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PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」体外診断用

体外診断用医薬品　承認番号 : 22800EZX00078000

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」染色結果判定マニュアル

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使用目的 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4はじめに . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5PD-L1 の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8キットの構成 (SK00621-5J) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9技術的留意点 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

検体の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10施設内コントロール組織 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10追加（オプション）の施設内コントロール: 扁桃組織 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10組織の処理 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」染色手順 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11テクニカルチェックリスト . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13判定のためのガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14

一般的留意点 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14組織の評価基準 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14コントロールの評価 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14組織検体の妥当性の確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

染色性の評価と発現率 (TPS) の判定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18Tumor Proportion Score (TPS) の定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18判定のガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

スコアリングガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19TPS および治療の適格性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

TPS 決定に推奨される方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20治療対象となる非小細胞肺癌患者の選定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22結果の報告 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24PD-L1 染色の特徴 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」での染色結果判定における注意事項 . . . . . . . . . . . . .25非小細胞肺癌症例のさまざまな染色像とその解釈 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

TPS ＜ 1% の症例 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32TPS 1 ～ 49% の症例 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36TPS ≧ 50% の症例 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40カットオフ≧ 50% 付近の症例 (TPS 40～60%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47カットオフ≧ 1% 付近の症例 (TPS 0～10%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52アーチファクト . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58トラブルシューティングガイド . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65参考文献 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66

目次


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使用目的体外診断用

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」は、抗 PD-L1 マウスモノクローナル抗体（Clone 22C3）を用いた免疫組織化学染色法を原理としたアッセイキットであり、ダコ Autostainer Link 48 (IHC 自動染色装置 ) を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 非小細胞肺癌 (NSCLC) 組織中の PD-L1 発現率を測定するためのものです。PD-L1 発現率は、任意の強度で部分的または完全な細胞膜染色を示す陽性腫瘍細胞の割合である Tumor Proportion Score (TPS) を用いて決定します。

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」は、PD-L1 低発現 (TPS ≧ 1%) である既治療の非小細胞肺癌患者において、キイトルーダ ® ( ペムブロリズマブ ) の適切な投与を行うための補助として用いることを目的としています。

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」は、PD-L1 高発現 (TPS ≧ 50%) である未治療の非小細胞肺癌患者において、キイトルーダ ® ( ペムブロリズマブ ) の適切な投与を行うための補助として用いることを目的としています。


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この PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」染色結果判定マニュアルは、病理医や検査担当者が、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 非小細胞肺癌 (NSCLC) 検体中の PD-L1 発現率の評価において、正確で再現性のある結果を得られるようサポートするためのものです。抗 PD-1 治療を行う患者の選定の際、PD-L1 発現率の確認に使用してください。

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」は定性的アッセイですが、PD-L1 発現を用いた診断では、発現率を測定する必要があります。

PD-L1 発現を検査する非小細胞肺癌組織検体はスコアリングされ、Tumor Proportion Score (TPS) に基づき 3 つのレベルに分けられます。• 非発現：TPS ＜ 1%• 低発現：TPS 1 ～ 49%• 高発現：TPS ≧ 50%

PD-L1 発現率を用いて、患者にキイトルーダ® (ペムブロリズマブ)での治療の選択肢について情報提供を行うことができます。• 未治療および既治療の非小細胞肺癌患者

で、PD-L1 高発現 (TPS ≧ 50%) の場合、キイトルーダによる治療に適格

• 既治療の非小細胞肺癌患者で、PD-L1 低発現 (TPS ≧ 1%) の場合も、キイトルーダによる治療に適格

この判定マニュアルでは、高品質な染色と診断評価が得られるよう、 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」の判定法と技術情報を詳述します。

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」を用いた非小細胞肺癌の染色のスコアリングに必要な事項を十分に知っていただくために、様々な PD-L1 発現率の症例を参考として紹介しています。施設で再現性のある信頼性の高い結果を得るために、このような症例や PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

「ダコ」による判定のための詳細な推奨事項をお読みください。

染色と判定方法についての詳細は、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」 (コード: SK00621-5J) に同梱されている最新版の添付文書を参照するか、 www.agilent.com. をご確認ください。

結果の判定染色性を臨床的に判定するには、コントロールを適切に評価する必要があります。評価は、患者の病歴や他の診断検査の枠内で、病理医が行う必要があります。本製品は、体外診断用医薬品です。

結果の報告治療担当医師に報告すべき情報については、本マニュアル 24 ページの「結果の報告」の章を参照してください。

顕微鏡写真特に断りのない限り、掲載している顕微鏡写真は非小細胞肺癌のものです。

はじめに

キイトルーダは、Merck & Co., Inc の子会社である Merck Sharp & Dohme Corp. の登録商標です


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PD-1 / PD-L1 経路は、正常細胞における免疫応答を制御するプログラム細胞死リガンド 1 (PD-L1) は、免疫系の応答時にプログラム細胞死 1 (PD-1) 受容体に結合する膜貫通型タンパク質です。PD-1 受容体は通常、細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫細胞上に発現します。PD-L1 は通常正常な細胞上に発現します。正常な細胞は、PD-1 と PD-L1 の相互作用を利用し、T 細胞を不活性化することで免疫認識に対する保護機構として利用しています ( 図 1 )。細胞傷害性 T 細胞が不活性化すると、免疫応答のダウンレギュレートが起こり、その結果、不活性化した T 細胞が細胞分裂を停止して枯渇し、最終的にはプログラム細胞死、すなわちアポトーシスに至ります。

腫瘍は、PD-1 / PD-L1 経路を利用して免疫応答から免れる多くの腫瘍細胞は、人体の自然な免疫応答を免れるためのメカニズムとして、PD-L1 の発現をアップレギュレートすることができます。活性化された T 細胞は、腫瘍細胞上の PD-L1 を認識します。これは正常細胞の場合と類似しており、PD-L1 のシグナル伝達により、T 細胞は不活性化されます ( 図 2)。腫瘍細胞は免疫

サイクルを免れ、検知されて排除され増殖することができます。

抗 PD-1 治療薬により、腫瘍に対する免疫応答が可能キイトルーダ ® ( ペムブロリズマブ ) は、腫瘍細胞と活性化した T 細胞の間の PD-1 / PD-L1 相互作用をブロックする抗 PD-1 がん免疫治療薬です ( 図 3)。腫瘍細胞と活性化した T 細胞との相互作用をブロックすることで、腫瘍細胞による免疫抑制を防ぐことができます。 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」は、非小細胞肺癌組織検体中の PD-L1 を検出する腫瘍細胞での PD-L1 のアップレギュレートとその検出は、抗 PD-1 治療薬への反応性に対するバイオマーカーとなります。PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」は、非小細胞肺癌患者のうちキイトルーダでの治療適応を診断するために用いるコンパニオン診断薬です。キイトルーダはヒト化抗ヒト PD-1 モノクローナル抗体です。

PD-L1 の概要

PD-L1 発現正常細胞

PD-L1

PD-1

不活性の状態の細胞傷害性 T 細胞

図 1: T 細胞が不活性化すると、正常組織へのダメージが抑制される。


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PD-L1

PD-1

腫瘍細胞

不活性化細胞傷害性 T 細胞

図 2: T 細胞が不活性化すると、腫瘍の細胞死が抑制される。

抗 PD-1 治療薬

腫瘍細胞活性化細胞傷害性 T 細胞

図 3: PD-1 / PD-L1 の相互作用が阻害されると、活性化した T 細胞の働きが有効になり、腫瘍細胞を積極的に排除できるようになる。


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PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」とは何か？ PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」は、定性的な免疫組織化学的 (IHC) アッセイであり、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 非小細胞肺癌 (NSCLC) 組織中の PD-L1 発現率をダコ Autostainer Link 48 を用いて測定するためのものです。 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」の構成 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」には、リンカー試薬を用いた IHC 染色手順を実施するための最適化された試薬と、DAB エンハンサー試薬が含まれています ( 図 4)。

脱パラフィン、親水化、抗原賦活は、PT Link を用いて実施します。検体はブロッキング試薬で処理後、PD-L1 に特異的な一次抗体 ( 抗PD-L1マウスモノクローナル抗体 (Clone 22C3))、

または一次抗体陰性コントロールとともに反応させます。その後リンカー試薬を反応させ、次にポリマー試薬 ( デキストランポリマーに二次抗体とパーオキシダーゼが結合 ) を反応させ、さらに調製した基質溶液を反応させます。基質溶液中の DAB がポリマー試薬中のパーオキシダーゼにより酸化されて抗原部位に可視産物が生成され、抗原部位が暗褐色に染色されます。最後に、対比染色を行い、脱水、透徹処理後、非水溶性の永久標本用封入剤で封入し、カバーガラスをのせます。結果の判定には光学顕微鏡を用います。

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」の概要

一次抗体の添加リンカー試薬の添加ポリマー試薬の添加

図 4: PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」染色手順

抗原

一次抗体

リンカー試薬

ポリマー試薬

ポリマー試薬


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キットの構成PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」 (コード: SK00621-5J) には、50 テスト分に十分な試薬とコントロールスライド15枚が含まれています (図 5)。

1 濃縮抗原賦活液2 ブロッキング試薬3 一次抗体:

抗PD-L1マウスモノクローナル抗体（Clone 22C3）

4 一次抗体陰性コントロール5 リンカー試薬 6 ポリマー試薬 7 基質緩衝液 8 発色基質

図 5: PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」構成品

10 123

4

56

7

8

9

調製した基質溶液の添加 DAB エンハンサー試薬の添加

*Dr. AF Gazdar and Dr. JD Minna at NIH are acknowledged for their contribution in developing NCI-H226 (ATCC Number: CRL-5826™)

9 DAB エンハンサー試薬 10 コントロールスライド*ダコ　Envision FLEX 洗浄液 (20 x) (コード: K800721-2) およびダコ　Envision FLEX ヘマトキシリン (AutostainerLink用） (コード: K800821-2) が別途必要です。


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技術的留意点

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」キットを用いた検査は、その染色工程のみならず、検体の前処理工程からも大きな影響を受けます。本章では、検査を正しく実施して頂くため、製品の特性と技術的留意点についてご確認ください。

検体の準備免疫組織化学染色に適した処理をされた検体を用います。形態が保たれ評価するのに充分な数の腫瘍細胞が含まれる部位を選定してください。すべての検体は、標準的な（一般病理検査室の標準的な前処理）方法に準じて処理してください。

施設内コントロール組織施設内における検体の前処理工程の差異が、結果に大きな影響を与える可能性があります。実施に際し、染色ラン毎に、本品中のコントロールスライドに加え、施設内組織を用いた陽性対照および陰性対照のコントロール組織検体を必ず立ててください。

各コントロール組織は、組織検体と同様に腫瘍細胞が含まれる新鮮な検体から抽出し、固定、パラフィン包埋などの前処理も組織検体と同様に実施してください。本品中のコントロールスライドは、試薬の妥当性を評価するのものであり、検体処理の適正を判断するためのものではありません。

各施設でご用意いただく陽性対照のコントロール組織には、弱から中等度の細胞膜染色を呈する腫瘍細胞が含まれることが理想的です。陰性対照のコントロール組織は、腫瘍細胞は染色されないが、内因性陽性対照のコントロールとして捕らえることができる PD-L1 を発現する腫瘍関連マクロファージ/ 免疫細胞を含んでいることが理想的です。

追加（オプション）の施設内コントロール : 扁桃組織扁桃組織は、一次抗体で染色すると陰窩上皮が多数強度に染色され、胚中心では濾胞性マクロファージが弱から中等度に染色されます。コントロールに用いる場合には、予め扁桃組織の染色性を確認してください。内皮細胞、線維芽細胞、表層上皮に PD-L1 タンパクは発現していません。

組織の処理検体は 3 ～ 4mm に切り出し、アルコールでの脱水、キシレン置換を経て、パラフィンを浸透させます。パラフィンの温度は 60°C を超えないようにしてください。固定は、10％中性緩衝ホルマリンで 12 ～ 72 時間とします。また、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルでの使用は評価済みですが、脱灰や、他の固定液を使用した場合の評価は実施されておらず、推奨できません。

パラフィン包埋した組織は 4 ～ 5 µm に薄切し、コーティングスライドを使用してください。保存する場合は、2 ～ 8°C の冷暗所または25°C 以下の室温で保存し、6 ヶ月以内に染色してください。


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PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」染色手順

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」の試薬およびプロトコールは適切な結果を出すために最適化されています。このため試薬を希釈したり、反応時間や温度を変更することは、不適切な結果を招く原因になります。必要な全ステップと各反応時間は DakoLink ソフトウェア上に予め設定されています。染色には所定のプロトコールを使用してください。

試薬の保管使用しない時は、本品中のコントロールスライドを含むすべてのキット内の構成品を、2 ～ 8 °C の冷暗所に保管してください。

試薬の調製染色する前に、使用するすべての試薬を室温 (20 ～ 25 °C) に戻してください。パッケージに記載されている使用期限を過ぎている試薬は、絶対に使用しないでください。

抗原賦活液抗原賦活液を精製水で 50 倍希釈します。30mL ボトル 1 本で、PT Link のタンク１つ分

（1.5L）が調製できます。希釈後 5 日以内に使用してください ( 再使用は 3 回まで )。

洗浄液ダコ Envision FLEX 洗浄液 (20 x) を、精製水で 20 倍希釈します。希釈後、未使用の洗浄液は、2 ～ 8 °C で 1 ヶ月まで保管できます。液の濁りが観察された場合は、使用せず廃棄してください。

基質溶液基質緩衝液 1 mL あたり、発色基質 1 滴を加え混合します。調製後は、2 ～ 8 °C の冷暗所で保管し 5 日間使用できます。本基質溶液は使用に先立ち調製し、使用の際には十分に混ぜてから使用します。溶液中に沈殿が生じることがありますが、染色の品質には影響しません。• 基質緩衝液 1 本を全量使用する場合には、

発色基質 9 滴を加え混合してください。（ボトルラベルには、7.2mL と記載されていますが、ボトルには Dead volume 分の緩衝液が余分に入っています）

• 発色基質の溶液の色は様々で、透明からラベンダーブラウン色を呈します。この色調の差異は、品質に影響しません。上記のガイドラインに従って調製してください。過剰に発色基質を加えることは、陽性反応を損なう原因になります。

染色精度管理のためのコントロール染色ごとに、本品中のコントロールスライドを 1 枚、施設内の陽性対照ならびに陰性対照のコントロールをのせ、一次抗体を滴下させるプロトコールで染色します。組織検体は、2 枚ずつ作製し、一枚には一次抗体（抗PD-L1 抗体）を、他方には一次抗体陰性コントロールを滴下させるプロトコールにて染色します。

脱パラフィン、親水化、抗原賦活 PT Link の 3-in-1 処理機能を使用して、脱パラフィン、親水化、抗原賦活を実行します。• 予熱と冷却を 65°C に設定し、加熱を 97°C

で 20 分に設定します


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• PT Link には、1 タンクあたり 1.5L の抗原賦活液を充填します。（組織を完全に浸漬させるため、この量は厳守してください）

• 抗原賦活液を 65°C に予熱します • 組織検体をのせたスライドガラスを

Autostainer 用スライドラックに装填し、ラックごと PT Link に浸漬させます。（97°C、20分で処理 )

• PT Link リンスステーション ( コード : PT10930) には、室温の洗浄液を満たしておきます。処理が終わり、タンク内の温度が 65°C に下がったらスライドラックを取り出し、直ちに PT Link リンスステーションに移し、5 分間浸漬します。

染色および対比染色• スライドガラスを装填したスライドラックを

ダコ　Autostainer Link 48 にのせます。• スライドの装填中または機器の準備中に

スライドが乾かないよう、装填後直ちに、スライド表面にダコ Envision FLEX 洗浄液をかけてください。組織の乾燥は、非特異染色の原因になります。

• PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」プロトコールを選択してください。予めプログラミングされた手順に則って染色および対比染色が実施されます。

• 対比染色には、ダコ Envision FLEX ヘマトキシリン (AutostainerLink 用）、コード : K800821-2 を使用します。

封入非水溶性封入剤を使用してください。封入後の退色を防ぐため、スライドは室温 (20 ～ 25°C) 暗所で保管してください。


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施設名 / 所属

氏名と役職

ダコ　Autostainer Link 48 シリアル番号ソフトウェアバージョン

テクニカルチェックリスト

はいいいえダコ　Autostainer Link 48とPT Linkに対し、定期的なメンテナンスを実施していますか？PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」キットパッケージに表記されている有効期限を遵守していますか？本品中のコントロールスライドおよびすべてのPD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」構成試薬は、 2～8 °C 暗所に保管されていますか？本品中のコントロールスライドおよびすべてのPD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」構成試薬は、染色前に室温に戻しましたか？施設内陽性対照・陰性対照のコントロールスライドには、非小細胞肺癌症例組織を選択しましたか？組織は、10% 中性緩衝ホルマリンで固定していますか？組織へのパラフィン浸透は 60°C 以下で実施しましたか？

組織は4～5 µm に薄切し、コーティングスライドを使用していますか？

組織検体を、60 °C で 1～2 時間ベーキングしましたか？保管されていた未染スライドを使用した場合、その組織検体は、薄切後 6 ヶ月以内かつ暗所で2～8 °C (室温 25 °Cまで)に保管していたのものですか？抗原賦活液は、正しく調製しましたか？（希釈後の抗原賦活溶液の pH は 6.1 ± 0.2 である必要があります。）洗浄液は適切に調製していますか？基質溶液は適切に調製していますか？対比染色には、ダコ　Envision FLEX ヘマトキシリン (AutostainerLink用）を使用していますか？脱パラフィン・親水化・抗原賦活は、PT Link (3-in-1 処理)で実施しましたか？スライドを機器へ搭載時、機器の準備中に、スライド表面が乾燥しないように洗浄液をかけて湿潤状態を保っていますか？染色に際し、ダコ Autostainer Link 48 上で PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」プロトコールを選択しましたか？PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」プロトコールを実施するにあたり、必要な試薬や備品はすべて準備できていますか？不足しているものがあれば、下のコメント欄に記載してください。

追加事項またはコメント：

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」を正しくご使用頂くために、本チェックリストをご利用ください。


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判定のためのガイドライン一般的留意点 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」の結果は、光学顕微鏡を用いて観察し、病理医が判定してください。スコアリング方法は、18 ページを参照してください。組織検体の判定に先立ち、本品中のコントロールスライドで染色性の妥当性を確認してください。

最も信頼できる検査結果を出すために、3 枚の連続切片を作製し、HE、一次抗体染色、一次抗体陰性コントロールでの染色を実施してださい。HE 染色標本上で、該当腫瘍細胞が確認できれば、残りの連続切片の妥当性も担保されることになります。

本品中のコントロールスライドは、ランごとに必ず 1 枚染色してください。コントロールスライドの評価方法は 15 ページに記載されています。また、施設内コントロールスライドもランごとに加え染色してください。

組織の評価基準少なくとも 100 個以上の適切な腫瘍細胞が必要です。PD-L1 IHC 染色を実施するにあたり、HE 染色にて、組織検体の妥当性を確認してください。HE 染色と PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」での染色には、同ブロックから作製された連続切片を用いてください。

HE 染色検体上で、該当検体に 100 個以上の腫瘍細胞が含まれているかを判定してください。

» 腫瘍細胞が 100 個に満たない場合には、正しく評価できないと判断し、検体不適としてください。

腫瘍細胞が 100 個未満の検体ブロックを深く切り込むことで必要な腫瘍細胞を得られたり、別のブロックを採用することで十分数の腫瘍細胞を得られる場合があります。

コントロールの評価本品中のコントロールスライド本品中のコントロールスライドを観察し、試薬の性能に問題がないかを評価してください。本品中のコントロールスライドには、PD-L1 陽性対照ならびに陰性対照のセルブロック切片が貼付されています（図 6）。陽性細胞の割合と、染色強度を評価します。コントロール検体の染色性が不十分だと判断された場合には、同ランで染色された全ての組織検体結果を無効とみなします。コントロールスライドを、組織検体のスコアリング判定基準として使用しないでください。

下記のガイドラインに従って、全体の染色強度をスコアリングしてください。

0 陰性

1+ 弱陽性

2+ 中等度陽性

3+ 強陽性

PD-L

1 IHC

22C3

ph

arm

Dx 「

ダコ

」

PD-L1 陰性

PD-L1 陽性

図 6: 本品中のコントロールスライドには、PD-L1発現陽性と陰性の細胞が含まれています。


15

陽性対照のコントロール細胞以下の染色性を満たしている場合、PD-L1 陽性とします ( 図 7)。• 少なくとも 70％の細胞に細胞膜染色をみ

とめ、かつその強度が 2+（中等度）以上である

• バックグラウンド染色の染色強度が 1+ 未満

図 7 : 本品中のコントロールスライド(陽性対照のコントロール細胞)の染色性 (対物レンズ 20 倍)

陰性対照のコントロール細胞以下の染色性を満たしている場合、PD-L1 陰性とします ( 図 8)。• 大部分の細胞が染色されていない。明らか

な細胞膜陽性像を認めても、その数が 10個以下である場合には、陰性と判断してよい。

• バックグラウンド染色の染色強度が 1+ 未満

» 本品中のコントロールスライドを、結果の解釈に使用しないでください。

施設内陽性対照・陰性対照のコントロール組織 ( 非小細胞肺癌 )施設内陽性対照のコントロールを観察し、組織が適切に処理され、正しく染色できていることを確認してください。理想的な陽性対照のコントロールには、細胞膜に弱から中等度の各強度に染色される腫瘍細胞が観察されます（図 9）。

図 9 : (理想的な)施設内陽性対照のコントロールの一例 (10 倍)

理想的な陰性対照のスライドでは、腫瘍細胞は染色されず、PD-L1 発現を示す腫瘍関連マクロファージ・免疫細胞が観察されます。 ( 図 10、次ページ参照 )。たいていの切片には多種の細胞が含まれ、内部陰性対照のコントロールになります。

各施設の陽性対照・陰性対照のコントロール組織は、検査対象の患者検体と同じスライド上に貼付すると、より厳密に染色の妥当性を確認することができます。

図 8 : 本品中のコントロールスライド（陰性対照のコントロール細胞）の染色性 (対物レンズ 20 倍)


16

図 12 : 一次抗体コントロールで染色した非小細胞肺癌症例組織検体では、腫瘍細胞膜は染色されない (対物レンズ 20 倍)

» 施設内コントロール細胞を、結果の解釈の一助として使用しないでください。

一次抗体陰性コントロール一次抗体陰性コントロールで染色した陽性対照および陰性対照の施設内コントロール組織検体を観察し、腫瘍細胞に偽陰性がみられないことを確認してください。腫瘍細胞の細胞膜が染色されていないことが必要です ( 図 12)。

一次抗体陰性コントロールで染色した組織検体スライドを観察し、一次抗体染色スライドの判定を妨げになる可能性のある非特異的染色が存在するかどうかを確認します。

» 一次抗体陰性コントロールで染色した検体と照らし合わせることで、一次抗体で染色した検体上の非特異的な染色を把握でき、より正確に判定することが可能です。

（任意の判断で）万が一、陰性対照のコントロールに不適当な染色像を認めた場合には、同ランで染色されたすべての組織検体結果を無効とみなします。

オプションのコントロール組織FFPE 扁桃組織も、コントロール組織として使用することができます。一次抗体で染色すると陰窩上皮が多数強度に染色され、胚中心では濾胞性マクロファージが弱から中等度に染色されます ( 図 11)。

内皮細胞、線維芽細胞、表層上皮にはPD-L1 発現を認めません。

BA

図 11 : PD-L1 一次抗体で染色した扁桃組織は、陰窩上皮で部分的に強い膜染色を示し (A)胚中心で濾胞性マクロファージに弱から中等度の膜染色を示す (B) (対物レンズ 10 倍)

図 10 : 施設内陰性対照のコントロールの一例 (対物レンズ 10 倍)


17

組織検体の妥当性の確認

図 13 : スライド評価の推奨される順番

n細胞質の染色n免疫細胞n正常細胞 n壊死細胞

スコアから除外：

組織検体ブロックから3 枚の連続切片を薄切する

切片は 4～5 µm とし、剥離防止のためにコーティングスライドに貼付する

再染色する

再染色する

再染色する

再染色する

病理医による判定

結果報告

1枚をHE染色し、ブロック（組織）の妥当性を判断する。

HE スライドは妥当ですか？(≧ 100 個の腫瘍細胞)

同じブロックを切り込み深部を薄切した組織検体または、

別の検体（ブロック）を薄切し再度HE染色をします。

本品中のコントロールスライドは適切に

染色されていますか？

施設内陽性対照のコントロールは適切に染色されていますか？

施設内陰性対照のコントロールは適切に染色されていますか？

一次抗体陰性コントロールで染色した組織検体の

染色結果は妥当ですか？

いいえ

いいえ

いいえ

いいえ

いいえ

はい

はい

はい

はい

はい

一次抗体で染色した腫瘍細胞が 100 個以上の

組織検体を評価する


18

染色性の評価と発現率 (TPS) の判定

Tumor Proportion Score (TPS) の定義Tumor Proportion Score (TPS) とは、組織検体中の全腫瘍細胞に対し、部分的または完全な細胞膜染色を呈する ( ≧ 1+) 腫瘍細胞の割合です。

判定のガイドライン• 低倍率にて、良好に形態が保持されてい

る全腫瘍細胞領域を観察します。全領域において、腫瘍細胞の染色性を評価します

（陰性か陽性か）。陽性と判断するためには、部分的または完全な細胞膜染色を呈している必要がありますが、低倍での観察では膜染色の評価に注意を要することがある点に留意してください。少なくとも組織検体上に 100 個以上の判定対象となる腫瘍細胞が存在を確認してください。

• 10 倍、20 倍、40 倍等の倍率では、細胞膜染色の有無に関わらず、すべての腫瘍細胞を観察してください。

• 倍率を変えて観察が必要になる本段階においては、下記のポイントに焦点をあててください。

– 腫瘍関連免疫細胞と腫瘍細胞の区別 – 陽性腫瘍細胞領域と

陰性腫瘍細胞領域の判定 – 部分的または完全な細胞膜染色

≧ 1+ の判定• 組織検体中の全腫瘍細胞に対する、部

分的または完全な細胞膜染色を呈する( ≧ 1+) 腫瘍細胞の割合として、Tumor Proportion Score (TPS) を算出します。注意事項：明瞭な細胞膜染色を呈さない腫瘍細胞を含む領域の判定には、十分な注意が必要です。

免疫細胞と壊死細胞は判定対象から除外識別のポイント：• 免疫細胞の核は、腫瘍細胞の核に比べ小

さい• マクロファージの細胞質内には、色素性

小片が観察されることがあります• マクロファージは点在する場合があります

（肺胞マクロファージは肺胞腔に存在します）

PD-L1 染色の評価

細胞質染色と明確に区別できる、部分的または完全な細胞膜染色 ( ≧ 1+) のみをスコアリングする。（細胞質の染色は、判定対象から除外する）

判定対象条件を満たす腫瘍細胞のみでスコアリングする。免疫細胞・正常細胞・壊死細胞・細胞片（debris）は判定対象から除外する。

PD-L1 発現腫瘍細胞の総数 PD-L1 発現 / PD-L1 非発現腫瘍細胞の総数

TPS ＝


19

Tumor Proportion Score (TPS) 用いてPD-L1発現を判定します。スコアリングガイドラインの例は、下記の表をご覧ください。

スコアリングガイドライン

PD-L1 発現 TPS 染色パターン

非発現＜ 1%

部分的または完全な細胞膜染色(≧ 1+)をみとめるも、その細胞の割合が全判定対象腫瘍細胞の 1%未満

低発現 1 ～ 49%

部分的または完全な細胞膜染色 (≧ 1+) をみとめるが、その細胞の割合が全判定対象腫瘍細胞の1～49%

高発現 ≧ 50%

部分的または完全な細胞膜染色(≧ 1+)をみとめ、その細胞の割合が全判定対象腫瘍細胞の50%以上

表 1：PD-L1 発現率と染色特性

未治療および既治療非小細胞肺癌患者は、 PD-L1 高発現 (TPS ≧ 50%) の場合、治療に適格です。

既治療の非小細胞肺癌患者で、PD-L1 低発現 (TPS ≧ 1%) の場合、治療に適格です。

TPS および治療の適格性 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」は、非小細胞肺癌患者のうちキイトルーダ ® ( ペムブロリズマブ ) を適切に投与するための補助として使われることを目的としています。治療の適応は、患者の治療歴と対応する TPS カットオフ値に基づきます。


20

TPS 決定に推奨される方法

高倍率：染色領域とした 10% 領域の倍率を上げて観察し、PD-L1 陽性細胞の割合を判定する。判定：50 % の腫瘍細胞が PD-L1 陽性。

例 1 : 狭い範囲にのみ、染色腫瘍細胞が存在する症例

Tumor Proportion Score (TPS) の算出：全腫瘍領域に対する PD-L1 陽性腫瘍細胞の割合を決定する。判定：Tumor Proportion Score (TPS): 10% x 50% = 5%

図 14 : 染色領域が狭い腫瘍の例

スコアリングは、病理医が実施してください。ここでは例として 2 つの評価方法を示します。様々な染色強度が混在するような症例において TPS を決定する方法として参考にしてください。

全腫瘍

90% 非染色

10% 染色

陰性腫瘍細胞1+、2+、3+ の腫瘍細胞腫瘍関連免疫細胞

低倍率：腫瘍部全体を観察し、≧ 1+ の細胞膜染色性を呈する腫瘍細胞の占める割合を判断します。判定：全腫瘍領域の 90% は染色されておらず、染色領域は 10%


21

高倍率：区画ごとに、細胞膜染色を呈する陽性細胞の割合を判定する。判定：それぞれ：80%、25%、50%、100% （下図を参照）

低倍率：全腫瘍領域を区画化する。

Tumor Proportion Score (TPS) の算出：全腫瘍細胞領域に対するPD-L1陽性腫瘍細胞の割合を決定する。判定：Tumor Proportion Score (TPS)： (80% + 25% + 50% + 100%) / 4 = ≧ 60%

図 15 : 染色領域が不均一な　例

例 2 : 腫瘍領域内での発現が不均一な症例

陰性腫瘍細胞1+、2+、3+ の腫瘍細胞腫瘍関連免疫細胞

25% PD-L1 陽性

50% PD-L1 陽性

80% PD-L1 陽性

100% PD-L1 陽性


22

治療対象となる非小細胞肺癌患者の選定PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」は、非小細胞肺癌患者のうちキイトルーダ ® ( ペムブロリズマブ ) の適切な投与を行うための補助として使われることを目的としたコンパニオン診断薬です。

未治療非小細胞肺癌患者に対する PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」を用いた臨床試験未治療非小細胞肺癌患者における PD-L1 陽性の定義は、Merck Sharp & Dohme Corp が実施したキイトルーダ KEYNOTE-024 試験に基づいています (www.ClinicalTrials.gov、 NCT02142738)。

未治療の非小細胞肺癌患者の組織検体について、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」を用いた PD-L1 発現検査を行いました。未治療の非小細胞肺癌組織検体に対し、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」を用いて PD-L1 発現率を測定しました。この試験により、キイトルーダの有効性は、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」による TPS ≧ 50% の患者に有効であるとされています。

PD-L1 発現非発現TPS ＜ 1%

低発現TPS 1 ～ 49%

高発現TPS ≧ 50%

患者％ (n) 30 .7% (507) 39 .1% (646) 30 .2% (500)

a. Merck & Co.社内データ。b. 患者は、KEYNOTE-024 試験のエントリーにあたり、スクリーニングされたc. 未治療進行転移性非小細胞肺癌（NSCLC）に対する、ペムブロリズマブと（治験責任医師が選択した）プラチナ製剤化学療法

(pemetrexed+carboplatin、pemetrexed+cisplatin、gemcitabine+cisplatin、gemcitabine+carboplatin、または paclitaxel+carboplatin) と併用療法の有効性を比較評価するための国際治験第III相試験。 ClinicalTrials.gov number NCT02142738.

表 2：KEYNOTE-024c における PD-L1 発現非小細胞肺癌b 患者の割合a

既治療の非小細胞肺癌患者に対する、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」の臨床試験既治療の非小細胞肺癌患者における PD-L1 陽性の定義は、Merck Sharp & Dohme Corp が実施したキイトルーダ KEYNOTE-010 試験に基づいています (www.ClinicalTrials.gov、 NCT01905657)。

既治療の非小細胞肺癌組織検体について、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」を用いて PD-L1 発現率を測定しました。この試験により、キイトルーダの有効性は、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」による TPS ≧ 1% の患者に有効であるとされています。

PD-L1 発現非発現TPS ＜ 1%



患者％ (n) 43 .0% (433) 34 .2% (344) 22 .8% (230)

d. Merck & Co.社内データ。e. 患者は、KEYNOTE-010 非小細胞肺癌試験への試験のエントリーにあたり、スクリーニングされた。 f. プラチナ製剤化学療法治療歴を有する非小細胞肺癌患者に対し、ドセタキセル投与群と、ペムブロリズマブと投与群での有効性を比較した国際第

2/3相治験。ClinicalTrials.gov number NCT01905657。

表 3： KEYNOTE-010fにおける PD-L1 発現非小細胞肺癌e患者の割合d


23

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」検査アルゴリズム本チャートを用いて、免疫染色の結果に対するキイトルーダ治療の適用を判定してください。

図 16 : PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」の検査アルゴリズム

キイトルーダ投与に関する判定結果を医師へ報告

既治療の場合

キイトルーダの治療に適する

腫瘍サンプル

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」

非発現TPS ＜ 1%



キイトルーダの治療に適さない

未治療・既治療すべての患者

キイトルーダの治療に適する

未治療の場合

キイトルーダの治療に適さない


24

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」の結果報告の際には下記の内容を含めることが推奨されます

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」 (コード: SK00621-5J) 検査内容など：検査日: _____________________________________________

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」 Lot :_______________________________

染色 Log ID :______________________________________

検体 ID :_______________________________________________

患者番号 :________________________________________________________________________

検査タイプ : マニュアル判定による IHC 染色

その他 :___________________________________________________________________________

施設の非小細胞肺癌パネルに PD-L1が含まれてる: はい：いいえ：

組織タイプ: 扁平上皮（癌）：非扁平上皮（癌）： PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」に加えて実施された検査： _____________________________________________________________________________________

染色結果:本品中のコントロールスライド染色結果 : 合否

十分数(≧ 100)の腫瘍細胞が存在している :

治療担当医師への結果報告 Tumor Proportion Score*: ______________________________________* PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」を、既治療の転移性非小細胞肺癌患者に対して実施した場合、その結果がTPS≧ 1%であればキイトルーダ（ペムブロリズマブ）治療

適応と判断する。 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」を未治療の転移性非小細胞肺癌患者に対して実施した場合、その結果が TPS ≧ 50% であれば、キイトルーダ (ペムブロリズマブ) 治

療適応と判断する。

追加情報: 高発現 ≧ 50%：低発現 1 ～ 49%: 非発現＜ 1%：

治療担当医師（臨床医）へのコメント:

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

結果の報告


25

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」　での染色結果判定における注意事項結果を正しくスコアリングするためには、以下の点を厳守してください。• 100 個以上の判定対象腫瘍細胞が存在す

る（形態を十分に保った腫瘍細胞という意味）

• 判定対象条件に合致する腫瘍細胞を評価する（形態を十分に保った腫瘍細胞でスコアリング）

• 適切に染色態度を評価する（細胞膜染色のみ）

• 染色が適切に評価されている

PD-L1 の染色判定では、病理医の経験と判断が重要です。評価とスコアリングには、4倍、10倍、20 倍、40 倍の対物レンズを用いて評価し

てください。評価において考慮すべき染色上の特徴的パターンを下記にいくつか示します。• 腫瘍細胞の細胞膜染色の 1+ ～ 3+ の

すべての強度を含める（強度に関わらない）

• 部分的または完全な膜染色を含める • 観察でき、かつ細胞膜染色とはっきりと

確認できる細胞をすべて含める • 細胞質染色は含めない • 浸潤性リンパ球やマクロファージなどの

腫瘍関連免疫細胞は含めない • 顆粒状の染色は、細胞膜染色とはっきりと

確認できる場合には判定対象に含める

次に、様々な特徴的な染色像を示します。

PD-L1 染色の特徴


26

図 17b : 一次抗体で染色。染色性は弱いものの、明らかに細胞膜が染色されていることが確認できます (矢印)。(対物レンズ 40 倍)

図 17a : 一次抗体で染色。腫瘍細胞の細胞膜が弱く染色されています。 (対物レンズ 10 倍)

非小細胞肺癌症例のさまざまな染色像とその解釈弱いが細胞膜染色が認められる場合観察倍率に関わらず、明らかな細胞膜染色を示す細胞はスコアリングに含めます。不確かな場合は、高倍率で確認してください。

重要なポイント細胞が染色強度≧ 1+ の細胞膜染色を呈する腫瘍細胞はすべて TPS に含めてください。


27

許容できる細胞膜染色染色強度が微弱（1+ 以上）であっても、細胞膜染色と明らかに判断できる細胞はすべてスコアリングに含めます。

図 18a : 染色性は微弱であるものの、細胞膜に陽性であることが確認できる。 (対物レンズ 20 倍)

図 18b : 染色性は微弱であるものの、細胞膜に陽性であることが確認できる。 (矢印) (対物レンズ 40 倍)

重要なポイント細胞が染色強度≧ 1+ の細胞膜染色を呈する腫瘍細胞はすべて TPS に含めてください。


28

腫瘍関連免疫細胞 (TAIC) と腫瘍細胞の区別スコアリングには、1+以上の強度を示し、明らかな細胞膜染色を呈する細胞のみを含めます。腫瘍関連免疫細胞は除外してください。

A

図 19: (A)一次抗体で強度に染色されているTAIC　(B)PD-L1 陰性の腫瘍細胞 TAIC は判定から除外する。(対物レンズ 20 倍)

A

B

図 20 : (A) 強度に染色されている腫瘍細胞　(B)中等度に染色されているTAIC TAIC は判定から除外する。(対物レンズ 20 倍)

B

重要なポイント TAIC は判定から除外します。


29

不均一な染色強度 PD-L1染色により、不均一な染色強度（1+ ～ 3+）を呈する場合があります。

B

C

A

図 21 : 不均一な細胞膜染色症例。 1+ (A) 2+(B) 3+(C) の各強度に染色されている。 (対物レンズ 20 倍)

重要なポイントいずれの強度でも、細胞膜への染色性を確認できる腫瘍細胞はすべてスコアリングに含めてください。

部分的および完全な細胞膜染色スコアリングには、部分的および完全な細胞膜染色のいずれも含めます。

（強度は1+以上）

A

B

図 22 : 染色強度 1+～3+ を含む不均一な細胞膜染色を呈する症例。 (A) 部分的な膜染色を呈する腫瘍細胞　(B) 完全な膜染色を呈する腫瘍細胞(対物レンズ 20 倍)。

重要なポイント腫瘍細胞の部分的または完全な細胞膜染色を TPS に含める必要があります。


30

細胞質および細胞膜の染色一次抗体を用いた色では、細胞質や細胞膜の染色を認めるが、細胞質染色はTPS 判定から除外します。

顆粒状の染色顆粒状に染色されてくる場合には、細胞膜染色との識別ができないことがあります。とくに細胞質染色と見間違いやすく判定が難しく、明らかな細胞膜染色と認識できる細胞だけTPS判定の対象とします。

図 24: 顆粒状ではあるものの、細胞膜染色と判断できる。 (対物レンズ 20 倍)

重要なポイント顆粒状の染色を観察する場合には、明らかに細胞膜染色と判定できる細胞のみを TPS 判定の対象細胞とします。

図 23: 腫瘍細胞の細胞質および細胞膜が強度に染色されている。（対物レンズ 20 倍)

重要なポイント顆粒状の染色を観察する場合には、明らかに細胞膜染色と判定できる細胞のみをTPS判定の対象細胞とします。


31

不均一な染色組織検体全体に偏り（不均一性）のある染色性を呈することがあります。正確にスコアリングするためには、各エリアを高倍率で観察する必要があります。

図 25 : 組織検体全体に染色性の偏りをみとめる。 (対物レンズ 10 倍)

重要なポイント TPS を正確に求めるには、検体全体を評価する必要があります。

炭粉色素炭粉色素は、吸い込んだ煙や粉塵からの炭素が肺に集積したもので、黒色の顆粒状の斑点として観察されます。この色素は、肺胞マクロファージの細胞質内に取り込まれるため、腫瘍細胞との鑑別に役立ちます。

A

B

図 26 : (A)強度の染色された腫瘍細胞　(B)中等度に染色された TAIC。TAIC はスコアリングから除外する。 (対物レンズ 20 倍)

重要なポイント炭粉色素は無視します。


32

TPS ＜ 1% の症例

症例 1: 非発現 (TPS ＜ 1%)

図 27a-27c: PD-L1 非発現 (TPS<1%)

図 27a : 対物レンズ 10 倍

図 27b : 対物レンズ 20 倍

図 27c : 対物レンズ 40 倍


33

図 28a-28c : PD-L1非発現 (TPS<1%)

症例 2: 非発現 (TPS ＜ 1%)





34

事例 3: 非発現 (TPS ＜ 1%)

図 29a-29c: PD-L1非発現 (TPS<1%) TAIC は染色されているが、スコアリングからは除外する。





35

事例 4: 非発現 (TPS ＜ 1%)

図 30a-30c : PD-L1非発現 (TPS<1%)TAIC は染色されているが、スコアリングからは除外する。





36

症例 5: 低発現 (TPS 1 ～ 49%)

図 31a-31c : PD-L1 低発現（TPS 1 ～ 49%)




TPS 1 ～ 49% 症例


37

症例 6: 低発現 (TPS 1 ～ 49%)

図 32a-32c : PD-L1低発現 (TPS 1 ～ 49%)





38

症例 7: 低発現 (TPS 1 ～ 49%)

図 33a-33c : PD-L1低発現（TPS 1 ～ 49%）





39

症例 8: 低発現 (TPS 1 ～ 49%)

図 34a-34c : PD-L1低発現（TPS 1 ～ 49%）





40

症例 9: 高発現 (TPS ≧ 50%)




図 35a-35c : PD-L1 高発現（TPS ≧ 50%）

TPS ≧ 50% の症例


41

症例 10: 高発現 (TPS ≧ 50%)

図 36a-36c : PD-L1高発現（TPS ≧ 50%）





42

症例 11: 高発現 (TPS ≧ 50%)




図 37a–37c: PD-L1高発現（TPS ≧ 50%）


43

症例 12: 高発現 (TPS ≧ 50%)

図 38a–38c : PD-L1高発現（TPS ≧ 50%）





44

症例 13: 高発現 (TPS ≧ 50%)




図 39a–39c : PD-L1高発現（TPS ≧ 50%）


45

症例 14: 高発現 (TPS ≧ 50%)

図 40a–40c : PD-L1高発現（TPS ≧ 50%）


図 40b : 対物レンズ 20 倍20 倍



46

症例 15: 高発現 (TPS ≧ 50%)




図 41a–41c : PD-L1高発現（TPS ≧ 50%）


47

判定が困難な症例 1: カットオフ≧ 50% 付近 (TPS 40 ～ 60%)

図 42a-42c : PD-L1低発現（TPS 40%）




カットオフ≧ 50% 付近の症例（TPS 40 ～ 60%）


48





図 43a–43c : PD-L1低発現（TPS 40%）


49





図 44a–44c : PD-L1 高発現（TPS 50%）


50

判定が困難な症例 4: カットオフ ≧ 50% 付近 (TPS 40 ～ 60%)




図 45a–45c : PD-L1 高発現 (TPS 60%)


51

判定が困難な症例 5: カットオフ ≧ 50% 付近 (TPS 40 ～ 60%)




図 46a–46c : PD-L1 高発現 (TPS 60%)


52





カットオフ≧1% 付近の症例(TPS 0 ～ 10%)

図 47a–47c : PD-L1 非発現（TPS ＜ 1%）


53





図 48a–48c : PD-L1非発現（TPS ＜ 1%）


54


図 49a–49c : PD-L1 低発現（TPS = 1 ～ 10%）





55





図 50a–50c : PD-L1 低発現（TPS = 1 ～ 10%）


56


図 51a–51c : PD-L1 低発現 (TPS = 1 ～ 10%)





57


58

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」を用いて染色した際に、遭遇しうるアーチファクト

非特異的バックグラウンド染色バックグラウンド染色とは、組織検体の広範囲にみられる非特異的染色と定義されます。これには、様々な要因が関与します。例えば、検体の固定などの前処理や組織検体作製時のプロセスが正しく実施されなかったり、脱パラフィン不良やスライドの洗浄不良などからも引き起こされます。

10% 中性緩衝ホルマリン以外の固定液を使用することもバックグラウンド染色の原因となることがあります。PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」によるバックグラウンド染色は稀です。

バックグラウンド染色を生じうる要因• スライドの染色前の乾燥（ダコ Autostainer

Link 48 へスライドをのせる際、機器の稼動前にスライドが乾いてしまうことを防ぐため、スライド表面に洗浄液をかけ、湿潤状態を保つ）

• 脱パラフィン不良 • スライドの洗浄不良

陰性対照のコントロールと、組織検体上のバックグラウンド染色状態を照らし合わせることで、その程度を把握することができます。全ての組織検体において、非特異的バックグラウンド染色は、≦ 1+ である必要があります。

アーチファクト

図 52 : バックグラウンドの非特異染色は許容範囲内。 (対物レンズ 20 倍)

重要なポイント全ての標本において、非特異的バックグラウンド染色は≦ 1+である必要があります


59

図 53 : バックグラウンド染色は> 1+ 判定に不適当。 (対物レンズ 20 倍)

図 54 : バックグラウンド染色は許容範囲内。 (対物レンズ 20 倍)


60

エッジアーチファクト一般的に、前処理工程における組織の取り扱いに関係して生じます。• 厚い組織を固定した場合、組織周辺部分

にくらべ組織中央部が十分に固定されず、エッジアーチファクトに類似した染色態度を示すことがあります。このような場合、組織周辺部のみが適切に染色されることで、適切に染色されてこない組織中央部の評価を偽陰性と誤ってしまうことがあります。

• エッジアーチファクトは、組織周辺部の染色性が増強する現象として知られています。

• 組織が固定前に乾燥したり、染色中に乾燥することによっても引き起こされます。

• 陽性反応が組織切片の周辺部位にだけ認める場合、その周辺部位のみでスコアリングすることは避けてください。

図 55a : エッジアーチファクトを示している。エッジ部分での判定は避ける。 (対物レンズ 4 倍)

重要なポイントこれらの要因により組織検体全体に染まりムラ（不均一性）を呈していると考えられる場合には、周辺部のみでスコアリングすることは避けてください。


61

図 55b : エッジアーチファクトを示している。エッジ部分での判定は避ける。 (対物レンズ 20 倍)


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クラッシュアーチファクト一般的に、エッジアーチファクトと密接に関連しています。このアーチファクトは、経気管支生検材料で高頻度に認められます。検体採取の際に強い力が加わったことにより組織が挫滅し、そのエッジ部分が縁取るように染色されます。

• 切片作製中に不注意で組織を挫滅してしまうと、形態学的に組織構造に歪を生じてしまいます。

• 挫滅した細胞は、周囲の細胞よりも強い染色性を示すことがあります。典型像としては、核の凝集が観察されます。挫滅した細胞は、スコアリングから除外してください。

図 56 : クラッシュアーチファクトを呈する。 (対物レンズ 10 倍)

重要なポイント組織検体全体像から、クラッシュアーチファクトと考えられる場合には、アーチファクト部位でのスコアリングは避けてください。


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壊死壊死は、細胞死を示す形態学的変化ですが、その詳細は明確に定義されていません。細胞肺がん検体に存在することが多く、スコアリングからは除外する必要があります。

図 57 : 強度に染色された壊死細胞と、判定に適切な腫瘍細胞をみとめる。壊死染色はスコアリングから除外します。 (対物レンズ 20 倍)

重要なポイント壊死領域はスコアリングから除外します。


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図 58: 固定不良組織検体 (対物レンズ 10 倍)

固定不良PD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」を用いる場合、固定方法の標準化が非常に重要であり、不適切な処理は誤った検査結果を生じることになります。

重要なポイント正しい診断結果を出すためには、適切な固定が不可欠となります。


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トラブルシューティングガイド

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 「ダコ」のトラブルシューティングガイド詳細なトラブルシューティングが必要な場合には、テクニカルサポート担当者またはカスタマーサポートまでご連絡ください。

問題考えられる原因推奨される処置

染色されていないプログラミングエラースライドオーダーに際し、 PD-L1 IHC 22C3pharmDx「ダコ」プロトコールが選択されていることを確認

DABによる反応不足基質発色液が適切に調製されていることを確認

洗浄液中のアジ化ナトリウム

ダコ Envision FLEX 洗浄液 (20 x)、コード: K800721-2 以外は使用しない

本品中のコントロールスライドの劣化

外装に印刷されているキットの使用期限と保存条件を確認

染色が弱い不適切な固定法の使用検証された固定液と固定方法のみを使用していることを確認

本品中のコントロールスライドの染色が弱い不適切な抗原賦活液の調整 3-in-1 処理が正しく行われたことを確認

過度のバックグラウンド染色を認める脱パラフィン不良 3-in-1 処理が正しく行われたことを確認

機器搭載時など染色前にスライドが乾燥した

染色前のいずれの段階においても、スライドが緩衝液で湿潤状態であることを確認

試薬と組織切片の非特異的吸着

検体が適切に固定されていることや、壊死の有無を確認

スライドから組織が剥がれる不適切なスライドガラスの使用適切なコーティング済みスライドを使用

染色性が強すぎる不適切な固定法の使用検証された固定液と固定方法のみを使用していることを確認

不適切な洗浄液の使用ダコ Envision FLEX 洗浄液 (20 x)、コード: K800721-2以外は使用しない

加熱時、抗原賦活液が濁る加熱時、抗原賦活液が濁るこれは正常であり、染色には影響しない


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参考文献

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