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Informe Final Proyecto: Cultivo de Células Vegetales en Biorreactores Director: Dr. Mario Rodríguez Monroy Claves asignadas (CGPI 20040032, SIP 20050035 y 20060039) Nota aclaratoria. En los 2 informe previos enviados a la SIP 2004 y 2005 se incluyeron los
resultados correspondientes a las metas previas, de tal forma que en el presente informe se
incluyen solamente los resultados correspondientes a las metas del 2006.
Resumen
Continuando con las investigaciones sobre el cultivo de células vegetales en fermentadores, en
éste tercer y último informe del proyecto se avanzó tanto en la parte experimental como con los
productos comprometidos. En la parte experimental, se trabajó en la implementación de un
cultivo de alta densidad de U. tomentosa utilizando una concentración de sacarosa inicial en el
medio de X g/l. El escalamiento de este cultivo a un biorreactor de laboratorio (3 litros), resultó
satisfactorio utilizando un impulsor de paletas inclinadas. Por otro lado, se demostró que el
impulsor de paletas inclinadas, resulta un sistema de agitación ventajoso a la turbina Rhuston
para el crecimiento de los cultivos vegetales. Lo anterior se demostró utilizando un criterio de
igualdad de potencia inicial, usando como sistema biológico a los cultivos de S. chrysotrichum
que producen compuestos con principios bioactivos. Como subproductos de investigación se
avanzó en la parte experimental de la tesis de una alumna de Doctorado (inscrita en el 7
semestre), se terminaron dos tesis de maestría (una pendiente la realización del examen de
grado y la otra en fase re-reestructuración del escrito) y se concluyó la residencia profesional de
un estudiante de licenciatura. Los estudiantes de Posgrado todos ellos becarios PIFI. Se
impartió el curso de Posgrdo Aspecto Teórico Prácticos del Cultivo de Células en Biorreactores,
del cual se derivaron el Manal de Prácticas y los Apuntes respectivos. Se encuentra enviado y
se espera la pronta aceptación del artículo titulado: “Hydrodynamic stress induces
monoterpenoid oxindole alkaloid accumulation by Uncaria tomentosa (Willd) D. C. cell
suspension cultures via oxidative burst" en la revista Biotechnology and Bioengineering.
Finalmente se impartieron 5 conferencias (una de ellas por invitación en Centroamérica).
Introducción El cultivo de células y tejidos vegetales es una alternativa para la obtención de principios activos
usados para la fabricación de medicamentos, pesticidas, saborizantes y fragancias. No
obstante, es importante incrementar la productividad para hacer económicamente rentables
estos procesos y lograr el crecimiento satisfactorio de los cultivos en biorreactores.
La especie Uncaria tomentosa ha sido explotada insosteniblemente debido a el interés que
despierta la obtención de sus alcaloides oxindólicos monoterpénicos. Los estudios realizados
previamente a este trabajo comprueban que el cultivo in vitro de células de esta especie es una
alternativa para la producción de estos metabolitos secundarios. Pero es importante continuar
el trabajo de investigación acerca de la producción de alcaloides oxindólicos monoterpénicos
(AOM) de Uncaria tomentosa, evaluando las distintas herramientas de las técnicas de cultivo de
células y tejidos vegetales; concretamente, evaluar el efecto de una concentración mayor de
sacarosa inicial en el medio y el impulsor de paletas inclinadas para el desarrollo de una
suspensión celular de Uncaria tomentosa. Partiendo de la premisa anterior, se pensó que
incrementando la sacarosa inicial en el medio de un cultivo de células de Uncaria tomentosa
(línea Green Uth-3) conllevaría a un aumento de su producción de biomasa y de AOM, además
de analizar la capacidad del impulsor de paletas inclinadas en un tanque agitado para el
desarrollo de este cultivo y la producción de AOM.
Por otro lado, en eestudios previos se demuestro que las células de S. chrysotrichum pueden
crecer tanto en matraces, como en reactores de tipo air lift (Villarreal et al., 1997; 1998) y
tanque agitado (Rodríguez-Monroy et al., 2004). Ortiz (2005) comparó el uso de un impulsor de
paletas inclinadas (que tiene un patrón de flujo axial) con la turbina Rushton (con un patrón de
flujo radial) a la misma velocidad en la punta del impulsor (2.3 m s-1). Sus resultados
demostraron que con el impulsor de paletas inclinadas las células pudieron crecer, y no así con
la turbina Rushton. Se concluyó entonces que el impulsor axial representaba la mejor opción
para crecer células de esta especie respecto al impulsor radial; sin embargo, en ese trabajo no
se consideró que a la misma velocidad, un impulsor radial consume mayor potencia que uno
axial. Debido a lo anterior, resulta complicado saber qué fue lo que en realidad impidió crecer a
las células, si la mayor potencia suministrada o el patrón de flujo. Por lo tanto en este trabajo se
propuso comparar una turbina Rushton con un impulsor de paletas inclinadas a la misma
potencia inicial, para poder discernir si el patrón de flujo radial o axial generan las condiciones
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más favorables para el crecimiento y producción de saponinas en células de Solanum
chrysotrichum. Por otro lado, se hizo un análisis tanto del tamaño como de la forma de los
agregados y células libres, con el fin de determinar si el patrón de flujo afectaba las
características morfológicas y su posible efecto en el comportamiento reológico de los caldos.
Objetivos Evaluar el uso de un biorreactor agitado con un impulsor de paletas inclinadas para el cultivo
celular de alta densidad de Uncaria tomentosa, para la producción de AOM.
Comparar el desempeño de la turbina Rushton contra el de un impulsor de paletas inclinadas, a
la misma potencia inicial en función del crecimiento del cultivo de Solanum chrysotrichum, su
producción de saponinas, las características morfológicas de los agregados y las curvas de
viscosidad de los caldos.
Materiales y Métodos
Para cubrir el primer objetivo, la estrategia experimental se planteó en dos etapas: 1ª) evaluar
los efectos de diferente concentración de sacarosa en el medio buscando obtener un cultivo de
alta densidad y con producción de AOM y 2ª) el uso de un biorreactor equipado con un impulsor
de paletas inclinadas para el desarrollo del cultivo de alta densidad y con producción de AOM
(figura 1).
Mientras que para el segundo objetivo, se siguió metodología de la figura 2.
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Uncaria tomentosa Línea celular green Uth-3
Matraces. Efecto de la concentración de sacarosa inicial. (20, 30, 40 y 50 gsac/l)
Biorreactor: IPI Concentración de
sacarosa inicial:20, 50 gsac/l
Medición de biomasa, sacarosa residual y AOM
Figura 1. Diagrama de bloques de la metodología empleada
Figura 2. Esquema del plan de trabajo.
Impulsor turbina Rushton
Impulsor de paletas inclinadas
Curvas de potencia en función de la velocidad de
agitación
Establecimiento de las condiciones para operar a la misma potencia inicial con
ambos impulsores
Cultivos de Solanum chrysotrichum
Crecimiento Saponinas Reología Morfología
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Efecto de la concentración de sacarosa inicial en el cultivo de U. tomentosa en matraces
Se probaron diferentes concentraciones de sacarosa inicial: 20, 30, 40 y 50 g/l (3 matraces
para cada concentración). Para ello, se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 ml con 25 ml de
medio de cultivo y se inocularon con 2.5 g de células frescas cada uno. Las células
provenientes de un cultivo de 7 días de edad, fueron escurridas en un tamiz e inmediatamente
trasladadas a los matraces con la ayuda de una espátula . A los 10 días de edad de los cultivos,
se evaluó el contenido de biomasa fresca (PF), biomasa seca (PS) y se determinó el contenido
de sacarosa residual en el medio de cultivo, así como la presencia de AOM. Se realizaron dos
réplicas de este experimento.
Condiciones de cultivo de U. tomentosa en el biorreactor tipo tanque agitado con el impulsor de
paletas inclinadas
Se utilizó un biorreactor (figura 3 a) de 3 litros de volumen nominal (Vn), y un volumen de trabajo
(Vt) de 1.4 l asistido por un biocontrolador (marca Applikon, Holanda). El biocontrolador registra
en línea los valores de pH y oxígeno disuelto, además de dirigir la adición de una solución de
NaOH 0.1 N para mantener el pH cercano a 5, todo ello siguiendo la metodología utilizada por
Trejo-Tapia et al. (2005).
El impulsor utilizado fue de 6 paletas inclinadas a 45° (figura 3 b) y estuvo situado a 2.6 cm del
fondo del biorreactor. La relación diámetro del impulsor/diámetro del tanque (D /Di t) es de 0.3, la
velocidad de agitación fue constante de 400 revoluciones por minuto (rpm).
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Figura 3. Dimensiones generales del biorreactor (a), Esquema del impulsor de 6
paletas inclinadas a 45° (b).
El biorreactor se inoculó con 140 g de células frescas utilizando un matraz Erlenmeyer de 1000
ml con 200 ml de medio. Las condiciones de cultivo fueron con iluminación artificial por medio
de 3 lámparas de luz fría (150 �molm-2 -1s ), y a 23.5 + 1.5ºC. Se probaron dos concentraciones
de sacarosa inicial: 20 y 50 g/l.
Para los cultivos de S. chrysotrichum se utilizó el sistema reportado por Ortiz (2005), que
consistió en un biorreactor tipo tanque agitado de 7 L de volumen nominal (4 L de volumen de
trabajo) de vidrio (Applikon, Schiedam, Netherlands), de 35 cm de altura y 16 cm de diámetro
(figura 4). La tapa del biorreactor contó con puertos para la introducción de aire, toma de
muestra, entrada para electrodos de oxígeno y pH, tres mamparas para mejorar el mezclado y
evitar la formación de vórtices. El aire de entrada se esterilizó mediante filtros de 2 µm
(Whatman), los cuales también se instalaron en las dos salidas de venteo. Para la toma de
muestra se utilizaron frascos de vidrio de 80 mL de capacidad. La agitación del tanque se hizo
con un motor de velocidad variable (máxima 1000 min-1) y un controlador de agitación modelo
ADI 1032 (Applikon, Schiedam, Netherlands). El biorreactor se instrumentó con un electrodo
para medir el oxígeno disuelto en el medio (TOD) y otro para medir el pH; ambos electrodos son
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esterilizables. El registro de los valores de pH y de TOD se realizó en un módulo biocontrolador
modelo ADI 1030 (Applikon, Schiedam, Netherlands).
Se utilizaron dos impulsores, dimensionados y mandados a construir por Ortiz (2005): uno tipo
turbina Rushton y otro con paletas inclinadas a 45º insertadas de tal forma que la dirección del
flujo fuera hacia la superficie del líquido. El diámetro de ambos impulsores fue de 6.4 cm, y
fueron manufacturados en acero inoxidable (figura 5).
35 cm
16 cm Figura 4. Esquema del biorreactor utilizado en los experimentos.
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6.4 cm
A
1.5 cm
1.9 cm
B
Figura 5. Esquema de los impulsores utilizados: (A) turbina Rushton, (B) impulsor de paletas
inclinadas.
Curvas de potencia de los impulsores en función de la velocidad de agitación.
La caracterización de los dos impulsores utilizados se hizo mediante la obtención de las curvas
de potencia en función de la velocidad de agitación, utilizando el torquímetro descrito en el
apartado 5.2.5. (Reséndiz et al., 1991). A la flecha de agitación se le colocó el impulsor a
analizar y mediante un controlador de velocidad, se hicieron barridos a diferentes valores de
agitación (100, 200, 300, 400, 500, 600 y 700 rpm). A partir del valor del torque, se obtuvo el
valor de la potencia, y se generó un gráfico de potencia contra velocidad de agitación. Los
resultados fueron procesados a través de una hoja de cálculo de Excel y se obtuvieron las
ecuaciones de correlación de potencia en función de la velocidad de agitación.
Toma de muestra de caldo del biorreactor
Para tomar las muestras, el reactor se presurizó cerrando la salida de aire. A continuación se
abrió la manguera de toma de muestra y se recolectaron 80 mL de caldo de cultivo. Después el
tanque se llevó a una campana de flujo laminar para realizar el cambio del frasco de toma de
muestra y así evitar cualquier contaminación.
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Determinación del crecimiento
La determinación del peso seco se realizó por el método gravimétrico. Para ello se filtraron al
vacío 5 mL de muestra de caldo de cultivo, utilizando un papel filtro Whatman del No. 1, de peso
conocido. El papel con la muestra se secó en un horno a 80 ºC durante la noche, y se usó para
determinar la biomasa seca. Esta determinación se realizó por duplicado.
Determinación de las curvas de viscosidad
Para la realización de las curvas de comportamiento reológico de los caldos de cultivo, se utilizó
el viscosímetro descrito en el apartado 5.2.7. Se tomaron las lecturas de esfuerzo de corte al
variar la velocidad de deformación; para cada punto se calculó la viscosidad, como el cociente.
El equipo permitió manejar un intervalo de entre 11.7 y 1170 s-1; las determinaciones se hicieron
dos veces para cada muestra.
Análisis de la morfología de células libres y de agregados celulares.
Se siguió la metodología reportada por Miranda (2003), para lo cual se tomaron 100 �L de
muestra del caldo celular y se colocaron en un portaobjetos. Se puso un cubreobjetos a la
muestra y se tomaron las fotomicrografías con el equipo de adquisición de imágenes, utilizando
el objetivo 4x. Para el análisis de morfología celular, se tomaron al menos 100 imágenes y se
determinó el área de agregado y la relación largo-ancho del agregado, llamado factor de forma
elíptica (FFE). 30
Consumo de sacarosa.
La sacarosa se cuantificó por el método de Dubois et al. (1956), el cual consiste en tomar 1 mL
de muestra (del medio filtrado y diluido a una concentración no mayor a 200 �g mL-1) y se le
agregó 1 mL de fenol al 5% y 5 mL de ácido sulfúrico concentrado. La mezcla anterior se agitó
vigorosamente en vortex y se esperó hasta que se enfriara; posteriormente se leyó la
absorbancia de las muestras (λ= 490 nm). La curva patrón se realizó con sacarosa, en un
intervalo de 0 a 200 �g mL-1.
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Obtención de los estándares de saponinas a partir de la planta.
Los estándares de la planta para realizar la identificación y cuantificación de las saponinas se
obtuvieron de la planta. Para esto, se montó un extracto metanólico en una columna de sílica
gel; se utilizó un sistema de elución de polaridad ascendente, que consistió en hexano:acetato
de etilo:metanol, en las siguientes relaciones: 5:5:0, 5:5:0.5, 5:5:1 y 5:5:2. El fraccionamiento
fue monitoreado por cromatografía en placa fina (CPF) utilizando un sistema 5:5:1 y 5:5:2 de
hexano:acetato de etilo:metanol. Una vez obtenidos los estándares, se procedió a realizar
varias pruebas para determinar las condiciones más adecuadas para correrlas en el CLAR, que
correspondieron a un sistema acetonitrilo:agua en una relación 92:8, a un flujo de 1.5 ml min-1 y
con un detector de índice de refracción.
Extracción y cuantificación de saponinas en los cultivos in vitro.
La extracción de saponinas se realizó siguiendo la metodología desarrollada por Zamilpa et al.
(2002), con algunas modificaciones. Las muestras de las células, previamente liofilizadas, se
suspendieron en una mezcla de cloroformo:metanol, en una relación 50:50. Las suspensiones
se mantuvieron por 24 horas en agitación y al término de ese tiempo se sonicaron por 20
minutos. Este extracto se evaporó hasta sequedad en un rotavapor, para posteriormente,
realizar una bipartición con 30 mL de cloroformo:agua (1:1). La fase clorofórmica se recuperó y
se evaporó a sequedad; la fase acuosa se liofilizó. Estos extractos secos fueron resuspendidos
en metanol grado CLAR y se inyectaron en el equipo. Para el análisis de saponinas en los
sobrenadantes, éstos fueron liofilizados y sonicados con 10 mL de cloroformo. El extracto fue
llevado a sequedad y resuspendido en metanol grado CLAR para ser inyectado en el equipo.
Extracción y cuantificación de alcaloides
Se utilizó la metodología reportada por Luna-Palencia et al. (2005). Los alcaloides se extrajeron
alcalinizando el medio libre de biomasa con hidróxido de amonio al 29% a pH entre 8 y 9.
Después se extrajeron con cloroformo (grado HPLC) (2 veces el volumen de la muestra)
agitando vigorosamente en embudo de separación. Después de dos minutos, la fase orgánica
se recuperó y se evaporó el solvente en un rotavapor a 65°C. Las muestras, después de la
evaporación, se disolvieron y se inyectaron 50 �l (bomba Varian Pro Star 320 de inyección
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manual) en una columna C-18 Waters Spherishob de una longitud de 25 cm en un cromatógrafo
de líquidos de alta resolución (Varian Pro Star) acoplado a un detector de arreglos de diodos.
Los alcaloides se identificaron por la comparación de los espectros de absorción UV de
triptamina, loganina, pteropodina y ajmalicina cuyos estándares fueron obtenidos de la corteza
de la planta por Luna-Palencia et al. (2005) quienes también obtuvieron las relaciones área bajo
la curva-concentración de AOM utilizadas en este trabajo.
RESULTADOS Efecto de la concentración de sacarosa en el crecimiento de las células de Uncaria tomentosa
en matraces agitados
En la figura 6A se presentan los resultados de crecimiento de las células de Uncaria tomentosa
a diferentes concentraciones de sacarosa inicial. Con relación al peso fresco no se observa
cambio alguno entre los diferentes tratamientos (alfa= 0.95); sin embargo para los resultados de
peso seco se aprecia una tendencia de incremento en proporción directa al aumento en la
concentración de sacarosa que va desde 12 gPS/l a 24 gPS/l, para 20 y 50 gsac/l
respectivamente. No obstante sólo se encontró una diferencia significativa entre los
tratamientos de 20 gsac/l y 50 gsac/l (alfa=0.95)
En la figura 6B, se observa que la relación PF/PS decrece a medida que se aumentó la
concentración de sacarosa (alfa = 0.95 ). También se observa que el rendimiento de biomasa
en con base en la sacarosa consumida no varía (alfa=0.95) entre los tratamientos de sacarosa
evaluados.
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Figura 6. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre el cultivo de
células de Uncaria tomentosa desarrolladas en matraces. A) Crecimiento
celular, B) Relación PF/PS y rendimiento celular con base en sacarosa
consumida.
Efecto de la concentración de sacarosa en la producción de alcaloides en matraces agitados
En la figura 7 se presentan los resultados de producción de alcaloides e iridoides (loganina)
obtenidos con el cultivo de células de Uncaria tomentosa en matraces agitados con diferente
concentración de sacarosa inicial. Es posible apreciar que el comportamiento de las
producciones específicas (con base en peso seco y con base en el volumen de medio) son muy
similares entre sí. Se observa una tendencia de aumento tanto en la producción de alcaloides
como de iridoides. A medida que se aumenta la concentración de sacarosa en el rango de 20 a
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40 g/l, pero con 50 gsac/l, cae la producción de ambos. Ninguno de los resultados presentados
presenta algún cambio significativo.
Figura 7. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre la producción
de AOM y loganina. A) Rendimiento específico, B) Rendimiento
volumétrico.
Cinéticas de crecimiento de las células de Uncaria tomentosa en biorreactor tipo tanque agitado
con un impulsor de paletas inclinadas
En la figura 8 se presentan la cinética de crecimiento y consumo de sacarosa de el cultivo de
células de Uncaria tomentosa con 20 gsac/l en biorreactor con un impulsor de paletas
inclinadas. La células presentaron una fase de adaptación (lag) de 1 día y presentaron una
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-1velocidad máxima de crecimiento (�) de 0.1472 d (obtenida de la fase exponencial: del día 1 al
6) alcanzando una cantidad de biomasa máxima de 14 gPS/l (en el día 6); posteriormente el
cultivo presentó la fase de muerte. Las células consumieron toda la sacarosa suministrada, y la
agotaron el día 6. El rendimiento Yx/s (peso seco de biomasa producida/peso de sacarosa
consumida) fue de 0.37 y la velocidad de consumo de sustrato (q -1. s) fue de 0.36 d
Figura 7. Cinética de crecimiento y consumo de sacarosa del cultivo de células de
Uncaria tomentosa con 20 g sac/l en biorreactor con un impulsor de
paletas inclinadas. Biomasa en base seca (♦), sacarosa residual (■).
En la figura 8 se presentan la cinética de crecimiento y consumo de sacarosa de el cultivo de
células de Uncaria tomentosa con 50 gsac/l en biorreactor con un impulsor de paletas
inclinadas. En esta gráfica se observa que la concentración máxima de biomasa fue de 35 gPS/l
(día 10) y el cultivo presentó dos fases distintas y subsecuentes de crecimiento: del inicio al día
6 (mu=0.0963) y del día 6 al día 10 (mu=0.1688). No se observó fase lag. El consumo de
sacarosa se presentó de una forma acelerada durante los primeros dos días (q -1s=1.64d ) y
después de este momento el consumo fue más gradual (q -1 xs=0.92 d ). El rendimiento (Y /s) fue
de 0.51.
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Figura 8. Cinética de crecimiento y consumo de sacarosa del cultivo de células de Uncaria
tomentosa con 50 gsac/l en biorreactor con un impulsor de paletas inclinadas.
Biomasa en base seca (♦), sacarosa residual (■).
Cinéticas de producción de alcaloides en biorreactor tipo tanque agitado.
En la figura 9 se presentan los resultados de producción de alcaloides e iridoides (loganina)
obtenidos con el cultivo de células de Uncaria tomentosa en un biorreactor con un impulsor de
paletas inclinadas con 20 g de sacarosa inicial. Es posible apreciar que el comportamiento de
las producciones específicas (con base en peso seco y con base en el volumen de medio) son
muy similares entre sí. Se observa un comportamiento oscilante en la concentración de cada
metabolito, este comportamiento se presenta de manera análoga hasta el día 10, en el cual la
concentración de iridoides es mayor y la concentración de iridoides continua en descenso en
lugar de aumentar como lo hacía después de algún descenso durante la cinética.
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Figura 9. Cinética de producción de alcaloides (■) e iridoides (▲) con células suspendidas
de Uncaria tomentosa en un biorreactor tipo tanque agitado con un impulsor de
paletas inclinadas con 20 g/l de sacarosa inicial. A) Rendimiento específico, B)
Rendimiento volumétrico.
En la figura 10 se presentan los resultados de producción de AOM obtenidos con el cultivo de
células de Uncaria tomentosa en un biorreactor con un impulsor de paletas inclinadas con 50 g
de sacarosa inicial. De el día 2 en adelante se mantiene la presencia de los AOM en el cultivo la
cual no parece aumentar ni disminuir conforme pasa el tiempo. Las desviaciones de estos
resultados son muy grandes.
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Figura 10. Cinética de producción de alcaloides con células suspendidas de Uncaria
tomentosa en un biorreactor tipo tanque agitado con un impulsor de
paletas inclinadas con 50 g/l de sacarosa inicial.
En la figura 11 se presentan los resultados de producción de iridoides obtenidos con el cultivo
de células de Uncaria tomentosa en un biorreactor con un impulsor de paletas inclinadas con 50
g de sacarosa inicial. El mayor contenido de iridoides se presenta al inicio de la cinética y se
aprecia una tendencia a la disminución de su contenido a medida que transcurre el tiempo, sin
embargo las desviaciones de los datos obtenidos son muy grandes.
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Figura 11. Cinética de producción de iridoides con células suspendidas de Uncaria
tomentosa en un biorreactor tipo tanque agitado con un impulsor de
paletas inclinadas con 50 g/l de sacarosa inicial.
Determinación de las curvas de potencia de los impulsores.
En primer término, se caracterizaron las curvas de potencia de los impulsores. De esta forma,
se determinó la potencia que suministraba el IPI a 700 rpm y la velocidad a la que la TR debía
operarse para suministrar la misma potencia. La figura 12 muestra las curvas en función de la
velocidad de agitación para los dos impulsores. Se puede observar que a la misma velocidad, la
potencia suministrada con la TR siempre es mayor que con el IPI.
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10
100
1000
10000
100 200 300 400 500 600 700 800
Pote
ncia
(Wat
t m-3
)
Velocidad (rpm)Velocidad de agitación (rpm)
Figura 12. Curvas de potencia en función de la velocidad de agitación para los impulsores
(■,IPI; ♦, TR).
Una vez obtenidos los gráficos superiores se procedió a realizar una regresión exponencial a
cada una de las curvas:
0.0076x (r2 = 0.985) para la TR. (3) Y = 13.94e
0.0067xY = 7.13e (r2 = 0.993) para el IPI. (4)
Con las ecuaciones anteriores, se sustituyó en la ecuación para el IPI (4) una velocidad de 700
rpm para conocer la potencia suministrada por tal impulsor. El resultado fue un valor de 776
Watt m-3. Este valor se sustituyó en la ecuación para la TR (3) y así se obtuvo su velocidad de
operación, que resultó ser de 529 rpm. De esta forma se determinó la velocidad de agitación de
la TR para operar a la misma potencia que el IPI.
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Crecimiento del cultivo de Solanum chrysotrichum en el tanque agitado con la turbina Rushton y
con el impulsor de paletas inclinadas.
En la figura 13 se presentan las cinéticas de crecimiento del cultivo de S. chrysotrichum
obtenidas al evaluar el desempeño de la turbina Rushton (A) y el del impulsor de paletas
inclinadas (B). Con la TR el cultivo creció de una biomasa inicial de 4 g PS L-1 a una biomasa
máxima de 14 g PS L-1 (día 14). A partir del día 14 y hasta el día 17 la concentración celular
disminuyó ligeramente (hasta 13.8 g PS L-1), lo que puede atribuirse a una fase de muerte
celular. Con el IPI los valores de la biomasa inicial y de la biomasa máxima fueron muy
similares a los obtenidos con la TR, pero con el IPI la biomasa máxima se alcanzó a los 9 días.
Pasado el día 9 de cultivo se observó la fase de muerte celular, donde la biomasa disminuyó
desde 14 hasta 11 g PS L-1 (figura 13 B).
La tabla 1 muestra los diferentes parámetros cinéticos obtenidos con el cultivo utilizando ambos
impulsores. En cuanto a la velocidad específica de crecimiento (mu), se puede observar que el
valor para la TR es menor que para el IPI, esto quiere decir que con el IPI el cultivo crece más
rápido. En consecuencia, el tiempo de duplicación (td) fue mayor para la TR que para el IPI; esto
implica que el IPI tarda menos días para duplicar su biomasa que la TR.
20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Peso
sec
o (g
L-1
)
A
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 5 10 15 20
Peso
sec
o (g
L-1
)
B
Tiempo de crecimiento (días)
Figura 13. Cinéticas de crecimiento de S. chrysotrichum en un tanque agitado a 776 watt m-3
utilizando una turbina Rushton (A) y un impulsor de paletas inclinadas (B).
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Tabla 1. Parámetros cinéticos de los cultivos de S. chrysotrichum a 776 Watt m-3 desarrollados
en el biorreactor con la turbina Rushton y con el impulsor de paletas inclinadas.
Parámetros cinéticos Turbina Rushton Impulsor de paletas inclinadas
Inóculo inicial 4 g L-1 -14 g L
Biomasa máxima 13.5 g L-1 -114 g L-1 -1Velocidad específica de
crecimiento (mu)
0.15 d 0.18 d
Tiempo de duplicación (td) 4.62 d 3.85 d
Índice de crecimiento (IC) 2.4 2.5
Productividad -1 -11.05 g PS L d -1 -11.55 g PS L d
El índice de crecimiento (IC) fue similar para ambos cultivos; esto es reflejo de que la biomasa
inicial aumentó el mismo número de veces para ambos impulsores. La productividad nos indica
cuánta biomasa podemos tener por día. Este valor para el IPI fue de 1.55 g PS L-1 d-1,
mientras que para la TR resultó de 1.05 g PS L-1 d-1, lo cual quiere decir que se pueden
producir más células por día con el IPI. Estos valores indican en conjunto que con el IPI el
cultivo crece más rápido que con la TR, lo que sugiere que el patrón de flujo axial generado con
el IPI representa mejores condiciones para el crecimiento de los cultivos de S. chrysotrichum,
que el patrón radial de la TR.
Consumo de sacarosa de los cultivos de Solanum chrysotrichum en el tanque agitado con la
turbina Rushton y con el impulsor de paletas inclinadas.
Un aspecto importante para la caracterización de los cultivos es la determinación del perfil de
consumo de sacarosa; la figura 14 muestra el perfil del consumo de sacarosa obtenido con la
TR (A) y con el IPI (B). Los gráficos muestran perfiles muy similares, en donde el punto máximo
se observa al inicio de las cinéticas (25-30 g de sacarosa L-1) y va disminuyendo a medida que
transcurre el tiempo de cultivo, hasta llegar, en ambos casos hasta 4g L-1. El valor de
rendimiento de biomasa con base al consumo de sacarosa (Yx/s) para la TR fue de 0.45 y para
el IPI de 0.43; ambos valores son muy similares y por lo tanto podemos decir que el patrón de
descarga no ejerce ningún efecto sobre el rendimiento de biomasa respecto al consumo de
sacarosa.
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Viscosidad de los caldos de cultivo.
Para definir el comportamiento reológico de los caldos se determinó la viscosidad de los caldos
de cultivo generados. La viscosidad es una propiedad de suma importancia para el diseño y
escalamiento de equipos. La figura 15 muestra los gráficos de viscosidad en función de la
velocidad de deformación de los caldos obtenidos con la TR (A) y con el IPI (B). En ambos
gráficos, se puede ver que a medida que aumenta la concentración celular se hace más
pronunciado el comportamiento reofluidizante de los caldos. Al analizar el comportamiento del
caldo libre de células, se observó un comportamiento Newtoniano, con viscosidad cercana a la
del agua (0.001 Pa s). Por lo cual, el aumento de la pseudoplasticidad de los caldos se atribuye
a la cantidad de biomasa presente. Los datos de la figura 15 fueron ajustados al modelo de la
ley de la potencia para obtener los valores de n (índice de comportamiento de flujo) y K (índice
de consistencia).
La figura 16 muestra el gráfico de los valores de n y K correspondientes a los caldos crecidos
con ambos impulsores: para la TR (A) y para el IPI (B), en función del tiempo. Se observa que
para la TR el valor de n al inicio del cultivo es de 0.80 y para el IPI es de 0.60 y tiende a
disminuir a medida que transcurre la cinética; para la TR disminuye hasta 0.46, mientras que
para el IPI llega a 0.61. En cuanto al valor de K, vemos que el perfil es similar, pero al final del
cultivo parece que aumenta considerablemente con la TR. Que llega a 0.42 Pa sn, mientras que
con el IPI alcanza un valor de 0.10 Pa sn. Esto significaría que el caldo de cultivo se volvió más
consistente con la TR que con el IPI; sin embargo, estos últimos valores se alcanzaron cuando
ambos cultivos se encontraban en fase de muerte celular.
23
0
5
10
15
20
25
30C
once
ntra
ción
de
saca
rosa
(g L
-1)
A
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20
Con
cent
raci
ón d
e sa
caro
sa (g
L-1
)
B
Tiempo de crecimiento (días)
Figura 15. Perfiles del consumo de sacarosa de los cultivos de S. chrysotrichum en un tanque
agitado obtenidos con una turbina Rushton (A) y un impulsor de paletas inclinadas (B).
41
24
Resultados
0.0001
0.001
0.01
0.1Vi
scos
idad
(Pa
s)
A
0.0001
0.001
0.01
0.1
10 100 1000 10000
Velocidad de deformación (s-1)
Visc
osid
ad (P
a s)
B
Figura 15. Viscosidad en función de la velocidad de deformación de los caldos de S.
chrysotrichum obtenidos en un tanque agitado, con una turbina Rushton (A) y un impulsor de
paletas inclinadas (B) a diferentes concentraciones celulares (♦ = 4.25 g L-1 -1, ▲ = 6.11 g L , ■ =
11.5 g L-1, Δ = medio filtrado).
25
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
n (-)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
K (P
a sn )
A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 5 10 15 20
Tiempo de crecimiento (días)
n (-)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
K (P
a sn )
B
Figura 16. Valores de n (♦) y K (■) del modelo de la ley de la potencia para los caldos durante el
crecimiento del cultivo en un tanque agitado obtenidos con una turbina Rushton (A) y un
impulsor de paletas inclinadas (B).
26
Distribución de células libres y agregados en los cultivos de Solanum chrysotrichum agitados
con la turbina Rushton y con el impulsor de paletas inclinadas.
Se analizó la distribución de células libres y de agregados presentes, ya que posiblemente el
patrón de descarga radial generado por la TR, podría favorecer la disgregación de los
agregados, generando más células libres que con el IPI. La figura 17 muestra el porcentaje de
células libres y agregados en el cultivo crecido con ambos impulsores, en donde se observa que
los perfiles son muy similares. Para las dos condiciones, el porcentaje de células a lo largo de la
cinética no es mayor al 10%, lo cual sugiere que con los dos impulsores no se generan más
células libres o agregados.
Análisis de área y forma de las células libres y los agregados en los cultivos de Solanum
chrysotrichum agitados con la turbina Rushton y con el impulsor de paletas inclinadas.
La figura 18 muestra la distribución de área de células libres y agregados en función del tiempo
para el cultivo agitado por ambos impulsores. Para el caso de los agregados, bajo las dos
condiciones de agitación, al inicio el valor fue de alrededor de 0.02 mm2 y al final del cultivo
disminuyó a un valor de 0.01 mm2. Este comportamiento fue similar para las células libres,
cuyos valores de área al inicio de la cinética fueron alrededor de 0.011 mm2 y al final del cultivo
bajó a 0.004 mm2. El análisis estadístico indicó que no existe diferencia significativa entre los
valores del área de los agregados y células crecidos con la TR y del tamaño de agregados y
células crecidos con el IPI (�= 0.01); esto quiere decir que el patrón de flujo no afecta el área de
células libres y agregados en los cultivos de S. chrysotrichum.
Además, se analizó el cambio de forma de agregados y células libres a lo largo de la cinética.
La figura 19 muestra la cinética de forma de células libres y agregados (medida como factor de
forma elíptica, FFE); se observa que para ambos cultivos, el FFE de los agregados cambió de
un valor de 1.9 a 1.6 (figura 19B) y, para las células de 2.6 hasta 2 (figura 19A). Lo anterior
implica que tanto agregados como células se hicieron ligeramente más redondos.
27
0
20
40
60
80
100
0 3 5 7 10 12 14 17
Tiempo de crecimiento (días)
Porc
enta
je (%
)A
0
20
40
60
80
100
0 3 5 7 9 11
Tiempo de crecimiento (días )
Porc
enta
je (%
)
B
Figura 17. Distribución de células libres y agregados presentes durante el
crecimiento de los cultivos en un tanque agitado obtenidos con una turbina Rushton (A) y un
impulsor de paletas inclinadas (B).
28
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025Á
rea
med
iana
(mm
2 )
A
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0 5 10 15 20
Áre
a m
edia
na (m
m2 )
B
Tiempo de crecimiento (días)
Figura 18. Distribución del área de células libres (■) y agregados (♦) en función del tiempo de
crecimiento en los cultivos desarrollados en un tanque agitado obtenidos con una turbina
Rushton (A) y un impulsor de paletas inclinadas (B).
29
1
1.5
2
2.5
3
3.5
FFE
(-)
A
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 5 10 15 20
Tiempo de crecimiento (días)
FFE
(-)
B
Figura 19. Distribución de la forma de células libres (■) y agregados (♦) durante la cinética de
crecimiento en los cultivos desarrollados en un tanque agitado con una turbina Rushton (A) y un
impulsor de paletas inclinadas (B).
30
Producción de saponinas del cultivo de Solanum chrysotrichum en el tanque agitado con la
turbina Rushton y con el impulsor de paletas inclinadas.
En la figura 20 se muestran los datos correspondientes a la producción específica (A) y
volumétrica (B) de las saponinas esteroidales totales de los cultivos. Cabe señalar que las
saponinas fueron recuperadas solamente en las células, y no se encontraron en el medio libre
de células, lo cual indica que no existió liberación o secreción por parte de las células con
ninguno de los impulsores evaluados. Con el IPI, la producción específica de saponinas
disminuyó a medida que avanzó el tiempo de cultivo; inicialmente se tienen valores de 16 mg g-1
PS y al final del cultivo de 4 mg g-1 PS. Por otro lado, con la TR la producción de saponinas se
mantiene alrededor de los 4 mg g-1 PS a lo largo de toda la cinética. Estos datos indican que los
compuestos producidos por esta planta son metabolitos que no están asociados al crecimiento.
31
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Prod
ucci
ón d
e sa
poni
nas
(mg
gPS-1
)A
020406080
100120140160180
0 5 10 15 20
Tiempo de crecimiento (días)
Prod
ucci
ón d
e sa
poni
nas
(mg
L-1)
B
Figura 20. Producción específica (A) y volumétrica (B) de saponinas en los cultivos en un
tanque agitado utilizando una turbina Rushton (▲) y un impulsor de paletas inclinadas (■).
32
5. Impacto
Se trata de un proyecto de investigación básica que ha generando información científica y con
el cual se asocia la formación de recursos humanos.
33