utilizados, para todas as amostras, métodos padrão de processamento de tecidos para coloração imuno-histoquímica (16). Quando se testam amostras de biopsia de pequenas dimensões, garantir uma morfologia tumoral intacta e a presença de núcleos suficientes para contagem. Se a análise HER2 FISH for realizada numa amostra de biopsia, deve proceder-se à análise de várias (7-8) biopsias avaliáveis de diferentes regiões do tumor para assegurar uma determinação fiável do estado do HER2. Cortes impregnados em parafina Somente tecidos preservados em formol neutro tamponado e impregnados em parafina são adequados para utilização. As amostras devem, p. ex., ser bloqueadas a uma espessura de 3 ou 4 mm e fixadas durante 18 a 24 horas em formol tamponado neutro. As amostras de biopsia foram fixadas durante 6-8 horas no ensaio ToGA [para referência do estudo, consultar (28)]. Os tecidos são então desidratados numa série graduada de etanol e xilol, seguindo-se a sua

infiltração com parafina derretida, mantida a uma temperatura não superior a 60 C. Os tecidos devidamente fixados e impregnados conservar-se-ão por um período indefinido antes de serem

seccionados e montados em lâminas, caso sejam conservados em local fresco (15-25 C) (16-17). Não são adequados outros agentes de fixação.

As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de 3-6 µm.

As lâminas necessárias para a análise de amplificação do gene HER2 e para a verificação da presença do tumor devem ser preparadas ao mesmo tempo. Recomenda-se um mínimo de dois cortes em série, um corte para a presença do tumor, colorida com hematoxilina e eosina (coloração H&E) e um corte para a análise de amplificação do gene HER2. Recomenda-se a montagem dos cortes de tecido em Dako FLEX IHC Microscope Slides, referência K8020. Superfrost Plus slides (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) são também adequadas. Garantir que as lâminas de vidro não ultrapassaram a data de validade. As amostras devem ser

analisadas num período de <6 meses após o seccionamento, quando conservadas a 2-25 C.

NOTA: as amostras de tecido têm de ser colocadas na lâmina de vidro dentro da área definida de coloração da lâmina. Consulte o guia básico do utilizador do Dako Omnis para obter as dimensões da área de coloração da lâmina.

INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO - Gástrico

A. Preparação dos Reagentes - Gástrico A.1 HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) O frasco do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) contém uma esfera de metal revestida a ouro que é utilizada para mistura. Antes do carregamento do frasco no Dako Omnis, o reagente deve

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ser descongelado e cuidadosamente misturado, uma vez que a fase se separa durante a congelação.

Utilizar o dispositivo de mistura Dako Omnis para a mistura de sondas.

Seguir o procedimento abaixo para a mistura de sondas no dispositivo de mistura Dako Omnis e consultar o guia do utilizador do dispositivo de mistura para obter detalhes adicionais.

1. Retirar o frasco do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) do congelador.

2. Carregar o frasco no dispositivo de mistura Dako Omnis.

3. Ligar o dispositivo de mistura e garantir que a luz verde de estado está acesa.

4. Selecionar o programa "Descongelar + misturar". Importante: os frascos conservados a uma temperatura inferior a −25 °C devem ser descongelados (apenas imediatamente) antes de carregar o frasco no dispositivo de mistura Dako Omnis, devendo ser utilizado o programa "Misturar".

5. Remover o frasco do dispositivo de mistura.

6. Abrir a tampa com abertura da parte superior, virar para trás e encaixar na posição de corte (consultar o guia básico do utilizador do Dako Omnis para detalhes).

7. Carregar de imediato o frasco no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no instrumento Dako Omnis. No caso do uso da funcionalidade de carregamento de reagente durante o processo de coloração, garantir que o período de tempo desde a mistura até à aspiração do frasco no Dako Omnis corresponde a, pelo menos, 10 minutos.

A sonda HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) pode ser redescongelada e utilizada até 10 vezes.

Misturar sempre a mistura de sondas HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) imediatamente antes de carregá-la no instrumento. Não agitar. A estabilidade de utilização total do ISH HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é de 80 horas, quando conservado no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis (consultar acima). Após o período de tempo no instrumento Dako Omnis, o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) deverá ser imediatamente transferido para < −18 °C (−18 °C a -25 °C é o intervalo recomendado). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Preparar uma solução de trabalho, diluindo o concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) a 1:20 do seguinte modo:


2. Deitar os 175 mL de um frasco de concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) no reservatório grande.



5. Colocar imediatamente o reservatório grande no equipamento Dako Omnis. A solução diluída pode ser utilizada no período de 7 dias quando conservada no equipamento Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis

(consultar acima). A solução diluída não utilizada pode ser conservada a 2-8 C durante 30 dias.

Após a conservação a frio, garantir que a solução diluída é ajustada para, pelo menos, 18 C antes do carregamento no Dako Omnis.

NOTA: eliminar a solução diluída, caso esta fique turva.

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A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Preparar uma solução de trabalho, diluindo o concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) a 1:20 do seguinte modo:


2. Deitar os 175 mL de um frasco de concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) no reservatório grande.



5. Colocar imediatamente o reservatório grande no instrumento Dako Omnis.

A solução diluída pode ser utilizada no período de 7 dias quando conservada no equipamento Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis (consultar acima). A solução diluída não utilizada pode ser conservada a 2-8 °C até 30 dias. Após a conservação a frio, garantir que a solução diluída é ajustada até pelo menos 18 °C antes do carregamento no Dako Omnis.

NOTA: eliminar a solução diluída, caso esta fique turva. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) A ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) é um reagente pronto a usar. Antes de carregar no Dako Omnis, abrir a tampa com abertura da parte superior, virar para trás e encaixar na posição de corte.

A estabilidade de utilização total da ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) é de 80 horas quando conservada no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis (consultar acima). Após a conclusão do processo, a ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) pode ser transferida para a temperatura de conservação (2-8 °C) para preservar o tempo de estabilidade de utilização. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) A ISH Pepsin (Dako Omnis) é um reagente pronto a usar. Antes de carregar no Dako Omnis, garantir que o reagente é descongelado e abrir a tampa do frasco com abertura da parte superior, virar para trás e encaixar na posição de corte.

A estabilidade de utilização total da ISH Pepsin (Dako Omnis) é de 80 horas, quando conservada no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes) no Dako Omnis. A estabilidade de utilização restante é controlada pelo software Dako Omnis (consultar acima). Após a conclusão do processo, a ISH Pepsin (Dako Omnis) deve ser transferida para a temperatura de conservação a −18-8 °C para preservar o tempo de estabilidade de utilização. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) O Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) é um meio de montagem pronto a usar utilizado fora do instrumento Dako Omnis. Transferir o Fluorescence Mounting Medium para a temperatura de conservação (2-8 °C) imediatamente após a sua utilização. A.7 Acessórios adicionais Os seguintes acessórios devem ser adicionalmente carregados no Dako Omnis: água desionizada, tampão de lavagem diluído 20x (Dako Omnis), referência GC807, Clearify™ (Dako Omnis), referência GC810, ISH Cleaning Solution, referência GC207 e tampa ISH (Dako Omnis), referência GC102, conforme especificado no(s) guia(s) do utilizador do Dako Omnis.

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B. Procedimento de Coloração - Gástrico B.1 Notas do procedimento O HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) é a sonda de hibridização para a fluorescência direta automatizada no ensaio de hibridização in situ (FISH) no instrumento Dako Omnis e é, em conjunto com os reagentes acessórios GM300, GM301, GM302, GM303 e GM304 (GM304 fora do instrumento), concebido para a determinação quantitativa da amplificação do gene HER2. Antes da utilização, o utilizador deve ler todas as instruções com cuidado e familiarizar-se com todos os componentes e respetivas precauções.

O procedimento automatizado no Dako Omnis inclui a desparafinação de cortes de tecido, a recuperação de alvo, a digestão de pepsina, a hibridização e a lavagem rigorosa. As lâminas são descarregadas na estação de saída seca. Todas as etapas do protocolo estão pré-programadas no software Dako Omnis.

Consultar o(s) guia(s) do utilizador do Dako Omnis para instruções sobre o carregamento de lâminas, tampa ISH, reagentes, etc. Três protocolos HER2 IQFISH validados: HER2 IQFISH Pepsina Curto, HER2 IQFISH Pepsina Médio e HER2 IQFISH Pepsina Longo, que apenas diferem no tempo de digestão da pepsina, estão pré-programados no software Dako Omnis e podem ser selecionados para cada uma das cinco lâminas no suporte de lâminas. Isto permite a otimização da digestão do tecido, o que pode depender de condições pré-analíticas. O protocolo HER2 IQFISH Pepsina Médio é considerado o protocolo padrão. Os diferentes protocolos de coloração podem ser vistos na estação de trabalho Dako Link Omnis.

Além disso, o utilizador pode optar por utilizar um Template IQFISH protocol. As condições ideais poderão variar dependendo do tipo de amostras e do método de preparação, devendo ser validadas por cada laboratório. B.2. Procedimento de pré-coloração

1. Escolher o protocolo HER2 IQFISH a aplicar a cada lâmina a partir do software na estação de trabalho Dako Link Omnis, em protocolos IQFISH.

2. Imprimir etiquetas de lâminas e afixá-las nas lâminas de vidro.

3. Colocar as lâminas no suporte de lâminas. Consultar o guia do utilizador básico do Dako Omnis para detalhes. Um suporte de lâminas tem capacidade para suportar entre uma e cinco lâminas. Recomenda-se a coloração de, pelo menos, duas lâminas num processo de coloração do HER2 IQFISH.

4. Carregar o suporte de lâminas no Dako Omnis.

5. Carregar a tampa ISH (uma tampa ISH por suporte de lâminas) no Dako Omnis.

6. Garantir que os reservatórios grandes com fluidos estão no equipamento e são registados pelo instrumento Dako Omnis. Fluidos de reservatórios grandes: Clearify™ (agente de limpeza), ISH Pre-Treatment Solution diluída (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer diluído (Dako Omnis) e Tampão de lavagem diluído (Dako Omnis).

7. Carregar a ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), a ISH Pepsin (Dako Omnis) e o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) recentemente misturado e ISH Cleaning Solution (Dako Omnis) no Reagent Storage Module (Módulo de conservação de reagentes). Garantir que todas as tampas com abertura da parte superior dos frascos estão abertas.

8. Seguir as instruções apresentadas no ecrã tátil e tocar em "Done" (Concluído) para iniciar o procedimento de coloração.

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B.3. Procedimento de coloração O procedimento de coloração do HER2 IQFISH no instrumento Dako Omnis (resumido na tabela 11) pode ser monitorizado na estação de trabalho Dako Link Omnis: Tabela 11. Descrição geral simplificada das etapas do protocolo de coloração do HER2 IQFISH.

Etapa Reagente Tempo e temperatura

Remoção de cera Clearify™ (agente de limpeza) 10 minutos, 38 °C

Recuperação do alvo

ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis)

15 minutos, 97 ˚C

Lavagem

ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis)

2 x 3 minutos, 32 °C

Digestão* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minutos, 15 minutos ou 20 minutos

Secagem 15 minutos, 45 °C

Desnaturação 10 minutos, 66 °C

Hibridização HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis)

75 minutos, 45 °C

Lavagem rigorosa ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis)

10 minutos, 61 °C

* É possível escolher três tempos de digestão da pepsina validados utilizando os protocolos HER2 IQFISH acima indicados.

Caso não estejam iminentes colorações de ISH adicionais, transferir todos os reagentes para as temperaturas de conservação recomendadas. B.4. Procedimento de pós-coloração Descarregar as lâminas e aplicar até 30 µL do Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), contendo DAPI, na área alvo da lâmina. O corte de tecido deve estar totalmente coberto pelo Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Aplicar uma lamela de vidro.

NOTA: as lâminas poderão ser analisadas 15 minutos depois ou no período de 7 dias após a montagem. Contudo, se as lâminas ficarem expostas à luz ou a temperaturas elevadas, dar-se-á o esmorecimento da amostra. Para minimizar o esmorecimento, conservar as lâminas num local

escuro a −18-8 C.

Controlo de Qualidade - Gástrico 1. Os sinais devem ser evidentes, distintos e fáceis de avaliar.

2. As células normais permitem um controlo interno do processo de coloração.

• As células normais devem ter 1-2 sinais verdes claramente visíveis, o que indica que a sonda de APN CEN-17 se hibridizou efetivamente na região centromérica do cromossoma 17.

• As células normais devem ter ainda 1-2 sinais vermelhos claramente visíveis, o que indica que a sonda de ADN HER2 se hibridizou efetivamente no(s) gene(s) HER2.

• Devido ao seccionamento do tecido, algumas células normais terão menos do que os dois sinais de cada cor antecipados.

• A não deteção de sinais nas células normais indica a falha do ensaio e os resultados devem ser considerados inválidos.

3. A morfologia nuclear deverá estar intacta quando avaliada utilizando um filtro DAPI. Numerosas células fantasma e uma fraca morfologia nuclear geral indicam uma sobredigestão da amostra, resultando em perda ou fragmentação dos sinais. Tais amostras devem ser consideradas inválidas.

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4. Um mínimo de 20 células tumorais deve ser avaliável.

5. Quaisquer diferenças na fixação, processamento e impregnação dos tecidos no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade nos resultados, sendo necessária a avaliação regular de controlos internos.

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Interpretação da Coloração - Gástrico

Tecido avaliável Localizar o tumor, dentro do contexto da lâmina corada com H&E e interpretar a mesma área na lâmina corada com FISH (no filtro DAPI). Só devem ser analisadas as amostras de doentes com adenocarcinoma do estômago ou da junção gastroesofágica. Nos casos em que na mesma amostra existir metaplasia intestinal e adenocarcinoma, apenas o componente do carcinoma deve ser classificado. Evitar áreas com inflamação acentuada, necrose e áreas onde as orlas nucleares estejam em estado ambíguo. Não incluir os núcleos que exijam uma avaliação subjetiva. Não incluir os núcleos com fraca intensidade de sinais e um fundo elevado ou não específico.

Começar com uma avaliação microscópica da secção completa corada com FISH e a área atribuída na secção H&E, respetivamente. Antes de contar a secção corada com FISH, anotar a distribuição global do sinal (homogénea ou heterogénea) na folha de contagem de sinais. No caso de distribuição heterogénea, anotar se está presente amplificação focal ou amplificação de células únicas (mosaico).

1) Distribuição homogénea dos sinais Se a distribuição dos sinais for homogénea, enumerar o número de centrómeros do cromossoma (sinais verdes) e o número de genes HER2 (sinais vermelhos) respetivamente, de 20 células em 1-2 áreas tumorais representativas.

2) Distribuição heterogénea dos sinais No caso da distribuição dos sinais ser heterogénea, contar um total de 20 células nas áreas selecionadas, conforme especificado abaixo: A) Se existir amplificação focal, devem ser selecionadas as áreas com células amplificadas. B) Se a distribuição for em mosaico ou amplificada, estiverem presentes células polissomais e dissomais, contar em áreas com células amplificadas. Dentro destas áreas, devem ser contadas não apenas as células amplificadas mas também as células adjacentes não amplificadas num total de 20 células.

Se for possível, não selecionar áreas sobrepostas.

Ignorar a coloração de ADN bacteriano Algumas células especializadas (mastócitos e macrófagos), presentes de forma espaçada no tecido gástrico, apresentam um nível de coloração elevado pela sonda HER2, devido à presença de ADN bacteriano. Isto resulta em células fluorescentes altamente vermelhas, que são claramente distintas das células tumorais com amplificação do gene HER2 elevada.

Contagem dos sinais Quando uma área tiver sido selecionada para avaliação dos sinais, iniciar a análise num dos 20 núcleos escolhidos adjacentes e depois contar célula a célula, deixando de parte apenas núcleos que não cumpram os critérios de qualidade. Localizar o tumor, dentro do contexto da lâmina corada com H&E e avaliar a mesma área na lâmina corada com FISH. Ler a lâmina corada inteira para explicar a possível heterogeneidade. Selecionar uma área com uma boa distribuição de núcleos. Iniciar a análise no quadrante superior esquerdo da área selecionada e, examinando-a da esquerda para a direita, contar o número de sinais que se encontrem dentro dos limites nucleares de cada núcleo avaliado de acordo com as orientações fornecidas a seguir (consultar ainda o Anexo 5).

- Focar para cima e para baixo para localizar todos os sinais nos núcleos individuais.

- Contar dois sinais que sejam do mesmo tamanho e se encontrem separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro do sinal como sendo apenas um sinal. A distância tem que ser pelo menos igual ao diâmetro de um sinal de tamanho normal, para que se contem dois sinais individuais. Quando a distância entre dois sinais for menor do que o diâmetro de um sinal, este tem que ser contado como um.

- Nos núcleos que contenham níveis elevados de amplificação do gene HER2, os sinais de HER2 podem estar posicionados muito próximo uns dos outros, formando aglomerações de

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sinais. Nestes casos, o número de sinais de HER2 não pode ser contado, devendo antes ser calculado. Deve prestar-se uma atenção especial aos sinais verdes, já que as aglomerações de sinais de HER2 vermelhos podem cobrir os sinais verdes, tornando impossível a sua visualização. Em caso de dúvida, verifique os sinais verdes com a ajuda de um filtro FITC específico.

Não incluir na classificação os núcleos sem sinais ou com sinais de apenas uma cor. Classificar apenas os núcleos com um ou mais sinais FISH de cada cor.

Guia de contagem de sinais

1

Não contar. Os núcleos encontram-se sobrepostos e nem todas as áreas dos núcleos se encontram visíveis.

2 Dois sinais verdes: não classificar os núcleos com sinais de apenas uma cor.

3 Contar como sendo 3 sinais verdes e 12 vermelhos (estimativa da aglomeração).

4 Contar como sendo 1 sinal verde e 1 vermelho. Dois sinais que sejam do mesmo tamanho e estejam separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro de um sinal contam-se como se fossem apenas um sinal.

5 Não contar (núcleos com digestão insuficiente ou excessiva). Sinais em falta no centro dos núcleos (núcleos de forma anelar).

6 Contar como sendo 2 sinais verdes e 3 sinais vermelhos. Dois sinais que sejam do mesmo tamanho e estejam separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro de um sinal contam-se como se fossem apenas um sinal.

7 Contar como sendo 1 sinal verde e 5 vermelhos.

8 Contar como sendo 3 sinais verdes (1 verde desfocado) e 3 sinais vermelhos.

9 Aglomeração de sinais vermelhos obscurecendo os sinais verdes, examinar os sinais verdes com um filtro FITC específico ou não contar.

Registar as contagens numa tabela, tal como indicado nos Anexos 3 e 4.

Contar 20 núcleos por amostra de tecido, sempre que possível pertencendo a áreas diferentes do tumor.

Calcular o rácio HER2/CEN-17, dividindo para tal o número total de sinais vermelhos de HER2 pelo número total de sinais verdes de CEN-17.

Deve considerar-se que as amostras que contenham um rácio HER2/CEN-17 igual ou superior a 2 têm o gene HER2 amplificado (29).

Os resultados que se situem no ou perto do ponto de corte (1,8-2,2) devem ser interpretados com cuidado.

Se a relação se encontrar no limite aceitável (1,8-2,2), contar 40 núcleos diferentes e calcular a relação dos 40 núcleos. Se a contagem continuar a estar no limite aceitável, o resultado da

ou

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segunda avaliação é válido. Se estiver disponível, deve incluir-se uma coloração imuno-histoquímica de HER2 para melhor orientação durante a segunda contagem.

Em caso de dúvida, classificar novamente a lâmina da amostra. Em casos limite, justifica-se uma troca de impressões entre o patologista e o médico de tratamento.

Limitações - Gástrico 1. Apenas para utilização automatizada em instrumentos Dako Omnis.

2. É necessária uma formação especializada para a preparação de tecido e lâminas e para a interpretação da coloração de IQFISH. A interpretação das colorações do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) não deve ser realizada por indivíduos com deficiências a nível da visão das cores.

3. Os resultados do FISH dependem da manipulação e processamento dos tecidos antes da sua coloração. Fixação, lavagem, secagem, aquecimento, seccionamento incorretos ou contaminação com outros tecidos ou líquidos poderão influenciar a hibridização das sondas. Os resultados inconsistentes podem dever-se a variações nos métodos de fixação e impregnação ou a irregularidades inerentes aos tecidos.

4. É da responsabilidade do utilizador validar o Template IQFISH protocol.

Características de Desempenho - Gástrico Eficácia da hibridização A eficácia da hibridização do HER2 IQFISH pharmDxfoi investigada através de 180 cortes de tecido fixados em formol e impregnados em parafina, testados em três centros de estudo. Os 180 cortes de tecido puderam ser enumerados de acordo com as orientações de enumeração de produtos. A eficácia da hibridização foi de 100%.

Os rácios HER2/CEN-17 calculados e utilizados em estudos das características de desempenho baseiam-se na contagem de sinais em 20 núcleos através das orientações de classificação indicadas na secção Interpretação da coloração destas instruções de utilização. Sensibilidade analítica A sensibilidade analítica do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi investigada em 20 amostras diferentes de adenocarcinoma de cancro gástrico (10 amostras com amplificação do gene HER2 e 10 amostras sem amplificação). O rácio entre o número de sinais HER2 e sinais CEN-17 foi calculado com base na contagem de sinais em 20 núcleos de células normais na amostra de tecido. O rácio HER2/CEN-17 para as 20 amostras de tecido de adenocarcinoma de cancro gástrico encontrou-se entre 0,94 e 1,19. Especificidade analítica As extremidades das sondas de ADN HER2 no HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foram sequenciadas e mapeadas para confirmar uma cobertura total de 218 kb, incluindo o gene HER2.

As sondas de APN CEN-17 no HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foram testadas, individualmente e em conjunto, para confirmar a sua hibridização específica na região centromérica do cromossoma 17.

Para excluir a hibridização cruzada noutros cromossomas além do cromossoma 17, foram efetuados estudos em expansões da metáfase, em conformidade com os procedimentos normais de CQ da Dako. Foram avaliadas, no total, 275 expansões da metáfase com sinais distintos para analisar a hibridização específica das misturas das sondas de ADN HER2 e de APN CEN-17. Nos 275 casos, a hibridização foi específica para o cromossoma 17. Não se observou a hibridização cruzada em loci de outros cromossomas em nenhum dos 275 casos. A especificidade da sonda foi então de 100% (275 de 275).

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Para medir a capacidade do ensaio de IQFISH para identificar unicamente as substâncias HER2 e CEN-17 alvo, sem a interferência de outras substâncias, foram realizados estudos em amostras de adenocarcinoma gástrico, ao omitir as sondas de HER2 e de CEN-17 da mistura de hibridização e ao utilizar apenas a solução tampão de hibridização. Foram avaliadas, no total, 20 amostras quanto à presença de sinais não relacionados com a mistura de sondas. Não foi observada a deteção de outros alvos cromossómicos ou de interferência com substâncias estreitamente relacionadas em nenhuma das 20 amostras.

Estudos de robustez A robustez do ensaio HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testada ao variar a concentração da sonda de APN, o tempo de recuperação de alvo, o tempo de incubação da pepsina, o tempo de desnaturação, o tempo de hibridização e o tempo e a temperatura da lavagem rigorosa. Os diferentes parâmetros foram testados em três amostras de tecido FFPE diferentes de adenocarcinoma gástrico e em duas amostras de tecido FFPE da junção gastroesofágica (JGE) (em cada grupo estiveram representadas amostras de tecido amplificadas e não amplificadas).

Todos os parâmetros foram testados tanto abaixo como acima das definições de protocolo padrão, com exceção da concentração da sonda de APN e da temperatura da lavagem rigorosa, para as quais a definição de protocolo padrão foi incluída na configuração.

Os parâmetros de teste foram:

Concentração da sonda de APN: testado a 100% e a +/-17%.

Tempo de recuperação de alvo: testado a 13 min e 45 seg e a 16 min e 15 seg.

Tempo de incubação da pepsina: testado a 14 min e 45 seg e a 16 min e 15 seg.

Tempo de desnaturação: testado a 9 min e 45 seg e a 10 min e 45 seg.

Tempo de hibridização: testado a 70 min e a 80 min.

Tempo de lavagem rigorosa: testado a 8 min e 45 seg e a 11 min e 15 seg.

Temperatura de lavagem rigorosa: testado a 59 C, a 61 C e a 63 C.

As três concentrações de sondas de APN foram avaliadas numa conceção de experiência fracionada (ferramenta JMP, SAS), que foi realizada com 12 protocolos de coloração diferentes, conforme indicado na tabela 12.

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Tabela 12. Foram utilizados doze protocolos de coloração diferentes no estudo de robustez.

N.º do proto-

colo de robustez

Parâmetro de teste

Tempo de recuperação de alvo (min)

Tempo da

pepsina (min)

Tempo de desnaturação

(min)

Tempo de hibridização

(min)

Tempo de lavagem rigorosa

(min)

Temperatura de lavagem rigorosa (0C)

Conc. de APN na

mistura de sondas

1 16,25 16,25 9,75 80 8,75 59 83%

2 13,75 14,75 10,75 70 8,75 59 100%

3 16,25 14,75 9,75 70 8,75 63 100%

4 13,75 14,75 10,75 80 8,75 61 83%

5 13,75 14,75 9,75 80 11,25 59 117%

6 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 83%

7 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 100%

8 16,25 14,75 9,75 70 11,25 61 83%

9 13,75 16,25 9,75 70 8,75 61 117%

10 16,25 16,25 10,75 70 11,25 59 117%

11 16,25 16,25 10,75 80 11,25 61 100%

12 16,25 14,75 10,75 80 8,75 63 117%

As cinco amostras de tecido foram coradas com os 12 protocolos.

A leitura para o estudo de robustez foi a intensidade do sinal e a qualidade da morfologia. Todos os protocolos produziram coloração em todas as amostras de tecido (60 no total) com sinais claros, distintos e fáceis de avaliar, sendo, portanto, adequados para a enumeração de sinais. Além disso, o efeito da espessura do tecido sobre os resultados do ensaio HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testado ao variar a espessura dos cortes de amostras de tecido FFPE de cancro gástrico. No total, foram testados cinco cortes consecutivos de amostras de adenocarcinoma gástrico com diferentes espessuras (2, 3, 4, 5, 6 e 7 µm) com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis). O coeficiente médio de variação do rácio HER2/CEN-17 foi de 3,9% (num intervalo de 3,2% a 5,0%). Reprodutibilidade No âmbito da reprodutibilidade de dia para dia e de lote para lote em laboratório, estes foram testados com o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis). O estudo foi concebido como um estudo interno, cego e aleatorizado dos rácios HER2/CEN-17 através de cortes de oito amostras diferentes, fixadas em formol e impregnadas em parafina, de cancro gástrico, incluindo a junção gastroesofágica (JGE), com diferentes níveis de amplificação do gene HER2. As oito amostras foram testadas com HercepTest™ e representaram duas amostras com HER2 IHC 0/1+, duas amostras com HER2 IHC 2+, duas amostras com HER2 IHC 3+ e duas amostras com um rácio HER2/CEN-17 FISH predeterminado entre 1,5 e 2,5, obtido através do HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731). Cada amostra foi corada com três lotes diferentes de HER2 IQFISH pharmDxTM (Dako Omnis) em cinco dias não consecutivos. Foram processadas, no total, 240 colorações de tecido para todo o estudo, uma vez que cada combinação foi corada em duplicados. As variações nos rácios entre os dias e os lotes são ilustradas na figura 8. Os dados foram analisados com a transformação Box-Cox, através de um modelo de efeito aleatório, de modo a obter homogeneidade na variação dos dados. Estimou-se que o coeficiente total de variação era de 6,5% e foi considerado que a variação de dias e lotes contribuiu com 0,7% e 0,8%, respetivamente.

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Figura 8. Rácios HER2/CEN-17 obtidos num estudo de reprodutibilidade em laboratório sobre o HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis), incluindo resultados finais de reprodutibilidade de lote para lote e de dia para dia. O valor médio para cada amostra de tecido é mostrado com uma linha horizontal.

Além disso, a reprodutibilidade de dia para dia e de instalação para instalação do HER2 IQFISH pharmDx (Dako Omnis) foi testada num estudo externo, estratificado e cego em três instalações (uma instalação nos EUA e duas na Europa) em cortes de tecido de 12 amostras diferentes, fixadas em formol e impregnadas em parafina, de adenocarcinoma gástrico, incluindo a junção gastroesofágica (JGE). Três amostras foram de HER2 IHC 0/1+, três amostras foram de HER2 IHC 2+, três amostras foram de HER2 IHC 3+ e três amostras tiveram o rácio HER2/CEN-17 FISH predeterminado entre 1,5 e 2,5, obtido através do HercepTest™ e do HER2 IQFISH pharmDx (referência K5731), respetivamente. As amostras foram coradas e analisadas nas instalações de estudo. Cada amostra foi corada, no mínimo, sete vezes em sete dias não consecutivos e classificada por um observador em cada instalação. 314 cortes foram corados e incluídos na análise estatística. Os dados foram analisados através da transformação Box-Cox e calcularam-se os componentes de variação. O coeficiente total da variação, baseado no limite superior de confiança de 95%, foi de 24%. A variação do rácio HER2/CEN-17 para o dia e a instalação é apresentada na figura 9.

Figura 9. Gráfico de variabilidade dos rácios HER2/CEN-17 em unidades não transformadas, obtido num estudo de reprodutibilidade de dia para dia e de instalação para instalação do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) em amostras de tecido de cancro gástrico.

O ensaio HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testado para a reprodutibilidade de observador para observador, como parte de um estudo de comparação de métodos realizado internamente, através de três observadores, para classificar de forma independente as amostras coradas. A reprodutibilidade foi testada em 139 amostras diferentes de adenocarcinoma gástrico

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com estado do gene HER2 não amplificado ou amplificado. Os dados foram analisados através da transformação Box-Cox. O coeficiente médio de variação de observador para observador foi de 18%. As amostras de adenocarcinoma gástrico consistiam em 96,4% de amostras de resseção e 5,6% de amostras de biopsia. 81,3% das amostras foram obtidas no estômago e 18,7% na junção gastroesofágica. Repetibilidade A repetibilidade em laboratório do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) foi testada através de cortes consecutivos de oito amostras de adenocarcinoma gástrico com estado do gene HER2 não amplificado ou amplificado. Os tecidos foram testados em duplicado em cinco dias não consecutivos com três lotes diferentes, num total de 240 lâminas (120 cortes em duplicado). O modelo de efeitos aleatórios foi utilizado para a análise de dados e resultou numa variação atribuível a dias e lotes (consultar o estudo interno de reprodutibilidade acima). A variação residual explica a variação entre as réplicas e, portanto, a repetibilidade. O limite superior de confiança de 95% para o coeficiente de repetibilidade da variação foi de 7,1%. Estudo de comparação de métodos

Comparação do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis) com o HER2 IQFISH pharmDx(K5731)

O estudo incluiu 140 amostras de cancro gástrico que consistiram em diferentes tipos de tecido de adenocarcinoma gástrico, ou seja, o estômago ou a junção gastroesofágica (JGE), e resseções ou biopsias com distribuição homogénea ou heterogénea (focal ou em mosaico) dos sinais, conforme mostrado na tabela 13. Tabela 13. Distribuição de amostras em tipo de cancro gástrico (estômago ou JGE), categoria de distribuição dos sinais (homogénea ou heterogénea) e tipo de tecido (resseção ou biopsia).

Tipo de cancro gástrico

Número de amostras

Distribuição dos sinais

Número de amostras

Tipo de tecido

Número de amostras

Estômago 113

Homogénea 58

Resseção 134

Junção gastroesofágica (JGE)

27

Heterogénea - focal

61

Biopsia 6 Heterogénea

- em mosaico 21

Total 140 Total 140 Total 140

As amostras consistiram em 76 casos de HER2 não amplificado e 64 casos de HER2 amplificado com a classificação conhecida do HercepTest™, conforme mostrado na tabela 14. Tabela 14. Distribuição de amostras com base na classificação do HercepTest™ e na classificação do HER2 FISH obtida com o kit HER2 FISH pharmDx(K5731).

Classificação da coloração do HercepTest™

0 1+ 2+ 3+ Total

n 39 14 45 42 140





39 14 45 42 140

Os resultados da tabulação cruzada do estado do HER2, obtidos através dos dois ensaios com o cálculo do acordo de percentagens globais (APG), do acordo de percentagens positivas (APP) e do acordo de percentagens negativas (APN), são mostrados na tabela 15. A correlação entre os rácios HER2/CEN-17 com os dois ensaios é mostrada na figura 10.

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Tabela 15. Tabulação cruzada do estado do gene HER2, obtida através do HER2 IQFISH pharmDx(K5731) e do HER2 IQFISH pharmDx(Dako Omnis).

Estado do gene HER2 (K5731) Total

Não amplificado

Amplificado


Não amplificado

76 1 77

Amplificado 0 63 63

Total 76 64 140

APG: 99,3% APP: 98,4% APN: 100%

Figura 10. Correlação entre os rácios HER2/CEN-17 do HER2 FISH pharmDx(Dako Omnis) e do HER2 IQFISH pharmDx(referência K5731) em 140 amostras de cancro gástrico (ajuste linear: y = 0,06 + 0,97*x; R2 = 0,97. Ponderado com variação inversa para permitir o ajuste linear).

O intervalo de confiança de 95% para a diferença média entre os dois métodos de coloração com o rácio HER2/CEN-17 = 2 foi considerado ser [0,007; 0,022]. Isto significa que não é esperada uma diferença superior a 2%. Dados clínicos A segurança clínica e a eficácia do trastuzumab (Herceptin™) foi demonstrada no estudo BO18255 (o ensaio ToGA "Um estudo de fase III sem dupla ocultação, aleatorizado e multicêntrico do traustuzumab, em combinação com cisplatina e uma fluoropirimidina (capecitabina ou 5-fluorouracil) (FC+H) versus quimioterapia (FC) isoladamente como terapêutica de primeira linha em doentes com cancro gástrico avançado HER2 positivo") (28). O estudo foi concebido como um estudo sem dupla ocultação, aleatorizado, multicêntrico e de fase III em doentes positivos para HER2 com adenocarcinoma gástrico ou da junção gastroesofágica avançado. No estudo BO18255, a positividade HER2 foi definida como sendo IHC positivo (3+), através do HercepTest™(Dako), e/ou FISH positivo (HER2/CEN-17 ≥ 2.0), através do kit HER2 FISH pharmDx(Dako). Após a inclusão no estudo, os doentes foram aleatorizados para receber quimioterapia (5-FU ou capecitabina e cisplatina) ou quimioterapia mais trastuzumab.

A principal medida de resultado de eficácia foi a sobrevivência global (SG), analisada pelo teste log-rank estratificado. A análise de SG final, baseada em 351 mortes, foi estatisticamente

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significativa (nível de significância nominal de 0,0193). Foi também realizada uma análise de SG atualizada um ano após a análise final. A sobrevivência global média de 13,5 meses no grupo de Herceptin™ mais quimioterapia foi significativamente maior em comparação com a sobrevivência global média de 11,0 meses no grupo de apenas quimioterapia. Os resultados de eficácia na análise final e na análise atualizada estão resumidos na tabela 16 e na figura 11. Tabela 16. Sobrevivência global na população com intenção de tratar (ITT).

Grupo de FC N=296

Grupo de FC + H N=298

Sobrevivência global final N.º de mortes (%) Média IC de 95% (meses)

184 (62,2%)

11,0 (9,4, 12,5)

167 (56,0%)

13,5 (11,7, 15,7)

Rácio de risco IC de 95% valor p*, bilateral

0,73 (0,60, 0,91)

0,0038*

Sobrevivência global atualizada N.º de mortes (%) Média IC de 95% (meses)

227 (76,7%)

11,7 (10,3, 13,0)

221 (74,2%)

13,1 (11,9, 15,1)

Rácio de risco IC de 95%

0,80 (0,67, 0,97)

*Em comparação com o nível de significância nominal de 0,0193.

Figura 11. Sobrevivência global atualizada em doentes com cancro gástrico metastático.

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Uma análise exploratória da SG baseada no teste da amplificação do gene (FISH) e da hiperexpressão da proteína (IHC) está resumida na tabela 17. Tabela 17. Análise exploratória pelo estado HER2 com resultados atualizados de sobrevivência global.

FC N=296a

FC+H N=298b

Subgrupo FISH+ / IHC 0, 1+ (N=133) N.º de mortes / n (%) Duração da SG média (meses) IC de 95% (meses)

57/71 (80,3%)

8,8 (6,4, 11,7)

56/62 (90,3%)

8,3 (6,2, 10,7)

Rácio de risco (IC de 95%) 1,33 (0,92, 1,92)

Subgrupo FISH+ / IHC2+ (N=160) N.º de mortes / n (%) Duração da SG média (meses) IC de 95% (meses)

65/80 (81%)

10,8 (6,8, 12,8)

64/80 (80%)

12,3 (9,5, 15,7)


Subgrupo FISH+ ou FISH-/IHC3+c (N=294) N.º de mortes / n (%) Duração da SG média (meses) IC de 95% (meses)

104/143 (73%)

13,2 (11,5, 15,2)

96/151 (64%)

18,0 (15,5, 21,2)


A sobrevivência média foi estimada a partir das curvas Kaplan-Meier. a Dois doentes no grupo de FC que eram FISH+, mas com estado IHC desconhecido, foram

excluídos da análise. b Cinco doentes no grupo de HercepTest™ que eram FISH+, mas com estado IHC

desconhecido, foram excluídos da análise. c Inclui 6 doentes no grupo de quimioterapia, 10 doentes no grupo de Herceptin™ com FISH-,

IHC3+ e 8 doentes no grupo de quimioterapia, 8 doentes no grupo de Herceptin™ com estado de FISH desconhecido, IHC3+.

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Resolução de problemas - Gástrico


1. Sinais inexistentes ou fracos

1a. Os reagentes foram expostos a temperaturas elevadas durante o transporte ou a conservação

1a. Verificar as condições de conservação. Garantir que estava presente gelo seco quando foram recebidas as remessas de mistura de sondas IQISH e pepsina. Garantir que os reagentes foram conservados conforme especificado.

1b. O microscópio não funciona corretamente

- Conjunto de filtros inadequado

- Lâmpada inapropriada - Lâmpada de mercúrio

demasiado velha - Lentes do coletor sujas

e/ou partidas - Óleo de imersão

inadequado

1b. Examinar o microscópio e verificar se os filtros utilizados são adequados para usar com os fluorocromos da mistura de sondas e se a lâmpada de mercúrio é correta e não está a ser utilizada para além do seu prazo de validade (consultar Anexo 5). Em caso de dúvida, contactar o fornecedor local do microscópio.

1c. Sinais fracos

1c. Evitar utilizar o microscópio durante longos períodos e minimizar a exposição a fontes de luz fortes.

1d. Tampões incorretamente identificados

1d. Substituir tampões dos reservatórios e garantir um registo (na estação de trabalho) e identificação (no ecrã tátil) corretos dos tampões dos reservatórios. Consultar o guia do utilizador básico do Dako Omnis para detalhes adicionais. Tenha em atenção: a ISH Pre-Treatment Solution é verde e a ISH Stringent Wash Buffer é amarela.

2. Áreas sem sinal 2. Bolhas de ar retidas durante a montagem

2. Evitar bolhas de ar. Caso sejam observadas, bater levemente com os fórceps para as eliminar.

3. Coloração de fundo excessiva

3a. Fixação inapropriada do tecido

3a. Certificar-se de que apenas são utilizados cortes de tecido impregnados em parafina e fixados em formol.

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3b. Exposição prolongada do corte hibridizado à luz forte

3b. Evitar utilizar o microscópio durante longos períodos e minimizar a exposição à luz forte.

4. Morfologia deficiente do tecido

4a. Tratamento incorreto da pepsina

4a. Mudança para outro dos três protocolos de coloração diferentes. Garantir que a ISH Pepsin é conservada à temperatura correta.

4b. Tratamento demasiado longo com pepsina ou corte de espessura muito fina poderão resultar no aparecimento de células fantasma ou células tipo donut

4b. Experimentar um protocolo de coloração com tempo de incubação mais curto da pepsina. Garantir que a espessura do corte corresponde a 3-6 µm.

5. Elevado nível de fluorescência automática verde na lâmina, incluindo áreas sem tecido FFPE

5. Utilização de lâminas de vidro expiradas ou não recomendadas

5. Escolher lâminas de vidro conforme especificado. Garantir que as lâminas de vidro não ultrapassaram a data de validade.

NOTA: se o problema não for atribuído a qualquer uma das causas acima ou se a ação corretiva sugerida falhar em resolver o problema, chamar a Assistência técnica Dako para a resolução do problema.

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Anexo 3 - Gástrico


Esquema de classificação

Data do processo: ____________ ID de registo do processo de coloração: ____________ Lote do HER2 IQFISH pharmDx (Dako Omnis): __________ ID da amostra: _________________ Caracterização da distribuição dos sinais no tecido:

Homogénea:

Heterogénea – Focal: ou Heterogénea – Em mosaico:

Contar os sinais em 20 núcleos

N.º do núcleo


(vermelho)


(verde)

N.º do núcleo


(vermelho)


(verde)

1 11

2 12

3 13

4 14

5 15

6 16

7 17

8 18

9 19

10 20

Total (1-10)

Total (11-20)

Para determinação do rácio HER2/CEN-17, contar o número de sinais de HER2 e o número de sinais de CEN-17 nos mesmos 20 núcleos e dividir o número total de sinais de HER2 pelo número total de sinais de CEN-17. Se o rácio HER2/CEN-17 se encontrar no limite aceitável (1,8-2,2), contar 40 núcleos diferentes e recalcular o rácio para os 40 núcleos (consultar o esquema de classificação da recontagem, Anexo 4). Os resultados que se situem no ou perto do ponto de corte (1,8 a 2,2) devem ser interpretados com cuidado (consultar o guia de contagem).

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Data e assinatura do patologista: Para as diretrizes de classificação: consultar a secção Interpretação da coloração.



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Anexo 4 - Gástrico

HER2 IQFISH pharmDx™, referência GM333

Esquema de classificação da recontagem

Data do processo: ____________ ID de registo do processo de coloração: ____________

Lote do HER2 IQFISH pharmDx (Dako Omnis): __________ ID da amostra: __________________

Sinais em 40 núcleos adicionais (1-40)

N.º do núcleo

HER2 (ver-

melho)

CEN17 (verde)

N.º do núcleo

HER2 (ver-

melho)

CEN-17 (verde)

N.º do núcleo

HER2 (ver-

melho)

CEN-17

(verde)

N.º do núcleo

HER2 (ver-

melho)

CEN-17 (verde)

1

11

21 31

2

12

22 32

3

13

23 33

4

14

24 34

5

15

25 35

6

16

26 36

7

17

27 37

8

18

28 38

9

19

29 39

10

20

30 40

Total (1-10)

Total (11-20)

Total (21-30)

Total (31-40)

Para determinação do rácio HER2/CEN-17, contar o número de sinais de HER2 e o número de sinais de CEN-17 nos mesmos 40 núcleos e dividir o número total de sinais de HER2 pelo número total de sinais de CEN-17. Relatar a classificação total a partir dos 1-40 núcleos na tabela em baixo.




Data e assinatura do patologista: Para as diretrizes de classificação: consultar a secção Interpretação da coloração.



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Anexo 5 - Gástrico

HER2 IQFISH pharmDx™, referência GM333

Especificações do microscópio de fluorescência

A Dako recomenda o seguinte equipamento para utilização com o HER2 IQFISH pharmDx™, (Dako Omnis), GM333:

1. Tipo de microscópio

• Microscópio de epifluorescência.

2. Lâmpada

• Lâmpada de mercúrio de 100 watts (manter um registo sobre o tempo de iluminação).

3. Objetivas

• Para a análise do tecido, aplicam-se as objetivas com óleo de imersão 16x ou 20x.

• Para uma maior ampliação de potência e contagem dos sinais, apenas são recomendadas objetivas com óleo de imersão, por exemplo, 100x.

4. Filtros Os filtros são individualmente concebidos para fluorocromos específicos, devendo ser escolhidos em conformidade com os mesmos. A Dako recomenda a utilização de um filtro DAPI específico, em combinação com um filtro duplo Texas Red/FITC de alta qualidade.

• Filtro DAPI

• Filtro duplo Texas Red/FITC

• Poderão ser utilizados filtros individuais Texas Red e FITC para confirmação e contagem.

Fluorocromo Comprimento da onda de excitação

Comprimento da onda de emissão

FITC 495 nm 520 nm

Texas Red 596 nm 615 nm

Os filtros são específicos de cada tipo de microscópio e a utilização de filtros adequados é crucial para a interpretação dos resultados. Caso deseje obter informações detalhadas, contacte o fornecedor do seu microscópio ou o seu representante da Dako.

5. Óleo

• Óleo não fluorescente.

Precauções

• Não se recomenda a utilização de uma lâmpada de mercúrio de 50 watts.

• Não se podem utilizar filtros de rodamina.

• Não se recomendam os filtros triplos.

Um microscópio não otimizado pode causar problemas na interpretação dos sinais fluorescentes. É importante que a fonte de luz não tenha expirado, que esteja devidamente alinhada e a focar corretamente.

O cliente deve monitorizar e acompanhar as recomendações do fabricante relativamente à lâmpada de mercúrio. O microscópio deve ser mantido e a lâmpada de mercúrio deve ser colocada em alinhamento antes da interpretação dos resultados.

Dever-se-á tentar expor a amostra ao mínimo de luz de excitação possível, de modo a minimizar o esbatimento da fluorescência.

Recomendamos que o cliente discuta a preparação do seu microscópio específico com o seu fabricante antes de iniciar o processo de hibridização de fluorescência in situ ou que consulte a correspondente literatura.

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Explicação dos símbolos

Número de catálogo

Limite de temperatura

Utilizar até

Dispositivo médico para diagnóstico in vitro

Manter afastado da luz solar (consultar a secção relativa à conservação)

Fabricante

Consultar as instruções de utilização

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