INFORME FINAL DEL PROYECTO

CGPI 20050428

CARACTERIZACIÓN CELULAR Y MOLECULAR DE LAS AGAMMAGLOBULINEMIAS

MARZO 2006

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R E S U M E N

INTRODUCCIÖN. En la agammaglobulinemia congénita con ausencia de linfocitos B el 90%

de los pacientes son del sexo masculino y tienen anormalidades en BTK, defecto ligado al

coromosoma X (ALX). Un 10% de los pacientes con infecciones bacterianas recurrentes,

profunda hipogammaglobulinemia y ausencia de B son niñas, por lo que los defectos se deben

a desordenes autosómicos recesivos (AR) que son indistinguibles clínicamente del ALX. Entre

éstos hay defectos en λ-5, en µ, en BLNK y en Igα. OBJETIVOS. Los objetivos de este trabajo

fueron caracterizar en 16 pacientes y en 12 testigos de la misma edad las poblaciones de

linfocitos B (CD19), (CD45), T (CD3, CD4 y CD8), NK (CD16+56) y monocitos (CD14),

determinar la expresión de Btk en 7 pacientes para confirmar la ALX, y estudiar la expresión

de Blnk, IgM, IgD, Igα, Igβ y CD38 en una niña, para conocer el posible defecto autonómico

recesivo. MATERIAL Y MÉTODOS: El análisis se hizo por citometría de flujo en sangre

heparinizada. Se hizo tinción superficial para: CD45, CD14, CD3, CD4, CD8, CD16+56 y

CD19, IgM, IgD, Igα, Igβ y CD38 y tinción intracelular para Blnk. Se analizaron en un

FacsCalibur con el programa WinMDI 2.8. Btk se determinó por western blot (WB) con anti-Btk

y quimioluminiscencia en 7 pacientes y 2 controles. RESULTADOS: En 15/16 pacientes los

valores de: PMN = 75%, linfocitos = 17 %, monocitos = 75%, CD3= 29.4%, CD4=12%, CD8=

50% y NK = 37.5% sobrepasaron el límite mayor de los de referencia y CD19 estuvo muy por

debajo. Seis de siete pacientes no expresaron Btk, uno presentó una banda con un peso

molecular más alto que Btk (77kD). La paciente que expresó CD19 también expresó IgM, IgD,

Blnk, Igα, Igβ y CD38 pero no tuvo células B de memoria. CONCLUSIÓN: Los niveles de

células por arriba de los valores de referencia, pueden deberse a compensación por la falta de

B (> 1%). La falta de expresión de Btk o la alteración en la misma confirma lo reportado para la

ALX. La citometría y el WB son herramientas poderosas para estudiar la expresión fenotípica

en las agammaglobulinemias. La paciente que expresa CD19 no es ALX ni AR, y es candidata

para el estudio de proteínas involucradas en el desarrollo tardío de B por otros métodos

como la biología molecular.

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I N T R O D U C C I Ó N

EL SISTEMA INMUNE

La respuesta inmunitaria incluye una red compleja de mecanismos de defensa comprendida por

barreras físicas formadas por epitelios y mucosas, además de componentes celulares y mediadores solubles. En

el curso normal de una infección, el agente infeccioso desencadena una respuesta inmunitaria innata, seguida por

una respuesta inmunitaria adaptativa las cuales se complementan entre sí para eliminar dicha infección y

establecer un estado de inmunidad protectora con memoria inmunológica (Cooper y col., 2003).

En la inmunidad innata no se reconoce a un patógeno en particular, sino a un grupo de patrones

moleculares altamente conservados que son comunes a un grupo de familias de patógenos. Se basa en la

activación tanto de una serie de moléculas (proteínas del complemento), como de células: los fagocitos monocitos/

macrófagos, los neutrófilos y los mastocitos, que tienen receptores innatos para múltiples patógenos. Algunos

mecanismos innatos no actúan inmediatamente, sino que se inducen en respuesta a la infección, como las células

asesinas naturales (células NK).

La inmunidad adaptativa, específica o adquirida reconoce patógenos con los que el organismo no ha

estado en contacto. Los responsables principales de la inmunidad adaptativa son un tipo de leucocitos

denominados linfocitos T y B, que tienen receptores que reconocen epítopos característicos de cada patógeno,

denominados TCR y BCR, respectivamente. Los linfocitos B reconocen preferentemente a los patógenos tal como

entran al sistema, esto es en su estado nativo, mientras que los linfocitos T reconocen principalmente epítopos de

naturaleza peptídica previamente procesados por una célula presentadora y montados en moléculas de

histocompatibilidad (MHC). La base del reconocimiento de los diferentes patógenos es la gran diversidad de

linfocitos B y T, presentes en nuestro organismo. Existen aproximadamente 1011 linfocitos B y T distintos, cada

uno de los cuales porta un receptor específico para un antígeno diferente, que le permite reconocer cualquier

estructura molecular de forma específica.

Para combatir a los patógenos extracelulares o sus productos, los linfocitos B secretan una forma

soluble del receptor de membrana con el cual reconoció al patógeno, que se denomina anticuerpo. Los

anticuerpos no eliminan directamente al patógeno o antígeno, sino que facilitan su destrucción por los

mecanismos de la inmunidad innata.

Hay dos estirpes de linfocitos T los T cooperadores (Th) o CD4 positivos y los T citotóxicos (Tc) o

CD8 positivos. Los linfocitos Th al reconocer al péptido en las moléculas del MHC clase II y al establecerse las

interacciones entre la célula presentadora (APC) y la célula Th que incluyen a la señal co-estimulatoria y otras

interacciones, que en conjunto se denominan la segunda señal, se activan y producen citocinas. De acuerdo al

ambiente de citocinas presentes producidas por la APC, o por otras células, el linfocito Th se diferencia a células

efectoras Th1 o Th2. Los linfocitos Th2 ayudan a los linfocitos B a producir anticuerpos y a los Th1 a activar a los

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macrófagos para que destruyan a los patógenos intracelulares que han fagocitado. Los linfocitos T citotóxicos que

reconocen a los péptidos presentados por moléculas del MHC clase I destruyen a células infectadas por virus

(Delves, Roitt, 2000).

El sistema inmune ha desarrollado una variedad de respuestas apropiadas para combatir cada tipo

de patógeno, al mismo tiempo que mantiene la tolerancia a los componentes del propio organismo (Tabla I). La

principal prueba de la función del sistema inmune (combatir la infección) es el gran número de infecciones

persistentes que sufren los individuos que padecen alguna de las inmunodeficiencias, ya sea heredadas o

adquiridas, que afectan a algún componente de la respuesta inmune. La erradicación de algunos tumores parece

ser más bien una función secundaria, derivada del correcto mantenimiento de la tolerancia a lo propio y rechazo a

lo extraño (Buckley, 2002).

Tabla I. Tejidos, células y moléculas que intervienen de manera coordinada en la respuesta inmune.

INMUNIDAD INNATA

INMEDIATA

(segundos)

INDUCIDA

(horas/días)

INMUNIDAD

ADAPTATIVA

(semanas)

Moléculas Complemento

Lisozima

Citocinas

Mediadores de la inflamación

Proteínas de fase aguda (SAP, CRP, MBL, LBP)

Interferones

Defensinas

Citocinas

Anticuerpos

Perforinas y granzimas

Moléculas HLA

Células Macrófagos

Mastocitos

Linfocitos NK

Eosinófilos

Basófilos

Neutrófilos

Linfocitos T

Células dendríticas

Linfocitos B

FDC

Órganos y tejidos de interacción

Zonas infectadas, barreras físicas Bazo

Ganglios

MALT

Órganos y tejidos de producción

Hígado (complemento, proteínas de fase aguda, citocinas)

Médula ósea ( leucocitos)

Timo

Médula ósea

Sistema de circulación

Sangre y linfa Linfa

Sangre

*Tomada de Regueiro JR . Inmunología. Biología y patología del sistema inmune. 3ª. Edición. 2003.

LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS

Las inmunodeficiencias se producen cuando uno o más componentes del sistema inmunitario están

defectuosos. Las inmunodeficiencias se clasifican en primarias y secundarias. Las inmunodeficiencias secundarias

o adquiridas son debidas a factores extrínsecos, como fármacos, radiaciones, la desnutrición, las infecciones, las

malformaciones del tracto urinario o del sistema respiratorio. La causa más común de deficiencia inmunitaria en

todo el mundo es la malnutrición. Las inmunodeficiencias primarias (IDPs) son debidas a defectos intrínsecos de

las células que integran el sistema inmunitario, y en la mayoría de los casos aparecen como consecuencia de

anomalías genéticas. Pueden deberse a la alteración de un solo gen, ser poligénicas o pueden representar la

interacción de determinadas características genéticas y factores ambientales o infecciosos (Bonilla, Geha, 2003).

Representan un grupo heterogéneo que se caracteriza por la predisposición a enfermedades infecciosas,

autoinmunitarias y procesos cancerosos.

MANIFESTACIONES CLINICAS

Las inmunodeficiencias primarias se presentan fundamentalmente en forma de infecciones

recurrentes. Según el tipo de infección puede sospecharse la existencia de la deficiencia inmunitaria. Sin embargo,

las infecciones son sólo un elemento de orientación, ya que existe un buen número de casos intermedios y de

formas de difícil definición. La edad de aparición y la gravedad de las infecciones varía según el tipo de deficiencia,

se presentan con mayor frecuencia (60%) en lactantes o niños. En la tabla II se exponen las manifestaciones

clínicas para las inmunodeficiencias primarias según la frecuencia (Smith y col, 1999).

El tipo de infección identificado en los pacientes nos dan un indicio del tipo de defecto inmune.

Infecciones bacterianas recurrentes del sistema respiratorio están asociadas a defectos de células B. Por otro

lado, pacientes que presentan infecciones con Pneumocystis carinii ó microorganismos intracelulares puede tener

deficiencias de células T.

CLASIFICACION DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS El concepto de IDP y su desarrollo comienza con el descubrimiento de la agammaglobulinemia de

Bruton en 1952 (Bruton, 1952). A partir de entonces se inicia la investigación de estas enfermedades que

enseguida se relaciona con las anomalías de la ontogenia del sistema inmunitario. Desde 1950 a 1965 se

describen las IDP más características, sin embargo, el número de IDPs ha incrementado con el tiempo,

registrándose 34 formas en 1973, 66 en 1989 y cerca de un centenar en la actualidad (Stiehm, 1992).

Los desórdenes congénitos de la inmunidad son raros. Se han reportado muchas variedades de IDPs. En la

mayoría de los casos se trata de enfermedades hereditarias cuya clasificación sufre una revisión continua a

medida que se producen progresos en la inmunología. Sin embargo llama la atención comprobar que a pesar de

un mejor conocimiento y aplicación de sondas moleculares para la identificación de los genes, la mayor parte de

los déficit inmunitarios todavía se clasifican de acuerdo a sus manifestaciones clínicas y biológicas. 5

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La clasificación de las inmunodeficiencias primarias más actualizada está bajo la revisión de la Organización

Mundial de la salud. La última clasificación se publicó en 2003 y clasifica a las inmunodeficiencias conocidas en ocho grupos,

los cuales se mencionan en la tabla IV (Notarangelo y col, 2004).

INMUNODEFICIENCIAS PREDOMINANTEMENTE DE ANTICUERPOS

Las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos son las más comúnmente reportadas en

el mundo. Los trastornos causados varían desde la ausencia absoluta de todas las clases de anticuerpos hasta

estados de deficiencia selectiva de una sola clase o subclase. Todas estas inmunodeficiencias tienen un

diagnóstico temprano y tratamiento, con una etiología genética de deficiencia de anticuerpos como principal

característica.

Clásicamente los individuos con defectos humorales son divididos en dos grupos, los que tienen y los

que no tienen células B. Pacientes del primer grupo incluyen a individuos con inmunodeficiencia común variable

(CVID), deficiencia de IgA (IgAD), síndrome de hyper-IgM, defecto específico de las subclases de IgG y otros

desordenes (Conley y Cooper,1998).

El segundo grupo de individuos tienen un defecto en el desarrollo en el linfocito B y comprende

principalmente a la agammaglobulinemia de Bruton, ligada al cromosoma X (XLA) que se caracteriza por que

los pacientes presentan una hipoagammaglubulinemia severa y por que los números de linfocitos B presentes

en circulación se encuentran notablemente reducidos. También existe un grupo de individuos que tienen

agammaglobulinemia y defecto en el desarrollo de linfocito B y el patrón de herencia es autosomático

recesiva ( Igµ, Blnk, Igβ, Igα) (Grunebaum, 2001).

AGAMMAGLOBULINEMIA DE BRUTON

La primera descripción de enfermedad por inmunodeficiencia fue realizada por Ogden C. Bruton en

1952, a raíz de la incapacidad de un niño para producir anticuerpos. Dado que este defecto es heredado de forma

ligada al cromosoma X y se caracteriza por la ausencia de inmunglobulinas en suero (IgG menor de 200mg/dl, y

los valores de IgM, IgA se hallan muy bajos o ausentes) se denomina agammaglobulinemia de Bruton ligada al

cromosoma X (XLA) (Conley, 2001).

Los pacientes con XLA carecen de linfocitos B en la sangre, la médula ósea, el bazo o los ganglios

linfáticos. Los tejidos linfoides carecen de centros germinales. Hay una ausencia total de células plasmáticas en

ganglios linfáticos, el intestino, el bazo y otros tejidos en que se encuentran normalmente las células plasmáticas.

Las amígdalas de niños con XLA son muy pequeñas y esto constituye uno de los principales rasgos diagnósticos

de la enfermedad. En el suero no se detectan IgM, IgA, IgE. El nivel de IgG es inferior al 10% de lo normal (menos

de 50mg/dl). No se produce respuesta de anticuerpos específica posterior a la administración de algún antígeno

(Sorensen y Moore, 2000).

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La mayoría de los pacientes con XLA poseen linfocitos B precursores, pero muy pocos de estos se

desarrollan para convertirse en linfocitos B. Por lo tanto, el defecto sobresaliente en XLA es la imposibilidad de los

linfocitos B precursores para convertirse en células B maduras. Se sabe actualmente que el gen defectuoso en

XLA codifica una tirosina cinasa denominada Btk (tirosina cinasa de Bruton), que pertenece a la familia de las

TEC cinasas (Tsukada, 1994, Vetrie y col, 1993, Rawling y Witte, 1994), esta proteína se expresa en células

mieloides, así como en las células B. La función de estas enzimas es fosforilar residuos de tirosina presentes en

otras moléculas que participan en las vías de señalización de la célula que culminan en la activación de factores

nucleares. Btk se requiere para acoplar el receptor de la célula pre-B (formado por Igµ, cadena ligera sustituta,

Igα e Igβ) con los acontecimientos nucleares que conducen al crecimiento y diferenciación de las células pre-B. No

se sabe por que la ausencia de BTK ocasiona grave problemas exclusivamente a los linfocitos B, y quizás leves

en los neutrófilos (Satterhmaite y Witte, 2000). Por el contrario, el número y función de los linfocitos T es normal y

su respuesta frente a todo tipo de mitógenos es equivalente a la de los controles normales, aunque se ha

comprobado que existe un predominio de células Th1 sobre las Th2 en la respuesta inmunológica (Amedei y col,

2001).

Los pacientes con XLA presentan infecciones recurrentes por bacterias piógenas como neumococo,

estafilococo, estreptococo y Haemophilus. Además, son susceptibles a ciertas infecciones virales, como la

poliomielitis y a algunos parásitos intestinales como Giardia lamblia, lo que demuestra la importancia de los

anticuerpos en la inmunidad frente a estos microorganismos (Gaspar y Kinnon, 2001).

AGAMMAGLOBULIMENIA AUTOSOMICAS RECESIVAS

Se ha estimado que un 90% de pacientes con agammaglobulinemia y ausencia de células B tiene

anormalidades en BTK. Aproximadamente 10% de pacientes con infecciones bacterianas tempranas y

recurrentes y profunda hipoagammaglobulinemia y ausencia de linfocitos B son niñas. Esto sugiere que existen

desórdenes autosómicos recesivos que son indistinguibles de XLA. Estudios recientes muestran que un 10 % de

niños que se presume XLA no tienen mutaciones en BTK, y que presentan mutaciones en otros genes que

también resultan en la falla selectiva del desarrollo de la célula B (Conley, 2001) (Sorensen y Moore, 2000).

Dentro de estos defectos, la anormalidad más frecuentemente identificada es la mutación del gen de la cadena

pesada mu (µ) en el cromosoma 14. Las manifestaciones clínicas, en estos pacientes son idénticas a las

observadas en pacientes con defectos en BTK. Sin embargo tienden a desarrollar síntomas a más temprana edad

(4 meses) y estos síntomas son más severos (Grunebaum, 2001).

También se han reportado mutaciones en los genes que codifican para Igα (CD79 a) e Igβ (CD79b)

codificados por el gen mb-1 y B29 respectivamente, estas proteínas modulan la traducción de señales a través

del BCR y del pre-BCR. La médula ósea de estos pacientes presenta una reducción marcada de células CD19+

(células B 2%) comparados con individuos sanos (20%) además de un bloqueo en la transición de células de pro-

B a pre-B. La falla en el desarrollo de la célula B, tal vez sea la causa de que Igα mutada no se pueda escoltar a

la cadena pesada µ en la superficie celular por lo cual hay una perdida de capacidad de la señalización, esto lo

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sugiere dos modelos murinos. El ratón con Igα con deleción en el dominio citoplasmático y el ratón Knockout del

gen de Igβ (Grunebaum, 2001, Minegishi y col, 1998).

La cadena ligera sustituta, codificada por gen λ-like en humanos (el gen λ-5 en ratones) y el gen

VpreB, es expresado en las células B y es parte del complejo pre-BCR. Pacientes descritos con

agammaglobulinemia y mutación en el gen λ, sufren de otitis recurrentes como a los dos meses de edad y

desarrollan meningitis (por Heamophilus influenzae). Los Ratones con defectos en λ5 presentan un bloqueo en la

transición de pro-B a pre-B, pero algunas células pueden alcanzar el estado de madurez, se escapan al bloqueo y

se puede detectar células B que producen anticuerpo (Conley, 2001, Minegishi y col, 1998).

Recientemente se ha descrito pacientes con mutaciones en la proteína adaptadora Blnk en células B.

Los pacientes presentan en muy temprana edad sepsis con tardanza en el desarrollo. Los ratones deficientes en

esta proteína, exhiben un bloqueo incompleto en las células B con una severa inhibición en la diferenciación de

pro-B a pre-B. Con el tiempo una pequeña proporción de células B expresan IgM y se acumulan en el tejido

linfoide periférico, sin embargo, estás células fallan en la maduración y no responden a estímulos en su BCR

(Grunebaum, 2001, Minegishi y col, 1999).

DESARROLLO DEL LINFOCITO B EN MÉDULA ÓSEA El defecto básico de las agammaglobulinemia LX y AR es un defecto en la maduración de los

linfocitos B, lo que lleva a que los pacientes presenten una profunda deficiencia de anticuerpos (Nomura y col,

2000).

Durante los primeros estadios de diferenciación del linfocito B se determina su especificidad, esto

ocurre cuando el ADN que codifican las regiones variables de las inmunoglobulinas, se agrupan a partir de

segmentos génicos dando lugar a la expresión de un receptor de antígeno en la superficie de un linfocito B,

constituyendo esto un momento clave en su desarrollo, ya que a partir de entonces puede detectar ligandos que

se unen a su receptor (Delves y Roitt, 2002).

El desarrollo de las células B depende de las células estromales que se encuentran en médula ósea.

El estroma proporciona el soporte necesario para el desarrollo de las células B: forma contactos de adhesión

específicos con las células del linaje B en desarrollo mediante interacciones entre moléculas de adhesión celular

(CAM) y sus ligandos, y proporciona factores de crecimiento que estimulan la diferenciación y proliferación de los

linfocitos (Hardy y Hayakawa, 2001).

El crecimiento de la célula B temprana es estimulada por el factor de la célula madre (Stem cell

factor), citocina producida por las células estromales que interacciona con su receptor que es una tirosina cinasa y

se conoce como c-Kit. En etapas más tardías las células B requieren de la interlucina 7 (IL-7), el factor de

crecimiento de célula B (PBSF-SDF), entre otras.

Tanto en los humanos como en los ratones, el proceso de diferenciación de los linfocitos B se da en

etapas establecidas que están determinadas por pasos sucesivos en el reordenamiento de los genes del receptor

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de antígeno y la expresión de sus productos y cambios en la expresión de proteínas de superficie o intracelulares

(Hardy y Hayakawa, 2001).

Las células B más tempranas en el linaje B se conoce como células pro-B, se derivan de las células

madre hematopoyéticas pluripotenciales y se identifican por la aparición de proteínas de superficie características

(CD19, CD45R, CD10, CD34). El reordenamiento de los genes de la cadena pesada de inmunoglobulinas (Igµ)

comienza en las células pro-B temprana con la unión de los segmentos D y JH. Esto ocurre frecuentemente en

ambos alelos del locus de la cadena pesada, momento en que la célula se convierte en una célula pro-B tardía. La

célula procede entonces al reordenamiento de un segmento génico VH ala secuencia DJH. (Akashi y col, 2000).

El reordenamiento de los genes de las inmunoglobulinas depende las proteínas RAG-1 y RAG-2

(Genes activadores de recombinación). El dímero RAG-1 y RAG-2 es un componente de la recombinasa V (D) J,

que es muy activa en las etapas más tempranas del desarrollo de los linfocitos B. Después de que se han

completado los reordenamientos productivos en los primeros loci de la cadena pesada viene una supresión

temporal, así las proteínas RAG son inactivas durante la proliferación celular consecutiva a los primeros

reordenamientos, pero se sintetizan de nuevo cuando las células cesan de dividirse y continúan el reordenamiento

en el segundo locus (Akashi y col, 2000)

La enzima deoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), añade nucleótidos N en las uniones entre

segmentos génicos reordenados, se expresa en células pro-B, pero su expresión decae en el estadio pre-B,

cuando se ha completado el reordenamiento de la cadena pesada y comienza el de la cadena ligera ( Burrows y

Cooper, 1997).

El reordenamiento de VH a DJH se produce primero en un cromosoma. Un reordenamiento productivo

significa que se producen cadenas µ intactas, el reordenamiento cesa y la célula se diferencia a un estadio

conocido como pre-B, la cual, empieza a dividirse activamente. Este estadio se produce después de la expresión

del receptor de la células pre-B que se forman por la asociación entre una cadena pesada µ y dos proteínas

sintetizadas por las células pro-B, que se unen de forma no covalente para formar la cadena ligera sustituta, una

de estas se llama λ5 por su similitud con el dominio C de la cadena ligera λ, y la otra, llamada VpreB, recuerda el

dominio V de la cadena ligera, pero contiene una región terminal extra (Burrows y Cooper, 1997).

El pre-BCR está formado además de la molécula de inmunoglobulina, por otras dos cadenas

accesorias invariantes, conocidas como Igα e Igβ, las cuales, se encargan de la transducción de señales mediante

la interacción con tirosina cinasas a través de sus colas citoplasmáticas. Igα e Igβ se expresan desde el estadio

pro-B hasta su diferenciación a célula B madura. Así λ5, VpreB, la cadena µ y las cadenas Igα e Igβ forman el

complejo receptor pre-B, que estructuralmente se parece al receptor B maduro (figura 2)(Niiro y Clark, 2002).

Las células pre-B grandes entran en varios ciclos de proliferación celular, expandiéndose así la

población de células que tuvieron rearreglos génicos productivos antes de convertirse en el siguiente estadio:

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células pre-B pequeñas, estadio en el cual inicia el reordenamiento de los genes de la cadena ligera (Loffert y col,

1996).

Los reordenamientos en el locus de la cadena ligera se producen en un solo alelo cada vez. El locus

de la cadena κ se ordena antes que el locus de la cadena λ. Las probabilidades de generar eventual una

cadena ligera intacta se ven incrementadas por el potencial de realizar múltiples reordenamientos sucesivos en

cada alelo y por la probabilidad de obtener un reordenamiento productivo en uno de los loci de la cadena ligera.

Una vez obtenido un reordenamiento productivo de los genes de la cadena ligera, las cadenas se

sintetizan y combinan con las cadenas pesadas para formar IgM, la cual, aparece en la superficie celular junto con

Igα e Igβ para formar el un receptor funcional en la célula B. La mayoría de las células que alcanzan el estadio

pre-B consiguen generar progenie que expresan moléculas de IgM intactas y que se pueden clasificar como

células inmaduras (figura 1)(LeBien, 2000).

Hasta este punto, todo el desarrollo se produce en la médula ósea y es independiente de antígeno.

En este momento, las células B inmaduras se someten a selección para tolerancia a lo propio y a la capacidad de

supervivencia en los tejidos linfoides periféricos. Las células B que sobreviven en la periferia experimentan una

diferenciación adicional para convertirse en células B maduras o naive, que expresan IgD además de IgM. Estas

células recirculan en los tejido linfoides secundarios, donde pueden encontrar el antígeno extraño apropiado y ser

activadas (LeBien, 2000).

DESARROLLO DEL LINFOCITO B EN ORGANOS LINFOIDES PERIFÉRICOS.

Cuando la célula B inmadura sale de médula ósea, migra a través del torrente circulatorio hacia el

bazo, en donde forman folículos primarios. Estas células, aún inmaduras, pueden encontrar su antígeno y

activarse y proliferar o irse a apoptosis, dependiendo de la intensidad de estímulo (Hardy y Hayakawa,2001).

Cuando las células B se activan por una señal adecuada proliferan formando lo que se conoce como

reacción de centro germinal, en donde ocurre la maduración de la afinidad de las moléculas de inmunoglobulinas,

un fenómeno que se sabe, ocurre gracias a una mutación en los genes que codifican para las regiones variables

de las inmunoglobulinas, al cual se le conoce como hipermutación somática (Burrows y Cooper, 1997, Le Bien,

2000).

Cuando la célula B se activa y se divide, sus células hijas no recuperan la capacidad de rearreglo

V/D/J sino más bien continúan expresando genes rearreglados, algunas experimentan diferenciación y se

convierten en células plasmáticas, las cuales secretan grandes cantidades de Inmunoglobulinas (Arpin y col,

1995). Típicamente, el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa requiere de una semana para la producción

de anticuerpos monoespecíficos de alta afinidad, primero IgM y después del cambio de switch de tipo IgG. La

mayoría de las células B dentro de una clona en proliferación que no se diferencian a células plasmáticas,

revierten al estado de reposo para convertirse en células B de memoria, las cuales no se dividen y viven mucho

tiempo. Esta población se encuentra en sangre, amígdalas y ganglios linfáticos (Arpin y col, 1995).

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El análisis de células B en la médula ósea y tejidos linfoides secundarios nos revelan un gran rango

de subpoblaciones de la célula B por sus diferentes marcadores de superficie. Análisis de subpoblaciones de

células B en sangre periférica concluyen que existe 60% de células naive y 40% de células B de memoria (Klein y

col, 1997).

Unos estudios sugieren que la organización funcional de los compartimientos de la célula B es muy

similar en el ratón y el hombre. En el humano las células B transicionales migran de la médula ósea al bazo y se

desarrollan como células maduras (Ghia y col, 1998). En la médula ósea del humano, los diferentes estadios en

desarrollo de la célula B se identifica basado en la expresión de marcadores de superficie y en la caracterización

de los rearreglos de la cadena pesada y ligera de las inmunoglobulinas. Así mismo en los tejidos periféricos las

células maduras y las células de memoria se pueden diferenciar por sus marcadores de superficie y definir las

subpoblaciones de células B (Bohnhorts y col, 2001).

En los tejidos linfoides secundarios y en sangre periférica, CD38 e IgD pueden ser utilizados para

clasificar los estados de desarrollo importantes desde las células naive hasta célula de memoria (Bm1-Bm5)

(Pascual y col, 1994, Carsetti y Rosado, 2004). El CD38 es una proteína de superficie que se expresa en los

estadios tempranos del desarrollo de la célula B, deja de expresarse en células B inmaduras, pero en células B

activadas comienza a expresarse nuevamente, para nulificar su expresión en células B de memoria pero seguir

expresándose en células plasmáticas (figura 1) (Conley, 2001). Por eso el CD38 junto la IgD pueden clasificar en

subpoblaciones a las células B de memoria.

Así mismo, la expresión de los marcadores característicos de las célula B CD19+ ( CD10, CD44,

CD77, CD23, IgM) en estados de célula naive a célula de memoria se van a expresar selectivamente en las

subpoblaciones de células B (Bm1-Bm5) (Bohnhorts y col, 2001).

VIA DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES MEDIADA POR EL BCR

En el desarrollo y activación de la célula B es importante el complejo BCR y Pre-BCR. Las cadenas

pesadas y ligeras confieren la capacidad a la célula B de reorganizar un antígeno específico y las células de

membrana Igα y Igβ tienen dominios citoplasmáticos con ITAM (motivos de activación de inmunoreceptor

basados en tirosina) en la cual se llevan la transducción de señales de activación (Kurosaki, 1999).

Los primeros eventos que ocurren en el linfocito B después de que su receptor (BCR) interactúa con

su antígeno son: las tirosinas de los ITAM se fosforilan a través de unas tirocinasas de la familia Src asociadas al

receptor Blk, Fyn o Lyn. La fosfatasa CD45 puede eliminar un fosfato de inhibición de estas cinasas, permitiendo

así un aumento en su activación. Luego Syk se une a los ITAM fosforilados de la cadena Igβ. Dado que existen al

menos dos complejos de BCR en cada grupo, las proteínas Syk se unen y quedan muy próximas, de forma que

pueden activarse por transforforilación, e iniciar así la señalización (figura 4 A).

El proceso de activación de Btk es iniciado por la fosforilación de la tirosina 551 (Tyr551) en el

dominio cinasa de BTK por una cinasa de la familia Src (Lyn), después Btk se autofosforila en la tirosina 223

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(Tyr223) en el dominio SH3 (figura 4 B). Btk es entonces reclutado en la membrana celular, el dominio PH se

asocia a PIP3. Syk por su parte fosforila a la proteína adaptadora Blnk , que ayuda a reclutar a fosfolipasa γ2

(PLC-γ2) a la membrana cerca del complejo Syk-BLNK-Btk y facilitar la fosforilación y subsiguiente activación de

PLCγ2 (figura 4C) (Kurosaki, 1999).

El PLCγ2 corta fosfolípidos de la membrana el fosfatidil inositol bifosfato (PIP2) para generar

diacilglicerol (DAG) e inositol trisfosfato (IP3)( figura 4 D). Se inician dos vías de señalización al núcleo. IP3 libera

calcio de fuentes intracelulares y extracelulares, y se activan enzimas dependientes de calcio, mientras que DAG

activa a la proteincinasa C con la ayuda de Ca2+.(Liu y col, 1998)

El mecanismo a través del cual Btk interacciona con PLCγ2 empieza a definirse, y claramente vemos

que Btk participa en la cascada de señalización responsable de la movilización de calcio, que inician diversos tipos

de eventos transcripcionales y respuestas de proliferación y apoptosis (Niiro y Clark, 2002 y Kurosaki, 2002).

El gen de Btk esta localizado en el brazo largo del cromosoma X en Xq21.3. el gen humano tiene

37.5 kb, esta organizado en 19 exones. Esta proteína muestra una secuencia de aminoácidos (a. a.) altamente

homóloga a los miembros de la familia Src de tirosinas cinasas citoplasmáticas Fyn, Lck y Lyn que fosforilan

residuos de tirosina, por lo que están involucradas en la transducción de señales en las células hematopoyéticas.

La proteína Btk presenta 4 dominios: SH1 (dominio cinasa), SH2, SH3 y PH (figura 3). Los dominios SH2 y SH3

están involucrados en el reconocimiento intermolecular y en la regulación de la actividad cinasa. El dominio SH2

medía la interacción con motivos peptídicos fosforilados en residuos de tirosinas de otras moléculas y el dominio

SH3 medía la interacción proteína a proteína con motivos ricos en prolina (Rawling y Witte 1995). El dominio de

homología a plekstrina (PH) es el sitio de activación por fosfatidilinositol fosfato, por las subunidades βγ de

proteínas G y de inhibición por proteína-cinasa C (PKC). El dominio de homología Tec su función propuesta es el

plegamiento intramolecular de Btk y la modulación de la actividad de Btk por medio de las cinasas Src. El dominio

cinasa (SH1) tiene la función de fosforilación de tirosinas (Rawlings y Witte, 1999 y Mao y col, 2001).

En los últimos años se ha visto que los pacientes con agammaglobulinemia y con números

reducidos de células B se identifican con un patrón de herencia ligado al cromosoma X con una proteína Btk

anormal, pero también existen pacientes de sexo femenino o masculino que indican que las mutaciones son

en otras proteínas que difieren del Btk, pero que presentan igual fenotipo. Las proteínas identificadas son de

la cadena λ-like y VpreB, la cadena pesada µ, Blnk e Igα. Para un mejor entendimiento del desarrollo de la

célula B se tiene que estudiar el rol de cada una de las proteínas implicadas las vías principales de

señalización que llevan a la diferenciación de la célula B (Grunebaum, 2001).

ANTECEDENTES

Los pacientes que se analizaron en este trabajo llenan los requisitos de una inmunodeficiencia

predominantemente de anticuerpos, esto basado en los hallazgos clínicos. En todos los pacientes las

manifestaciones de la enfermedad fueron a edades muy tempranas, entre los seis meses a 4 años de edad. Los

13

pacientes se hospitalizaban por infecciones bacterianas recurrentes del tracto respiratorio alto y bajo; y en algunos

casos neumonías ó infecciones por enterovirus. En el suero de los pacientes no se detectaron IgG, IgM e IgA. En

la exploración física no se les detecto amígdalas o eran muy pequeñas. En la historia familiar de la mayoría de los

pacientes existe un o varios parientes muertos a causa de infecciones recurrentes.

Una de las características principales de los pacientes con agammaglobulinemia LX y AR es la

ausencia ó un bajo número de células B en sangre periférica, por lo que es importante la determinación de las

poblaciones celulares en muestra de sangre periférica, en estos pacientes. Esto para caracterizar el grupo de

pacientes con presuntiva agammaglobulinemia de a cuerdo a su historial clínico. Es importante también la

determinación de la expresión de las proteínas implicadas con este defecto.; la proteína Btk para

agammaglobulinemia LX y Blnk, Igα e Igβ para Agammaglobulinemia AR, con el objeto de orientar la búsqueda de

los defectos moleculares en estos pacientes.

En el presente estudio presentamos los datos obtenidos de 16 pacientes que fueron diagnosticados,

de acuerdo a su historia clínica y sus niveles de inmunoglobulinas en suero, como agammaglobulinemia LX, el

análisis de las poblaciones celulares en sangre periférica indica que los 15 pacientes tienen agammaglobulinemia,

y el análisis de la expresión de la proteína Btk, realizada por Western blot, sugiere que esta podría ser la proteína

implicada en el defecto.

El análisis de un probable caso de agammaglobulinemia AR indica que el diagnóstico fue erróneo ya

que la población de células B de la paciente fue inclusive mayor que la población observada en los testigos sanos,

y el análisis de las células B por medio de los marcadores IgD y CD38 indican un probable defecto de maduración

a células de memoria.

Con un diagnóstico más preciso los pacientes serían candidatos para estudiar sus mutaciones por

medio de las técnicas de Biología Molecular, para futuras perspectivas.

JUSTIFICACIÓN

Es importante el estudio de las agammaglobulinemias para conocer el mecanismo de diferenciación

del linfocito B en humanos. Es necesario desarrollar metodologías que permitan la detección rápida de los casos y

además conocer el tipo de defecto que tienen los pacientes, lo que puede orientar al diagnóstico molecular

preciso.

HIPÓTESIS

Los defectos moleculares en pacientes con agammaglobulinemias conducen a modificaciones en la

expresión de proteínas y poblaciones celulares que son susceptibles de ser estudiadas por citometría de flujo y

western blot..

14

OBJETIVO GENERAL

Determinar el nivel de expresión de Btk de pacientes con agammaglobulinemia ligada al cromosoma

X, y de Igµ, Blnk, Igα y Igβ en células B de pacientes con agammaglobulinemia autosómica recesiva y determinar

en que estadio de desarrollo se encuentran las células B por medio de los CD38 e IgD.

OBJETIVOS PARTICULARES

• Caracterizar en cada paciente y sus madres poblaciones de leucocitos (CD45): linfocitos

B (CD19), linfocitos T (CD3, CD4, CD8), células NK (CD16+56) y monocitos CD14.

• Determinar la expresión de Btk en los pacientes con agammaglobulinemia.

• Determinar la expresión de Igµ, Blnk, Igα e Igβ en células B.

• Determinar en los pacientes que tengan CD19+ en que estado de madurez se encuentran

las células B, por medio de los marcadores IgD y CD38 en pacientes que se les haya detectado células B

en sangre periférica.

MATERIAL Y MÉTODOS.

Selección de pacientes:

Los pacientes que se incluyeron en este estudio, deben ser individuos que hayan padecido

infecciones recurrentes por microorganismos piógenos desde edades tempranas y que asistan de manera regular

al servicio de Inmunología del Instituto Nacional de Pediatría, de acuerdo con los criterios del instituto hayan sido

diagnosticados como agammaglobulinemia y que los padres hayan autorizado la realización del estudio.

Tinción Superficial:

Se obtuvieron una muestra de sangre periférica de todos los pacientes para realizar una tipificación

por citometría de flujo. Se realizaron tinciones para determinar las proporciones de diferentes poblaciones

celulares, para lo cual se emplearon 30 µl de sangre sin activar y se incubaron durante 20 minutos con 5µl de las

siguientes mezcla de anticuerpo: anti-CD45-FITC/ anti-CD14PE (Simultest LeucoGATE); anti-CD3-FITC/anti-

CD19-PE/anti-CD45PerCP; anti-CD4-FITC/anti-CD8-PE/antiCD3-PerCP; antiCD3-FITC/anti-Cd16+56-PE/anti-

CD45-PerCP (Becton-Dickinson). Después de la incubación, las muestras se trataron con 500 µl de solución de

15

lisis (Becton-Dickinson) durante 10 minutos y posteriormente se hicieron lavados con PBA, centrifugando a 1,200

rpm durante 5 minutos. Las células se fijaron con solución fijadora.

Adquisición y análisis:

Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente y en la oscuridad. Las muestras se

adquirieron en un FACScan y se analizaron con el programa WinMDI 2.8. En la mayoría de los casos se

adquirieron 10,000 eventos. El análisis y selección se detalla en la sección de resultados.

Se determinaron en proporciones y números absolutos, células T (CD3+), B (CD19+), NK

(CD16+56+), monocitos (CD14high, CD45high) y polimorfonucleares, (CD14low, CD45low). En el caso de los

pacientes con agammaglobulinemia, fueron seleccionados aquellos pacientes que presentaron valores normales

de células T, monocitos y polimorfonucleares y valores reducidos de células B, menos 2 %, con respecto a la

proporción de linfocitos totales seleccionados dentro de una región CD45high. Estos pacientes fueron seleccionaron

para análisis de Btk por western blot.

Las muestras en las que se detectaron una proporción mayor de 2% de células B en circulación, se

les realizó una segunda determinación y se detectó la expresión de Blnk por tinción intracelular y de Igµ, Igα e

Igβ, IgD y CD38 por tinción de superficie. Para determinar la expresión de Igµ, Igα y Igβ, las muestras se hizo

reaccionar con los anticuerpos y con anti-CD19, se analizó la expresión de estas moléculas en las células CD19+.

Se siguieron los pasos como en la tinción superficial.

Para realizar la tinción superficial de CD38 e IgD se emplearon 30 µl de sangre sin activar y se

incubaron durante 20 minutos con 5µl de CD38 e IgD (Becton-Dickinson) Después de la incubación, las muestras

se trataron con 500 µl de solución de lisis (Becton-Dickinson) durante 10 minutos y posteriormente se agregaron

los anticuerpos secundarios para CD38 fue anti-IgG1 murino PE una dilución 1:700 y para IgD anti-IgG3 murino

FITC una dilución 1:500, las células se incubaron durante 20 minutos y posteriormente se hicieron lavados con

PBA, centrifugando a 1,200 rpm durante 5 minutos. Las células se fijaron con solución fijadora.

Tinción Intracelular:

La determinación intracelular de Blnk se realizó de la siguiente manera: 30µl muestras se pusieron se

incubaron durante 20 minutos con 5µl de anti-CD19-PerCP para Blnk, posteriormente se adicionó 500 µl de

solución de lisis ( Becton-Dickinson) durante 10 minutos, se hicieron lavados con PBA y se centrifugó a 1,200

rpm durante 5 minutos, las células se permeabilizaron con 300µl de la solución permeabilizante ( Becton-

Dickinson) incubando durante 10 minutos. Después de eliminar el exceso de solución por centrifugación, se

adicionó 5 µl de anti-Blnk (Santa Fe) dilución 1:200. Las células se incubaron durante 30 minutos y posteriormente

se lavaron con PBA a 1,200 rpm durante 5 minutos. Después de decantar se le agregó el anticuerpo secundario

anti-IgG2a FITC dilución 1:50. Finalmente las células se fijaron con solución fijadora (paraformaldehído al 1%) y

se adquirieron en el citómetro de flujo FACScalibur, el análisis de expresión de Blnk se realizó en las células

CD19+ (linfocitos B).

16

Determinación de la Expresión de Btk por Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

Para determinar la expresión de Btk en los pacientes con XLA, se realizó una purificación de

leucocitos a partir de las muestras de sangre periférica. Para esto, las muestras se adicionaron sobre una

solución de percoll (Sigma) al 60.9% en una proporción 1:1 y se centrifugaron durante 30 minutos a 2500 rpm con

aceleración 0. El botón celular se lavó tres veces con PBS. Al finalizar los lavados, se eliminó todo el exceso de

PBS de los botones celulares para adicionar 300 µl de solución de lisis, los lisados celulares se incubaron a 4

grados centígrados durante 15 minutos y posteriormente se centrifugaron a 14000 rpm por 15 minutos. Una vez

obtenidos los lisados celulares, se realizó la determinación de la concentración de proteína empleando un equipo

comercial (Bio Rad) (ver anexo). Se hizo el cálculo para conocer el volumen en el que se tiene 40 µg de proteína

de cada muestra y el volumen así requerido se mezcló con buffer de carga 6x y se trataron en condiciones

reductoras empleando β-mercaptoetanol al 5%. Una vez preparadas las muestras, se realizó la electroforesis en

geles de poliacrilamida al 12% cargando 40 µg de proteína en cada carril. La electroforesis se corrió a 100V. Las

proteínas separadas en los geles de poliacrilamida se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond

– ECL, Amersham) a 130 volts durante 1.5 horas de baño en hielo. Las membranas se tiñeron con solución Rojo

de Ponceau y se bloquearon 1 hora con una solución de leche al 5% en TBS en agitación lenta y a temperatura

ambiente.

Las proteínas se revelaron por el siguiente método. A las membranas se les adicionó el primer

anticuerpo, anti-Btk policlonal (Pharmigen)en una dilución 1:1000 ó anti-β-actina MoAb en una dilución 1:5000, se

incubaron de 1hr a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo con el primer anticuerpo, las membranas se

lavaron 3 veces por diez minutos con TBS adicionado con Tween 20 al 0.1% y leche descremada al 1%. Las

membranas se incubaron con el anticuerpo secundario, anti –Rabbit-HRP (Dako) en una dilución 1:4000 ó anti-

mouse (Zymax) en una dilución 1:8000, de 1hr a temperatura ambiente. Transcurrido ese tiempo, se lavaron otras

tres veces con TBS-Tween 20 al 0.1% por diez minutos y se revelaron por quimioluminiscencia (ECL-Amersham)

usando placas fotográficas (Konica Medical Film AX).

RESULTADOS

1.- Análisis de poblaciones de leucocitos.

Se determinó la proporción de las poblaciones celulares en sangre periférica, tanto en los pacientes

como en sus madres y en donadores sanos, empleando una doble tinción con anti-CD45-FITC y anti-CD14-PE:

R3

R2R1

CD14

R3

R2 R1

TESTIGO PACIENTE

CD45

Figura 1. Análisis de las poblaciones celulares en sangre periférica. La mezcla de anticuerpos empleada fue:

anti-CD45-FITC/CD14-PE. Se muestra las gráficas de punto CD45-FITC vs CD14. Tomada de la población de

leucocitos R2: población de polimorfonucleares (PMN), R3: población de monocitos y R1: población de linfocitos.

Con base en los resultados obtenidos en estas gráficas de punto de la figura 6 y con el dato de

números de leucocitos por mm3 de sangre determinado en cámara de Neubawer se pudo calcular el número

absoluto de cada una de las poblaciones leucocitarias de sangre periférica por medio de la siguiente fórmula:

Número de Linfocitos, monocitos o polimorfonucleares/ mm3

% de linfocitos, monocitos o polimorfonucleares (R1, R2 o R3)

Número deleucocitos/mm3

100

17

18

Los datos de leucocitos,, polimorfonucleares y linfocitos /mm3 obtenidos se muestran en las tablas II

y IIII se grafican en la figura 7.

Tabla II. Valores absolutos de leucocitos, PMN, linfocitos y monocitos de los donadores sanos de este estudio.

Sólo a los testigos se calculó la media y desviación estándar (tabla XV) y en los pacientes no.

# EDAD Leucocitos mm3 PMN mm3 Linfocitos mm3 Monocitos mm3

1 2ª 13800 1863 9384 359 2 5ª 5100 2754 1581 173 3 7ª 6300 1134 4536 88 4 9ª 8700 2610 4524 157 5 10ª 4800 1200 3120 77 6 11ª 9500 665 5795 162 7 12ª 6000 2160 1920 720 8 10m 10600 1590 8215 175 9 10ª 7100 3763 2485 142

10 2ª 8866 1323 5098 133 11 2ª 6275 690 3451 63 12 7ª 7850 3218 3611 56 13 2ª 11500 1725 9085 230

Promedio 7860.07 1899.62 4831.15 195.00 DS 2830.28 958.99 2619.16 177.00

Tabla III. Valores absolutos de leucocitos, PMN, linfocitos y monocitos de los pacientes en este estudio.

# EDAD Leucocitos mm3 PMN mm3 Linfocitos mm3 Monocitos mm3

1 11ª 9900 6633 1386 1089 2 10ª 5600 1624 2464 224 3 4ª 9500 5035 3800 190 4 11ª 13000 4160 5460 780 5 4ª 11534 2307 5248 923 6 8ª 11300 4972 4407 599 7 6ª 10000 4600 4500 53 8 1 ½ª 8350 1002 5344 501 9 2ª 12800 2432 7808 755 10 6ª 7700 3927 2464 346 11 12ª 18800 10434 5358 526 12 10ª 16600 9462 4731 896 13 13ª 18700 8789 8415 879 14 3ª 33900 18645 7797 1305 15 17ª 15200 9424 4408 578 16 15ª 10050 5075 2412 804

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

leucocitos

leucocitos

neutrofilo

linfoc ito

s

monocitos

no. c

élul

as/m

m3

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

media testigopaciente 1paciente 2paciente 3paciente 4paciente 5paciente 6paciente 7paciente 8paciente 9paciente 10paciente 11paciente 12paciente 13paciente 14paciente 15paciente 16

Figura 2. Número de linfocitos, monocitos y polimorfonucleares por mm3 de sangre periférica. En los pacientes y muestra de testigos representada como media de testigo con desviación estándar de la tabla

XV.

19

2.- Análisis de las poblaciones de linfocitos T, linfocitos B y células NK.

Para realizar el análisis se llevaron a cabo tinciones triples, por un lado se realizaron tinciones con los anticuerpos anti-CD3-FITC/anti-CD19-PE/anti-CD45-PerCP y por otro lado se emplearon los anticuerpos anti-CD3-FITC/anti-CD16+56-PE/anti-CD45-PerCP. La proporción de las poblaciones de células B, T o NK se realizó

dentro de una región de células CD45+, como se muestra a continuación.

Testigo

SSC

CD45

Figura 3. Análisis de las poblaciones T ,B y NK topoblación se realizó sobre una región de células CD45+.

Paciente

mada de la región CD45. El análisis de cada

20

TESTIGO PACIENTE

(a)

CD19

CD3

CD3

b)

CD16+56

Figura 4. Análisis de las poblaciones T, B y NK. El análisis de cada población se realizó sobre una

región de células CD45+ (figura 8), a partir de la cuál se muestra la proporción de B (a) ,NK (b) y T (CD3) en (a) y

(b).

Los datos de células NK, linfocitos (CD3) y células B (CD19)/ mm3 son los siguientes:

21

22

Tabla IV. Valores absolutos de NK, CD3, CD19 de los donadores sanos de este estudio.

# EDAD NK mm3 CD3 mm3 CD19 mm3

1 2ª 694 4786 3472 2 5ª 332 1090 150 3 7ª 454 3220 748 4 9ª 814 2873 679 5 10ª 593 2090 468 6 11ª 243 3859 1565 7 12ª 40 1574 250 8 10m 821 5217 1643 9 10ª 472 1516 497

10 2ª 306 3248 1733 11 2ª 380 2243 656 12 7ª 722 2564 361 13 2ª 182 6087 1181

Promedio 465.62 3105.15 1031.00 DS 248.96 1522.87 908.99

Tabla V. Valores absolutos de NK, CD3 y CD19 de los pacientes de este estudio.

# EDAD NK mm3 CD3 mm3 CD19 mm3

1 11a 277 1178 0 2 10a 468 1873 12 3 4a 399 2470 912 4 11a 2020 3385 0 5 4a 262 5038 6 6 8a 1190 3085 0 7 6a 225 4275 0 8 1 1/2a 321 4810 5 9 2a 2030 6051 0 10 6a 517 2070 0 11 12a 482 3721 0 12 10a 804 3998 1 13 13a 1262 7405 0 14 3a 1988 5536 23 15 17a 1190 3218 7 16 15a 531 1930 0

Del mismo modo que en la figura 2, fue posible determinar en valores absolutos la cantidad de linfocitos T, B y

células NK en circulación, dichos resultados se muestran en la figura 5.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

NK CD3 CD190

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

media testigopaciente 1paciente 2paciente 3paciente 4paciente 5paciente 6paciente 7paciente 8paciente 9paciente 10paciente 11paciente 12paciente 13paciente 14paciente 15paciente 16

Figura 5. Números de linfocitos T (CD3+), B (CD19+) y células NK (CD16+56) por mm3 de sangre periférica. En los pacientes y el promedio de linfocitos de los testigos con desviación estándar (tabla XV).

23

3. – Análisis de linfocitos T CD4+ y CD8+

Para realizar este análisis se llevó a cabo una tinción triple con los anticuerpos anti-CD4-FITC/anti-

CD8-PE/anti-CD3-PerCP. Las proporciones de células CD4+ y CD8+ se determinaron dentro de una región de

células CD3+, como se muestra en la figura 11.

CD4

CD3+

Paciente Testigo

CD8

Figura 6. Porcentaje de células CD8+ y CD4+ en las muestras de los pacientes y de los testigos. Las gráficas que se muestran se realizaron dentro de una región CD3+

Los datos de los linfocitos CD4+ y CD8+ son los siguientes:

24

25

Tabla VI. Valores absolutos de CD4 y CD8 de los donadores sanos de este estudio.

# EDAD CD4 mm3 CD8 mm3

1 2a 3398 1244 2 5a 501 403 3 7a 2254 805 4 9a 1494 1178 5 10a 1285 669 6 11a 2624 1042 7 12a 551 937 8 10m 3026 1930 9 10a 743 637 10 2a 1722 1466 11 2a 830 493 12 7a 1461 974 13 2a 4017 1583

Promedio 1838.92 1027.77 DS 1141.00 447.43

Tabla VII. Valores absolutos de CD4 y CD8 de los pacientes de este estudio.

# EDAD CD4 mm3 CD8 mm3 1 11a 660 459 2 10a 1086 711 3 4a 1828 568 4 11a 1930 1286 5 4a 3023 1763 6 8a 1697 1172 7 6a 3249 727 8 1 1/2a 2886 1635 9 2a 1815 2995 10 6a 745 1180 11 12a 1500 2513 12 10a 1919 1794 13 13a 2740 4221 14 3a 2906 1794 15 17a 1255 1834 16 15a 1255 531

De igual manera que en gráficas anteriores, se determinaron los números de células CD4+ y CD8+

por mm3 a partir del número de linfocitos T CD3+ por mm3 que se observa en la figura 5. Estos resultados se

muestran en la figura 12.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

cd4 CD4 CD8

no. d

e cé

lula

s /m

m3

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

media testigopaciente 1paciente 2paciente 3paciente 4paciente 5paciente 6paciente 7paciente 8paciente 9paciente 10paciente 11paciente 12paciente 13paciente 14paciente 15paciente 16

Figura 7. Número de células T CD4+ y CD8+ por mm3 en sangre periférica. En los pacientes

como el promedio de los testigos y desviación estándar (tabla XV).

26

4.- Análisis de poblaciones celulares en madres de los pacientes con agammaglobulinemia.

Se determinó la proporción de las poblaciones celulares de las madres de los pacientes en sangre

periférica de la misma manera que con los pacientes con agammaglobulinemia y comparándolas con testigos

adultos. Los datos del número de Leucocitos, linfocitos, monocitos, NK, células B, CD4+ y CD8+/ mm3 con los

siguientes:

Tabla VIII. Valores absolutos de leucocitos, PMN, linfocitos, monocitos y NK de las madres de los pacientes de

este estudio.

leucocitos Neutrofilos linfocitos monocitos NK Promedio de testigos n=10 7662 3384 2952 314 548

M 1 10000 4700 4600 420 1334 M 2 4400 1804 2332 57 560 M 4 10000 2900 6200 500 1426 M 6 6700 3216 2479 362 868 M 7 13900 6116 5828 570 1751 M 8 6350 2413 2794 292 657 M 9 7100 3550 2556 327 613

M 10 7100 2556 3621 348 760 M 11 8300 2988 4067 249 813 M 12 7200 3096 3312 274 497 M 13 6100 2623 2623 293 551 M 14 6600 2574 2772 185 249 M 15 5500 2145 2475 149 470 M 16 7950 3578 2306 262 334

27

Tabla IX. Valores absolutos de CD3, CD4, CD8 y CD19 de las madres de los pacientes de este estudio.

CD3 CD4 CD8 CD19

Promedio de testigos n=10 1973 1218 640

520 M 1 3266 2449 686 368 M 2 1819 800 964 280 M 4 4350 2734 1432 564 M 6 1735 798 486 198 M 7 3678 1214 1060 701 M 8 1984 1341 1089 419 M 9 1968 708 561 230 M 10 2861 1259 973 326 M 11 2928 1464 1376 447 M 12 2186 831 670 530 M 13 1967 767 688 656 M 14 2024 728 648 499 M 15 1782 677 552 272 16 1937 1791 531 120

28

De igual manera que en gráficas anteriores, se determinaron los números de leucocitos por mm3 a

partir del número de estos se determinaron linfocitos, polimorfonucleares y monocitos por mm3 que se observa en

la figura 2. Estos resultados se muestran en la figura 8.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

l

leuco

citos

neutr

ofilos

linfoc

itos

monoc

itos

no. d

e cé

lula

s po

mm

3

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000 media testigo

mama de pac 1

mama de pac 2

mama de pac 4

mama de pac 6

mama de pac 7

mama de pac 8

mama de pac 9

mama de pac 10

mama de pac 11

mama de pac 12

mama de pac 13

mama de pac 14

mama de pac 15

mama de pac 16

Figura 8. Número de linfocitos, monocitos y polimorfonucleares por mm3 de sangre periférica de las madres de los pacientes. También de los testigos adultos representada como media de testigo (n = 10)

y desviación estándar (tabla XV).

29

Del mismo modo que en la figura 8, fue posible determinar en valores absolutos la cantidad de

linfocitos T, B y células NK en circulación, dichos resultados se muestran en la figura 9 .

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

l NK CD3 CD19

no. d

e cé

lula

s/m

m3

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

media testigomama de pac 1mama de pac 2 mama de pac 4mama de pac 6mama de pac 7mama de pac 8mama de pac 9mama de pac 10mama de pac 11mama de pac 12mama de pac 13mama de pac 14mama de pac 15mama de pac 16

Figura 9. Números de linfocitos T (CD3+), B (CD19+) y células NK (CD16+56) por mm3 de sangre periférica de las madres de los pacientes. Y el promedio de linfocitos de los testigos y desviación

estándar (tabla XV).

30

De igual manera que en gráficas anteriores, se determinaron los números de células CD4+ y CD8+

por mm3 a partir del número de linfocitos T CD3+ por mm3 que se observa en la figura 10 . Estos resultados se

muestran en la figura 15.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

l CD4 CD8

no. d

e cé

lula

s/m

m3

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

media testigomama de pac 1mama de pac 2 mama de pac 4mama de pac 6mama de pac 7mama de pac 8mama de pac 9mama de pac 10mama de pac 11mama de pac 12mama de pac 13mama de pac 14mama de pac 15mama de pac 16

Figura 10. Número de células T CD4+ y CD8+ por mm3 en sangre periférica de las madres de los pacientes,

y el promedio de los testigos con desviación estándar .

31

5. Análisis de la expresión de la BTK en pacientes con XLA.

Se realizó un análisis de la expresión de Btk en un lisado de células de 7 pacientes y dos controles.

La expresión de Btk y β-actina fueron analizadas por Western blot.

BTK

β-ACTINA

Figura 11. Detención de la expresión de Btk por Western Blott. Las proteínas analizadas de lisados de + 107

células monoclonales de 7 pacientes con agammaglobulinemia (p) y dos testigos (t) usando anticuerpos

monoclonales anti-Btk o anti-β-actina. Los testigos expresan la proteína Btk ( 77 kD), mientras que en los

pacientes existe ausencia de la expresión de Btk, solo en el paciente 10 se observó una banda pero + 85 kD.

32

agammaglobulinemia pero con linfocitos B). Se realizó el análisis de expresión de IgM, IgD, Igα, Igβ y Blnk

Figura 12. El análisis se realizó en la regi

6.- Análisis de la expresión de IgM, IgD, y BLNK en el paciente 3 (niña con

en linfocitos B, para lo cuál se hizo una región en la pobl

granularidad y después se realizó un histograma para

respectivamente. Estos resultados se presentan en la fig

19(BLNK).

a)

c) b)

IgM e IgD:

IgM O IgD

CONTROL DE ISOTIPO

S

S

IgM IMF= 118

TESTIGO NIÑA DE 4 AÑO

PACIENTE 3 : NIÑA DE 4 AÑO

33

ón CD19+(a). Expresión de IgD (b) e IgM (c) en IMF.

ación de CD19+ en una gráfica de puntos de CD19 contra

determinar la expresión de IgM, IgD, Igα, Igβ y Blnk

ura 17 (IgM e IgD), en la figura 18 (Igα, Igβ) y en la figura

34

Figura 13. Expresión de (a) Igβ e (b) Igα medida en IMF.

Igα, Igβ:

IMF= 305 IgALFA IMF= 59

a) b)

Testigo niño 8 años

Paciente 3: niña 4 años

CO

Ig ALFA ó Ig BETA

NTROL DE ISOTIPO

BLNK:

Testigo niña de 13 años

Blnk IMF = 25

IsoBlnk IMF= 10

Testigo adulto

Blnk IMF = 145

IsoBlnk IMF= 7

Paciente 3: niña de 4 años

Blnk IMF = 80

IsoBlnk IMF= 7

Figura 14. Expresión de Blnk medida en IMF.

7. Análisis de la expresión de CD38 e IgD en el paciente 3 para determinar subpoblaciones de

células B.

35

Se realizó el análisis de expresión de CD38 e IgD en linfocitos B, para lo cuál se hizo una región en

la población de CD19+ en una gráfica de puntos de CD19 contra granularidad y después se realizó una grafica por

puntos de densidad para determinar la expresión de CD38 e IgD. Estos resultados se presentan en la figura 20.

SSC

CD19

IgD

CD38

Testigo varón, 2

9.75%

46.01%

15.53%7.47%

5.2%

18.28%

a)

b)

36

CD38

8.

5.6

12.

c)

IgD Pacien

13.3

0.96

3.26

IgD

CD38

Figura 15. Expresión de subpoblaciones de células B en sang

determinó la expresión de CD38 e IgD en los testigos b) y c), y en e

Testigo niña,5 años

15.04%

44.67%

52% 13.47%

5%

86%

te niña, 4 años

47.5%

29.39% 8%

%

d)

6.39% %

re periférica. En la región de células B a), se

l paciente d).

37

38

DISCUSIÓN

Las agammaglobulinemias LX y AR son unas inmunodeficiencias primarias que se caracterizan por

una profunda hipogammaglobulinemia y defecto en el desarrollo de células B y por lo tanto un decremento del

número de células B maduras en sangre periférica.

En el presente trabajo se hizo una comparación de las poblaciones celulares de los pacientes con

donadores niños y también se comparó las poblaciones de las madres de los pacientes con donadores adultos.

Con los datos de número absolutos de células; leucocitos, polimorfonucleares, linfocitos, monocitos, NK, CD3,

CD4, CD8 y CD19 de los testigos niños como de los testigos adultos se determinaron dos grupos de medias

(niños y adultos) y se calculo desviación estándar para sacar el rango (tabla XV), que pudiera servir para comparar

tanto el número absoluto de leucocitos de los pacientes con los testigos niños, como las madres de los pacientes

con los testigos adultos.

El análisis de las poblaciones celulares en nuestros pacientes, mostró que la mayoría de estos

presentaron números incrementados de todas las poblaciones analizadas, observamos que en cuanto a las

poblaciones de polimorfonucleares, linfocitos y monocitos, el 75%, 17% y 75%, (respectivamente) de los

pacientes, presentaron cuentas celulares que sobrepasaban el limite mayor de los valores de referencia

calculados para este estudio (tabla XVI), de igual manera para las células CD3, CD4, CD8 y los linfocitos NK

presentaron el 29.4%, 12%, 50%, y 37.5 (respectivamente) .Con respecto a las células B, 15 de los 16

pacientes presentaron niveles muy bajos de esta población celular, cumpliendo así una de las características

conocidas para los pacientes con agammaglobulinemia XL (Gaspar y Kinnon, 2001), por otro lado, uno de

estos pacientes presentó niveles de CD19 incluso mayores a los valores de referencia, lo cual descarta la

posibilidad de que esta paciente curse con agammaglobulinemia AR, ya que hasta la fecha no existen reportes

al respecto.

En las madres de los pacientes en la cuenta total de leucocitos un 14.3% se sale del límite del rango

mayor, en polimorfonucleares 7%, en linfocitos 0%, en monocitos 14%, en NK 21%, en CD3 29%, en CD4 21%,

en CD8 36% y en CD19 36%. Mientras que sólo en CD8 un 7% se sale del límite del rango menor. Con estos

datos presentados podemos concluir que el porcentaje global de los pacientes que entran en el rango normal es

de 46.92% mientras que el porcentaje en las madres de los pacientes que entran en el rango normal es de

79.4%.

Los pacientes en su mayoría salen de los límites del rango mayor, excepto en CD19. Este aumento

en la concentración de leucocitos en sangre periférica podría deberse a un mecanismo compensatorio por la falta

de linfocitos B. En las poblaciones celulares de CD4 y CD8 en donadores sanos existe una proporción, por lo

regular 1:2, por lo tanto, en la mayoría de las veces existe más expresión de CD4 que CD8 en sangre periférica.

39

En el análisis que se realizó de CD4 y CD8 en los testigos niños sólo existió un aumento de CD8 sobre CD4 en un

niño, igual pasó en una madre de un paciente. Pero en los pacientes se detectaron cinco pacientes que tenían

más expresión de CD8 y menos de CD4 en sangre periférica.

El 31.25% de los pacientes tienen invertida la relación 1:2 de CD4 y CD8. La explicación que le

damos a este fenómeno, es que podría deberse a que una función importante que tiene el linfocito B es que es

una célula presentadora de antígeno por medio de sus moléculas MHC clase II y tiene la capacidad de presentar

antígeno al linfocito T cooperador (CD4), al no existir las células B, aunque existan otras presentadoras ( fagocitos

y células dendríticas), el sistema no es completo y esto afectaría, en alguna medida, la presentación de antígeno a

las células CD4 y como consecuencia de esto, probablemente, es la manifestación de que no exista en algunos

pacientes la relación 1:2 normal entre CD4 y CD8.

Los resultados obtenidos por Western blot, realizado en los pacientes afectados, así como en un

grupo de controles sanos; muestra que la mayoría de los pacientes no expresan Btk (Figura 10), con excepción

del paciente 10 que expresa una banda con un peso molecular más alto que Btk. Existen varias explicaciones

posibles para lo observado, primero para explicar la ausencia de la expresión de la proteína BTK en los pacientes,

es obligado realizar un análisis de detección de mutaciones en el gen de BTK en los pacientes con XLA, para

tratar de realizar una correlación del fenotipo observado con el genotipo. A la fecha se han descrito más de 500

mutaciones en el gen de BTK, descritas en la base de datos: http//bioinf.ufa.fi/btkbase. Un tercio de estas

mutaciones se debe a la sustitución de aminoácidos, predominantemente en el dominio cinasa, pero también se

en todos los demás dominios excepto en SH3 (Vihinen y col, 1996, Lindvall y col, 2005). Mutaciones que crean un

codón de paro prematuro, deleciones e inserciones también se han descrito en todo el gen. La mayoría de las

mutaciones se encuentran en la región codificadora, alrededor del 12% de las mutaciones descritas se localizan

en sitios de splicing, sólo una mutación se encuentra en la región promotora, en donde se localizan secuencias

reguladoras del gen.

Cerca del 5 a 10% de las mutaciones resulta en una alteración gruesa del gen de Btk (Conley y

Cooper, 1998, Lindvall y col, 2005), que trae consigo la consecuencia en la expresión de la proteína Btk, y esto

puede deberse a las mutaciones sin sentido y deleciones que pueden inestabilizar al RNAm, o a la sustitución de

un aminoácido en el carboxilo terminal del RNAm ó una proteína inestable debido a deleciones que provoquen

que la proteína no adquiera una conformación tridimensional estable y se quede atrapada en retículo

endoplasmático, esto se va a notar en la falla para detectar proteínas de Btk mutado que no necesariamente

implica la ausencia de la proteína, ya que la proteína se podría encontrar en una muy baja cantidad que no puede

ser detectable por lo métodos utilizados. (Futatani y col, 1998). Por lo anterior, nuestros resultados podrían sugerir

que en nuestro grupo de pacientes están presentes mutaciones del tipo, tales como inserciones y deleciones que

pueden inestabilizar al RNAm, que provocan que no se logre un plegamiento adecuado de la proteína y por ende

no alcance la membrana plasmática, que trae como consecuencia que no se detecte la proteína debido a que no

existe una expresión de la proteína, observación corroborada debido a que en nuestros pacientes no detectamos

40

la proteína; este tipo de mutaciones ha sido descrito en otros genes donde una delecion provoca que la proteína

quede atrapada en el retículo endoplasmático y que no se detecte la proteína, como en el gen de la fibrosis

quistica; por otro lado es factible también que existan mutaciones del tipo que crean un codon de paro, que

conducen a una expresión nula de la proteína.

El análisis por citometría de flujo de las moléculas Blnk, Igα, Igβ, IgM e IgD se realizó al paciente 3 por

ser niña y por que su diagnóstico se dirigía hacia una agammaglobulinemia AR. Al realizarle el análisis de

leucocitos se verificó que la paciente contaba con CD19, en un porcentaje alto, pero sin embargo reporta una

profunda hipoagammaglobulinemia. Los resultados de los análisis fueron que expresan moléculas Blnk, Igα, Igβ,

IgM e IgD como los testigos con los que se comparo (figuras 11, 12 y 13). Con estos resultados se concluye que

aparentemente no hay defecto en estas moléculas que están involucradas en los estadios tempranos en el

desarrollo de la célula B.

Así mismo, también a la paciente 3 se le realizó el análisis para determinar el porcentaje de expresión

de CD38 e IgD para verificar en que estadio de desarrollo se encuentran las células B, este estudio también se

realizó por citometría de flujo (Bohnhorts y col, 2001); y los resultados se organizaron en una grafica de densidad

(figura 20), la cual se dividió en 6 compartimientos, que dividen alas subpoblaciones celulares como en el figura

21.

Los resultados mostraron que la paciente 3 (figura 20) tiene muy baja expresión en CD38- e IgD-, lo

que nos diría que la paciente no tiene células de memoria aunque si células maduras Bm1 a Bm4 ( Pascal V,

1994).

Para poder estudiar cual es el defecto que lleva a que el desarrollo de la célula B se detenga en la célula

madura y no pueda avanzar a célula de memoria., algunos estudios sugieren que los factores de transcripción

influyen en la diferenciación de la célula B por que regulan la expresión de numerosos genes específicos del linaje

(Reya y Grosschedl,1998). Estos estudios demuestran la compleja interacción y redundancia entre los factores de

transcripción que protegen los patrones precisos de la expresión de genes requeridos en la diferenciación normal

de la célula B.

Seguido de la expresión de la IgMs, las células B maduras migran a la periferia, expresan IgD y

comienzan a responder al antígeno. El encuentro con el antígeno induce cascadas de eventos de diferenciación,

lo cual resulta en proliferación, formación de células plasmáticas y secreción de inmunglobulinas. Trabajos

recientes identifican un número de factores de transcripción importantes para cada evento como Oct-2 (Corcocan

y col, 1993, Salas y Eckhardtl, 2003), OCA-B (Schubart y col, 1996, Quin y col, 1998) y Blimp-1 (Soro y col, 1999,

Reya y Grosschedl, 1998).

La tecnología de los ratones Knockout facilita el análisis del rol de estos factores de transcripción en

múltiples estados de desarrollo de las células. Por ejemplo en los ratones knockout de Oct-2 hay un decremento

41

del número de células IgM+ y existe una deficiencia en diferenciación a células plasmáticas y secreción de

inmunoglobulinas (Corcocan y col, 1993).

Para tratar de detectar el defecto que existe en la paciente 3 es importante hacer un análisis de

mutaciones de los factores de transcripción como OCA-B, Oct-2 y Blimp, que se han estudiado en ratones

Knockout y que se sabe llevan a un bloqueo en la diferenciación de células de memoria y células plasmáticas.

Por otro lado, se ha estudiado una molécula coestimuladora inducible (ICOS) de la familia de las

moléculas de células T coestimuladoras como CD28 y CTL-4 (Hutloff y col,1999). ICOS solo se expresa en células

T activadas y conduce a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, GM-CSF, TNFα y INF-γ pero también es superinductor de

IL-10. La expresión de ICOS se encuentra en células T de tejidos linfoides secundarios y en zonas de GC. Esta

expresión de citocinas inducida por ICOS es un punto importante para el rol de la interacción de ICOS-ICOS-L

mediada entre células T y la célula B y promueve la diferenciación terminal de las células B a células B de

memoria y células plasmáticas. Este hallazgo se encontró en el ratón knockout ICOS, y muestran un defecto en

formación de centros germinales e inapropiada respuesta inmune humoral (Salzer y col, 2004).

También se han identificado mutaciones de ICOS en pacientes con CVID (Salzer V, 2004). Por esta

razón, sería importante a la paciente 3 hacerle un análisis de mutaciones de la molécula ICOS, para determinar si

existe un defecto en ICOS que pudiera causar la enfermedad en esta paciente.

En conclusión, para entender el mecanismo preciso de la patogénesis de agammaglobulinemia LX y AR

y la relación genotipo-fenotipo, es importante conocer que tipo de mutación afecta a nuestro grupo de pacientes,

por lo que es imprescindible implementar la metodología para la detección de las mutaciones, en el gen BTK y los

genes de otras proteínas involucradas, esta metodología aunada a la citometría de flujo y al Western blot nos

permitirá ofrecer en un corto tiempo un diagnóstico temprano y certero, además de un tratamiento más eficaz; en

los pacientes con agammaglobulinemia.

CONCLUSIONES

Con la determinación de las subpoblaciones celulares junto con el diagnóstico clínico y las pruebas de

rutina del laboratorio se puede orientar el diagnóstico hacia una agammaglobulinemia.

En pacientes con agammaglobulinemia y <2% de células B, el western blot es una herramienta poderosa

que sirve para detectar la proteína intracelular Btk en lisados celulares.

. La capacidad semicuantitativa de los ensayos de citometría de flujo para detectar la expresión de la

proteína intracelular Blnk y superficiales de Igα e Igβ, IgM, CD38 e IgD contribuyen a entender la expresión

fenotípica de la enfermedad.

42

PRESPECTIVAS

Las técnicas de biología molecular junto con las técnicas usadas en este trabajo, nos aportarían

mucha información acerca del las fallas moleculares que existen en las agammaglobulinemias. Por lo tanto, es

importante implementar metodologías que ayuden a encontrar las mutaciones en estas enfermedades.

IMPACTO

El impacto de este proyecto es directamente en el sector salud. Con estos resultados ya se puede

implementar estas técnicas para el diagnóstico de las agammaglobulinemias congénitas y abre las puertas para

seguir desarrollando nuevas técnicas que mejoren considerablemente el diagnóstico oportuno y el tratamiento de

los pacientes con estos padecimientos.

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