IMUSUONITUKSEN ENNUSTEELLINEN MERKITYS

MUNASARJASYÖVÄSSÄ

Mari Lappalainen

Opinnäytetyö

Lääketieteen koulutusohjelma

Itä-Suomen yliopisto

Naistentautien ja synnytysten klinikka

Marraskuu 2011

2

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO

Terveystieteiden tiedekunta

Lääketieteen koulutusohjelma

LAPPALAINEN, MARI A.: Imusuonituksen ennusteellinen merkitys munasarjasyövässä

Opinnäytetyö, 28 sivua

Opinnäytetyön ohjaaja: dosentti Maarit Anttila (LT, erikoislääkäri)

Marraskuu 2011

_________________________________________________________________________ Avainsanat: munasarjasyöpä, imusuonitus, ennuste, VEGF-C & -D, D2-40, immunohisto-kemia, hyaluronaani

Munasarjasyöpä kuuluu naisten yleisimpiin syöpiin erityisesti korkean elintason maissa. Munasarjasyövän kuolleisuusluvut ovat pysyneet hoitojen kehityksestä huolimatta korkei-na, sillä suurin osa syövistä on diagnoosihetkellä pitkälle edenneessä vaiheessa.

Imusuonituksella on tärkeä rooli syöpien leviämisessä imusolmukkeisiin ja muihin kudok-siin. Imusuonten kehittymistä säätelevät eri kasvutekijät, tärkeimpinä VEGF-C ja -D, jotka stimuloivat niiden kasvua. Useissa tutkimuksissa on todettu, että syöpäkasvaimet voivat tuottaa edellä mainittuja ja muita uudisimusuonitukseen tarvittavia kasvutekijöitä. Imusuonituksen uudismuodostus on tärkeä syövän kasvun ja leviämisen mahdollistava keino ja tämän vuoksi tärkeä tutkimuksen kohde. Toistaiseksi imusuonituksen ennusteelli-sesta merkityksestä munasarjasyövässä on vain vähän tietoa.

Hyaluronaani on soluväliaineen sokerimolekyyli, jonka aineenvaihdunta häiriintyy syöväs-sä, jolloin sen määrä moninkertaistuu samalla edistäen syövän etenemistä eri mekanismein. Tutkimuksissa on todettu positiivinen korrelaatio hyaluronaanin määrän ja munasarjasyö-vän aggressiivisuuden välillä.

Tämän työn tarkoituksena oli tutkia 83 immunohistokemiallisesti värjätystä (DAKO,D2-40) munasarjasyöpänäytteestä imusuonituksen laajuutta (LVD) ja selvittää, onko tällä en-nusteellista merkitystä ja löytyykö yhteyttä hyaluronaanipositiivisuuteen.

Tulosten perusteella LVD:n vaihtelu oli näytteissä runsasta ja imusuonitus sijaitsi useim-miten kasvaimen reuna-alueilla. Tutkimuksessa ei tullut ilmi merkittävää yhteyttä LVD:n ja kliinispatologisten muuttujien, kuten hyaluronaanipositiivisuuden, erilaistumisasteen, syöpätyypin tai levinneisyyden, välillä. LVD ei myöskään korreloinut tautikuolleisuuteen, mutta havaittiin kuitenkin, että runsaampi imusuonitus oli viitteellinen lyhyemmän tautiva-paan ajan suhteen.

3

Sisältö 1. JOHDANTO .................................................................................................................................. 4

2. MUNASARJASYÖPÄ .................................................................................................................. 5

2.1. Epidemiologiaa ja riskitekijöitä ............................................................................................... 5

2.2. Etiologiaa ................................................................................................................................. 7

2.3. Epiteliaalinen munasarjasyöpä ............................................................................................... 7

2.4. Oireet ja diagnostiikka ............................................................................................................. 8

2.5. Hoito ja ennuste .................................................................................................................... 10

3. IMUSUONISTO .......................................................................................................................... 13

3.1. Imusuoniston rakenne ja tehtävät ........................................................................................ 13

3.2. Imusuoniston kehityksen säätely ja kasvutekijät .................................................................. 13

3.3. Imusuoniston merkitys syövässä ........................................................................................... 14

3.4. Imusuonituksen merkitys munasarjasyövässä ...................................................................... 17

4. HYALURONAANI ..................................................................................................................... 18

5. TUTKIMUSMATERIAALI JA -MENETELMÄT ..................................................................... 19

5.1. Tutkimusmateriaali ............................................................................................................... 19

5.2 Immunohistokemia ................................................................................................................ 20

5.2.1 D2-40 ............................................................................................................................... 20

5.2.2 Hyaluronaani ................................................................................................................... 20

5.3. Värjäyksen tulkinta ................................................................................................................ 21

6. TULOKSET ................................................................................................................................. 22

7. POHDINTA ................................................................................................................................. 26

LÄHTEET ........................................................................................................................................ 28

4

1. JOHDANTO

Tilastojen mukaan naisista 1/70 sairastuu elinaikanaan ja 1/100 kuolee munasarjasyöpään.

Munasarjasyöpä on tappavin kaikista gynekologisista syövistä, ja suurin osa syövistä diag-

nosoidaankin vasta levinneessä vaiheessa. (Bhoola 2006). Sukurasite on munasarjasyövän

tärkein riskitekijä. Mutaatioihin kasvaimenestogeenissä BRCA1 tai BRCA2 liittyy lisään-

tynyt munasarjasyövän riski. Yli 90 % invasiivisista munasarjasyövistä on epiteliaalisia eli

lähtöisin pintaepiteelistä. Munasarjasyövän levinneisyydessä käytetään kansainvälistä FI-

GO-luokittelua (I-IV). (Hennessy 2009). Varhaisen vaiheen syövillä on hyvä ennuste, le-

vinneen taudin ennuste riippuu pääasiassa kirurgisen hoidon radikaaliusasteesta. Syövän

hoito on ensisijaisesti kirurginen, minkä lisäksi solunsalpaajilla (usein platinapohjaisen

solunsalpaajan ja taksaanin yhdistelmä) on suuri merkitys syövän hoidossa. (Bhoola 2006).

Imusuoniston tehtävä on säädellä kudosten nestetasapainoa ja sillä on tärkeä tehtävä eli-

mistön puolustusjärjestelmässä. Uudisimusuonten muodostusta tapahtuu sikiön kehityksen

lisäksi tulehdusten, haavan paranemisen ja kasvainten metastasoinnin aikana, ja imusuoni-

tuksella onkin olennainen osa monien sairauksien, mm. syövän kehittymisessä (Alitalo

2005). Usein syövät lähettävät etäpesäkkeitä imuteitä pitkin alueellisiin imusolmukkeisiin

ennen laajempaa metastasointia. Imusolmukemetastaaseihin liittyy myös huonontunut en-

nuste verrattuna paikallisesti rajoittuneeseen tautiin. Imusuonituksen uudismuodostus on

tärkeä syövän kasvun ja leviämisen mahdollistava keino. Uudismuodostusta säätelevät

ensisijaisesti VEGF-perheen C ja D sekä niiden reseptori VEGFR-3. (Sundar 2006).

Hyaluronaani on soluvälitilan pitkäketjuinen sokerimolekyyli, jolla on suuri merkitys syö-

vän biologiassa. Sen hajoamistuotteiden on havaittu edistävän syövän kasvulle välttämä-

töntä verisuonten kasvua (Kultti 2009). Useissa tutkimuksissa on saatu todisteita hyalu-

ronaanin tärkeydestä syövän kasvussa ja metastasoinnissa (Sironen 2010).

Syventävissä opinnoissani tutustuin munasarjasyöpään ja imusuonituksen merkitykseen

syövässä ja metastasoinnissa. Työhöni liittyy 83 immunohistokemiallisesti värjätyn mu-

nasarjasyöpänäytteen analysointi valomikroskoopilla ja käyttäen SPSS-tilasto-ohjelmaa.

Tavoitteena oli selvittää imusuonituksen merkitystä munasarjasyövässä sekä arvioida, on-

5

ko imusuonituksen laajuudella yhteyttä hyaluronaanipositiivisuuteen. Tutkimusaineisto on

kerätty Kuopion yliopistollisen sairaalan ja Keski-Suomen keskussairaalan potilaista.

2. MUNASARJASYÖPÄ

2.1. Epidemiologiaa ja riskitekijöitä

Maailmanlaajuisesti munasarjasyöpä on kuudenneksi yleisin naisten syöpä ja se kattaa 4 %

kaikista naisten syövistä (Parkin 2005). Keskimäärin elinikäinen riski sairastua munasar-

jasyöpään on 1:70 (Cannistra 2004). Ilmaantuvuus on korkeinta Euroopassa ja Yhdysval-

loissa ja matalinta Japanissa ja kehitysmaissa (Hennessy 2009). Käypä hoito -sivuston mu-

kaan munasarjasyöpä on Suomessa kuudenneksi yleisin naisten syöpä ja toiseksi yleisin

gynekologinen syöpä ja siihen kuolee enemmän potilaita kuin muihin gynekologisiin syö-

piin yhteensä (Munasarjasyöpä: Käypä hoito -suositus, 2007). Vuonna 2009 Suomessa

munasarjasyöpään sairastui 433 ja kuoli 294 naista, ilmaantuvuuden ollessa tuolloin 8,1 ja

kuolleisuuden 4,6 / 100 000 henkilövuotta. Ilmaantuvuus on korkeimmillaan 55–74-

vuotiailla. Pohjois-Savon sairaanhoitopiirissä keskimääräinen sairastuneiden määrä vuosi-

na 2005–2009 oli 21. Noin 70 % munasarjasyövistä oli diagnoosihetkellä levinneitä (Can-

cerregistry 2011).

Tärkein riskitekijä munasarja- ja rintasyövän suhteen on sukurasite. Naisilla, joilla on mu-

taatio kasvaimenestogeenissä BRCA1 tai BRCA2, on lisääntynyt riski sairastua munasar-

jasyöpään. BRCA1-mutaation kantajilla arvellaan olevan 39–46 %:n riski sairastua mu-

nasarjasyöpään, BRCA2-mutaation aiheuttama riski on arviolta 12–20 %. BRCA1- ja 2-

mutaatioiden kantajille suositellaankin munasarjojen ehkäisevää poistoa, kun lapsia on

haluttu määrä (Hennessy 2009). Kohonnut riski liittyy myös HNPCC-oireyhtymään, jossa

on kyse mutaatiosta DNA:n korjausgeeneissä (Cannistra 2004). Muita riskitekijöitä ovat

aikainen kuukautisten alkamisikä, myöhäinen menopaussi ja lapsettomuus (Hennessy

2009). Aiemmin tuloksettomiin lapsettomuushoitoihin liitettiin lisääntynyt syöpäriski

(Whittemore 1992), mutta uusimmissa tutkimuksissa yhteyttä ei ole havaittu (Jensen

2009). Myös pitkäkestoisen hormonikorvaushoidon on todettu lisäävän munasarjasyöpää

(Beral 2007). Munasarjasyövältä suojaavia tekijöitä ovat synnytykset, imetys, ehkäisytab-

lettien käyttö ja sterilisaatio (Hennessy 2009) sekä kohdun poisto (Green 1997).

6

7

2.2. Etiologiaa

Munasarjasyövän etiologiasta on useita hypoteeseja, eikä tarkkaa patogeneesia ole saatu

selville. Vallalla olevan ovulaatio-hypoteesin (Fathalla 1971) mukaan etiologian arvellaan

perustuvan ovulaatioiden aiheuttamiin vaurioihin munasarjan pintaepiteelissä ja inkluu-

siokystien muodostumiseen. Myös ympäristötekijöillä näyttäisi olevan merkitystä mu-

nasarjasyövän synnyssä, sillä yhdysvaltoihin muuttaneiden japanilaissiirtolaisten tyttärillä

näyttäisi olevan yhtä suuri sairastumisriski kuin kantaväestöllä, vaikka japanissa muutoin

munasarjasyöpä on huomattavasti harvinaisempi kuin muissa kehittyneissä maissa (Gabra

2007).

2.3. Epiteliaalinen munasarjasyöpä

Yli 90 % invasiivisista munasarjasyövistä on epiteliaalisia, loput munasarjasyövistä ovat

itusolu- ja sukupienakasvaimia. Yleisin pintaepiteelistä lähtöisin oleva kasvaintyyppi on

seroosi ja toiseksi yleisimmät ovat endometrioidi ja musinoosi, muut ovat harvinaisempia.

(Taulukko 1)

TAULUKKO 1. Munasarjasyöpien histologinen jakauma.

Munasarjasyöpä: Käypä hoito -suositus, 2007

Erilaistumisasteen perusteella kasvaimet luokitellaan lievästi, kohtalaisesti tai vahvasti

erilaistumattomiin (asteet 1–3). Epiteliaalinen munasarjasyöpä jaetaan tyypin I tai II luok-

kaan riippuen siitä, miten kasvain on kehittynyt. Tyypin I kasvaimet kehittyvät asteittain

Histologia % Epiteliaaliset kasvaimet (karsinoomat) 92–96 – Seroosi – Endometrioidi – Musinoosi – Kirkassolukarsinooma – Pahanlaatuinen Brennerin tuumori – Erilaistumaton – Sekamuoto

40 10–24 3–10 5–11 alle 0,1 6 5

Itusolukasvaimet 3–5 Sukupienakasvaimet 5–10

8

hyvänlaatuisista muutoksista pahanlaatuisiksi ja ovat lievästi erilaistuneita, kun taas tyypin

II kasvaimet kehittyvät suoraan huonosti erilaistuneiksi syöviksi (Hennessy 2009).

Munasarjasyöpä leviää kolmella eri tavalla, kapselin rikkouduttua suoraan ympäröiviin

lantion elimiin, hilseilemällä vatsaonteloon syöpäsoluina ja imuteitse. Hilseilleet syö-

päsolut kulkeutuvat pallean hengitysliikkeiden ja suoliston liikkeiden mukana ympäri vat-

saonteloa, niinpä etäpesäkkeet pallean pinnalla ja vatsakalvolla ovat yleisiä. Imuteitä pitkin

syöpä leviää lantion alueen ja para-aortaalisiin imusolmukkeisiin. Lähes kaikissa levinneis-

sä syövissä ja 20 %:ssa varhaisvaiheen syövissä tauti on levinnyt imusolmukkeisiin (Bhoo-

la 2006). Veriteitse leviäminen on harvinaista munasarjasyövässä, joissakin tapauksissa

syöpä kuitenkin voi levitä veriteitse mm. maksakudokseen ja keuhkoihin (Leminen ja Leh-

tovirta 2006).

2.4. Oireet ja diagnostiikka

Munasarjasyöpä on alussa usein oireeton ja myöhemminkin taudin oireet voivat olla niin

epäspesifisiä, että diagnoosiin päästään vasta kun syöpä on jo levinnyt. Yleisimpiä oireita

ovat vatsakivut ja vatsan turvotus (askites), suolisto-oireet, virtsavaivat ja yleinen heikko-

us. Suurimmalla osalla levinnyttä syöpää sairastavista voidaan havaita palpoituva kasvain,

mikä ohjaa oikeaan diagnoosiin. Munasarjasyövän lopullinen diagnoosi perustuu leikkauk-

sessa irrotetun kudosnäytteen histopatologiseen tutkimukseen. Leikkausta edeltävästi teh-

dään diagnoosiepäilyn varmistamiseksi laboratorio- ja kuvantamistutkimuksia. Kasvain-

merkkiainetutkimuksista tärkeimpänä pidetään CA 125:ta, joka on kohonnut yli 80 % le-

vinnyttä syöpää sairastavista (Cannistra 2004), muita käytössä olevia merkkiaineita ovat

CEA (karsinoembryonaalinen antigeeni), AFP (alfafetoproteiini), βhCG (β-korioninen go-

nadotropiini) ja LD (laktaattidehydrogenaasi), nämä lähinnä nuorilla potilailla itusolukas-

vainten poissulkemiseksi (Benedet 2000).

Emättimen kautta tehtävä ultraäänitutkimus kuuluu perustutkimuksiin, ja se näyttäisi ole-

van tietokonetomografiaa parempi havaitsemaan lantion seudun kasvaimia ja antamaan

informaatiota kasvaimen laadusta. Laparotomiateitse tehtävässä leikkauksessa saadaan

histologinen varmistus ja kasvaimen luokitus. (Cannistra 2004). Taulukossa 2 on nähtävillä

9

FIGO:n (International Federation of Gynecology and Obstetrics) luokitus, joka perustuu

kirurgisiin, sytologisiin ja histopatologisiin löydöksiin munasarjasyövässä.

10

TAULUKKO 2. Munasarjasyövän levinneisyysluokittelu (FIGO)

Luokka Levinneisyys I Kasvain rajoittunut munasarjoihin A Kasvain vain toisessa munasarjassa, munasarjan kapseli ehjä, pinnassa ei kasvainta, ei kas-

vainsoluja askiteksessa eikä huuhtelunäytteissä B Kasvain molemmissa munasarjoissa, munasarjojen kapselit ehjät, pinnassa ei kasvainta, ei

kasvainsoluja askiteksessa eikä huuhtelunäytteissä C Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa ja lisäksi munasarjan kapseli revennyt tai

kasvainta munasarjan pinnassa tai askiteksessa taikka huuhtelunäytteissä kasvainsoluja II Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa ja lantion alueella A Kasvain levinnyt kohtuun tai munanjohtimiin, ei kasvainsoluja askiteksessa eikä huuhtelu-

näytteissä B Kasvainta muissa lantion kudoksissa, ei kasvainsoluja askiteksessa eikä huuhtelunäytteissä C Kasvain levinnyt muihin lantion elimiin ja kasvainsoluja askiteksessa tai huuhtelunäytteissä

III Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa, kasvainta peritoneumissa lantion ulkopuolella tai alueellisissa imusolmukkeissa, maksassa pinnallisia etäpesäkkeitä

A Primaarikasvain lantion alueella ja mikroskooppisesti varmistettu leviäminen lantion ulko-puolelle peritoneumiin, ei kasvainkudosta imusolmukkeisssa

B Vatsaontelon pesäkkeet kooltaan alle 2 cm, ei kasvainkudosta imusolmukkeissa C Vatsaontelon pesäkkeet kooltaan yli 2 cm tai kasvainkudosta imusolmukkeissa IV Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa, etäpesäkkeet vatsaontelon ulkopuo-

lella, pleuranesteessä kasvainsoluja, maksassa parenkyymipesäkkeitä

Munasarjasyöpä: Käypä hoito -suositus, 2007

2.5. Hoito ja ennuste

Munasarjasyövän hoito on ensisijaisesti kirurginen. Tavoitteena on kasvaimen täydellinen

poisto tai ellei tämä onnistu, sytoreduktio eli mahdollisimman täydellinen poisto (Cannist-

ra 2004), sillä levinneessä taudissa sytoreduktion jälkeinen jäljelle jääneen kasvaimen koko

on tärkein ennustetekijä (Hennessy 2009). Jokaista 10 %:n lisäystä poistettavassa kasvain-

massassa vastaa 5,5 %:n parantuminen eloonjäännin mediaanissa, ja paras etu sytoredukti-

osta eloonjäämisen suhteen saadaan, kun jäännöskasvaimen koko on alle 1 cm (Bristow

2002). Standardileikkauksessa poistetaan kohtu, munanjohtimet ja munasarjat, osa vatsa-

paitaa ja epäilyttävät imusolmukkeet, koepaloja otetaan lantion sekä para-aortaalisista

imusolmukkeista, tutkitaan vatsaontelon seinämät ja huuhdellaan vatsaontelo (Hennessy

2009). Joidenkin tutkimusten mukaan imusolmukkeiden systemaattisella poistolla olisi

11

hyödyllinen vaikutus potilaan ennusteeseen (Crawford 2005). Toispuoleista munasarjan ja

munatorvenpoistoa voidaan harkita potilaalle, jolla on aste IA tai IC -luokan tauti ja on

tarve säilyttää hedelmällisyys (Hennessy 2009).

Suurin osa munasarjasyöpäpotilaista saa leikkauksen jälkeen adjuvanttisolunsalpaajalääki-

tystä, jonka tarkoituksena on poistaa jäljelle jäänyt syöpä. Ainoastaan potilaat, joilla on

luokan 1A tai B ja gradus 1 -kasvain, eivät saa adjuvanttihoitoa, sillä yli 90 %:lla heistä on

todettu olevan yli kymmenen vuoden tautivapaa ennuste ilman lisähoitoja. Muille potilaille

annetaan (3-) 6 sykliä yhdistelmähoitoa karboplatiinilla ja paklitakselilla, mikä on mu-

nasarjasyövän ensisijainen solunsalpaajahoito. Vatsaontelon sisäinen solunsalpaajalääkitys

on joissakin tutkimuksissa parantanut potilaiden ennustetta (Armstrong 2006), mutta sen

käyttöä komplisoivat toksisuus ja tekniset ongelmat, joten sitä ei ole hyväksytty yleiseen

käyttöön munasarjasyövän hoidossa (Hennessy 2009).

Primaaristi on mahdollista saavuttaa hyvä hoitovaste, mutta optimaalisesta kirurgiasta ja

solunsalpaajahoidosta huolimatta jopa 75 %:lla levinnyttä tautia sairastavista tauti uusii

(Kikuchi 2005). Uusiutuvassa taudissa toisen linjan hoito valitaan sen perusteella, onko

syöpä herkkä vai vastustuskykyinen solunsalpaajalle (platinajohdokselle). Kasvain on

herkkä solunsalpaajalle, jos vaste hoitoon kestää yli kuusi kuukautta. Vastaavasti kasvain

on vastustuskykyinen solunsalpaajalle, mikäli tauti etenee primaarin hoidon aikana tai jos

vaste kestää alle kuusi kuukautta (Markman 1991). Platinalle herkän kasvaimen uusiutu-

man hoidossa käytetään karboplatiinia yhdistettynä paklitakseliin, platinapohjaiselle solun-

salpaajalle vastustuskykyisen kasvaimen uusiutumassa valitaan muu solunsalpaaja, esi-

merkiksi doketakseli, gemsitabiini tai vinorelbiini. Koska vaste toisen linjan hoitoon on

varsin vähäinen, noin 20 % (Bhoola 2006), voidaan ajatella, että kyse on palliatiivisesta

hoidosta, jonka hyödyt ja haitat kannattaa punnita tarkkaan, kuunnellen potilaan tahtoa.

Palliaatio perustuu hyvälle kivunlievitykselle, ja tarvittaessa voidaan kirurgisesti helpottaa

mm. suolisto- tai virtsatietukosoireita. Kivuliaaseen lantion kasvaimeen voidaan joissakin

tapauksissa käyttää sädehoitoa, jolla ei muutoin ole roolia munasarjasyövän hoidossa

(Hennessy 2009)

Kehitteillä on uusia hoitomuotoja, joiden vaikutuskohteena on syöpäkudoksen lisäksi kas-

vainta ympäröivä strooma, verisuonitus tai immuunivaste. Toistaiseksi täsmälääkkeiden

tehosta uusiutuneen munasarjasyövän hoidossa on vähän kokemuksia. Ensimmäinen syö-

vän hoitoon hyväksytty verisuonten kasvua estävä täsmälääke bevasitsumabi yksinään

12

(Cannistra 2007) tai liitettynä pieniannoksiseen syklofosfamidihoitoon (Garcia 2008) näyt-

täisi tuottavan noin 20 %:n hoitovasteen.

Munasarjasyövän ennuste riippuu ennen kaikkea levinneisyydestä. Levinneessä munasar-

jasyövässä (FIGO III-IV) viiden vuoden elossaoloennuste on 19–47 %, mutta varhaisen

vaiheen (FIGO I-II) syövän ennuste on hyvä, 71–90 % on elossa viiden vuoden kuluttua.

(Heintz 2006). Varhaisen vaiheen syövissä ennustemerkitystä on levinneisyysluokituksella,

kapselin läpäisevyydellä, erilaistumisasteella, histologisella tyypillä, potilaan iällä ja aski-

teksen sytologialla. Levinneessä taudissa jäljelle jääneen kasvaimen koon lisäksi merkittä-

viä ennustetekijöitä ovat levinneisyysluokka, histologinen tyyppi, ikä, erilaistumisaste ja

leviäminen imusolmukkeisiin (Hennessy 2009).

Edellä mainittujen pääasiallisten ennustetekijöiden lisäksi myös muilla muuttujilla on tut-

kimuksissa havaittu olevan ennustevaikutusta. Muun muassa soluadheesioon liittyvät teki-

jät ovat tärkeitä syövän kehityksen kannalta. Esimerkkinä solunulkoinen polysakkaridi,

hyaluronaani, jonka määrän on todettu olevan koholla levinneissä, huonosti erilaistuneissa

kasvaimissa, muodostaen itsenäisen ennustetekijän eloonjäännin suhteen (Anttila 2000).

13

3. IMUSUONISTO

3.1. Imusuoniston rakenne ja tehtävät

Imusuoniverkosto muodostuu päistään avonaisten ohuiden imukapillaarien yhdistyessä

laajempiin kokoojasuoniin ja lopulta imusolmukkeiden kautta imutierunkoihin ja rinta-

tiehyen sekä oikean imutiehyen kautta laskimoverenkiertoon. Imukapillaarit muodostuvat

yhdestä solukerroksesta (LEC; lymphatic endothelial cell), eikä niissä ole tyvikalvoa, ym-

päröiviä perisyyttejä tai sileää lihasta, vaan ne ovat kiinnittyneet solunulkoiseen tilaan elas-

tisilla ankkurifilamenteilla. Suurempia kokoojasuonia ympäröi supistumiskykyinen sileäli-

haskerros, ja niissä on läpät edesauttamassa imunesteen virtausta yhteen suuntaan (Alitalo

2005).

Imusuoniston tärkein tehtävä on säädellä kudosten nestetasapainoa kuljettamalla valtimo-

kapillaareista tihkunutta proteiinipitoista nestettä ja makromolekyylejä takaisin verenkier-

toon. Lisäksi imusuonituksella on tärkeä tehtävä elimistön puolustusjärjestelmässä, lymfo-

syyttien ja antigeeniä esittelevien solujen kulkeutuessa niitä pitkin imusolmukkeisiin, jois-

sa tunnistetaan elimistölle vieraat tekijät ja saadaan aikaan immuunivasteen kehittyminen

(Tammela 2005). Ohutsuolen suolinukassa imusuonten tehtävänä on absorboida ravinnon

rasvoja, kylomikroneita, ja kuljettaa ne edelleen verenkiertoon (Tammela ja Alitalo 2010).

Imusuonituksella on myös tärkeä osa monien sairauksien, kuten syövän, lymfedeeman ja

tulehdustilojen kehittymisessä (Alitalo 2005).

3.2. Imusuoniston kehityksen säätely ja kasvutekijät

Sikiön kehityksen jälkeen uusien imusuonten muodostusta tapahtuu tulehdusten, haavan

paranemisen ja kasvainten metastasoinnin aikana (Tammela ja Alitalo 2010). Imusuonten

uudismuodostus tapahtuu pääasiassa olemassa olevien imusuonten versomisena. Imusuon-

ten kehityksen ja säätelyn mekanismeja on alettu ymmärtää vasta viime vuosina, kun on

tunnistettu niihin vaikuttavia molekyylejä. Uusien imusuonten kasvua (lymphangiogenesis)

säätelevät monet kasvutekijät, joista tärkeimpiä ja eniten tutkittuja ovat VEGF (vascular

endothelial growth factor) -perheen VEGF-C ja -D sekä niiden reseptori VEGFR-3.

VEGF-C ja -D kasvutekijät lisäävät myös verisuonten kasvua (angiogenesis) (kuva 1).

14

Myös angiopoietiinien on todettu edistävän imusuonten kasvua, tehokkaimmaksi on osoit-

tautunut Ang-1 (Tammela 2005b). Muita imusuonten uudismuodosta lisääviä kasvutekijöi-

tä ovat verihiutaleperäinen kasvutekijä (PDGF), hepatosyyttikasvutekijä (HGF), ja insulii-

ninkaltaiset kasvutekijät (IGF-1 ja IGF-2) (Van der Auwera 2006, kuva 2).

KUVA 1. VEGF-perheen kasvutekijät ja niiden reseptorit. Reseptoreista VEGFR-1 ja VEGFR-2 välittävät verisuonten ja VEGFR-3 imusuonten muodostusta (Al-Rawi 2005)

KUVA 2. Imusuonten muodostukseen vaikuttavat kasvutekijät ja niiden reseptorit (Van der Auwera 2006)

3.3. Imusuoniston merkitys syövässä

Imusuonistolla on olennaisen tärkeä merkitys monissa syövissä, sillä kasvainsolujen tun-

keutuminen imusuoniin ja imusolmuke-etäpesäkkeiden kehittyminen vaikuttaa merkittä-

västi syövän levinneisyysluokkaan ja syöpäpotilaan ennusteeseen (Schoppmann 2002).

Alueellisten imusolmuke-etäpesäkkeiden esiintyminen on yleistä kiinteiden kasvainten

15

kohdalla, ja se on merkki levinneestä taudista ja huonommasta ennusteesta (Sundar ja Ga-

nesan 2007). Imuteiden rakenne mahdollistaa kasvainsolujen tunkeutumisen niihin huo-

mattavasti helpommin kuin verisuoniin, johtuen väljistä solujen välisistä liitoksista ja peri-

syyttien ja tyvikalvon puutteesta (Saharinen 2004), lisäksi imutiet ovat laajempia kuin ve-

risuoniston kapillaarit (Al-Rawi 2005).

Nykytietämyksen mukaan imusuonten uudismuodostus on ratkaisevassa asemassa syö-

päsolujen leviämisessä alueellisiin imusolmukkeisiin (Al-Rawi 2011). Aiemmin uskottiin

syövän leviämisen imuteiden kautta olevan pelkästään passiivinen prosessi, mutta viime

vuosina saadun tutkimustiedon myötä on käynyt ilmi, että uudisimusuonitus, jota säätelee

monimutkaisesti kasvutekijät, syto- ja kemokiinit, vaikuttaa aktiivisesti syövän leviämiseen

(Ji 2006). Syöpäkasvaimen nopean kasvun vasteena imusuonistossa tapahtuu dramaattisia

muutoksia, kuten imusuonten endoteelisolujen (LEC) versomista ja kasvainta ympäröivien

imuteiden laajentumista (He 2005). Kasvainsolut ja makrofagit tuottavat imusuonikasvute-

kijöitä, jotka tehostavat kasvaimen ympärillä olevien imuteiden kasvua ja laajentumista

sekä helpottavat kasvainsolujen tunkeutumista niihin (Alitalo 2005).

Tutkimuksissa on osoitettu positiivinen korrelaatio VEGF-C:n ja -D:n ilmentymisen ja

imutieinvaasion, imusolmuke- ja kaukometastasoinnin ja huonon eloonjäämisennusteen

välillä useissa syövissä (Achen 2005). Siirtogeenisissä koe-eläinmalleissa on todettu

VEGF-C:n ja -D:n yli-ilmentymisen johtavan imusuonten uudismuodostukseen ja lisäävän

kasvaimen leviämistä alueellisiin imusolmukkeisiin jopa sellaisissa kasvaimissa, jotka ei-

vät normaalisti leviä imusolmukkeisiin (Alitalo 2005). Vastaavasti useissa kasvainmalleis-

sa saatiin imusolmukemetastasointi vähenemään 60–70 % estämällä VEGFR-3-reitti (Ac-

hen 2005). (Kuva 3)

16

KUVA 3. VEGF-C/D:n lisääntyneen ilmentymisen vaikutus imusuonten uudismuodostuk-seen ja imusolmukemetastasointiin (A). VEGF-C/D / VEGFR-3 -signaloinnin esto on koe-eläinmalleissa estänyt imusolmukemetastoinnin (B). (Sundar ja Ganesan 2007)

Kiistanalaista on ollut, onko syöpäkudoksen sisäisillä (ITL; intratumoral lymphatics) vai

sitä läheisesti ympäröivillä imusuonilla (PTL; peritumoral lymphatics) suurempi merkitys

syövän patologiassa ja leviämisessä imusolmukkeisiin (Van der Auwera 2006). Useat vii-

meaikaiset tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että PTL:t olisivat toiminnallisia (Achen

2005), kun taas ITL:t korkeasta kasvaimen sisäisestä paineesta johtuen olisivat huonosti

toimivia ja merkityksettömiä metastasoinnin kannalta (Padera 2002).

Viime vuosien aikana ymmärrys imusuonituksen merkityksestä ja metastasoinnin meka-

nismeista syövissä on parantunut uusien imusuonimarkkereiden myötä. Tutkimuksissa

käytetyimpiä näistä ovat LYVE-1, D2-40 ja podoplaniini. LYVE-1 on imutiespesifinen

hyaluronaanireseptori ja D2-40 on monoklonaalinen vasta-aine, joka reagoi mm. itusolu-

tuumoreihin, mutta on todettu luotettavaksi imusuonimarkkeriksi. Markkerien löytyminen

on mahdollistanut tutkimukset imusuonituksen tiheyden (LVD; lymphatic vessel density,

MVD; microvessel density) merkittävyydestä syövän ennustetekijänä tai välineenä, jolla

voisi ennustaa imusolmukemetastasointia (Sundar ja Ganesan 2007). Useissa syövissä

17

LVD:n on havaittu korreloivan imusolmukemetastasointiin ja huonoon ennusteeseen (Ac-

hen 2005).

Tutkimuksissa LVD:n on havaittu korreloivan imusolmukemetastasointiin ainakin kolo-

rektaalisyövässä (Matsumoto 2007), pään ja kaulan levyepiteelikarsinoomissa (Kayzas

2005), rintasyövässä (Nakamura 2005) ja mahasyövässä (Kitadai 2005).

3.4. Imusuonituksen merkitys munasarjasyövässä

Imusuonituksen ennusteellisesta merkityksestä munasarjasyövässä on toistaiseksi vähän

tietoa. Munasarjasyövässä on todettu VEGF-C-tason korreloivan imusolmukemetastoinnin

ja huonomman ennusteen kanssa (Nishida 2004). VEGF-D-taso korreloi myös imusolmu-

kemetastasointiin ja huonoon ennusteeseen, ja sen on todettu olevan itsenäinen ennustete-

kijä munasarjasyövässä (Yokoyama 2003).

Imusuonituksen ennusteellisesta merkityksestä munasarjasyövässä on näyttöä joissakin

tutkimuksissa, LVD:n on havaittu olevan merkittävä ennustetekijä taudin etenemisen ja

eloonjäännin suhteen (Li 2009, Sundar 2006). Toisaalta erään tutkimuksen mukaan

imusuonten muodostumisella ei havaittu vaikutusta munasarjasyövän kehityksessä (Birner

2000).

18

4. HYALURONAANI

Hyaluronaani on solujen pinnalla valmistettava, soluvälitilassa esiintyvä pitkäketjuinen

sokerimolekyyli. Sillä on tärkeä rooli kudosten toiminnassa, ja sitä esiintyy lähes kaikissa

kudoksissa. Hyaluronaanilla on suuri merkitys syövän biologiassa. Useissa syövissä hyal-

uronaania kertyy syöpäkudokseen, jossa se muokkaa solunsisäisiä viestireittejä, lisäten

syöpäsolujen jakautumista, liikkuvuutta ja tunkeutumista ympäröivään kudokseen (Sironen

2010). Hyaluronaanin on todettu suojaavan syöpäsoluja ja tekevän ne vastustuskykyisem-

miksi elimistön immuunipuolustukselle sekä syöpälääkkeille, ja sen hajoamistuotteiden on

havaittu edistävän syövän kasvulle välttämätöntä verisuonten kasvua (Kultti 2009).

Hyaluronaanin tärkeydestä syövän kasvussa ja metastasoinnissa on saatu näyttöä useissa

kokeellisissa ja kliinisissä tutkimuksissa, ja korkealla hyaluronaanipitoisuudella on todettu

yhteys kasvaimen huonoon erilaistumiseen ja aggressiivisuuteen (Sironen 2010). Aggres-

siivisimmissa munasarjasyövissä hyaluronaanin määrän on havaittu lisääntyvän jopa sata-

kertaiseksi (Kultti 2009), ja korkeaa hyaluronaanitasoa voidaan pitää itsenäisenä ennuste-

tekijänä munasarjasyövässä, jolloin se on yhteydessä potilaan huonoon ennusteeseen.

Hyaluronaania voidaankin pitää yhtenä mahdollisena kohteena syöpähoitojen kehittelyssä

(Anttila 2000).

19

5. TUTKIMUSMATERIAALI JA -MENETELMÄT

5.1. Tutkimusmateriaali

Tutkimusmateriaalina oli 83 munasarjasyöpäpotilaan immunohistokemiallisesti värjätyt

kasvainnäytteet. Näytteet edustivat epiteliaalista munasarjasyöpää, ja ne ovat peräisin

Kuopion yliopistollisen sairaalan ja Keski-Suomen keskussairaalan potilaista. Tarkemmat

tiedot tutkimusmateriaalista ovat taulukossa 3.

Muuttuja N (%)

Ikä (mediaani) 62

Histologinen tyyppi seroosi 28 (33,7)

musinoosi 11 (13,3)

endometrioidi 26 (31,3)

kirkassoluinen 7 (8,4)

muu epiteliaalinen 11 (13,3)

Gradus 1 12 (14,5)

2 35 (42,2)

3 36 (43,4)

Levinneisyys I 20 (24,1)

II 13 (15,7)

III 38 (45,8)

IV 12 (14,5)

Jäännöskasvain ei 30 (36,1)

< 2cm 18 (21,7)

>2cm 31 (37,3)

Residivointi ei 31 (37,3)

kyllä 12 (14,5)

Tilanne seurannan lopussa kuollut munasarjasyöpään 44 (53,0)

20

TAULUKKO 3. Potilasmateriaali jaoteltuna kliinispatologisten muuttujien mukaan

5.2 Immunohistokemia

5.2.1 D2-40

Formaliinilla kiinnitetyille ja parafiiniin valetuille kudosleikkeille tehtiin immunohistoke-

miallinen värjäys kaupallisella monoklonaalisella vasta-aineella, D2-40 (DakoCytomati-

on), jonka on tutkittu luotettavasti tunnistavan ja sitoutuvan imusuonten endoteeliin. Vär-

jäyksessä käytettiin Vectastain ® Elite ABC (Vector Laboratories Inc) -kittiä. Immunope-

roksidaasivärjäyksessä kiinnitettiin aluksi primäärivasta-aine (D2-40) näytteessä olevaan

antigeeniin, minkä jälkeen lisättiin biotinyloitu sekundäärivasta-aine, joka kiinnittyi pri-

määrivasta-aineeseen. Tämän jälkeen sekundäärivasta-aineessa olevaan biotiiniin kiinnitet-

tiin avidiini-biotinyloitu entsyymikompleksi ja lopuksi lisättiin substraattikromogeeni, joka

reagoi entsyymin kanssa muodostaen näkyvän värireaktion.

5.2.2 Hyaluronaani

Biotinyloitu hyaluronaanikompleksin kiinnittymisalue aggrekaaniin ja sidosproteiini

(bHABC) valmistettiin naudan nivelrustosta ja testattiin puhtauden suhteen. Jaksot depara-

finoitiin ksyleenissä, rehydroitiin moniarvoisilla alkoholeilla ja pestiin 0,1 M natriumfos-

faattipuskurilla (pH 7,4). Endogeeninen peroksidaasi inaktivoitiin yksiprosenttisella vety-

peroksidilla 5 minuutin ajan ja epäspesifi sitoutuminen estettiin yksiprosenttisella naudan

seerumin albumiinilla natriumfosfaattipuskurissa. Jaksot inkuboitiin sidosproteiinissa

(bHABC; 2.5 µg/ml, laimennettu yksiprosenttisessa naudan seerumin albumiinissa) yön yli

4 °C:n lämpötilassa. Näytelasit pestiin puskuriliuoksessa ja inkuboitiin avidiini-biotiini-

peroksidaasissa (ABC, Vectastain Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)

sekä pestiin puskuriliuoksella. Näytteet värjättiin 0,05-prosenttisella diaminobentsidiinitet-

rahydrokloridilla (DAB Sigma, St. Louis, MO, USA) ja 0,03-prosenttisella vetyperoksidil-

la puskuriliuoksessa. Näytelasit vastavärjättiin Mayersin hematoksyliinillä 2 minuutin ajan,

pestiin, dehydroitiin ja kiinnitettiin Depexissä (BDH Poole, UK). Värjäyksen spesifisyys

kontrolloitiin pilkkomalla osa jaksoista ennen värjäystä Streptomyces-hyaluronidaasilla

kuollut muuhun syyhyn 6 (7,2)

elossa 33 (39,8)

21

proteaasi-inhibiittorien läsnäollessa tai blokkaamalla bHABC-koetin preinkuboimalla hy-

aluronaanioligosakkarideilla.

5.3. Värjäyksen tulkinta

Imusuonivärjäyksen tulkinnassa laskentamenetelmänä oli koko kudosnäytteen seulonta

kvantitoiden D2-40-värjätyt imusuonet valomikroskoopilla 100x (10x okulaari ja 10x lins-

si) -suurennoksella. Mikroskopoidessa havainnoitiin lisäksi imusuonituksen paikantuminen

kasvaimen sisälle (intratumoraalisesti), reuna-alueelle (peritumoraalisesti) tai molempiin.

22

6. TULOKSET

Tulosten analysoinnissa käytettiin SPSS-tilasto-ohjelmaa, jonka avulla oli tarkoitus selvit-

tää, löytyykö imusuonten lukumäärän (LVD) ja kliinispatologisten muuttujien (levinnei-

syysaste, erilaistumisaste, syöpätyyppi, hyaluronaanipositiivisuus, tautikuolleisuus) korre-

laatiota. Tutkittuja histologisia näytteitä oli 83, joissa imusuonten absoluuttinen lukumäärä

vaihteli välillä 0–585, mediaanin ollessa 75 (kuva 4). Imusuonia oli todettavissa 70 näyt-

teessä, ja suurimmassa osassa ne sijaitsivat pääosin peritumoraalisesti (82,9 prosenttia

näytteistä), 7,1 prosentissa imusuonet sijaitsivat lähinnä intratumoraalisesti ja lopuissa 10

prosentissa imusuonitusta havaittiin molemmissa yhtä lailla.

Tässä tutkimuksessa ei tullut esille tilastollista merkitsevyyttä yllä mainittujen muuttujien

osalta. Imusuonten lukumäärän ei todettu korreloivan munasarjasyövän erilaistumisastee-

seen (kuva 5), levinneisyysasteeseen (kuva 6) tai syöpätyyppiin (kuva 7). LVD:n mediaa-

nin mukaan korrelaatiota ei tullut esille tautikuolleisuudessa (kuva 8), mutta runsas

imusuonitus oli kuitenkin viitteellinen lyhyemmän tautivapaan ajan suhteen (kuva 9).

Hyaluronaaniekspression ja LVD:n välillä ei myöskään todettu korrelaatiota syöpäsolujen

epiteelissä eikä stroomassa.

23

KUVA 4. Imusuonten lukumäärän jakauma

KUVA 5. Imusuonten lukumäärä syövän erilaistumisasteen mukaan, p=ns, Kruskall–Wallis-testi

24

KUVA 6. Imusuonten lukumäärä levinneisyysasteen mukaan, p=ns, Kruskall–Wallis-testi

KUVA 7. Imusuonten lukumäärä syöpätyypin mukaan, p=ns, Kruskall–Wallis-testi

KUVA 8. Tautikuolleisuuden ennuste kymmenen vuoden seurannassa LVD:n perusteella, p=0.5 Kaplan–Meier-testi

25

KUVA 9. Tautivapaan ajan ennuste kymmenen vuoden seurannassa LVD:n perusteella. p=0.6, Kaplan–Meier-testi

26

7. POHDINTA

Tässä tutkimuksessa ei voitu havaita merkittävää yhteyttä LVD:n ja kliinispatologisten

muuttujien välillä. LVD ei myöskään korreloinut tautikuolleisuuteen, mutta runsas

imusuonitus oli kuitenkin viitteellinen lyhyemmän tautivapaan ajan suhteen.

Munasarjasyövän leviäminen tapahtuu suurelta osin hilseilynä vatsaonteloon, ja tästäkin

johtuen imusuonten kautta leviämisen merkityksestä on ollut hankalaa tehdä johtopäätök-

siä. Laajemmat tutkimukset alkuvaiheen syövistä selventäisivät LVD:n ennustearvoa, ja

sitä, voisiko LVD:n määrittämisestä olla hyötyä harkittaessa, ketkä potilaista tarvitsevat

solunsalpaajahoitoja (Sundar 2006). Kuitenkin toistaiseksi löytyy vain harvoja julkaistuja

tutkimuksia uudisimusuonituksen merkityksestä munasarjasyövässä.

Viime vuosien aikana imusuonten uudiskasvun säätelyä on tutkittu runsaasti ja tämä on

lisännyt huomattavasti tietämystä imusuonten merkityksestä tautiprosesseissa, kuten syö-

vän metastasoinnissa (Thiele ja Sleeman 2006). Imusuonispesifisten reseptorimarkkereiden

ja säätelymolekyylien löytyminen on parantanut mahdollisuuksia tutkia imusuonituksen

merkitystä syövissä (Tammela ja Alitalo 2010). Tämä tietenkin avaa lupaavat näkymät

jatkotutkimukselle ja uusien imusuonten kasvua ja näin ollen metastasointia estävien hoi-

tokeinojen kehittämiselle. Syövän aikaansaaman uudisimusuonituksen ja sen merkitykseen

liittyvä tutkimus on vasta aluillaan, ja tärkeitä kysymyksiä tutkimukselle tulevaisuudessa

onkin monia. Tärkeä tutkimuskohde olisi selvittää, mikä on uudisimusuonituksen ja

imusolmukemetastasoinnin merkitys laajemmalle metastasoinnille muihin elimiin. Oleel-

lista on myös tutkia, mikä on saavutettavissa oleva hyöty ja tehokkuus syövän hallinnassa

kehitettäessä menetelmiä, jotka estävät uudisimusuonten muodostumista (Thiele ja Slee-

man 2006).

LVD:n merkityksellisyyden suhteen tutkimustuloksissa on ollut paljon ristiriitaisuuksia,

minkä on ajateltu johtuvan standardisoitujen menetelmien puutteesta immunohistokemial-

listen värjäysten ja imusuonituksen arvioinnissa. Toimenpiteitä menetelmien yhdenmukais-

tamiseksi on kuitenkin ehdotettu 2006 julkaistussa katsausartikkelissa (Van der Auwera

2006).

27

Tässä työssä käytetty imusuonten laskentatapa oli yksinkertainen ja helppo suorittaa. Las-

kentatapaa voi kritisoida siitä, ettei se ottanut huomioon histologisen näytteen pinta-alaa,

vaan jokainen näyte seulottiin kvantitoiden kokonaisuudessaan. Tämän menetelmän on-

gelmana on myös se, että laskentatulos riippuu mikroskopoijan perehtyneisyydestä ja ko-

kemuksesta tunnistaa yksittäiset imusuonet. Usein tarvitaan vähintään kaksi mikroskopoi-

jaa, jotta yksilökohtainen "kädenjälki" voitaisiin häivyttää. Imusuonten kvantitointi on

ollut yleisimmin käytetty laskentatapa LVD:n määrittämiseksi, mutta muitakin menetelmiä

on kehitetty, esimerkkinä Chalkleyn laskenta, jossa käytetään erillistä mikroskooppiin

asennettavaa seulaa. Siinä on 25 satunnaisesti sijoitettua täplää, ja sijoittamalla ne runsaasti

imusuonitusta sisältäville alueille (hot spot), voidaan arvioida imusuonituksen tiheyttä.

Yksittäisten imusuonten laskemisen sijaan tässä menetelmässä lasketaan täplien maksimaa-

linen määrä. Menetelmä on mahdollisesti objektiivisempi, mutta se on edelleen riippuvai-

nen mikroskopoijan tekemästä valinnasta (hot spot) (Van der Auwera 2006).

Imusuonituksen uudismuodostuksen mekanismien ymmärtäminen voisi osoittautua hyö-

dylliseksi syövän adjuvanttihoidoissa, joiden tavoitteena on estää syöpäkasvaimen kasvu

tai uusien kasvainten ilmaantuminen (Van der Auwera 2006). Tulevaisuuden toiveena on

saada käyttöön hoitokeinoja, joiden tavoitteena on vähentää ennenaikaisia syöpäkuolemia.

Imusuoniin liittyvä tutkimustyö on kuitenkin vasta alussa, ja moniin kysymyksiin on vielä

löydettävä ratkaisuja, ennen kuin tutkimustietoa päästään soveltamaan syöpäpotilaiden

hoitoon.

28

LÄHTEET Achen MG, McColl BK, Stacker SA. Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis. Cancer Cell 2005;7:121–7 Alitalo K, Tammela T, Petrova TV. Lymphangiogenesis in development and human disease. Nature 2005;438:946-53

Al-Rawi, MAA, Jiang, WG. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Frontiers in Bioscience 2011;16:723-39

Al-Rawi MAA, Mansel RE, Jiang WG. Molecular and cellular mechanisms of lymphangiogenesis. European Journal of Surgical Oncology 2005;31:117-21

Anttila MA, Tammi RH, Tammi MI, Syrjänen KJ, Saarikoski SV, Kosma VM. High levels of stromal hyaluronan predict poor disease outcome in epithelial ovarian cancer. Cancer Research 2000;60:150-155 Armstrong DK, Bundy B, Wenzel L. Huang HQ, Baergen R, Lele S, Copeland LJ, Walker JL, Burger RA. Intraperitoneal cisplatin and paclitaxel in ovarian cancer. New England Journal of Medicine 2006;354:34-43

Benedet JL, Bender H, Jones H, Ngan HY, Pecorelli S. FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers. FIGO Committee on Gynecologic Oncology. Interna-tional Journal of Gynaecology & Obstetrics 2000; 70(2): 209-62

Beral V, Bull D, Green J, Reeves G. Ovarian cancer and hormone replacement therapy in the Million Women Study. Lancet 2007;369:1703-10. Bhoola S, Hoskins WJ. Diagnosis and management of epithelial ovarian cancer. Obstetrics & Gynecolo-gy 2006;107(6): 1399-410 Birner P, Schindl M, Obermair A, Plank C, Breitenecker G, Kowalski H, Oberhuber G. Lymphatic microvessel density in epithelial ovarian cancer: its impact on prognosis. Anticancer Research 2000;20(5):2981-5 Bristow RE, Tomacruz RS, Armstrong DK, Trimble EL, Montz FJ. Survival effect of maximal cytoreductive surgery for advanced ovarian carcinoma during the platinum era: a meta-analysis. Journal of Clinical Oncol-ogy 2002;20:1248-59. Cannistra SA. Cancer of the ovary. New England Journal of Medicine 2004;351: 2519-29 Cannistra SA, Matulonis UA, Penson RT, Hambleton J, Dupont J, Mackey H, Douglas J, Burger RA, Arm-strong D, Wenham R, McGuire W. Phase II study of bevacizumab in patients with platinum-resistant ovarian cancer or peritoneal serous cancer. Journal of Clinical Oncology 2007;25(33):5180-6 Crawford SC, Vasey PA , Paul J, Hay A, Davis JA, Kaye SB. Does aggressive surgery only benefit patients with less advanced ovarian cancer? Results from an international comparison within the SCOTROC-1Trial. Journal of Clinical Oncology 2005;23(34):8802-11 Fathalla MF. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia? Lancet 1971; (2): 163. Gabra H. Epithelial ovarian cancer. Kirjassa Dewhurst’s Textbook of obstetrics and gynaecology [elektroninen aineisto]/(seitsemäs painos)toim. Edmonds DK. Lontoo: Blackwell publishing 2007, s.625-34

Garcia AA, Hirte H, Fleming G, Yang D, Tsao-Wei DD, Roman L, Groshen S, Swenson S, Markland F, Gandara D, Scudder S, Morgan R, Chen H, Lenz HJ, Oza AM. Phase II clinical trial of bevacizumab and

29

low-dose metronomic oral cyclophosphamide in recurrent ovarian cancer: a trial of the California, Chicago, and Princess Margaret Hospital phase II consortia. Journal of Clinical Oncology 2008;26(1):76-82

Green A, Purdie D, Bain C, Siskind V, Russell P, Quinn M, Ward B. Tubal sterilization , hysterectomy and decreased risk of ovarian cancer. Survey of Women´s Health Study Group. International Journal of Cancer 1997;71:948-51

He Y, Rajantie I, Pajusola K, Jeltsch M, Holopainen T, Ylä-Herttuala S, Harding T, Jooss K, Takahashi T, Alitalo K.Vascular endothelial cell growth factor receptor 3-mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumorcell entry and spread via lymphatic vessels. Cancer Research 2005;65:4739-46 Heintz AP, Odicino F, Maisonneuve P, Quinn MA, Benedet JL, Creasman W T, Ngan HY, Pecorelli S, Beller U. Carcinoma of the ovary. FIGO 6th Annual Report on the Results of Treatment in Gynecological Cancer. International Journal of Gynaecology & Obstetrics 2006;95(1): S161-S92 Hennessy BT, Coleman RL, Markman M. Ovarian cancer. Lancet 2009;374:1371-82 Jensen A, Sharif H, Frederiksen K, Kjaer SK. Use of fertility drugs and risk of ovarian cancer: Danish Popu-lation Based Cohort Study. British Medical Journal 2009;338:b249 Ji RC. Lymphatic endothelial cells, tumor lymphangiogenesis and metastasis: New insights into intratumoral and peritumoral lymphatics. Cancer and Metastasis Reviews 2006;25:677-94 Kayzas PA, Gellef S, Batistatou A, Agnantis NJ, Stefanou D. Evidence for lymphangiogenesis and its prog-nostic implications in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Pathology 2005;206:170-177 Kikuchi Y, Kita T, Takano M, Kudoh K, Yamamoto K. Treatment options in the management of ovariancancer. Expert Opinion on Pharmacotherapy 2005;6(5):743-54 Kitadai Y, Kodama M, Cho S, Kuroda T, Ochiumi T, Kimura S, Tanaka S, Matsumura S, Yasui W, Chayama K. Quantitative analysis of lymphangiogenic markers for predicting metastasis of human gastric carcinoma to lymph nodes. International Journal of Cancer 2005;115(3):388-92 Kultti A. Hyaluronan in cancer : regulation and consequences of hyaluronan biosynthesis. Kuopion yliopis-ton julkaisuja. D. Lääketiede 2009, no. 470 Leminen A, Lehtovirta P. Munasarja-ja munanjohdinkasvaimet. Kirjassa Ylikorkala O, Kauppila A, toim. Naistentaudit ja synnytykset . Keuruu: Kustannus Oy Duodecim 2006, s.239-256 Li L, Liu B, Li X, Yang S, Xiao J, Chen M, Zhang Y, Ma J. Vascular endothelial growth factor D and intratumoral lymphatics as independent prognostic factors in epithelial ovarian carcinoma. The Anatomical Record 2009;292: 562-9 Markman M, Rothman R, Hakes T, Reichman B, Hoskins W, Rubin S, Jones W, Almadrones L, Lewis, JL. Second-line platinum therapy in patients with ovarian cancer previously treated with cisplatin. Journal of Clinical Oncology 1991;9:389-93 Matsumoto K, Nakayama Y, Inoue Y, Minagawa N, Katsuki T, Shibao K, Tsurudome Y, Hirata K, Nagata N, Itoh H. Lymphatic microvessel density is an independent prognostic factor in colorectal cancer. Diseases of the Colon & Rectum 2007;50(3):308-14 Munasarjasyöpä (online). Käypä hoito -suositus. Suomalaisen Lääkäriseuran Duodecimin ja Suomen Gyne-kologiyhdistyksen asettama työryhmä. Helsinki: Suomalainen Lääkäriseura Duodecim, 2007 (viitattu 23.3.2011). Saatavilla Internetissä: www.kaypahoito.fi Nakamura Y, Yasuoka H, Tsujimoto M Imabun S, Nakahara M, Nakao K, Nakamura M, Mori I, Kakudo K. Lymph vessel density correlates with nodal status, VEGF-C expression, and prognosis in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment 2005;91(2):125-32

30

Nishida N, Yano H, Komai K, Nishida T, Kamura T, Kojiro M. Vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 2 are related closely to the prognosis of patients with ovarian carcinoma. Cancer 2004;101:1364-74 Padera TP, Kadambi A, di Tomaso E, Carreira CM, Brown EB, Boucher Y, Choi NC, Mathisen D, Wain J, Mark EJ, Munn LL, Jain RK. Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics. Sci-ence 2002;296:1883-6 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002. CA Cancer Journal for Clinicians 2005;55:74-108 Saharinen P, Tammela T, Karkkainen M J, Alitalo K. Lymphatic vasculature: development, molecular regu-lation and role in tumor metastasis and inflammation. Trends in Immunology 2004;25:387-395 Schoppmann SF, Horvat R, Birner P. Lymphatic vessels and lymphangiogenesis in female cancer: mecha-nisms, clinical impact and possible implications for anti-lymphangiogenic therapies. Oncology Reports 2002;9(3):455-60 Sironen RK, Tammi M, Tammi R, Auvinen PK, Anttila M,. Kosma VM. Hyaluronan in human malignancies. Experimental Cell Research 2011;317:383– 91 Sundar SS, Ganesan TS. Role of lymphangiogenesis in cancer. Journal of Clinical Oncology 2007;25:4298-307

Tammela T, Petrova TV, Alitalo K. Molecular lymphangiogenesis: new players. Trends in Cell Biology 2005;15:434-41

Tammela T, Alitalo K. Lymphangiogenesis: Molecular mechanisms and future promise. Cell 2010;140: 460-476. Tammela T, Saaristo A, Lohela M, Morisada T, Tornberg J, Norrmen C, Oike Y, Pajusola K, Thurston G, Suda T. Angiopoietin-1 promotes lymphatic sprouting and hyperplasia. Blood 2005;105:4642–48 (b) Van der Auwera I, Cao Y, Tille JC, Pepper MS, Jackson DG, Fox SB, Harris AL, Dirix LY, Vermeulen PB. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. British Journal of Cancer 2006;95(12):1611-25 Whittemore AS, Harris R, Itnyre J. Characteristics relating to ovarian cancer risk: collaborative analysis of 12 US case-control studies. II. Invasive epithelial ovarian cancers in white women. Collaborative Ovarian Can-cer Group. American Journal of Epidemiology 1992;136:1184-203 www.cancerregistry.fi (luettu 17.3.2011) Yokoyama Y, Charnock-Jones DS, Licence D, Yanaihara A, Hastings JM, Holland CM, Emoto M, Umemoto M, Sakamoto T, Sato S, Mizunuma H, Smith SK. Vascular endothelial growth factor-D is an independent prognostic factor in epithelial ovarian carcinoma. British Journal of Cancer 2003;88:237-44