IN VIN VİİTROTRO ARAARAŞŞTIRMA TIRMA YYÖÖNTEMLERNTEMLERİİ

Prof. Dr. Hasan BayramGaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi

Göğüs Hastalıkları ADE-posta: bayram@gantep.edu.tr

Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008

Amaç• Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve

kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma

• Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma

• Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma

• Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme

Sunu Akışı• Giriş;

– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?

• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Özet

Sunu Akışı• Giriş;

– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?

• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Özet

İn Vitro Araştırma Laboratuarı

• Nasıl kurulur?• Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK• Profesyonel destek• Personel; biyolog, teknisyen, asistan

İn vitro yöntemler nerede kullanılır?

• İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi;– Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs.– Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL– Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava

yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu• İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde

edilmesi ve incelenmesi– Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler,

eozinofil vs– Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre

kültürleri vs

İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır?

• Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs• Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya

titreşimi, elektriksel direnç, permabilite• Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue• Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot• Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi:

PCR, RT-PCR• Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya• Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre)

ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)

Sunu Akışı• Giriş;

– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?

• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Özet

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme

ImmunoAssay (EIA)

(‘capture ab’)(Nümune)

(‘detecting ab’)

(‘enzime bağlısecondary ab’)

(Substrat)

ELİSA

ImmunoSito/Histokimya

Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi

‘Blotting’ (leke)• Southern blot; DNA dizisi

(sequence,sekans)• Western blot; protein antibody ile • Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile• Southwestern blot: DNA bağlı protein• Far-western blot: Protein, non-antibody

protein ile

http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

Western Blot (Immunoblot)

•Doku homojenat•Spesifik proteini, düzeyini belirlemek

ı/ekstraktı, hücre

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Microarray (Mikrodizi)

• DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays

• Protein mikroarray• Tissue mikroarray• Transfection mikroarray (hücre microarray) • Kimyasal bileşik mikroarray• Antibody mikroarray• Gene Chip Analizleri

DNA Mikroarray

•Gen/genom chip, DNA chip, gen array•Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu•Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yıkullanırlar.

Genomic

•Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması•Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans)tespitine dayalı çalışmalar

Proteomic

•‘Genomic’ ılır• Genel olarak protein çal(yap

• ‘Proteome’; ‘•Bir organizma taraf

ile analoji yaratmak amacıyla kullanışmaları

ı ve fonksiyonları)protein’ ve ‘genome’ dan oluşur.

ından üretilen tüm proteinler

Small Interfering RNA (siRNA)

•‘short interfering RNA’• Sçift-sarmal RNA moleküllerinden olu

• sSpesifik geni etkisizlekullan

veya ‘silencing RNA’pesifik rolleri olan 20-25 nükleotid uzunluğunda

şur.iRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek

ştirme de (knock down)ılabilir

Flow Cytometry

• DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs)• Apopitozis çalışmalarında• Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde

(CD markerları)• Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs)• Kromozom analiz ve tespitinde• RNA çalışmalarında• Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda

http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/support/training/online/ITF/index.shtml

•Tek dalga ışın demeti(lazer) sıvı akımına yönlendirilir•Çevredeki detektörler ışığınkırılma yönü, yaydığıfloresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır

Akım Sitometri (Flow Cytometry)

Hücre Siklüs Ölçümü

Sunu Akışı• Giriş;

– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?

• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Özet

Hücre Kültürleri• İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik

sorunları• Uygun çalışma modeli• Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb• Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser• Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel

irritanlar (hava kirliliği), biomas• Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, β2-

agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs

Hücre Dizileri (‘Cell line’)• Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale

getirilirler (viruslar, SMV40);– BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri)– 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri)

• Kanserleşmiş hücreler kullanılır– A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri)

NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection

A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri)(Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)

• DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine• Tek katman (‘monolayer’) oluşturur

Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4μm)

Hücre Canlılığı - MTT

SF 50 100 200 400FCS%10

5 10

Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)

DEP’nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi

24 saat

***p<0.0001 - 0μg/ml DEP

FCS 0 5 10 50 100

200

400

1000

2000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)(%10)

* *

*

*

Opt

ik D

ansi

te

FCS 0 5 10 50 100

200

400

1000

2000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)

*

* * **

*

(%10)

Opt

ik D

ansi

te

FCS 0 5 10 50 100

200

400

1000

2000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

(%10) Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)

**

*O

ptik

Dan

site

72 saat48 saat

Serum 0 10 50 100

200

400

0

1000

2000

3000

4000

5000

*

Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml)

IL-8

(pg/

ml)

Serum 0 10 50 100

200

400

1000

0

5

10

15

*

Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/mG

M-C

SF (p

g/m

l)l)

DEP (10-1000μg/ml) ile 72s İnkübasyonunA549’dan Sitokin Salınımına Etkisi

DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi

G0/1 S G2/M0

25

50

75

100Serum FreeDEP (10μg/ml)FCS (10%)***

***

*

**

*****

Cell cycle compartments

Perc

ent o

f cel

ls

Channels (FL2-H)0 50 100 150 200 250

Num

ber

020

040

060

080

010

00

G0G1G2MS-Phase

SF

Bayram H et al, Eur Respir J 2006

SF

LL(A-/P-) LR(A+/P-) UR(A+/P+) UL(A-/P+)0

10

20

30

40

70

100 **

*

FCS(10%)SFDEP (10μg/ml)

*

*

Kuadrantlar

Hüc

rele

rin %

'si

*P<0.05 and**P<0.005 vs SF

Bayram H et al, Eur Respir J 2006

DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre apoptozisine etkisi

DEP’nin A549 hücre p21CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi

0 1 100

50

100

150

p21

(% o

f βac

tin)

10% FCS

10%FCS0 1 10

DEP (μg/ml)

*** β-actin

p21CIP1/WAF1

*P<0.05 and**P<0.01 vs 0μg/ml DEP

0 1 100

100

200

300

400

DEP(μg/ml)

*

p21

mR

NA

(% G

APD

H)

*P<0.05 vs SF

DEP (10μg/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi

Sunu Akışı• Giriş;

– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?

• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Özet

Primer Hücreler-Avantajlar• İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve

fenotipik benzerlik• Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt

olarak elde edilebilirler

Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar

• Elde edilmeleri daha zor• Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar• Etik sorunlar

Doku - Hücre Kaynağı• Cerrahi eksplant

– Pnömonektomi, Lobektomi– Transplant akciğeri

• Biyopsi• Fırçalama (epitel hücreler)• Enzimatik digestion,• Disseksiyon• Hazır, ticari olarak

Akciğerin Primer Hücre Kültürleri

• Düz kas hücreleri• Fibroblast kültürleri• Alveolar epitel hücreleri• Bronş epitel hücreleri

Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri

• Fırçalama,• Enzimatik digestion,• Disseksiyon

Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu

Kültür Vasatı• ‘Medium 199’

– Foetal bovine serum (2.5ml)– 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 μg/ml)– 1ml human transferrin (2.5 μg/ml)– 1ml epidermal growth factor (20μg/ml)– 1ml hydrocortisone (0.36 μg/ml)– 1ml L-glutamine (0.02mg/ml)– 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon

• 100ml tamamlanır ve 0.2μm por çap filtreden geçirilir

Kültür Kapları

6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastikkültür kapı (Becton Dickinson,UK)

9mm çaplı 24 gözlü, 0.45μm porçaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı

24-Kuyucuklu Plate

(Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

1. Hafta 3. Hafta

Hücrelerin DEP ile İnkübasyon

Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi

Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1998.

DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi

0,01

0,1

1

10

100

1000

Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronşepitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı

IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1

p<0.05

p<0.002

p<0.003

pg/μg selüler protein

YK

Non-ast. Ast.(log.)

Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği

%5 CO2İn Air

NO2

Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği

Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronşepitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi

Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.

Sunu Akışı• Giriş;

– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?

• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve

araştırmalarda kullanımı• Özet

Özet• Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı• İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda

kullanılabilirler• Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri

yapılabilir• Solunum yolu hücrelerinin

– Fizyolojik– Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi– Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında

kullanılabilir

Yorum• Bütün dünyada yaygın olarak

kullanılan in vitro araştırma yöntemlerinden yararlanmalıyız

Sabrınız İçin Teşekkür Ederim