il ruolo della microflora nella produzione del parmigiano

IL RUOLO DELLAMICROFLORA NELLAPRODUZIONE DELPARMIGIANO-REGGIANO

Erasmo Neviani – Monica GattiUniversità di Parma

La ricerca per la valorizzazione delParmigiano ReggianoReggio Emilia 16.06.2009

Batteri lattici,Chi sono?A cosa servono?Il latte lo faccio io

Lo studio del ruolo della microflora lattica nellacaseificazione non è cosa recente……

…….più di 100 annidi lavori sperimentali

A Lodi nel 1873 , con i contributifinanziari del Ministero

dell’Agricoltura aveva iniziato adoperare la Prima StazioneSperimentale di Caseificio

Italiana (Regia StazioneSperimentale di Caseificio).

I primi direttori che ne lanciaronol’attività furono Guglielmo Corner,Luigi Manetti e Giovanni Musso.Nel 1879 iniziavano 40 di attivitàdel Prof.Carlo Besana (nella foto)

•L’adozione dell’utilizzo delsieroinnesto per la produzione diformaggio Grana risale alla fine delsecolo scorso.•Gli studi di Gorini e Spallanzaniavevano enfatizzato l’importanza deimicrorganismi nel processo dicaseificazione e Notari, prima, epoi Fascetti individuavano l’innestocome possibile metodo percontenere i difetti di gonfiore.

PRIME ESPERIENZE NELL’IMPIEGO DI INNESTI

La tradizione di oggi è stata innovazione in passat o !

Spallanzani nel 1895, in unasua memoria, riporta i primiesperimenti di aggiunta di

sieroinnesto a debole aciditàeseguiti presso la scuola di

caseificio di Reggio Emilia, dicui il Notari era

“capocascinaio”. Leesperienze di Notari venneroriprese da Fascetti succedutoa Spallanzani nella direzione

della Scuola.

Fascetti nel 1911 al II Congresso nazionale di Chimicaapplicata, spiega che “fin dal 1888 anche in Italia si fecero

tentativi sulla azione migliorante del siero latteospontaneamente fermentato”.

Nello stesso periodo il Laboratorio Batteriologico dellaScuola di Zootecnia e di Caseificio di Reggio Emili a

produce e distribuisce ai caselli colture pure da utilizzare per lapreparazione del primo sierofermento. Con tali colture nel 1912

si produssero almeno 3000 forme.

Besana nel 1912 giudica “i risultati del metodo dell’innesto nellafabbricazione del formaggio reggiano nel loro complesso

soddisfacenti”.

CASEIFICAZIONEBatteri lattici motore del processo

Non Starter LAB + Starter LAB GlicolisiProteolisi

Enzimi Cellule microbiche intere

Prima degli anni 80

• ILC Lodi (Carini e coll)

• Centro latte CNR Milano (Carini, Lodi e coll• Uni Cattolica Piacenza (Bottazzi, Battistotti e coll.)• Uni Bologna (Losi…. e coll.)

• Parmigiano Reggiano

�Caratterizzazionemicrorganismi ParmigianoReggiano

�Innovazione tecnologica

-

Analisi fenotipo

anni 80• ILC lodi• Uni Piacenza• Uni Bo- Molise• Parmigiano Reggiano• …..altri

batteri lattici

Differenti•Generi•Specie•Biotipi

Biodiversità e sopravvivenza

La biodiversità si traduce in differentepossibilità di sopravvivere in un substrato

Quindi

Differente attitudine alla trasformazionetecnologica….

Cambia il territorio, cambia il clima, cambial’organizzazione della vita dell’uomo…..

SONO SEMPRE VALIDE LE “RAGIONI” DEIBATTERI LATTICI?

Microrganismi ed evoluzione ecosistemaproduttivo e modificazioni tecnologia di

produzione

La storia ci insegna…

…la continua evoluzione negli anni della composizione dellamicroflora degli innesti in relazione sia alla modificazione degliecosistemi ambientali che, e soprattutto, alle variazioni della

tecnologia di produzione è stata osservata nel tempo.Prima Renko negli anni ’40 e poi Bottazzi riprendendone gli studihanno evidenziato come dagli inizi del secolo in poi la microflora del

sieroinnesto sia mutata da una miscela di microrganismisostanzialmente mesofili ad una di microrganismi termofili.Questa modificazione è probabilmente da mettere sia in

relazione alle diverse temperature di cottura della cagliata siaalle condizioni di incubazione del siero dolce.

Legame indissolubile trasviluppo di specificamicroflora lattica e

tecnologia di caseificazione

Dal 1995 al 2008

Luigi Grazia, Raffaele Coppola (e coll.: Nanni,

Sorrentino, Iorizio, Salzano, Chiavari, Benevelli;Ferri, Castagnetti, Nocetti, Reverberi)

�Caratterizzazione microflora termofila innesto emesofila da latte crudo

�sviluppo microflora LAB

�Lactobacillus rhamnosus isolati da Parmigiano Reggiano

latte crudo!!!Impronta ambiente

Gatti, Mucchetti, Neviani e coll.

�Caratterizzazione microflora termofila innesto – ruolobiodiversità

�sviluppo microflora LAB in maturazione

�Produzione peptidi (Dossena, Marchelli e coll.)

Sieroinnesto !!!Biochimica Maturazione

Università di Parma

Aspetti microbiologici relativi a sicurezza econtenimento difetti

Difetti fermentazione e gonfiori• Sandri, Pecorari…Mariani

• Colombari, Zapparoli… .Pecorari

• Consorzio e laboratori collegati

sono biodiverso acosa servo…?

“MOLTEINCERTEZZE EDIBATTITI IN

MERITO”

Biodiversità ???

Studio biodiversità in batteri latticiisolati da diverse

�Aree geografica�Nicchie di produzione

Biodiversità in sieroinnesti ParmigianoReggiano e Grana Padano

L helveticus pianura S 18 P.Reggiano


L helveticus ATCC 15009

L helveticus ft 5 Grana

L helveticus 3 s Grana

L helveticus pianura Q 5 P.Reggiano



L helveticus hbt 4 Grana



L helveticus pianura R 7 P.Reggiano

L helveticus pianura R 10 P.Reggiano

L helveticus montagna O 4 P.Reggiano

L helveticus montagna M 5 P.Reggiano

L helveticus montagna N 14 P.Reggiano




L helveticus Lh25 Grana












L helveticus TH456 Grana

L helveticus montagna N 1 P.Reggiano





















L helveticus 14s Grana

L helveticus 14d48 Grana

L helveticus 15b Grana

L helveticus 3a48 Grana

L helveticus 1 s Grana

L helveticus 15b48 Grana

L helveticus 37s Grana

L helveticus sf 1 Parm.Regg.

L helveticus sf 2 Parm. Regg.


10080604020

GPGP

PRPR

classe del nodo

se C31 è assente quando altro

ceppi

se C53.7 è assente quando altro se C51.7 è assente qu ando altro

se P50 è assente quando altro

se C59 è assente quando altro

PROV = Provolone

GRPA = Grana Padano

PARM = Parmigiano Reggiano

Node 1

Term. Node 4

6 PARM2

119 PROV

Node 2

60 GRPA

Node 4

46 GRPA

Node 3

54 GRPA

Node 5

59 GRPA

Term. Node 6

5 PARM3

nodo terminale

243 GRPA

nodo terminale

13 PARM

Biodiversità (Classification Tree) in L. helveticusisolati da Parmigiano Reggiano - Grana Padano -

Provolone

Biodiversità in sieroinnesti ParmigianoReggiano

M13 M13 fingerprintingfingerprinting1

2

3

54

7

11

10

8

9

6

11

10

9

8

7

65

43

2

1

Lact helveticus S13 pianuraLact helveticus R 1 pianuraLact helveticus S 2 pianuraLact helveticus S 4 pianuraLact helveticus R 5 pianuraLact helveticus M 5 montagnaLact helveticus S11 pianuraLact helveticus R13 pianuraLact helveticus S 7 pianuraLact helveticus M 7 montagnaLact helveticus Q11 pianuraLact helveticus N 1 montagnaLact helveticus S19 pianuraLact helveticus M 12 montagnaLact helveticus N 9 montagnaLact helveticus N10 montagnaLact helveticus M 3 montagnaLact helveticus N 5 montagnaLact helveticus N13 montagnaLact helveticus N 8 montagnaLact helveticus N 3 montagnaLact helveticus N 6 montagnaLact helveticus N15 montagnaLact helveticus M 2 montagnaLact helveticus N16 montagnaLact helveticus 0 4 montagnaLact helveticus 011 montagnaLact helveticus 0 7 montagnaLact helveticus 0 8 montagnaLact helveticus M 15 montagnaLact helveticus 014 montagnaLact helveticus M 8 montagnaLact helveticus M10 montagnaLact helveticus M 9 montagnaLact helveticus 019 montagnaLact helveticus Q 4 pianuraLact helveticus 0 20 montagnaLact helveticus 017 montagnaLact helveticus 018 montagnaLact helveticus Q 2 pianuraLact helveticus Q12 pianuraLact helveticus 0 9 montagnaLact helveticus M11 montagnaLact helveticus M 1 montagnaLact helveticus M 6 montagnaLact helveticus S 9 pianuraLact helveticus S12 pianuraLact helveticus S10 pinauraLact helveticus N14 montagnaLact helveticus Q 1 pianuraLact helveticus 010 montagnaLact helveticus Q 6 pianuraLact helveticus 016 montagnaLact helveticus M 4 montagnaLact helveticus 012 montagnaLact helveticus S16 pianuraLact helveticus Q 7 pianuraLact helveticus S 8 pianuraLact helveticus S14 pianuraLact helveticus R 6 pianuraLact helveticus R14 pianuraLact helveticus S17 pianuraLact helveticus Q 5 pianuraLact helveticus S18 pianuraLact helveticus Q 8 pianuraLact helveticus R 8 pianuraLact helveticus R 10 pianuraLact helveticus R 7 pianura

1009080706050

montagna

pianura

pianura

Modificazioni del prodottoassociate a produzionee stagionatura

Selezione biotipi“adatti”

Evoluzione microflora nel formaggio

Devo resistere !

biodiversità come differente possibilità di sopravvivere

Quindidifferente attitudine alla trasformazione tecnologica

NUOVI DUBBI E FRONTIERE

Cosa siamo in grado di valutare dellecomponenti di una popolazione

microbica

Nel corso della vita del prodotto fattori distress modificano vitalità e significato

tecnologico di una popolazionemicrobica

Microrganismi non coltivabili Alcuni biotipi risultano

incapaci di crescere in condizioni “colturali”, ma solo nell’ecosistema

alimento (non siamo in grado di riprodurre)

Alcune cellule sono danneggiate o “stressate”

Altre necessitano di interazioni con altri microrganismi

• etc……

VITALI NONVITALI

NONCOLTIVABILI

COLTIVABILI

TOTALI

Possibile popolazione microbica in un alimento

?

Quello che sei abituato a vedere: ma c’èdell’altro…

Tramite colorazioni differenziali èpossibile distinguere cellule vitali e

cellule non vitali

streptococconon vitale

streptococco vitale

lattobacillo vitale

lattobacillo non vitale

SIEROINNESTO A SIEROINNESTO B

� Tecnica qualitativaqualitativa e semi-quantitativa;� Permette di distinguere diversi microrganismi in base avariazioni naturali nella lunghezza di una regione del DNA;� Ecosistemi complessi: suolo, sieroinnesto per formaggi Grana,insilati, bacterioplankton;

Si basa su:

• Polimorfismo di un genePolimorfismo di un gene presente nelle specie di studio, es.16S rRNA;

• Amplificazione medianteAmplificazione mediante PCRPCR con uno dei due primerfluorescente;

• Separazione e AnalisiSeparazione e Analisi dei prodotti amplificati perelettroforesi capillare in un sistema automatizzato quale ilsequenziatoresequenziatore di DNA.

LH-PCR (LH-PCR (LengthLength heterogeneityheterogeneity PCR) PCR)

ElettroferogrammaElettroferogramma di frammenti di DNA in un di frammenti di DNA in uncampione di Sieroinnestocampione di Sieroinnesto

La lunghezza dei La lunghezza dei frammentiframmenti amplificati per ogni specie presente in un amplificati per ogni specie presente in unsieroinnesto per Grana Padano:sieroinnesto per Grana Padano:

Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus 318 318 pbpb

Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus delbrueckii sppspp. lactis/bulgaricus. lactis/bulgaricus 331 331 pbpb

Lactobacillus helveticusLactobacillus helveticus 335 335 pbpb

Lactobacillus fermentumLactobacillus fermentum 342 342 –– 345 pb 345 pbFluorescenza (rfu)

L. helveticus

L. fermentum

L. delbrueckii

S. thermophilus

Siero 1

Siero 2

Siero 3

Siero 4

Siero 5

autolisi

DNA di cellule batteriche intere DNA di cellule batteriche lisate

1 L. delbrueckii subsp. lactis/bulgaricus2 L. helveticus

3 L. rhamnosus / L. casei / L. plantarum4 P. acidilactici / L. parabuchneri

* Unattributable peaks

LH-PCR applicata a siero, latte, cagliata e formaggio

PROFILI CAMPIONE ……..:PROFILI CAMPIONE ……..:

Cellule intereCellule intere

Cellule lisateCellule lisate

L.rhamnosus

L.parabuchneri /P. acidilactici ?

L.d lactis

L.helveticus

L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

L.fermentum?

337: L.plantarum?

•• Profilo molto diverso. Profilo molto diverso.

•• Minoranza di Minoranza di L.lactisL.lactis e e L.L.

helveticushelveticus..

•• Maggioranza di Maggioranza di

L.rhamnosusL.rhamnosus..

•• Evidenza di presenza di Evidenza di presenza di L.L.

plantarum, L. fermentum eplantarum, L. fermentum e

P.acidilactici?P.acidilactici?..

PROFILI CAMPIONE …….:PROFILI CAMPIONE …….:



L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

L.fermentum

345: L.parabuchneri / P. acidilactici?

L.d lactis L.helveticus

L.fermentum

•• Predominanza Predominanza L. lactisL. lactis,,

•• Minoranza Minoranza L. helveticusL. helveticus e e L.L.

rhamnosusrhamnosus..

•• Forte evidenza Forte evidenza L.fermentumL.fermentum

e e P.acidilacticiP.acidilactici?.?.



Cellule intereCellule intere L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

L.fermentum?

345:L. parabuchneri / P. acidilactici?

•• Dominante L.rhamnosus, Dominante L.rhamnosus,

•• Forte evidenza di L. Forte evidenza di L.

fermentum e P. acidilactici?fermentum e P. acidilactici?

PROFILI CAMPIONE……PROFILI CAMPIONE……



L.rhamnosus L.d lactis

L.helveticus

S.thermophilus? 337: L.plantarum?

L.rhamnosus L.d lactis

L.helveticus

•• Dominante L.lactis Dominante L.lactis

insieme a L. rhamnosus,insieme a L. rhamnosus,

•• Evidenza di presenza di Evidenza di presenza di

L. plantarum e S.L. plantarum e S.

thermophilus,thermophilus,




L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

345: L. parabuchneri / P. acidilactici?

L.d lactis

L.helveticus

•• Profili simili a Parmigiano Profili simili a Parmigiano

ReggianoReggiano

Ma anche tra le vitali, coltivabili o no,

importanza presenza o attività?

Differente efficacia tecnologica

modificazionibiochimiche associate all’attività

metabolica di microrganismi(Utilità dei Chimici!)

lattelatte formaggioformaggio

La caseificazione è sostanzialmente unprocesso enzimatico governato dalla

tecnologia

0

400

800

1200

1600

2000

Curd

6 ho

urs

Curd

12 h

ours

Curd

48 h

ours

Salted

chee

se (1

mon

th)

Chees

e 2

mon

ths

Chees

e 3

mon

ths

Chees

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mon

ths

Chees

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mon

ths

Chees

e 8

mon

ths

Chees

e 10

mon

ths

Chees

e 12

mon

ths

Chees

e 16

mon

ths

Chees

e 20

mon

ths

EA

0

200400600

8001000

1200

1400

16001800

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2000

Curd

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EA

0

200400

60080010001200

1400160018002000

Pep NPep CPep L

Pep APep IPep X

Attività amminopeptidasica libera in formaggio(non asociata a cellule batteriche intere e vitali)

Parte esterna Parte interna

SLAB autolisi

NSLAB crescita ed autolisi

Sem

iqua

ntita

tive

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nt

0

2

4

6

8

10

12

Curd

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t extr

actio

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Chees

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mon

ths

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mon

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Chees

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Mon

ths

β CN f (99-160)

β CN f (99-159)

αS1 CN f (1-23)

β CN f (99-160)

β CN f (99-159)

αS1 CN f (1-23)

α S2 CN f (154-162)β CN f (60-68)β CN f (1-6)αS1 CN f (1-16)

αS1 CN f (186-192)β CN f(37-67)β CN f (1-4)αS1 CN f (1-14)

αS1 CN f (174-199)β CN f (47-52)β CN f (1-3)αS1 CN f (14-23)

β CN f (159-183)αS1 CN f (155-187)β CN f (199-209)αS1 CN f (17-23)



β CN f (53-93)αS1 CN f (30-35)β CN f(193-209)αS1 CN f (1-17)

β CN f(57-93)αS1 CN f (24-30)αS1 CN f (16-20)αS1 CN f (10-16

β CN f (55-93)αS1 CN f(24-38)αS1 CN f (10-14)αS1 CN f (18-23)

β CN f(59-96)αS1 CN f (24-36)αS1 CN f (1-4)αS1 CN f (1-7)

β CN f (51-93) αS1 CN f (24-34)αS1 CN f (1-9)αS1 CN f (10-13)

α S2 CN f (154-162)β CN f (60-68)β CN f (1-6)αS1 CN f (1-16)

αS1 CN f (186-192)β CN f(37-67)β CN f (1-4)αS1 CN f (1-14)

αS1 CN f (174-199)β CN f (47-52)β CN f (1-3)αS1 CN f (14-23)




β CN f (53-93)αS1 CN f (30-35)β CN f(193-209)αS1 CN f (1-17)

β CN f(57-93)αS1 CN f (24-30)αS1 CN f (16-20)αS1 CN f (10-16

β CN f (55-93)αS1 CN f(24-38)αS1 CN f (10-14)αS1 CN f (18-23)

β CN f(59-96)αS1 CN f (24-36)αS1 CN f (1-4)αS1 CN f (1-7)

β CN f (51-93) αS1 CN f (24-34)αS1 CN f (1-9)αS1 CN f (10-13)

ßCN f(17-25)2P

ßCN f(11-28) 4P

ßCN f(12-28) 4P

ßCN f(14-28) 4P

ßCN f(15-28) 4P

ßCN f (15-28)3P

ßCN f(17-28) 3P

ßCN f (71-83)

ß CN f(142-161)

ßCN f (82-95)

aS1 CN f (169-179)

ß CN f(13-28) 4P

ß CN f (16-28)3P

ß CN f(16-25)3P

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ßCN f(11-28) 4P

ßCN f(12-28) 4P

ßCN f(14-28) 4P

ßCN f(15-28) 4P

ßCN f (15-28)3P

ßCN f(17-28) 3P

ßCN f (71-83)

ß CN f(142-161)

ßCN f (82-95)

aS1 CN f (169-179)

ß CN f(13-28) 4P

ß CN f (16-28)3P

ß CN f(16-25)3P

evoluzione della frazione oligopeptidica nel corso dellastagionatura

Set 1: 5 peptidi (media Mw 4024)



NSLAB + SLAB

SELEZIONE BIOTIPI“ADATTI”

LAB: funzionali,caratteristici, “autoctoni”..

•Parametri Tecnologici

•Presenza altri microrganismi

•Modificazioni del substratoindotte dalla tecnologia e/o attivitàmicrobica (Aw, pH, NaCl, etc.)

Evoluzione e Ruolo microflora nel PR

Ecco fatto!!!!

Rilascio enzimi,stagionatura, caratteri

organolettici

Domani !

quesiti aperti• Quali e quanti sono i microrganismi presenti

nelle differenti fasi di produzione e stagionaturaIn che stato fisiologico

• I microrganismi svolgono necessariamente tutti unruolo di interesse tecnologico

• Quali microrganismi presenti ma in stato “nonattivo”

• Effetto di metabolismi microbici in condizioni nonottimali

• Interazioni tra microrganismi• Lisi e rilascio enzimi (impronta enzimatica)• Attività enzimi (potenziale o effettiva)

Metoditradizionalicolturali

Metodi cultureindependent

Ecologia microbica - Studio metabolismo

GenomicaProteomicaMetabolomica

COMPRENDERE IL RUOLO

DEI BATTERIE’ ESSENZIALE PER MUOVERSI CON SICUREZZA

TRA TIPICITA’ E INNOVAZIONE

GRAZIE perattenzione e pazienza

Ora un poco dipubblicità!!!

il ruolo della microflora nella produzione del parmigiano

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