inmunohistoquimica · se la clona hasta lograr una línea celular que produce exactamente el mismo...
TRANSCRIPT
INMUNOHISTOQUIMICA
Laboratorio de Inmunología Clínica
Facultad de Ciencias Químicas - UNA
INMUNOHISTOQUIMICA
Objetivo identificar Ag dentro
de un corte tisular.
Mediante la utilización de Anticuerpos
monoclonales o policlonales
específicos
La visualización de la reacción Ag-Ac se
logra mediante la marcación del
complejo con un segundo anticuerpo con un indicador, como una enzima.
PARA INMUNOHISTOQUIMICA SE
EMPLEAN
Anticuerpos policlonales Por inmunización del animal inoculado con
una molecula especifica purificada
(inmunogeno), que contiene el antígeno
frente al cual se pretende obtener Ac . El
animal produce diferentes clones de celulas
plasmáticas, cada una de las cuales es
capaz de producir anticuerpos frente a un
epitopo del antígeno. Reaccionan con
distintos epitopos del mismo antígeno.
PARA INMUNOHISTOQUIMICA SE
EMPLEAN
Anticuerpos monoclonales Por lo general se obtienen a partir del ratón, una vez
que se obtiene la respuesta inmune del animal, se
obtienen células B del ganglio o bazo. Las células que
secretan Ac apropiado, se fusionan con células del
mieloma, para formar un hibridoma que se mantiene
en cultivo, cuando el cultivo se desarrolla lo
susficiente, se toma una sola célula del hibridoma y
se la clona hasta lograr una línea celular que produce
exactamente el mismo Ac.
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Alta especificidad
Menor probabilidad de reacción cruzada
Poca variación de un lote a otro
Menor sensibilidad
Tinciones menos intensas.
ANTICUERPOS POLICLONALES
Alta sensibilidad
Presentan títulos más altos
Mayor posibilidad de experimentar reacciones cruzadas.
Obtención de cantidades limitadas
MATERIAL
Tejido congelado, suelen utilizarse para
marcadores linfocitarios, pues pueden
preservarse mejor los antígenos de
superficie.
Tejidos fijados e incluídos en parafina, la
fijación evita la difusión de Ag. celulares al
causar rigidez de las membranas.
Coágulos incluidos en parafina.
Tejido fresco
PASO CRÍTICO
•Frenar la autolisis
•Evitar la destruccion por bacterias
•Mantener la morfología.
Objetivos de la
fijacion
Los fijadores producen cambios constitucionales en la estructura del tejido.
FIJACION
FIJACION
El fijador de elección suele ser el formol tamponado cuando el material será incluído en parafina.
Los extendidos citológicos deben fijarse preferentemente con un fijador a base de acetona
PROCESAMIENTO DEL TEJIDO
Inclusión en parafina
Cortes de 3-5 um
Los mismos deben levantarse en
láminas silanizadas o cargadas
con polilisina.
Previo a la utilización deben
dejarse en estufa a 37C toda la
noche
ENMASCARAMIENTO DEL ANTIGENO
El formol actúa produciendo reticulación de proteínas mediante la formación de
uniones cruzadas por puentes de metilo entre los aminoácidos básicos de las
proteínas, lo que produce un enmascaramiento antigénico impidiendo
que el anticuerpo alcance el epítopo específico del Ag de interés, impidiendo
que se produzca la reacción Ag-Ac.
RECUPERACION ANTIGENICA
La perdida del acceso al epitopo inhabilita
al Ag. A reaccionar con el Ac.
La recuperación restaura la afinidad y la
avidez del antígeno para que pueda
reaccionar con el anticuerpo específico.
Recuperación por calor
Vaporera
Microondas
Olla a presión
Recuperación por digestión enzimática
Con enzimas proteolíticas como tripsina,
pepsina, proteinasa K, produce la ruptura
de los enlaces cruzados entre las
estructuras antigénicas, poniendo de
manifiesto los antígenos enmascarados por
la fijación. Este método presenta
complicaciones debido a que un exceso en el
tiempo de exposición a la enzima puede
producir una sobredigestión del tejido.
RECUPERACION ANTIGENICA
A FIN DE DEMOSTRAR IN VITRO LAS
REACCIONES AG – AC SE EMPLEAN
Inmunoquímica conjugada con
fluorocromo
Los anticuerpos conjugados con
fluorocromo se agregan a una
suspensión celular o corte tisular.
Isotiocianato de fluoresceína
Isotiocianato de
tetrametilrodamina
A FIN DE DEMOSTRAR IN VITRO LAS
REACCIONES AG – AC SE EMPLEAN
Inmunoquímica conjugada con enzimas
Los anticuerpos conjugados con enzima se
agregan a un corte tisular para formar un
complejo inmune que se colorea con el
agregado de un cromógeno y se visualiza
por microscopía óptica.
Peroxidasa
Fosfatasa alcalina
TECNICAS DE
INMUNOHISTOQUÍMICA
Procedimiento inmunoquímico directo
Procedimiento inmunoquímico indirecto
Dos pasos: Reacción entre un Ac primario no
conjugado y el Ag. Tisular. Posteriormente se
permite la reacción de un Ac secundario conjugado
(específico para el huésped y el tipo de Ac
secundario).
Tres pasos: Se liga un anticuerpo terciario
conjugado al anticuerpo secundario conjugado, a fin
de aumentar la cantidad de enzimas que
reaccionarán con el cromógeno y lograr una
reacción más intensa.
TECNICAS
INMUNOHISTOQUIMICAS
http://www.neurowikia.es
TECNICAS DE
INMUNOHISTOQUIMICA
Procedimiento con Ac no
marcado.
Implica el uso de una enzima soluble y el Ac. Específico
para ella. El complejo inmune de enzimas solubles y el Ac.
Primario deben ser del mismo húesped a fin de que el Ac secundario pueda ligarlos.
Immunohistochemical Staining Methods, Fourth Edition 2006 DAKO
TECNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA
Procedimiento con Ac.
Marcados
En la naturaleza la avidina (vitH) tiene gran afinidad por la biotina.
Por lo que la estreptavidina reacciona
con la biotina para formar un complejo que cuando
se emplea en procedimientos de tinción
inmunohistoquímica, produce una reacción Ag-
Ac fuerte y sensible.
Immunohistochemical Staining Methods, Fourth Edition 2006 DAKO
Estos métodos utilizan una tecnología única basada en una
cadena principal de polímero (dextran) en la que múltiples
anticuerpos y moléculas de enzima se conjugan. Esto
permite que todo el procedimiento de tinción
inmunohistoquímica de anticuerpo primario a la enzima,
se realice en un solo paso.
MÉTODO DE VISUALIZACIÓN
BASADO EN POLÍMERO
Immunohistochemical Staining Methods, Fourth Edition 2006 DAKO
CROMOGENOS FRECUENTEMENTE
EMPLEADOS
Para Peroxidasa de rábano picante
DAB (Diaminobencidina)
Color marrón oscuro con reacción granular
insoluble en alcohol.
AEC (Aminoetil carbazol)
Color rojo ladrillo soluble en alcohol, se decolora
con el tiempo.
Para Fosfatasa alcalina
Fucsina
Rojo permanente
CONTROLES
Positivos, negativos e internos. Son necesarios para:
•Validar resultados
•Evaluar el protocolo de trabajo
•Evaluar funcionamiento del reactivo
•Evaluar variacion inter·/ intraoperador
PROCEDIMIENTO GENERAL DE TINCION
CON PEROXIDASA
Desparafinado y rehidratación de los tejidos
Recuperación Antigénica
Bloqueo de la peroxidasa endógena
Lavado con Buffer
Incubación con Ac. Primario
Incubación con Ac. Secundario (linker biotinilado)
Incubación con complejo streptavidina-biotina-
peroxidasa
Colocación del Cromógeno
Lavado con Agua destilada
Contracoloración y montaje
RECEPTORES
DE ESTROGENO
RECEPTORES DE
PROGESTERONA
CEA EN ADENOCARCINOMA DE
COLON
c-erb-B2 EN Ca MAMA
DESMINA EN TUMORES DE
ORIGEN MUSCULAR
Epstein – Barr virus - LMP
Mieloperoxidasa -
LMA
P53 – AdenoCa.
Colon
IMPORTANCIA DE LA
INMUNOHISTOQUÍMICA
El uso de la inmunohistoquímica para
estudiar marcadores celulares permite
definir inmunofenotipos específicos y
provee de una importante
herramienta para el diagnóstico y la
predicción del pronóstico relativo al
estado de enfermedad y la biología de
la misma.
UTILIDAD Reconocimiento de marcadores de estirpe
celular
Identificación de agentes infecciosos
Detección de receptores hormonales, antígenos de proliferación y producto de oncogenes en neoplasias.
Porqué usar inmunohistoquímica en cáncer
Los protocolos de tratamiento son diferentes para los distintos tipos de tumores, de ahí la importancia de subclasificarlos.
LINFOMA DE HODGKIN
Neoplasia de tejido linfoide definida por la presencia de células malignas de Reed-Stemberg ( Células R-S).
Inmunohistoquímica en el LH: CD30 (Ki1): marcador de activación linfocitaria.
CD15: expresado en estadíos finales de la granulopoyesis, aunque no se limita a los granulocitos
CD20 y CD19: expresado en 40% de los casos en las células tumorales, en los tipos histológicos esclerosis nodular y celularidad mixta.
CD45 y CD20: expresado en LH del tipo histológico, predominio linfocítico nodular.
Fascin: expresado en el citoplasma de las células R-S se cree que este producto génico está involucrado en la formación de microfilamentos.
.