Imunofenotipizacija in

diagnostika imunskih

pomankljivosti

A. Ihan

Imunski sistem

Ekspresija receptorjev, adhezijskih in drugih

molekul je značilna za posamezen tip celice

cs895f

Mikroskopsko imajo limfociti enak izgled...

...vendar vezava s določenimi, dobro opredeljenimi

monoklonskimi protitelesi pokaže razlike v ekspresiji molekul

med posameznimi vrstami limfocitov. Vezavo

fluorescenčno označenih monoklonskih protiteles na celice

ugotavljamo z metodo fluorescenčne mikroskopije ali z

metodo pretočne citometrije.

Imunofluorescenca

Specifična vezava

Nespecifična vezava

Direktno označevanje

Fluorescenčno barvilo vezano na protitelo

Specifični signal razmeroma majhen

Nespecifični signal zelo majhen

Avidin-Biotin

biotinilirano

primarno

protitelo

biotin

avidin

Biotinilirano

barvilo

Do sedaj je opredeljenih 350 različnih površinskih molekul

na celicah, ki jih lahko določimo z monoklonskimi

protitelesi, uvrščenimi v sistem"Clusters of Differentiation" (CD).

gStainin

Mrtva c.

CD3

T

CD14

Mo

aktivirani

T

CD69

CD3

Ekspresija receptorjev, adhezijskih in drugih

molekul je značilna za posamezen tip celice, ker vsak tip

celice za svoje delovanje potrebuje svoji funkciji ustrezne

signale, metabolne poti, encime, efektorske mehanizme

cs22

origin of

blood

cells

Kako z imunofenotipizacijo opredelimo funkcioniranje

imunskega sistema ?Kostni mozek

pluripotentna matična celica

Kostni mozek

Mieloidna

progenitorna celica

Kri

limfoidna

Progenitorna celica

granulocitno/makrofagna

progenitorna celica

megakariocitna/

eritrocitna

Progenitorna celica

Efektorji Bezgavke

megakariocit eritroblast

Zela dendritična celica

Beritrocit

plazmatka

nevtrofilci eozinofilci bazofilci monocitiNezrela

dendritična celica

Granulociti

trombocitiT

Aktivirani

limfocit Tl

Tkiva

mastocit makrofag

Nezrela dendritična celica

cs521

CD

nomencl

ature

CD (Cluster Designations) Nomenklatura

HLDA Workshops (Human Leukocyte Differentiation Antigens)

)

CD350

CD1

Alternative

Name

Ligand/

receptor/

substrate/

associated

molecule

Description and Function

CD195 CCR5 HIV-1

Regulates lymphocyte

chemotoxis, activation

and transendothelial

migration during in-

flammation.Neutralizes

HIV infection

T +

B -

DC (+)

NK -

Mono +

Granulo +

platelet -

erythr -

EC -

gene

locus

kDa

? 37.0

www.bdbiosciences.com/pharmingen/

Dozorevanje B limfocitov

Deficiti protiteles

Zaščitni nivoji protiteles

Cepivo Zaščitni nivo IgG

Difterija 0.1 IU/mL11

Haemophilus influenzae B 0.15 g/mL29

Hepatitis A 10 mIU/mL30

Hepatitis B s –Ab 10 mIU/mL31

Ošpice (rubeola) 120 mIU/mL

Polio (inactiviran) nevtralizacijski titer 1:8

Steklina 0.5 IU/mL

Rubella 10 IU/mL

Tetanus 0.1 IU/mL

Rumena mrzlica 0.7 IU/mL

IU – mednarodna enota; mIU – mili-mednarodna enota

Cepljenje • Protitelesni odziv

Razvoj limfocitov B –do plazmatk

Naivni limfociti B imajo antigenski receptor IgM. Ko se med kroženjem po telesu na njihov IgM veže ustrezen antigen, izpostavijo naivni limfociti B kemokinski receptor CCR7, ki jih privede v področje limfocitov T sekundarnih limfatičnih organov. Tam se limfociti B srečajo z nedavno aktiviranimi (manj kot 24 ur) dendritičnimi celicami in celicami T pomagalkami. Ob nadaljnji navzočnosti antigena se ob pomoči limfocitov T hitro zgodi diferenciacija limfocitov B v plazmatke, ki tvorijo nizkoafinitetna protitelesa – proces imenujemo zunajfolikularni protitelesni odziv. Poglavitna protitelesa zunajfolikularnega protitelesnega odziva so IgM, spremlja jih tudi nekaj protiteles IgG1.

Dovolj velika aktivacija limfocitov Th pri zunajfolikularnem odzivu proizvede dovolj citokinov, da nekateri z antigenom aktivirani limfociti B razvijejo kemokinski receptor CXCD5 in migrirajo v folikle, kamor jih s kemokini privabijo folikularne dendritične celice (FDC) – folikularni odziv.

Limfociti B, ki se aktivirajo na FDC, postanejo germinalne celice in preidejo v masivno klonsko razmnoževanje. Hkrati z razmnoževanjem poteka tudi preklop med imunoglobulinskimi razredi in afinitetno zorenje limfocitov B. To omogoči razmnoževanje tistih klonov limfocitov B, ki imajo večjo afiniteto za antigen (pozitivna selekcija), medtem ko kloni z manjšo afiniteto za antigen propadejo.

Normalno

MBO

MB1

CVID Warnatz et al 2002,

Piqueras et al 2003

MB2

HSC

T

NKCLP

Mieloid

Pro B Pre B

Plazmacit

HIGM Preklopljeni BIgG

IgA

IgECD40L

CD40

AICDA UNG HIGM4

AICDAlC

CVID

ICOS

Immunoglobulin IgM

Mutiran IgM

IgG

IgA

XLA

BTK

0

0

0

0

0-low

0-low

0-low

0-low

Low

Low

Low

Low

N-hi

Low

0

0

N-hi

0

0

0

N-hi

biased

0-low

0

N-hi

N

0-low

0-low

zreli B

Iz: A Fischer Nature Immunology 2004

L5

V preB

m

Kostni mozek

IgM

IgD

Avtosomna recesivna agamaglob.

l5 Ig a/b m BLNK LRRC8

Izražanje molekul na celicah

Pretočni citometer

RačunalnikDetektor &

Mehanika Pretočni sistem

Epruveta s celicami, ki so bile predhodno

“obarvane” z označenimi monoklonskimi

protitelesi. Celično suspenzijo posrka

pretočni sistem, nato celice potujejo skozi

snop laserske svetlobe. Hitrost analize je

nekaj 100 celic / sekundo.

Celični sorterji (FACS – Fluorescence Activated Cell Sorter)

Optika

PMT 1

PMT 2

PMT 5

PMT 4

Filtri

Laser

Pretočna

celica

PMT 3

Scatter

Senzor

Vzorec

Optika za FSC (forward scatter)

detektor

reža

blok

Laser

0 200 400 600 800 1000

0

20

0 4

00

60

0 8

00

10

00

Side Scatter (SSc)

Velikost /

granuliranost

Forward Scatter (FSc)

Nevtrofilci

Limfociti

Monociti

Velikost celic

Velikost delcev

Šte

vil

o d

og

odk

ov

mali veliki

0.1 1 10 100 1000

0.920

90

200

700

“B”

“T”

3 Parameterska analiza

4 barvna analiza

Emisija (nm)530 580 630 680 730 780

FITC PE PE-TR

PE-CY5

10 1 10 2 10 3 10 4

CD56 -->

10

11

02

10

31

04

CD

4 -

->

10 1 10 2 10 3 10 4

CD3 -->

10

11

02

10

31

04

CD

4 -

->

CD3CD3 CD3

10 1 10 2 10 3 10 4

CD3 -->

10

11

02

10

31

04

CD

56 -

->

10 1 10 2 10 3 10 4

CD3 -->

10

11

02

10

31

04

CD

8 -

->

CD56

10 1 10 2 10 3 10 4

CD56 -->

10

11

02

10

31

04

CD

8 -

->

CD56 CD8

10 1 10 2 10 3 10 4

CD8 -->

10

11

02

10

31

04

CD

4 -

->

4 barvna analiza

CD

4

CD

8

CD

56 -

NK

CD

8

CD

4

CD

4

CD56 – NK

CD3 – T

CD4 – Th

CD8 – TcThis is a subset of cells

It is CD3+ CD56+This is a subset of cells

It is CD3+ CD4+

Večbarvna analiza

Sortiranje celic

Fizično ločevanje celic na osnovi razlik v

parametrih, izmerjenih s pretočnim

citometrom

HidrodinamikaVzorec

Tekočinski ovoj

Laser

Piezoelektrični

cristalni oscilator

Fluorescenčni

Senzor

Scatter Senzor

jedroOvoj

Smer

svetlobe

Pretočna celica

++ --

Celične funkcije

Viabilnost

Fagocitoza

Funkcije organel mitohondriji, ER

endosomi, Golgi

Oksidativne reakcije Superoksid

Vodikov peroksid

NO

Glutation

• Koncentracija ionov

–Znotrajcelični kalcij

– znotrajcelični pH

• Membranski el. potencial

• Membranska polarizacija

• Peroksidacija lipidov

FluorescencaE

NE

RG

Y

S0

S1

S2

T2

T1

ABS FL I.C.

ABS - Absorbance S 0.1.2 - Singlet Electronic Energy Levels

FL - Fluorescence T 1,2 - Corresponding Triplet States

I.C.- Nonradiative Internal Conversion IsC - Intersystem Crossing PH - Phosphorescence

IsC

IsC

PH

[Vibrational sublevels]

Vibrational energy levels

Rotational energy levelsElectronic energy levels

Singlet States Triplet States

Ethidium

PE

cis-Parinarična kisl.

Texas Red

PE-TR Conj.

PI

FITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm

457350 514 610 632488 Linije najpogostejših

laserjev

Viri svetlobe - laserji

Argon Ar 353-361, 488, 514 nm

Krypton-Ar Kr-Ar 488, 568, 647 nm

Helium-Neon He-Ne 543 nm, 633 nm

He-Cadmium He-Cd 325 - 441 nm

Laser Okrajš. Vzbujevalna svetloba

Sipana svetloba Molekule in zelo mali delci

svetlobe ne absorbirajo

ampak jo razpršijo, pri tem

valovna dolžina ostane enaka.

Nebo je modro, ker molekule plinov bolj pršijo svetlobo manjših

valovnih dolžin (modro) kot večjih valovnih dolžin (rdečo)

Vrhovi ekscitacije in emisije

Fluorofor EX EM

% Max ekcitacije pri

488 568 647 nm

FITC 496 518 87 0 0

Bodipy 503 511 58 1 1

Tetra-M-Rho 554 576 10 61 0

L-Rhodamine 572 590 5 92 0

Texas Red 592 610 3 45 1

CY5 649 666 1 11 98

Fluorescenčni mikroskop s 35 mm kamero

Hoechst 33342 (AT rich) (uv) 346 460

DAPI (uv) 359 461

POPO-1 434 456

YOYO-1 491 509

Acridine Orange (RNA) 460 650

Acridine Orange (DNA) 502 536

Thiazole Orange (vis) 509 525

TOTO-1 514 533

Ethidium Bromide 526 604

PI (uv/vis) 536 620

7-Aminoactinomycin D (7AAD) 555 655

Barvila za nukleinske kisline

DNA barvila AO

Metakromatsko barvilo

• Emisija odvisna od koncentracije

• Dvojna vijačnica - zeleno

• Enojna vijačnica - rdeče

AT/GC vezavna barvila

AT : DAPI, Hoechst, quinacrine

GC : antibiotics bleomycin, chromamycin A3, mithramycin, olivomycin, rhodamine 800

Celični ciklus

G1

MG2

S G0

G0G0- G1

s G2M

Količina DNA2N 4N

G2M G0

G1

s

0 200 400 600 800 10000

75

150

225

300

Šte

vilo

ce

lic

DNA Histogram

G0-G1

S

G2-M

Fluorescenca

Šte

vil

o d

ogodkov

2n 4n

Analiza DNA Histograma

DNA Content0 50 100 150 200

Num

ber

02

00

40

06

00

Kromosomska analiza

Večina humanih kromosomov se loči s pretočno citometrijo

DNA fragmentacija DNA barvilo – Acridine orange

Metakromatsko barvilo

• Dvojno vijačna DNA/ enovijačna (fragmentirana) DNA

Annexin V - PI

Annexin V

PI

Annexin V

Barvila za oksidacijsko stanje

DCFH-DA (H2O2) 488 525

HE (O2-) 488 590

DHR 123 (H2O2) 488 525

Barvilo Oksidant Ekscitacija Emisija

DCFH-DA - dichlorofluorescin diacetate

HE - hydroethidine

DHR-123 - dihydrorhodamine 123

RKZ - spermiji

Čas (sekunde)

0 240018001200600

Log D

CF

.1

1000

100

1

0 1

Skala

345

115

38

12

4

Nevtrofilni oksidativni izbruh

PMA-Stimulacija

Kontrola

FITC-Označene bakterije

Fagocitoza

Oksidativne reakcije

Superoksid: hidroetidin

Peroksid: DCFH-DA prehaja skozi

membrano celic, znotrajcelično postane

polaren (hidroliza z esterazo). H2O2 oksidira

DCFH v fluorescenten DCF

Glutation: 40 mM monobromobiman

reagira z glutathion-S-transferazo

Dušikov nitrit (NO): DAF

DCFH-DA DCFH DCF

COOHH

Cl

O

O-C-CH3

O

CH3-C-O

Cl

O

COOHH

Cl

OHHO

Cl

O

COOHH

Cl

OHO

Cl

O

Fluorescenca

Hidroliza

Oksidacija

2’,7’-dichlorofluorescin

2’,7’-dichlorofluorescin diacetate

2’,7’-dichlorofluorescein

Cellular Esterases

H2O2

DCFH-DA

DCFH-DA

DCFH

DCF

H O2 2Lymphocytes

Monocytes

Neutrophils

log FITC fluorescenca.

1 1000100101

0

20

40

60

co

un

ts

PMA-stimulacija PMNkontrola

80

Fagosom

O2

O2-

H2O2

NADPH + H+

NADP+

HMP

NADPH

Oksidaza

GSSG

GSH

GRGP

H2O2SOD

O2-

H+

H2O

katalaza

H2O + O2

PCB

SOD

PCB

Stimulator

PKC

PCB

(PMA)

Nevtrofilna celica

?

?

+O2

-

OH.

Lipidna Peroksidacija

Fosfolipaza A2Levkotrieni

H2O2

Barvila za organele

BODIPY Golgi 505 511

NBD Golgi 488 525

DPH Lipidi 350 420

TMA-DPH Lipidi 350 420

Rhodamine 123 Mitohondr. 488 525

DiO Lipidi 488 500

diI-Cn-(5) Lipidi 550 565

diO-Cn-(3) Lipidi 488 500

Barvilo Mesto Ekscitacija Emisija

BODIPY - borate-dipyrromethene complexes

NBD - nitrobenzoxadiazole

DPH - diphenylhexatriene

TMA - trimethylammonium

Funkcije organel

Mitohondriji Rhodamine 123

Endosomi Ceramidi

Golgi BODIPY-Ceramid

ER DiOC6(3)

Methods: MMP (mitochondrial

membrane potential)

DiOC6(3)

Parametri spermatocitov

Zdravih spermijev (več kot 60 %)*

Nekrotičnih spermijev (manj kot 40 %)*

Apoptotičnih spermijev (manj kot 25

%)*

Spermijev s fragment. DNA (manj kot 10 %)*

Indeks (N + Ap) / Z (manj kot 1 )*

Celični drobir (delež) (manj kot 30%)

Povp. PMA indeks RKZ/ celico: (manj kot 1,2

)*

Apoptosis

Initiator phase

(mitochondrial changes)

Effector phase

(membrane and

cytoplasmic changes)

Cell degradation phase

(DNA fragmentation)

Barvila za proteine

FITC 488 525

PE 488 575

APC 630 650

PerCP™ 488 680

Cascade Blue 360 450

Coumerin-phalloidin 350 450

Texas Red™ 610 630

Tetramethylrhodamine-amines 550 575

CY3 (indotrimethinecyanines) 540 575

CY5 (indopentamethinecyanines) 640 670

Barvilo Ekcitacija Emisija

Barvila za ione

INDO-1 Ex350 Em405/480

QUIN-2 Ex350 Em490

Fluo-3 Ex488 Em525

Fura -2 Ex330/360 Em510

pH indikatorska barvila

SNARF-1 488 575

BCECF 488 525/620

440/488 525[2’,7’-bis-(carboxyethyl)-5,6-carboxyfluorescein]

Barvilo Ekcitacija Emisija

Področja uporabe pretočne citometrije

•Imunologija

•Hematologija

•Patologija

•Mikrobiologija

•Genetika

•Odkrivanje zdravil

•Testiranje toksičnosti

• Gojenje celic

•Funkcijske študije celic

Klinika in raziskovanje

•Biotehnologija

•Agronomija

•Veterina

Specifični T limfociti – označeni polimeri MHC

za spremljanje imunskega odziva

Polimeri MHC I za detekcijo specifičnih citotoksičnih limfocitov T (CD8)

Polimeri MHC II za detekcijo specifičnih limfocitov T –celic pomagalk T (CD4)

Pentameri MHC I vezani s peptidi HCV –

spremljanje anti-HCV odziva

Peptidi HCV:

CINGVCWTV

DLMGYIPAV

KLVALGINAV

RVCEKMALY

AYSQQTRGL

Ostali virusi: CMV, EBV, HBV, InfluA, HIV, HPV, HSV, ...

Onkoantigeni

Bazofilni aktivacijski test (BAT)

In vitro (kri)

specifična aktivacija

bazofilcev z

alergenom in

detekcija ekspresije

CD63 na bazofilcih

(CD123)