P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 1/14

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 testova za upotrebu sa sustavom Autostainer Link 48 Namjena Za upotrebu u in vitro dijagnostici. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je kvalitativni imunohistokemijski test koji upotrebljava monoklonski mišji anti-PD-L1, klon 22C3 namijenjen za otkrivanje proteina PD-L1 u tkivu karcinoma pluća nemalih stanica (NSCLC) fiksiranima u formalinu i uklopljenima u parafin (FFPE) s pomoću sustava vizualizacije EnVision FLEX na sustavu Autostainer Link 48. Ekspresija proteina PD-L1 određuje se s pomoću udjela tumorskih stanica (Tumor proportion score, TPS) što predstavlja postotak održivih stanica tumora koje pokazuju djelomično ili potpuno bojenje membrane. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx indiciran je kao pomoć u identificiranju pacijenata s NSCLC-om za liječenje lijekom KEYTRUDA® (pembrolizumab). Sažetak i objašnjenje Vezanje liganda PD-1, PD-L1 i PD-L2 za PD-1 receptor na T stanicama inhibira proliferaciju T stanica i proizvodnju citokina. U nekim tumorima događa se povećanje broja PD-1 liganda i signaliziranje kroz taj put može doprinijeti inhibiciji aktivnog imunološkog nadzora tumora za T-stanice. KEYTRUDA je humano monoklonalno antitijelo koje se veže na receptor PD-1 i blokira njegovu interakciju s PD-L1 i PD-L2, otpuštajući inhibiciju imunosnog odgovora posredstvom puta recptora PD-1, uključujući antitumorski imunosni odgovor. U modelima singeničnih mišjih tumora blokiranje aktivnosti PD-1 rezultiralo je smanjenjem rasta tumora (1). Načelo postupka PD-L1 IHC 22C3 pharmDx sadrži optimizirane reagense i protokole potrebne za dovršavanje imunohistokemijskog (IHC) postupka bojenja uzoraka fiksiranih u formalinu i uklopljenih u parafin (FFPE) s pomoću sustava Autostainer Link 48. Nakon inkubacije s primarnim monoklonskim antitijelom na PD-L1 ili reagensom negativne kontrole (NCR), uzorci se inkubiraju s vezujućim antitijelom specifičnim za vrstu domaćina primarnog antitijela, a zatim se inkubiraju s reagensom za vizualizaciju spremnim za upotrebu koji se sastoji od molekula sekundarnog antitijela i molekula peroksidaze hrena vezanih na okosnicu polimera dekstrana. Enzimska konverzija naknadno dodanog kromogena rezultira taloženjem vidljivog produkta reakcije na mjestu antigena. Reagens za pojačanje kromogena mijenja boju reakcije kromogena. Uzorak se tada može kontraobojiti i pokriti pokrovnicom. Rezultati se tumače s pomoću svjetlosnog mikroskopa. Isporučeni materijali Svaki komplet uključuje 19,5 mL primarnog antitijela PD-L1 (približna koncentracija proteina od 3 µg/mL) i sadrži reagense potrebne za izvršavanje 50 testova u do 15 pojedinačnih serija. Materijali navedeni u nastavku dostatni su za 50 testova (50 stakalaca inkubiranih s primarnim antitijelom na PD-L1 i 50 stakalaca inkubiranih s odgovarajućim reagensom negativne kontrole, sveukupno 100 stakalaca). Broj testova temelji se na upotrebi 2 x 150 µL svakog reagensa po stakalcu, osim DAB+ i otopine za demaskiranje antigena. Komplet obuhvaća materijale dostatne za najviše 15 pojedinačnih ciklusa bojenja. Količina Opis 1 x 34,5 mL Reagens za blokiranje peroksidaze

Puferirana otopina koja sadrži vodikov peroksid, deterdžent i 0,015 mol/L natrijeva azida.

1 x 19,5 mL

Primarno antitijelo: Monoklonski mišji anti-PD-L1, klon 22C3

Monoklonski mišji (IgG1) anti-PD-L1 u puferskoj otopini, sa stabilizirajućim proteinom i 0,015 mol/L natrijeva azida.

1 x 15 mL

Reagens negativne kontrole

Monoklonsko mišje kontrolno antitijelo IgG u puferskoj otopini, sa stabilizirajućim proteinom i 0,015 mol/L natrijeva azida.

1 x 34,5 mL Mišji LINKER

Sekundarno zečje antitijelo nasuprot mišjih imunoglobulina u puferiranoj otopini sa stabilizirajućim proteinom i 0,015 mol/L natrijeva azida.

1 x 34,5 mL Reagens za vizualizaciju – HRP

Dekstran vezan na molekule peroksidaze i molekule kozjeg sekundarnog antitijela protiv zečjih i mišjih imunoglobulina

VISUALIZATION REAGENT-HRP

LINKER, ANTI-MOUSE

NEGATIVE CONTROL REAGENT

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 2/14

u puferiranoj otopini koja sadrži stabilizirajući protein i antimikrobni agens.

15 x 7,2 mL DAB+ supstratni pufer

Puferirana otopina sadrži hidrogen-peroksid i antimikrobno sredstvo.

1 x 5 mL DAB+ kromogen

3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid u organskom otapalu.

1 x 34,5 mL Pojačivač DAB-a

Bakreni sulfat u vodi.

6 x 30 mL EnVision FLEX otopina za demaskiranje antigena, niski pH, 50x

Puferirana otopina, pH 6,1, koja sadrži deterdžent i antimikrobni agens.

15 stakalaca Kontrolna stakla PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Svako stakalce sadrži dijelove dviju staloženih staničnih linija fiksiranih u formalinu i uklopljenih u parafin: NCI-H226* s umjerenom ekspresijom proteina PD-L1 i MCF-7 s negativnom ekspresijom proteina PD-L1.

P

D-L

1 IH

C 2

2C3

ph

arm

Dx

XX

XX

X

*Dr. AF Gazdar i Dr. JD Minna pri NIH-u priznaje se njihov doprinos razvoju NCI-H226 (ATCC broj: CRL-5826™) (2). Napomena: Svi uključeni reagensi formulirani su specifično za upotrebu s ovim kompletom. Kako bi test radio prema specifikacijama, ne smiju se upotrebljavati zamjene, osim otopine za demaskiranje antigena EnVision FLEX, niski pH, koncentracije 50x (šifra K8005). PD-L1IHC 22C3 pharmDx prilagođen je za upotrebu s uređajem Autostainer Link 48. Daljnje upute pogledajte u korisničkim priručnicima za Autostainer Link 48 i PT Link Potrebni materijali koji nisu dostavljeni Modul za predtretman PT Link (šifra PT100/PT101) Autostainer Link 48 (šifra AS480) Pufer za ispiranje EnVision FLEX, koncentracije 20x (šifra K8007) Hematoksilin (šifra K8008) Destilirana ili deionizirana voda (voda kvalitete reagensa) Mjerač vremena Pozitivna i negativna tkiva za upotrebu kao kontrole procesa (pogledajte odjeljak Kontrola kvalitete) Mikroskopska stakalca: Mikroskopska stakalca Dako FLEX IHC (šifra K8020) ili nabijena stakalca Fisherbrand Superfrost Plus Pokrovnice Trajni medij za pokrivanje i pomoćni reagensi potrebni za pokrivanje pokrovnicama Svjetlosni mikroskop (uvećanje objektiva 4x–40x) Mjere opreza 1. Za upotrebu u in vitro dijagnostici. 2. Za profesionalne korisnike. 3. Ovaj proizvod sadrži natrijev azid (NaN3), kemijsku tvar koja je u čistom obliku iznimno otrovna. Iako nije klasificiran kao opasan, u

koncentracijama proizvoda NaN3 može reagirati s olovnim i bakrenim cijevima te stvoriti izuzetno eksplozivne tvorevine metalnih azida. Nakon odlaganja isperite velikom količinom vode kako biste spriječili stvaranje metalnih azida u cijevima (3).

4. Primarno antitijelo, reagens negativne kontrole, linker i reagens za vizualizaciju sadrže materijal životinjskog porijekla. 5. Uzorke prije i nakon fiksacije, kao i sve materijale koji su im izloženi, mora se tretirati kao da mogu prenijeti infekciju te ih se mora

odložiti uz ispravne mjere opreza (4). 6. Vremena inkubacije, temperature i metode koji nisu navedeni mogu dati pogrešne rezultate. 7. Reagensi su optimalno razrijeđeni. Daljnje razrjeđivanje može rezultirati gubitkom obojenja antigena. 8. Prekomjerno izlaganje svjetlosti može negativno utjecati na reagens za vizualizaciju, tekući kromogen DAB+ i pripremljenu otopinu

supstrat-kromogena DAB+. Ne pohranjujte komponente sustava i ne izvršavajte bojenje na jakom svjetlu, kao što je izravno sunčevo svjetlo.

9. Ostaci parafina mogu izazvati lažno negativne rezultate. 10. Upotreba količina reagensa koje nisu preporučene može rezultirati gubitkom vidljive PD-L1 imunoreaktivnosti.

DAB ENHANCER

DAB+ CHROMOGEN

CONTROL SLIDES

EnVision™ FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

MCF-7: PD-L1 negativno

NCI-H226: PD-L1 pozitivno

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 3/14

11. Rezultati malog istraživanja pokazali su sličan dinamički raspon ekspresije PD-L1 u primarnim i metastatskim parovima uzoraka karcinoma pluća nemalih stanica (NSCLC). Moguće je da postoje razlike u ekspresiji PD-L1 u primarnim tumorima u odnosu na metastatske lokacije u istog pacijenta.

12. Za velike rezove tkiva može trebati 3x150 µl reagensa. 13. Kao općenito pravilo, osobe mlađe od 18 godina ne smiju rukovati ovim proizvodom. Korisnici moraju biti pažljivo upućeni u

ispravne radne postupke, opasna svojstva proizvoda i nužne sigurnosne upute. Dodatne informacije potražite u listu sa sigurnosnim podacima (SDS).

14. Nosite prikladnu osobnu zaštitnu opremu kako biste izbjegli kontakt s očima i kožom. 15. Neiskorištenu otopinu potrebno je odložiti u skladu s lokalnim i državnim propisima. 16. List sa sigurnosnim podacima dostupan je na zahtjev profesionalnih korisnika.

Opasnost DAB+ kromogen: 1–5 % bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraamin tetrahidroklorid H350 Može prouzročiti rak. H341 Sumnja se da uzrokuje genetske defekte. P201 Prije uporabe pribaviti posebne upute. P202 Ne rukovati prije upoznavanja i razumijevanja sigurnosnih mjera predostrožnosti. P280 Nositi zaštitne rukavice. Nositi zaštitnu opremu za oči ili lice. Nositi zaštitnu odjeću. P308 + P313 U SLUČAJU izloženosti ili sumnje na izloženost: Zatražiti pomoć liječnika. P405 Skladištiti pod ključem. P501 Spremnik i sadržaj trebaju se odložiti u skladu s lokalnim, regionalnim, nacionalnim i međunarodnim propisima.

Upozorenje EnVision FLEX otopina za demaskiranje antigena, niski pH (50x): 1 – 5 % limunske kiseline H319 Uzrokuje jako nadraživanje oka. H411 Toksično za vodene organizme s dugoročnim posljedicama. P280 Nositi zaštitnu opremu za oči ili lice. P273 Izbjegavajte otpuštanje u okoliš. P264 Nakon uporabe temeljito oprati ruke. P305 + P351 + P338

U SLUČAJU DODIRA S OČIMA: Oprezno ispirati vodom nekoliko minuta. Ukloniti kontaktne leće ako ih nosite i ako se one lako uklanjaju. Nastaviti ispiranje.

P337 + P313 Ako nadražaj oka ne prestaje: Zatražiti pomoć liječnika. P501 Spremnik i sadržaj trebaju se odložiti u skladu s lokalnim, regionalnim, nacionalnim i međunarodnim propisima.

Pohrana Sve komponente testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, uključujući kontrolna stakalca, pohraniti na tamnom mjestu na 2 – 8 °C kada se ne upotrebljavaju na uređaju Autostainer Link 48. Ne upotrebljavajte komplet nakon roka trajanja ispisanog na vanjskoj strani kutije kompleta. Ako reagensi nisu pohranjeni u uvjetima navedenim u ovim uputama za upotrebu, korisnik mora provjeriti uvjete. Ne postoje očiti znakovi koji bi ukazali na nestabilnost ovog proizvoda, stoga zajedno s uzorcima pacijenta treba provoditi i pozitivne i negativne kontrole. Priprema uzorka Uzorcima se mora rukovati tako da se tkivo sačuva za imunohistokemijsko bojenje. Za sve uzorke moraju se upotrebljavati standardne metode obrade tkiva. Sekcije uklopljene u parafin Tkiva fiksirana u formalinu i uklopljena u parafin prikladna su za upotrebu. Alternativni fiksativi nisu potvrđeni i mogu dati pogrešne rezultate. Preporučuje se vrijeme fiksacije za 12 – 72 sata u neutralno puferiranom formalinu (NBF) od 10 %, međutim, istraživanje s ograničenim uzorcima pokazalo je da vremena fiksacije od 4 – 168 sati u neutralno puferiranom formalinu od 10 % nisu sistematski promijenila otkrivanje PD-L1. Vremena fiksacije ≤3 sata mogu rezultirati varijabilnim otkrivanjem PD-L1. Uzorke treba blokirati u debljinu od 3 ili 4 mm, fiksirati u formalinu i dehidrirati te razbistriti u seriji alkohola i pufera za ispiranje, nakon čega slijedi infiltracija otopljenim formalinom. Temperatura parafina ne smije prekoračiti 60 °C. Blokovi FFPE tkiva od 5 ili više godina mogu rezultirati gubitkom imunoreaktivnosti PD-L1. Uzorke tkiva potrebno je izrezati u dijelove veličine 4 – 5 µm. Nakon izrezivanja u dijelove, tkiva treba pokriti na stakalcima Fisherbrand Superfrost Plus ili mikroskopskim stakalcima Dako FLEX IHC (šifra K8020), a zatim staviti na 1 sat u pećnicu pri temperaturi 58 ± 2 °C. Kako bi se očuvala antigenost, kada se rezovi tkiva pokriju na stakalcima trebaju se čuvati na tamnom mjestu na 2 – 8 °C (poželjno) ili na sobnoj temperaturi do 25 °C te obojiti unutar 6 mjeseci od izrezivanja. Uvjeti pohrane i rukovanja stakalcima ne smiju prelaziti 25°C ni u kojem trenutku nakon pokrivanja kako bi se sačuvali integritet i antigenost tkiva. Upotreba testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx na dekalcificiranim tkivima nije provjerena i ne preporučuje se. Priprema reagensa Prije bojenja potrebno je pripremiti sljedeće reagense: EnVision FLEX otopina za demaskiranje antigena, niski pH, 50x Pripremite dovoljnu količinu otopine za demaskiranje antigena, niski pH koncentracije 1x tako da otopinu za demaskiranje antigena niskog pH koncentracije 50x razrijedite u omjeru 1:50 s pomoću destilirane ili deionizirane vode (voda kvalitete reagensa); pH otopine za demaskiranje antigena koncentracije 1x mora biti 6,1 ± 0,2. pH otopine za demaskiranje antigena koncentracije 1x ispod 5,9 može dati pogrešne rezultate. Jedna boca otopine za demaskiranje antigena niskog pH koncentracije 50x od 30 mL, razrijeđena u omjeru 1:50 dat će 1,5 L reagensa koncentracije 1x što je dovoljno da se napuni jedan spremnik za PT Link s kojim se može obraditi do 24

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 4/14

stakalca po upotrebi. Otopinu za demaskiranje antigena koncentracije 1x bacite nakon tri upotrebe i ne upotrebljavajte je nakon 5 dana od razrjeđivanja. Ako je potrebno, dostupna je dodatna otopina za demaskiranje antigena EnVision FLEX, niski pH, koncentracije 50x, pod šifrom K8005. Pufer za ispiranje EnVision FLEX, koncentracije 20x Pripremite dovoljnu količinu pufera za ispiranje tako da razrijedite pufer za ispiranje koncentracije 20x u omjeru 1:20 s pomoću destilirane ili deionizirane vode (voda kvalitete reagensa) za korake ispiranja. Neiskorištenu 1x otopinu pohranite pri 2-8 °C na najviše mjesec dana. Odbacite pufer ako izgleda zamućeno. Dodatne informacije potražite u korisničkom priručniku za Autostainer Link 48. Pufer za ispiranje EnVision FLEX, koncentracije 20x dostupan je pod šifrom K8007. DAB+ otopina supstrat-kromogen Otopinu je prije upotrebe potrebno temeljito izmiješati. Talog koji se može stvoriti u otopini ne utječe na kvalitetu bojenja. Za pripremu DAB+ otopine supstrat-kromogen, dodajte 1 kap tekućeg DAB+ kromogena po mL DAB+ supstratnog pufera i izmiješajte. Pripremljeni supstrat-kromogen stabilan je 5 dana ako se pohrani na tamnom mjestu pri 2-8 C. Važne napomene:

Ako upotrebljavate cijelu bocu DAB+ supstratnog pufera, dodajte 9 kapi DAB+ kromogena. Iako je na naljepnici naveden volumen od 7,2 mL, to je iskoristivi volumen i ne obuhvaća "mrtvi volumen" u boci.

Boja tekućeg DAB+ kromogena u boci može varirati od prozirne do lavanda-smeđe. To ne utječe na rad proizvoda. Razrijedite prema gore navedenim smjernicama. Dodavanje viška tekućeg DAB+ kromogena u DAB+ supstratni pufer rezultirat će pogoršanjem pozitivnog signala.

Postupak bojenja na otopini za Autostainer Link 48 Proceduralne napomene Prije upotrebe korisnik mora pažljivo pročitati ove upute i upoznati se sa svim komponentama i instrumentima. Prije imunobojenja svi reagensi moraju se izjednačiti sa sobnom temperaturom (20-25 °C). Isto tako, sve inkubacije moraju se izvršiti na sobnoj temperaturi. Sekcije tkiva ne smiju se osušiti tijekom postupka bojenja. Na osušenim sekcijama tkiva mogu se pojaviti pojačana nespecifična obojenja. Svi potrebni koraci i vremena inkubacije za bojenje unaprijed su programirani u softveru Dako Link. Dodatne informacije o protokolima programiranja i umetanju stakalaca i reagensa potražite u korisničkim priručnicima za Autostainer Link 48 i PT Link. Napomena: Reagensi i upute isporučeni s ovim sustavom osmišljeni su za optimalan rad kad se upotrebljavaju s preporučenim reagensima i materijalima. Dodatno razrjeđivanje reagensa ili promjena vremena inkubacije ili temperatura može dovesti do pogrešnih ili nepodudarnih rezultata. Protokol bojenja Odaberite protokol bojenja PD-L1 IHC 22C3 pharmDx iz opcija u padajućem izborniku softvera Dako Link. Svi potrebni koraci i vremena inkubacije za bojenje unaprijed su programirani u uređaju Autostainer Link 48. Ako se na vašem poslužitelju ne nalaze odgovarajući protokoli PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, obratite se lokalnom predstavniku tehničke podrške kako biste dobili protokole. 1. korak: Postupak deparafinizacije, rehidracije i demaskiranja antigena (3-u-1)

Pojedinosti potražite u Korisničkom priručniku za PT Link.

Predzagrijavanje i hlađenje za PT Link (šifra PT100/PT101) postavite na 65 °C. Zagrijavanje postavite na 97 °C na 20 minuta. ►Spremnike instrumenta PT Link napunite s 1,5 L otopine za demaskiranje antigena, niski pH, po spremniku, 1x aktivne otopine za

prekrivanje sekcija tkiva. ►Prethodno zagrijte otopinu za demaskiranje antigena na 65 °C. ►Nosače za Autostainer s pokrivenim rezovima tkiva fiksiranima u formalinu i uklopljenima u parafin (FFPE) uronite u unaprijed

zagrijanu otopinu za demaskiranje antigena, niski pH (aktivna otopina koncentracije 1x) u spremnik PT Link. Inkubirajte 20 minuta pri 97 °C.

►Kada završi inkubacija demaskiranja antigena i temperatura se ohladila na 65 °C, izvadite svaki nosač za stakalca Autostainer sa stakalcima iz spremnika PT Link i nosač za stakalca Autostainer sa stakalcima odmah stavite u spremnik (npr., stanica za ispiranje PT Link, šifra PT109) koji sadrži razblaženi pufer za ispiranje, sobne temperature (šifra K8007).

►Stakalca inkubirajte 5 minuta u razrijeđenom puferu za ispiranje na sobnoj temperaturi. 2. korak: Postupak bojenja Nakon postupka deparafinizacije, rehidracije i demaskiranja antigena (3-u-1), nosači sustava Autostainer sa stakalcima postavljaju se na Autostainer Link 48. Instrument će izvršiti postupak bojenja primjenom odgovarajućeg reagensa, praćenjem vremena inkubacije i ispiranjem stakalaca između reagensa. Vremena reagensa unaprijed su programirana u softveru Dako Link. 3. korak: Kontraobojenje Stakalca treba bojiti kontrastnom bojom 5 minuta s pomoću hematoksilina (Link) (šifra K8008). Vrijeme inkubacije hematoksilina unaprijed je programirano u protokolu. 4. korak: Pokrivanje Potrebno je sredstvo za trajno pokrivanje bez vode. Napomena: Moguće je blijeđenje obojenih stakalaca, ovisno o nekoliko faktora koji uključuju, ali nisu ograničeni na kontraobojenje, materijal i metode pokrivanja te uvjete pohrane stakalca. Da biste izbljeđivanje sveli na najmanju moguću mjeru, stakalca pohranite na tamnom mjestu pri sobnoj temperaturi (20-25 °C). Kontrola kvalitete Reagensima u testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx kvaliteta je kontrolirana imunohistokemijom s pomoću gore navedenih postupaka demaskiranja antigena i bojenja. Odstupanja od preporučenih postupaka za fiksaciju, obradu i uklapanje tkiva u laboratoriju korisnika mogu prouzročiti značajnu varijabilnost rezultata. U svaki ciklus bojenja treba uključiti kontrolu kvalitete. Te kontrole kvalitete

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 5/14

specificirane su u Tablici 1 i uključuju: uzorak H&E obojenog tkiva pacijenta; laboratorijski dostavljena tkiva za pozitivnu i negativnu kontrolu i stakalce kontrolne stanične linije koji dostavlja Dako (5). Za SAD, pogledajte smjernice za kontrolu kvalitete u programu akreditacije za imunohistokemiju Udruženja američkih patologa (CAP); pogledajte i Osiguranje kvalitete CLSI-ja za imunohistokemiju, odobrene smjernice (5, 6, 7) za dodatne informacije. Verifikacija testa Prije prve upotrebe sustava za bojenje u dijagnostičkom postupku korisnik bi trebao provjeriti rad testa testiranjem na nizu tkiva koja isporučuje laboratorij s poznatim imunohistokemijskim karakteristikama izvođenja koja predstavljaju poznata pozitivna i negativna tkiva. Pogledajte postupak kontrole kvalitete opisan u odjeljku kontrole kvalitete ranije u tekstu. Te bi postupke kontrole kvalitete trebalo ponoviti za svaku novu seriju antitijela ili uvijek kada postoji promjena u parametrima testa. Mogućnosti rješavanja problema za potencijalne probleme, njihovi uzroci i predložene korektivne radnje opisani su u Tablici 10. Tumačenje bodovanja - NSCLC Treba procijeniti sve održive stanice tumora na cijelom stakalcu i uključiti u bodovanje PD-L1. Na PD-L1 obojenom stakalcu treba biti prisutno najmanje 100 održivih stanica tumora kako bi se uzorak mogao smatrati odgovarajućim za PD-L1 procjenu. Za uspješno bodovanje uzoraka obojenih testom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ključno je da se odgovarajuće stanice procijene, da se utvrdi odgovarajuća stanična lokalizacija te da se intenzitet bojenja pravilno tumači. Procjenu stakalaca mora izvršiti patolog pomoću svjetlosnog mikroskopa. Za procjenu imunohistokemijskog bojenja i bodovanje odgovara objektiv uvećanja od 10 – 40x. Svako zamjetno bojenje membrane stanica tumora treba biti uključeno u bodovanje. Bodujte djelomično ili potpuno bojenje membrane stanice (≥1+) koje se opaža različito od citoplazmatskog bojenja. Citoplazmatsko bojenje treba smatrati nespecifičnim bojenjem te se isključuje iz procjene intenziteta bojenja. Normalne stanice i imune stanice povezane s tumorom poput infiltracijskih limfocita ili makrofaga ne smiju se uključiti u bodovanje kako bi se odredila pozitivnost PD-L1. Uzorci tumora obojeni s NCR moraju imati 0 specifičnih bojenja i <1+ pozadinskog bojenja. Udio tumorskih stanica (TPS) je postotak održivih stanica tumora koji pokazuje djelomično ili potpuno bojenje membrane (≥1+). Uzorak treba smatrati PD-L1 pozitivnim ako TPS ≥1 % održivih stanica tumora pokazuje bojenje membrane bilo kojeg intenziteta (tj. ≥1+). Za svaku seriju bojenja, stakalca treba pregledati redoslijedom navedenim u Tablici 1 kako bi se odredila valjanost serije bojenja i omogućila procjena bojenja tkiva uzorka. Dodatne smjernice pogledajte u Priručniku za tumačenje za PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Dodatne preporuke za tumačenje bojenja PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 1. Kako biste provjerili bojenje membrane stanice, upotrijebite objektiv uvećanja 10 – 40x. 2. Razni ne-ciljni elementi, poput imunih stanica povezanih s tumorom (npr. makrofagi) i strome mogu također pokazati pozitivno

bojenje na PD-L1, međutim ne smiju se uključiti u bodovanje. Tablica 1. Preporučeni redoslijed procjene stakalaca

Uzorci Obrazloženje Zahtjevi 1. H&E (isporučuje laboratorij)

Najprije se procjenjuje obojenje uzorka tkiva hematoksilinom i eozinom (H&E) kako bi se procijenila histologija tkiva i kvaliteta očuvanja.

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx i H&E bojenje treba izvršiti na serijskim rezovima iz istog parafinskog bloka uzorka. Treba biti prisutno najmanje 100 održivih stanica tumora kako bi se uzorak mogao smatrati odgovarajućim za PD-L1 procjenu. Uzorci tkiva moraju biti netaknuti, dobro očuvani i moraju potvrđivati indikaciju tumora.

2. Stakalce za kontrolnu staničnu liniju (isporučuje tvrtka Dako)

Treba pregledati stakalce za kontrolnu staničnu liniju bojeno primarnim antitijelom PD-L1 iz PD-L1 IHC 22C3 pharmDx kako bi se utvrdilo rade li svi reagensi pravilno. Stakalce za kontrolnu staničnu liniju sadrži PD-L1 pozitivan pelet stanične linije i PD-L1 negativan pelet stanične linije.

Jedno stakalce kontrolne stanične linije treba biti bojeno s primarnim antitijelom na PD-L1 u svakoj seriji bojenja. Kriteriji prihvaćanja NCI-H226 (PD-L1 pozitivna kontrolna stanična linija): Bojenje stanične membrane od ≥70 % stanica pri prosječnom intenzitetu

bojenja od ≥2+. Nespecifično obojenje intenziteta <1+. Kriteriji prihvaćanja MCF-7 (PD-L1 negativna kontrolna stanična linija): Bez specifičnog obojenja. Nespecifično obojenje intenziteta <1+. Ponekad se može primijetiti

obojenje nekoliko stanica u staničnom peletu MCF-7. Primjenjuju se sljedeći kriteriji prihvaćanja: prihvatljivi su prisutnost ukupno ≤10 stanica s izrazitim obojenjem membrane plazme ili citoplazmatsko obojenje s intenzitetom ≥1+ unutar granica staničnog peleta MCF-7.

Ako bilo koja kontrolna stanična linija ne ispunjava te kriterije, svi rezultati za uzorke pacijenta smatraju se nevažećima.

3. Stakalca tkiva pozitivne kontrole (isporučuje laboratorij)

Zatim treba pregledati stakalca tkiva za pozitivnu kontrolu bojena primarnim antitijelom PD-L1 i reagensom negativne kontrole. Tim stakalcima provjerava se jesu li metoda fiksacije i postupak demaskiranja antigena učinkoviti. Poznata tkiva za pozitivnu kontrolu

Kontrole trebaju biti biopsijski/kirurški uzorci iste indikacije tumora kao uzorak pacijenta, fiksirani, obrađeni i uklopljeni što prije na isti način kao uzorci pacijenta. Za tumačenje rezultata bojenja upotrijebite neoštećene uzorke jer nekrotične ili degenerirane stanice često pokazuju nespecifična bojenja. Tkiva odabrana za upotrebu kao tkiva za pozitivnu kontrolu trebaju davati slabo

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 6/14

trebaju se upotrebljavati samo za praćenje ispravne izvedbe obrađenih tkiva i testnih reagensa, NE kao pomoć pri formuliranju specifične dijagnoze uzoraka pacijenta.

do umjereno pozitivno obojenje kad se boje s PD-L1 za pomoć u otkrivanju suptilnih promjena u osjetljivosti testa. U svaki ciklus bojenja treba uključiti dva stakalca tkiva pozitivne kontrole. Stakalce obojeno s PD-L1: Trebala bi biti vidljiva prisutnost smeđeg obojenja membrane plazme. Nespecifično obojenje trebalo bi biti ≤1+. Stakalce obojeno s reagensom negativne kontrole: Bez obojenja membrane. Nespecifično obojenje trebalo bi biti ≤1+. Ako tkiva pozitivne kontrole ne pokažu odgovarajuće pozitivno bojenje, rezultate s uzorcima testa treba smatrati nevažećima.

4. Stakalca tkiva negativne kontrole (isporučuje laboratorij)

Zatim treba pregledati stakalca tkiva za negativnu kontrolu (poznata su kao PD-L1 negativna) bojena s primarnim antitijelom PD-L1 i reagensom negativne kontrole kako bi se provjerila specifičnost označavanja ciljnog antigena primarnim antitijelom. Negativni dijelovi tkiva pozitivne kontrole također mogu poslužiti kao tkivo negativne kontrole, no korisnik to mora provjeriti.

Kontrole trebaju biti biopsijski/kirurški uzorci iste indikacije tumora kao uzorak pacijenta, fiksirani, obrađeni i uklopljeni što prije na isti način kao uzorci pacijenta. U svaki ciklus bojenja treba uključiti dva stakalca tkiva za negativnu kontrolu. Stakalce obojeno s PD-L1: Bez obojenja membrane u stanicama tumora. Nespecifično obojenje trebalo bi biti ≤1+. Stakalce obojeno s reagensom negativne kontrole: Bez obojenja membrane. Nespecifično obojenje trebalo bi biti ≤1+. Ako na stakalcu tkiva za negativnu kontrolu dođe do specifičnog bojenja membrane stanice, rezultati s uzorkom pacijenta trebaju se smatrati nevažećima.

5. Stakalce tkiva pacijenta obojeno reagensom negativne kontrole

Pregledajte uzorke pacijenta bojene reagensom za negativnu kontrolu iz testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Reagens negativne kontrole upotrebljava se umjesto primarnog antitijela i pomaže u tumačenju specifičnog obojenja na mjestu antigena.

Odsutnost bojenja membrane stanice potvrđuje specifično označavanje ciljnog antigena primarnim antitijelom. Nespecifično obojenje trebalo bi biti ≤1+.

6. Stakalce sa tkivom pacijenta bojeno s pomoću primarnog antitijela PD-L1

Na kraju pregledajte cijelo stakalce uzoraka pacijenta bojeno primarnim antitijelom PD-L1 iz testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Pogledajte Sažetak i objašnjenje, Ograničenja i Karakteristike izvođenja za određene informacije o imunoreaktivnosti testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx.

Intenzitet pozitivnog bojenja treba procijeniti u kontekstu nespecifičnog pozadinskog bojenja primijećenog na stakalcu reagensa negativne kontrole pacijenta u istoj seriji. Kao i u bilo kojem drugom imunohistokemijskom testu, negativan rezultat znači da antigen nije detektiran, ne nužno da je antigen odsutan u testiranim stanicama/tkivu. Treba procijeniti sve održive stanice tumora na cijelom stakalcu pacijenta bojenom s PD-L1 i uključiti u procjenu bodovanja PD-L1. Treba biti prisutno najmanje 100 održivih stanica tumora kako bi se uzorak mogao smatrati odgovarajućim za PD-L1 procjenu.

Opća ograničenja 1. Imunohistokemija je dijagnostički proces s više koraka za koji je potrebna posebna obuka za odabir odgovarajućih reagensa, odabir,

fiksaciju i obradu tkiva, pripremu imunohistokemijskih stakalaca te za tumačenje rezultata bojenja. 2. Bojenje tkiva ovisi o rukovanju tkivom i njegovoj obradi prije bojenja. Neispravna fiksacija, zamrzavanje, odmrzavanje, ispiranje,

sušenje, zagrijavanje, rezanje u dijelove ili kontaminacija drugim tkivima ili tekućinama mogu prouzročiti artefakte, zadržavanje antitijela ili lažno negativne rezultate. Nedosljedni rezultati mogu biti posljedica razlika u metodama fiksacije i uklapanja ili inherentnih nepravilnosti u tkivu.

3. Pretjerano ili nepotpuno kontraobojenje može ugroziti ispravno tumačenje rezultata. 4. Kliničko tumačenje pozitivnog obojenja ili njegovog izostanka mora se procijeniti u kontekstu kliničke prezentacije, morfologije i

drugih histopatoloških kriterija. Kliničko tumačenje svakog bojenja ili izostanka istog potrebno je nadopuniti morfološkim istraživanjima i odgovarajućim kontrolama, kao i drugim dijagnostičkim testovima. Obojeni pripravak mora tumačiti kvalificirani patolog koji je upoznat s antitijelima, reagensima i metodama koje se koriste. Bojenje se mora izvršiti u certificiranom licenciranom laboratoriju pod nadzorom patologa koji je odgovoran za provjeru obojenih stakalaca i osiguranje adekvatnosti pozitivnih i negativnih kontrola.

5. Tkiva ljudi zaraženih virusom hepatitisa B koja sadrže površinski antigen virusa hepatitisa B (HBsAg) mogu pokazati nespecifično obojenje s peroksidazom hrena (7).

6. Reagensi mogu pokazati neočekivane reakcije u tipovima tkiva koja prethodno nisu ispitivana. Mogućnost neočekivanih reakcija čak i u ispitanim tipovima tkiva ne može se u potpunosti eliminirati zbog biološke varijabilnosti ekspresije antigena u neoplazmama ili drugim patološkim tkivima. Kontaktirajte Dako tehničku podršku s dokumentiranim neočekivanim reakcijama.

7. Lažno pozitivni rezultati mogu se javiti zbog neimunološkog vezivanja proteina ili produkata reakcije supstrata. Također se mogu javiti zbog aktivnosti pseudoperoksidaze (eritrocita) i aktivnosti endogene peroksidaze (citokroma C) (7).

8. Reagensi i upute isporučeni s ovim sustavom osmišljeni su za optimalan rad. Dodatno razrjeđivanje reagensa ili promjena vremena inkubacije ili temperatura može dovesti do pogrešnih ili nepodudarnih rezultata.

Ograničenja specifična za proizvod 1. Propadanje antigena u tkivu tijekom vremena može izazvati lažno negativne rezultate. Uzorke treba obojati unutar šest mjeseci od

pokrivanja tkiva na stakalcima kada su pohranjena na tamnom mjestu 2-8 °C (poželjno) ili na sobnoj temperaturi do 25 °C. 2. Za optimalne i ponovljive rezultate, protein PD-L1 zahtijeva predtretman demaskiranja antigena kada su tkiva rutinski fiksirana

(neutralno puferirani formalin) i uklopljena u parafin.

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 7/14

3. Ne zamjenjujte reagense iz različitih brojeva serije ovog proizvoda ili iz kompleta drugih proizvođača. Jedina iznimka je otopina za demaskiranje antigena EnVision FLEX, niski pH koncentracije 50x, koja je po potrebi dostupna pod šifrom K8005.

4. Obojene kontrolne stanične linije moraju se upotrebljavati samo za potvrdu ciklusa bojenja i ne smiju se upotrebljavati za bodovanje reakcije bojenja na sekcijama tkiva.

5. Upotreba testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx na tkivima s drugim fiksativima osim formalina nije provjerena. 6. Upotreba testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx na uzorcima dobivenim aspiracijom tankom iglom nije provjerena. Evaluacija kliničke izvedbe Kliničke prednosti testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx istražene su u multicentričnom, otvorenom, randomiziranom kliničkom istraživanju provedenom radi procjene sigurnosti i djelotvornosti lijeka KEYTRUDA u pacijenata s uznapredovanim NSCLC-om (9). Pacijenti su bili pozitivni na PD-L1 u testu kliničkog istraživanja (CTA) te su imali napredovanje bolesti nakon liječenja kemoterapijom koja uključuje platinu. Pacijenti s EGFR ili ALK genomskim tumorskim odstupanjem imali su napredovanje bolesti na terapiji koju je odobrila Američka agencija za hranu i lijekove (FDA) za ta odstupanja prije primanja lijeka KEYTRUDA. Pacijenti su randomizirani (1:1:1) za primanje 2 mg/kg (n=344) ili 10 mg/kg (n=346) ili lijek KEYTRUDA svaka 3 tjedna ili 75 mg/m2 docetaksela svaka 3 tjedna (n=343). Procjena statusa tumora učinjena je svakih 9 tjedana. Primarne krajnje točke djelotvornosti bile su sveukupno preživljavanje (OS) i preživljavanje bez napredovanja bolesti (PFS) prema verziji 1.1 Kriterija za ocjenu odgovora kod solidnih tumora (RECIST 1.1) na temelju slijepe recenzije neovisnog radiologa. U istraživanje je randomizirano ukupno 1.033 pacijenta s NSCLC-om na temelju CTA-a. Kako bi se procijenila klinička korist testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, pohranjeni uzorci iz kliničkog istraživanja retrospektivno su testirani testom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx u referentnom laboratoriju sa sjedištem u SAD-u. Od 1.033 pacijenata, testom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx retrospektivno su testirana tumorska tkiva 529 pacijenata. Uzorci 413 pacijenata bili su pozitivni na ekspresiju PD-L1 (≥1 % održivih stanica tumora pokazuje obojenje membrane bilo kojeg intenziteta), a uzorci 94 pacijenta bili su negativni na ekspresiju PD-L1 (<1 % održivih stanica tumora pokazuje obojenje membrane bilo kojeg intenziteta). Od tih 413 pacijenata s pozitivnom ekspresijom PD-L1, uzroci 163 pacijenta imali su visoku ekspresiju PD-L1 (≥50 % održivih stanica tumora pokazuje obojenje membrane bilo kojeg intenziteta). Razina postignute podudarnosti između CTA i PD-L1 IHC 22C3 pharmDx pokazana je u Tablici 2. Tablica 2: Podudarnost CTA u odnosu na PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Stope podudarnosti PD-L1 Prekid

Postotak negativne podudarnosti (interval pouzdanosti (CI) od 95 %)

Postotak pozitivne podudarnosti (interval pouzdanosti (CI) od 95 %)

CTA u odnosu na PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1 % 94,5 % [91,4 % – 96,6 %] 80,0 % [76,9 % – 82,8 %] TPS 50 % 98,3 % [97,1 % – 99,0 %] 73,2 % [67,9 % – 77,9 %]

Među randomiziranim pacijentima pozitivnima prema PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, demografske i ostale temeljne karakteristike dobro su uravnotežene između terapijskih grupa. Medijan dobi je 63 godine (44 % u dobi od 65 ili stariji). Većina pacijenata bili su bijelci (77 %) i muškarci (58 %); osnovni status prema ljestvici ECOG bio je 0 (29 %) ili 1 (71 %). Sedamdeset osam posto (78 %) pacijenata bili su bivši/trenutačni pušači. Dvadeset dva posto (22 %) pacijenata imalo je skvamoznu histologiju, a 69 % imalo je ne-skvamoznu histologiju. Temeljne i demografske karakteristike bile su slično dobro uravnotežene kroz grupe s pembrolizumabom i docetakselom u sveukupnom kliničkom istraživanju. Rezultati djelotvornosti sažeti su u Tablici 3. KEYTRUDA je pokazala izdržljivu kliničku korist u pacijenata s NSCLC-om pozitivnima na ekspresiju PD-L1 s TPS-om 1 %, koje je pojačano u pacijenata s visokom ekspresijom PD-L1 s TPS-om 50 %, kako je određeno testom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Značaj koristi usporediv je s onom u ukupnom kliničkom istraživanju. U Tablici 2 sažete su ključne mjere djelotvornosti u sveukupnoj populaciji s pozitivnim PD-L1 (TPS 1 %) i u podskupini s visokom ekspresijom pozitivnog PD-L1 (TPS 50 %) za sveukupno kliničko istraživanje (pozitivan PD-L1 prema CTA) i u populaciji pozitivnoj prema PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Kaplan-Meierova krivulja za OS (TPS 1 % kako je utvrđeno testom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx) prikazana je na Slici 1.

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 8/14

Tablica 3: Odgovor na lijek KEYTRUDA u prethodno liječenih pacijenata s NSCLC-om: Sveukupno kliničko istraživanje i pozitivni pacijenti prema PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: PD-L1 TPS 1 % i TPS 50 %

Krajnja točka KEYTRUDA 2 mg/kg sva 3 tjedna

KEYTRUDA 10 mg/kg sva 3 tjedna

Docetaksel 75 mg/m2 svaka 3 tjedna

Kliničko istraživanje

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Kliničko istraživanje

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Kliničko istraživanje

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1 %

Broj pacijenata 344 140 346 142 343 131 OS Smrti (%) 172 (50 %) 59 (42 %) 156 (45 %) 59 (42 %) 193 (56 %) 67 (51 %) Omjer opasnosti* (95 % CI)

0,71 (0,58; 0,88)

0,54 (0,37; 0,78)

0,61 (0,49; 0,75)

0,57 (0,39; 0,82)

--- ---

p-vrijednost† <0,001 <0,001 <0,001 0,00115 --- --- Medijan u mjesecima (95 % CI)

10,4 (9,4; 11,9)

11,8 (9,6; NA)

12,7 (10,0; 17,3)

12,0 (8,7; NA)

8,5 (7,5; 9,8)

7,5 (6,3; 9,9)

PFS‡ Događaji (%) 266 (77 %) 97 (63 %) 255 (74 %) 103 (73 %) 257 (75 %) 94 (72 %) Omjer opasnosti* (95 % CI)

0,88 (0,73; 1,04)

0,68 (0,50; 0,92)

0,79 (0,66; 0,94)

0,79 (0,59; 1,06)

--- ---

p-vrijednost† 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- Medijan u mjesecima (95 % CI)

3,9 (3,1; 4,1)

4,9 (4,1; 6,2)

4,0 (2,6; 4,3)

4,0 (2,2; 4,6)

4,0 (3,1; 4,2)

3,8 (2,2; 4,2)

Stopa ukupnog odgovora‡

ORR %§ (95 % CI)

18 % (14; 23)

24 % (17; 32)

18 % (15; 23)

20 % (14; 28)

9 % (7; 13)

5 % (2; 11)

TPS 50 %

Broj pacijenata 139 56 151 60 152 47 OS Smrti (%) 58 (42 %) 18 (32 %) 60 (40 %) 19 (32 %) 86 (57 %) 25 (53 %) Omjer opasnosti* (95 % CI)

0,54 (0,38; 0,77)

0,45 (0,24; 0,84)

0,50 (0,36; 0,70)

0,29 (0,15 0,56)

--- ---

p-vrijednost† <0,001 0,00541 <0,001 <0,001 --- --- Medijan u mjesecima (95 % CI)

14,9 (10,4; NA)

Nije dosegnut (9,3 NA)

17,3 (11,8; NA)

Nije dosegnut (8,3 NA)

8,2 (6,4; 10,7)

7,2 (4,4; 8,3)

PFS‡ Događaji (%) 89 (64 %) 33 (59 %) 97 (64 %) 34 (57 %) 118 (78 %) 33 (70 %) Omjer opasnosti* (95 % CI)

0,58 (0,43; 0,77)

0,47 (0,28; 0,80)

0,59 (0,45; 0,78)

0,41 (0,24; 0,70)

--- ---

p-vrijednost† <0,001 0,00221 <0,001 <0,001 --- --- Medijan u mjesecima (95 % CI)

5,2 (4,0; 6,5)

5,9 (4,2; 9,0)

5,2 (4,1; 8,1)

4,8 (2,8; NA)

4,1 (3,6; 4,3)

3,9 (2,0; 4,3)

Stopa ukupnog odgovora‡

ORR %§ (95 % CI)

30 % (23; 39)

37 % (25; 52)

29 % (22; 37)

28 % (18; 41)

8 % (4; 13)

4 % (1; 15)

* Omjer opasnosti (KEYTRUDA u usporedbi s docetakselom) na temelju stratificiranog Coxovog modela proporcionalne opasnosti † Na temelju stratificiranog Log-rang testa ‡ Procijenjeno prema BICR s pomoću RECIST 1.1 § Svi su odgovori bili djelomični odgovori ¶ Temelji se na pacijentima s najbolji ukupnim odgovorom kao potvrđenim potpunim ili djelomičnim odgovorom

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 9/14

Slika 1: Kaplan-Meierova krivulja za sveukupno preživljavanje prema terapijskoj grupi (TPS 1 % prema PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, namjena za liječenje populacije)

Provedene su dodatne analize otpornosti kako bi se u obzir uzeo mogući utjecaj podataka koji nedostaju, a koji proizlaze iz pacijenata s pozitivnim rezultatom testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, ali koji su možda bili negativni prema CTA. Pacijenti s takvim rezultatima testa dio su populacije namijenjene za dijagnozu (ITD) testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx; međutim, bili su isključeni iz kliničkog istraživanja zbog negativnih rezultata nakon probira za CTA. Kako bi se opravdali ti podaci koji nedostaju, provedena je analiza osjetljivosti radi razumijevanja vjerojatnog raspona za stopu opasnosti (HR) procijenjenu na temelju testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx u pod-populacijama s TPS-om 1 % i TPS-om 50 % u okviru ITD-a radi provjere dosljednosti s utvrđenom stopom opasnosti na temelju uključivanja u CTA. Rezultati analize osjetljivosti na stopu opasnosti pokazali su da su procjene stope opasnosti otporne na pretpostavljeno slabljenje djelotvornosti liječenja u okviru ITD-a.

Vrijeme u mjesecima n pod rizikom

Docetaksel 75 mg/m2 Q3W

MK – 3475 2 mg/kg Q3W

MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Docetaksel 75 mg/m2 Q3W MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Sve

ukup

no p

reži

vlja

vanj

e (%

)

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 10/14

Evaluacija nekliničke izvedbe Analitička osjetljivost / Specifičnost Analitička osjetljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testirana je na uzorcima fiksiranima formalinom i uklopljenima u parafin 127 jedinstvenih slučajeva karcinoma pluća ne-malih stanica (NSCLC) stadija I-IV s pomoću proizvedene proizvodne serije. Procjena ekspresije PD-L1 pokazala je bojenje u rasponu 0-100 % pozitivnih stanica tumora s intenzitetom bojenja 0-3. Normalna tkiva: U Tablici 4 nalazi se sažetak imunosne reaktivnosti monoklonalnog mišjeg anti-PD-L1, klon 22C3 na preporučeni panel normalnih tkiva. Bojenje stanične membrane primijećeno je na imunosnim stanicama i stanicama epitelnog podrijetla. Bojenje citoplazme primijećeno je na nekim vrstama stanica, ali nije zabilježeno kao pozitivno bojenje. Sva su tkiva fiksirana u formalinu i uklopljena u parafin te obojena PD-L1 IHC 22C3 pharmDx u skladu sa smjernicama iz upute o upotrebi. Nisu uočeni neočekivani rezultati u ispitanim vrstama stanica ili tkiva. Primijećeno bojenje u skladu je sa zabilježenom literaturom za ekspresiju PD-L1 IHC u normalnim tkivima (10, 11). Tablica 4: Sažetak reaktivnosti normalnog tkiva na PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Vrsta tkiva (# ispitano)

Pozitivno bojenje membrane plazme: Elementi tkiva

Pozitivno citoplazmatsko bojenje: Elementi tkiva

Ne-specifično bojenje

Bubreg (3) 1/3 tubularni epitel 0/3 0/3 Cerviks (3) 1/3 epitel 0/3 0/3 Debelo crijevo (3) 2/3 makrofagi 0/3 0/3 Dojka (3) 0/3 0/3 0/3 Ezofagus (3) 0/3 0/3 0/3 Gušterača (3) 0/3 0/3 0/3 Hipofiza (3) 1/3 prednji režanj hipofize

1/3 stražnji režanj hipofize 1/3 prednji režanj hipofize 1/3 stražnji režanj hipofize

0/3

Jajnik (3) 0/3 0/3 0/3 Jetra (3) 1/3 heptatociti

1/3 makrofagi 0/3

0/3

Koštana srž (3) 3/3 megakariociti 3/3 megakariociti 0/3 Koža (3) 0/3 0/3 0/3 Krajnik (3) 2/3 germinativni centar (makrofagi)

3/3 kriptalni epitel 0/3

0/3

Mali mozak (3) 0/3 0/3 0/3 Maternica (3) 0/3 0/3 0/3 Mezotelne stanice (2) 0/2 0/2 0/2 Mišić, skeletni (3) 0/2 0/2 0/2 Mišić, srčani (3) 0/3 0/3 0/3 Nadbubrežno (3) 0/3 1/3 medularne stanice 0/3 Paratiroidna žlijezda (3) 1/3 žljezdani epitel 0/3 0/3 Pluća (3) 3/3 alveolarni makrofagi 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 epitel 0/2 0/2 Slezena (3) 2/3 makrofagi 0/3 0/3 Štitna žlijezda (3) 0/3 0/3 0/3 Tanko crijevo (3) 0/3 0/3 0/3 Testis (3) 0/3 0/3 0/3 Timus (3) 3/3 medularni epitel 0/3 0/3 Veliki mozak (3) 0/3 0/3 0/3 Želudac (3) 2/3 limfocita

1/3 želučane žlijezde 1/3 želučane žlijezde 0/3

Živac, periferni (3) 0/3 1/3 vezno tkivo/žile 0/3 Žlijezda slinovnica (3) 0/3 0/3 0/3

Neoplastična tkiva: U Tablici 5 nalazi se sažetak imunosne reaktivnosti monoklonalnog mišjeg anti-PD-L1, klon 22C3 na panelu neoplastičnih tkiva. Bojenje stanične membrane primijećeno je na imunosnim stanicama i stanicama epitelnog podrijetla. Bojenje citoplazme primijećeno je na nekim vrstama stanica, ali nije zabilježeno kao pozitivno bojenje. Sva su tkiva fiksirana u formalinu i uklopljena u parafin te obojena PD-L1 IHC 22C3 pharmDx u skladu sa smjernicama iz upute o upotrebi. Nisu uočeni neočekivani rezultati u ispitanim uzorcima tumora. Primijećeno bojenje u skladu je sa zabilježenom literaturom za ekspresiju PD-L1 IHC u neoplastičnim tkivima (10-13). Tablica 5: Sažetak reaktivnosti neoplastičnog tkiva na PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Vrsta tumora Lokacija PD-L1 pozitivno/ukupno N=159

Adenokarcinom

Cerviks, endocervikalni tip 0/1 Dojka, DCIS 0/2 Dojka, invazivni duktalni 0/7 Dojka, invazivni duktalni s metastazom u limfni čvor

0/1

Ezofagus 0/1 Gastrointestinalni, s metastazom u pluća 0/1 Glava i vrat, tvrdo nepce 0/1 Gušterača 0/2 Gušterača, duktalni 0/3 Jajnik 0/1 Jajnik, endometrioidni 0/1

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 11/14

Vrsta tumora Lokacija PD-L1 pozitivno/ukupno N=159

Jajnik, mucinozni 0/1 Jajnik, serozni 0/1 Kolon 0/5 Kolon, mucinozni 0/1 Kolon, s metastazom u jetru 0/1 Maternica, endometrij 0/3 Maternica, svjetlostanični 0/1 Pluća 1/4 Prostata 0/5 Rektum 0/4 Slijepo crijevo 0/1 Štitna žlijezda, folikularni 0/1 Štitna žlijezda, folikularno-papilarni 0/1 Štitna žlijezda, papilarni 0/3 Tanko crijevo 0/2 Želudac 0/6 Želudac, mucinozni 0/1 Žlijezda slinovnica / parotidna žlijezda 0/2 Žučni mjehur 1/5

Adrenokortikalni karcinom Nadbubrežno 0/1 Astrocitom Veliki mozak 0/3 Embrionalni karcinom Testis 0/1 Ependimom Mozak 0/1 Feokromocitom Nadbubrežno 0/1 Glioblastom Mozak 0/1 Hepatoblastom Jetra 0/1 Hondrosarkom Kost 0/1

Intersticijalni karcinom Kolon 0/1 Rektum 0/1 Tanko crijevo 0/1

Karcinom Nazofaringealni, NPC 0/1 Karcinom bazalnih stanica Koža 0/1 Karcinom bubrežnih stanica Papilarni Bubreg 0/1 Svjetlostanični Bubreg 0/6 Karcinom jetre Jetra 0/5

Karcinom malih stanica

Pluća 0/1 Cerviks 2/5 Ezofagus 0/7 Glava i vrat 0/2

Karcinom skvamoznih stanica

Karcinom skvamoznih stanica ezofagusa s metastazom u limfni čvor

0/1

Koža 0/2 Maternica 0/1 Pluća 1/2

Karcinom stanica prstena pečatnjaka

Bubreg 0/1 Karcinom stanica prstena pečatnjaka kolona s metastazom u jajnik

0/1

Kolon 0/1 Karcinom tranzicijskih stanica Mjehur 0/6 Kordom Zdjelična šupljina 0/1

Lejomiosarkom Meko tkivo, stijenka prsnog koša 0/1 Mjehur 0/1

Limfom Anaplastični velikostanični Limfni čvor 0/1 Difuzni limfom B-stanica Limfni čvor 0/4 Hodgkinov Limfni čvor 2/2 Ne-Hodgkinov Limfni čvor 1/1 Medularni karcinom Štitna žlijezda 0/1 Meduloblastom Mozak 0/1

Melanom Nosna šupljina 0/1 Rektum 0/1

Meningiom Mozak 0/2 Mezoteliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Meko tkivo, donji dio leđa 0/1 Osteosarkom Kost 0/2 Primitivni neuroektodermalni tumor (PNET)

Retroperitoneum 0/1

Rabdomiosarkom Meko tkivo, embrionalno 0/1 Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1

Seminom Testis 0/2

Sinovijalni sarkom Zdjelična šupljina 0/1

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 12/14

Vrsta tumora Lokacija PD-L1 pozitivno/ukupno N=159

Spermatocitom Testis 0/2 Timom Medijastinum 1/1 Tumor stanica otočića Gušterača 0/1 Ponovljivost / vanjska reproducibilnost Ponovljivost i reproducibilnost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx procijenila je tvrtka Dako i tri vanjske ispitne ustanove. Podaci o izvedbi dani su u Tablicama 6 – 9. Za istraživanja ponovljivosti izvršena u tvrtki Dako, postotak negativne podudarnosti (NPA), postotak pozitivne podudarnosti (PPA) i sveukupna podudarnost (OA) određeni su za prekid od ≥ 1 % i prekid od ≥ 50 % kako je prikazano u Tablici 6 i Tablici 7. Budući da su istraživanja ponovljivosti rezultirala podudarnosti od 100 %, intervali pouzdanosti izračunati su s pomoću Wilsonove metode bodovanja na temelju broja neovisnih usporedbi parova. Za vanjska istraživanja reproducibilnosti, prosječan postotak negativne podudarnosti (ANA), prosječan postotak pozitivne podudarnosti (APA) i postotak sveukupne podudarnosti (OA) određeni su za prekid od ≥ 1 % i prekid od ≥ 50 % kako je prikazano u nastavku u Tablici 8 i Tablici 9. Izračunate su prosječne podudarnosti budući da ne postoji prirodna referencija u parametrima reproducibilnosti kao što je lokacija i promatrač. Intervali pouzdanosti za prosječne podudarnosti izračunati su s pomoću bootstrap metode u percentilima. (Imajte na umu da istraživanja ponovljivosti nisu analizirana intervalima pouzdanosti bootstrap, budući da se navedeno ne može izračunati na podacima s nula neslaganja.) Tablica 6: Ponovljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testirana na jednoj lokaciji (≥1 %)

Istraživanje ponovljivosti

Dijagnostički prekid Dizajn istraživanja % podudarnosti (95 % CI)

Između instrumenata

≥1 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je na svakom od šest instrumenata Autostainer Link 48.

NPA 100 % (91,2 – 100 %) PPA 100 % (91,2 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

Između korisnika

≥1 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je upotrebom šest analitičara na jednom instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (91,0 – 100 %) PPA 100 % (91,2 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

Između dana

≥1 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je tijekom šest neuzastopnih dana na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (91,2 – 100 %) PPA 100 % (91,2 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

Između serija ≥1 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je s tri ponavljanja i svakom od tri serije reagensa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 98,6 % (96,0 – 100 %) PPA 98,6 % (95,7 – 100 %) OA 98,6 % (95,8 – 100 %)

Unutar ciklusa ≥1 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je sa šest ponavljanja unutar ciklusa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (91,2 – 100 %) PPA 100 % (91,2 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

Unutar dana ≥1 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je na dva ciklusa u danu, ponovljeno preko tri dna na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (91,0 – 100 %) PPA 100 % (91,2 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

NPA = postotak negativne podudarnosti; PPA = postotak pozitivne podudarnosti; OA = sveukupna podudarnost Tablica 7: Ponovljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testirana na jednoj lokaciji (≥50 %)

Istraživanje ponovljivosti

Dijagnostički prekid Dizajn istraživanja % podudarnosti (95 % CI)

Između instrumenata

≥50 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je na svakom od šest instrumenata Autostainer Link 48.

NPA 100 % (92,9 – 100 %) PPA 100 % (88,6 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

Između korisnika

≥50 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je upotrebom šest analitičara na jednom instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (92,7 – 100 %) PPA 100 % (88,6 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

Između dana

≥50 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je tijekom šest neuzastopnih dana na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (92,9 – 100 %) PPA 100 % (88,6 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

Između serija ≥50 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je s tri ponavljanja i svakom od tri serije reagensa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (92,6 – 100 %) PPA 100 % (92,6 – 100 %) OA 100 % (96,2 – 100 %)

Unutar ciklusa ≥50 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je sa šest ponavljanja unutar ciklusa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (92,9 – 100 %) PPA 100 % (88,6 – 100 %) OA 100 % (95,4 – 100 %)

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 13/14

Istraživanje ponovljivosti

Dijagnostički prekid Dizajn istraživanja % podudarnosti (95 % CI)

Unutar dana ≥50 % Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je na dva ciklusa u danu, ponovljeno preko tri dna na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100 % (88,3 – 100 %) PPA 100 % (82,4 – 100 %) OA 100 % (92,4 – 100 %)

NPA = postotak negativne podudarnosti; PPA = postotak pozitivne podudarnosti; OA = sveukupna podudarnost Tablica 8: Reproducibilnost PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testirana na tri vanjske lokacije (≥1 %)

Istraživanje reproducibilnosti

Dijagnostički prekid Dizajn istraživanja % podudarnosti (95 % CI)

Između lokacija ≥1 % Svaki od 36 NSCLC uzoraka (16 PD-L1 negativnih i 20 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je tijekom pet neuzastopnih dana. Analiza između lokacija izvršena je između tri lokacije na ukupno 2700 usporedbi parova.

ANA 94,8 % (90,3 – 98,4 %) APA 95,5 % (91,2 – 98,7 %) OA 95,2 % (90,8 – 98,6 %)

Unutar lokacija ≥1 % Svaki od 36 NSCLC uzoraka (16 PD-L1 negativnih i 20 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je tijekom pet neuzastopnih dana na svakoj od tri lokacije istraživanja. Analiza unutar lokacija izvršena je za tri lokacije na ukupno 1080 usporedbi parova.

ANA 96,2 % (94,1 – 97,5 %) APA 96,7 % (95,0 – 97,9 %) OA 96,5 % (95,2 – 97,4 %)

Između promatrača ≥1 % Bodovanje 62 NSCLC uzorka (28 PD-L1 negativnih i 34 PD-L1 pozitivna) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1, obojenih s PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, jedan na svakoj od tri lokacije istraživanja, tijekom tri neuzastopna dana. Analiza između promatrača izvršena je između tri lokacije na ukupno 1674 usporedbi parova.

ANA 85,8 % (79,3 – 91,8 %) APA 88,2 % (82,2 – 93,3 %) OA 87,1 % (81,0 – 92,6 %)

Unutar promatrača ≥1 % Bodovanje 62 NSCLC uzorka (28 PD-L1 negativnih i 34 PD-L1 pozitivna) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1, obojenih s PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, jedan na svakoj od tri lokacije istraživanja, tijekom tri neuzastopna dana. Analiza unutar promatrača izvršena je za tri lokacije na ukupno 558 usporedbi parova.

ANA 93,7 % (90,0 – 96,1 %) APA 94,8 % (91,6 – 96,7 %) OA 94,3 % (92,0 – 95,9 %)

ANA = prosječna negativna podudarnost; APA = prosječna pozitivna podudarnost; OA = sveukupna podudarnost Tablica 9: Reproducibilnost PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testirana na tri vanjske lokacije (≥50 %)

Istraživanje reproducibilnosti

Dijagnostički prekid Dizajn istraživanja % podudarnosti (95 % CI)

Između lokacija ≥50 % Svaki od 36 NSCLC uzoraka (21 PD-L1 negativnih i 15 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je tijekom pet neuzastopnih dana. Analiza između lokacija izvršena je između tri lokacije na ukupno 2700 usporedbi parova.

ANA 90,3 % (84,4 – 95,2 %) APA 85,2 % (75,6 – 92,9 %) OA 88,3 % (81,4 – 94,3 %)

Unutar lokacija ≥50 % Svaki od 36 NSCLC uzoraka (21 PD-L1 negativnih i 15 PD-L1 pozitivnih) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1 testiran je tijekom pet neuzastopnih dana na svakoj od tri lokacije istraživanja. Analiza unutar lokacija izvršena je za tri lokacije na ukupno 1080 usporedbi parova.

ANA 91,9 % (88,8 – 94,8 %) APA 87,6 % (82,5 – 92,2 %) OA 90,2 % (86,3 – 93,7 %)

Između promatrača ≥50 % Bodovanje 62 NSCLC uzorka (30 PD-L1 negativnih i 32 PD-L1 pozitivna) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1, obojenih s PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, jedan na svakoj od tri lokacije istraživanja, tijekom tri neuzastopna dana. Analiza između promatrača izvršena je između tri lokacije na ukupno 1674 usporedbi parova.

ANA 92,6 % (87,8 – 96,7 %) APA 92,8 % (88,1 – 96,8 %) OA 92,7 % (88,1 – 96,8 %)

Unutar promatrača ≥50 % Bodovanje 62 NSCLC uzorka (30 PD-L1 negativnih i 32 PD-L1 pozitivna) s rasponom imunohistokemijske ekspresije PD-L1, obojenih s PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, jedan na svakoj od tri lokacije istraživanja, tijekom tri neuzastopna dana. Analiza unutar promatrača izvršena je za tri lokacije na ukupno 558 usporedbi parova.

ANA 96,4 % (94,0 – 98,5 %) APA 96,5 % (94,3 – 98,6 %) OA 96,4 % (94,3 – 98,6 %)

ANA = prosječna negativna podudarnost; APA = prosječna pozitivna podudarnost; OA = sveukupna podudarnost Rješavanje problema

P03928HR_03/SK00621-2/2016.11 str. 14/14

Tablica 10: Rješavanje problema Problem Mogući uzrok Predložena radnja 1. Stakalca se ne boje 1a. Pogreška programiranja.

1a. Provjerite je li za programiranje stakalaca odabran program PD-L1 IHC 22C3 pharmDx.

1b. Izostanak reakcije s DAB+ otopinom supstrat-kromogen (DAB)

1b. Provjerite je li DAB+ otopina supstrat-kromogen ispravno pripremljena.

1c. Natrijev azid u puferu za ispiranje. 1c. Upotrebljavajte samo pufer za ispiranje tvrtke Dako (šifra K8007).

1d. Propadanje kontrolnog stakla 1d. Provjerite rok trajanja i uvjete pohrane kompleta na vanjskoj strani pakiranja.

2a. Slabo obojenje stakalaca s uzorcima.

2a. Upotrijebljena je neodgovarajuća metoda fiksacije.

2a. Provjerite upotrebljavaju li se samo odobreni fiksativi i metode fiksacije.

2b. Slabo bojenje stakalaca s uzorkom ili pozitivna stanična linija na kontrolnim staklima koje isporučuje Dako.

2b. Neadekvatno demaskiranje antigena.

2b. Provjerite je li 3-u-1 predtretman ispravno izvršen.

3. Pretjerano pozadinsko obojenje stakalaca.

3a. Parafin nije potpuno uklonjen. 3a. Provjerite je li 3-u-1 predtretman ispravno izvršen. 3b. Stakalca su se osušila prilikom umetanja na Autostainer Link 48.

3b. Stakalca moraju ostati namočena puferom tijekom umetanja i prije pokretanja ciklusa.

3c. Nespecifično vezanje reagensa za sekciju tkiva.

3c. Provjerite je li uzorak ispravno fiksiran i/ili je li prisutna nekroza.

4. Tkivo se odvojilo od stakalaca. 4. Upotreba neispravnih mikroskopskih stakalaca.

4. Upotrijebite Dako FLEX IHC mikroskopska stakalca (šifra K8020) ili nabijena stakalca (primjerice Fisherbrand Superfrost Plus).

5. Izrazito jako specifično obojenje. 5a. Upotrijebljena je neodgovarajuća metoda fiksacije.

5a. Provjerite upotrebljavaju li se samo odobreni fiksativi i metode fiksacije.

5b. Upotrijebljen je neodgovarajući pufer za ispiranje.

5b. Upotrebljavajte samo pufer za ispiranje tvrtke Dako (šifra K8007).

6. Otopina za demaskiranje antigena izgleda zamagljeno kad se zagrije.

6. Otopina za demaskiranje antigena izgleda zamagljeno kad se zagrije.

6. To je normalno i ne utječe na bojenje.

NAPOMENA: Ako problem ne uzrokuje ništa od navedenog ili predložena korektivna radnja ne rješava problem, nazovite Dako tehničku podršku za dodatnu pomoć. Dodatne informacije o tehnikama bojenja i pripremi uzorka možete pronaći u Dako vodiču za obuku: Metode imunohistokemijskog bojenja (5) (dostupno od tvrtke Dako). Literatura 1. Keytruda® package insert. 2. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91. 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures

for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976.

4. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000.

5. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.

6. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999. .

7. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626.

8. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28.

9. Herbst RS, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online 2015 Dec 19.

10. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. 11. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic

Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003; 170:1257. 12. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor

in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. 13. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and Virus-

Associated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473.

Kataloški broj Ograničenja temperature Medicinski uređaji za in vitro dijagnostičke postupke

Proizvođač Broj serije Sadrži dovoljnu količinu za <N> testove

Upotrijebiti do Proučite upute za korištenje Ovlašteni predstavnik u Europskoj zajednici

PT0020/ Rev C

Dako North America, Inc.6392 Via RealCarpinteria, California 93013 USA

Tel 805 566 6655Fax 805 566 6688Technical Support 800 424 0021Customer Service 800 235 5763

Dako Denmark A/SProduktionsvej 42DK-2600 Glostrup Denmark

Tel +45 4485 9500Fax +45 4485 9595

www.dako.com

Izdanje 11/16