isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil …
TRANSCRIPT
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI
PENGHASIL BIOPOLIMER POLI (3-
HIDROKSIBUTIRAT) DARI SAMPEL TANAH DI
DAERAH TAMBANG BATUBARA,
BENGKULU UTARA
SKRIPSI
Oleh:
AZIMAH SOLEHA DRAJAT
NIM : 1604119
PROGRAM STUDI S1 FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PERINTIS INDONESIA
PADANG
2020
i
PERNYATAAN ORISINILITAS DAN PENYERAHAN HAK CIPTA
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama : Azimah Soleha Drajat
NIM : 1604119
Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Biopolimer Poli
(3-Hidroksibutirat) dari Sampel Tanah di Daerah Tambang
Batubara, Bengkulu Utara.
Dengan ini menyatakan bahwa:
1. Skripsi yang saya tulis merupakan hasil karya saya sendiri, terhindar dari
unsur plagirisme, dan data beserta seluruh isi skripsi tersebut adalah benar
adanya.
2. Saya menyatakan hak cipta dari skripsi tersebut ke Sekolah Tinggi Farmasi
Indonesia Perintis Padang untuk dapat dimanfaatkan dalam kepentingan
akademik.
Padang, 10 September 2020
Azimah Soleha Drajat
ii
Lembar Pengesahan Skripsi
Dengan ini dinyatakan bahwa :
Nama : Azimah Soleha Drajat
NIM : 1604119
Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Biopolimer Poli
(3-Hidroksibutirat) dari Sampel Tanah di Daerah Tambang
Batubara, Bengkulu Utara.
Telah diuji dan disetujui skripsinya sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) melalui ujian sarjana yang diadakan pada tanggal
10 September 2020 berdasarkan ketentuan yang berlaku
Ketua Sidang
Dr.apt.Eka Fitrianda, M.Farm
Pembimbing I Anggota Penguji I
Prof.Dr.apt.Akmal Djamaan, MS apt. Nessa, S.Farm, M.Biomed
Pembimbing II Anggota Penguji II
Epi Supri Wardi, M.Si apt. Noni Rahayu Putri, M.Farm
Mengetahui :
Ketua Program Studi S1 Farmasi
apt. Revi Yenti, M.Si
iii
PERSEMBAHAN
حِيْمِِ حْمَنِِ رَّ بِسْــــــــــــــــــمِِ اللِِ الرَّ
Sesungguhnya bersama kesulitan itu ada kemudahan maka apabila telah selesai
(dari suatu urusan) kerjakanlah dengan sesungguh-sungguh (urusan) yang lain
dan hanya kepada Tuhanlah hendaknya kamu berharap
(Qs. Al- Insyirah: 7,9)
Dan bahwasanya seorang manusia tiada memperoleh selain apa yang telah
diusahakannya
(QS. An Najm : 39)
Skripsi ini merupakan usaha dan doaku kepada Allah SWT, karena kepadaNya
aku menyembah dan kepadaNya aku memohon pertolongan. Alhamdulillah
dapat terselesaikan skripsi sederhana ini, walaupun perjuangan yang di lalui
penuh suka dan duka yang pada akhirnya dapat ku lewati, awal perjalanan
yang tidaklah mudah, semoga ini adalah langkah awal untuk meraih cita-
citaku.....
Teruntuk Ayahanda Jasman Bustami dan Ibunda tercinta Elnahayati,
terimakasih telah bersusah payah mendidik dan mengajarkan tentang arti
perjuangan, yang selalu memberikan motivasi berupa dukungan moril maupun
materil serta doa-doa yang selalu dipanjatkan dalam setiap sujud mereka. Salam
kasih dan sayang kuberikan untuk Papa dan Mama semoga Allah SWT
iv
membalas jasa-jasa Papa dan Mama baik rezeki di dunia maupun dengan
surga-surga yang indah dikemudian hari. Aamiin...
Teruntuk Kakak-kakakku dan Abang tercinta (Ridha Elvina, Milla Syukrina
Sari, Muhammad Lekki Fadhili) yang selalu mengingtakan agar dapat
menyelesaikan skripsi ini tepat pada waktunya, serta motivator terbesar dalam
hidup ku untuk dapat melanjutkan ke tahap pendidikan selanjutnya.
Terimakasih untuk untuk Kak Miftahul Jannah, Kak Rahmi Anova, Anggun
Pradita) yang memberikan saran, masukkan dan membantu selama penelitian
di Labor Biota Sumatera (LBS).
Untuk partner seperbimbinganku Wahyu Suci Wulandari terimakasih telah
mau mendengarkan keluh kesahku selama penelitian ini, semoga kita di
lancarkan untuk tahap selanjutnya. Aamiin.
And the last not least, angkatan 16 “Veren16en” yang tak bisa disebutkan
namanya satu persatu, terimakasih atas kebersamaan kita baik suka maupun
duka yang kita lalui bersama selama 4 tahun pertemanan kita ini.
Harapannya semoga kita bisa dapat wujudkan apa yang kita cita-cita. Aamiin
ya robbal’alamin...
v
By Azimah Soleha Drajat, S.Farm
KATA PENGANTAR
حِيْمِِ حْمَنِِ رَّ بِسْــــــــــــــــــمِِ اللِِ الرَّ
Alhamdulillahrabbil’alamin, segala puji dan syukur hanya kepada Allah
SWT yang telah memberikan rahmat dan hidayahNya kepada penulis sehingga
dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “ISOLASIِDANِKARAKTERISASI
BAKTERI PENGHASIL BIOPOLIMER POLI (3-HIDROKSIBUTIRAT)
DARIِSAMPELِTANAHِDIِDAERAHِTAMBANG,ِBENGKULUِUTARA”.
Skripsi ini diajukan untuk melengkapi tugas akhir dan merupakan salah
satu syarat untuk menyelesaikan program pendidikan sarjana strata satu pada
Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia Perintis Padang. Dalam melaksanakan
penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari doa dan dorongan yang di
berikan oleh orang tua, saudara-saudara, dan teman-teman seperjuangan. Maka
pada kesempatan kali ini penulis ingin menyampaikan penghargaan dan ucapan
terima kasih kepada:
1. Bapak Prof. apt. Elfi Sahlan Ben selaku Rektor Universitas Perintis
Indonesia.
2. Ibu Dr. apt. Eka Fitrianda, M.Farm selaku Dekan di Fakultas Farmasi
Universitas Perintis Indonesia.
3. Ibu apt. Revi Yenti, M.Si selaku Ka. Prodi S1 Farmasi Universitas
Perintis Indonesia.
4. Bapak Prof. Dr. apt. Akmal Djamaan, MS selaku pembimbing I dan ibu
Epi Supri Wardi, M.Si selaku pembimbing II yang telah meluangkan
vi
waktu, bimbingan, pikiran dan petunjuk untuk mengarah dan membimbing
penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.
5. Ibu apt. Hj. Diana Agustin, MM, M.Si selaku penasehat Akademik yang
telah memberi motivasi, nasehet dan bimbingan yang diberikan agar tetap
semangat dalam kuliah agar selesai dengan tepat waktu.
6. Bapak/Ibu dan seluruh civitas akademika Program Studi S1 Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Perintis Indonesia yang telah membantu
kelancaran studi dan aktivitas sebagai mahasiswa.
Terima kasih atas semua bantuan yang telah di berikan semoga Allah SWT
membalasNya untuk kita semua. Dalam penulisan skripsi ini, penulis menyadari
masih banyak terdapat kekurangan dalam penyusunan naskah ini. Oleh karena itu,
penulis menerima saran dan kritik yang bersifat membangun sehingga skripsi ini
menjadi lebih baik lagi dan dapat bermanfaat untuk pengetauan pada masa
mendatang.
Padang, 10 September 2020
Penulis
vii
ABSTRAK
Bakteri poli (3-hidroksibutirat) P(3HB) merupakan bakteri yang di dalam selnya
menyimpan granula-granula yang berguna untuk menyimpan cadangan makanan.
Bakteri ini di isolasi dari tanah tambang batubara karena tambang batubara
mengandung unsur karbon yang tinggi dan rendah unsur lainnya seperti nitrogen,
fosfat. PHB diakumulasi di dalam sel bakteri pada kondisi lingkungan kelebihan
karbon dan kekurangan unsur lainnya. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui
apakah terdapat bakteri penghasil P(3HB) pada tanah tambang batubara di
Bengkulu Utara. Dengan proses isolasi dilakukan menggunakan metode pour
plate dan di tanam pada media crude palm oil (CPO) bakto agar, kemudian di
skrining menggunakan Nile Blue A dan di amati di bawah sinar UV dengan
panjang gelombang 365 nm. Hasil isolasi didapatkan 30 isolat bakteri 4
diantaranya bakteri penghasil P(3HB) dengan kode sampel isolat tanah tambang
ITB : ITB 8, ITB 15, ITB 20, dan ITB 29. Hasil dari fermentasi di dapatkan
biomassa, kemudian di lakukan karakterisasi menggunakan alat spektroskopi
FTIR. Gugus fungsi yang terdapat pada bakteri penghasil P(3HB) diantaranya
adalah gugus C-H, C=O, dan C-O. Uji biokimia dari keempat isolat bakteri uji
memberikan hasil berupa positif katalase dan positif motilitas. Kesimpulan tanah
di daerah tambang batubara Bengkulu Utara dari 30 isolat bakteri 4 yang
menghasilkan bakteri biopolimer P(3HB) yang memiliki karakteristik yang sama
yaitu bentuk basil, Gram positif dan positif endospora.
Kata Kunci : Bioplastik, Poli (3-Hidroksibutirat), Tambang Batubara, FTIR.
viii
ABSTRACT
Poly (3-hydroxybutyrate) P(3HB) bacteria is bacteria stores granules in the cells
function as foodstorage. This bacteria are isolated from the soil of coal mines
because it is that caol mines cotain high carbon and low other elements such as
nitrogen and Phosphate. PHB is accumalated in bacterial cells under enviromental
conditions of excess carbon and other elements deficiency. The purpose of this
study was to gain P(3HB) bacteria from Bengkulu Utara coalmine.With prosess
this bacterium was isolated from the soil of the coalmine using the pour plate
method and planted in crude palm oil (CPO) bakto agar, then screened using Nile
Blue A and observed under UV light in 365 nm. 4 of 30 isolates with mine soil
isolate sample code ITB : ITB 8, ITB 15, ITB 20, and ITB 29 was detected as
P(3HB) bacteria, the result of fermented is obtained biomass, and characterized
using FTIR spectroscopy. The functional groups found in producing bacteria
P(3HB) include C-H, C = O, and C-O groups. Biochemical identification of four
isolates was showed from result of positive catalase and positive motility. The
conclusion of the soil in the Bengkulu Utara coal mining area from 30 bacterial
isolates 4 which produced biopolymer P(3HB) bacteria which had the same
characteristics, such as bacilli, Gram positive and endospores positive.
Keywords: Bioplastics, Poly (3-Hydroxybutyrate), Minecoal, FTIR.
ix
DAFTAR ISI
JUDUL ............................................................................................................ i
PERNYATAAN ORISINILITAS DAN PENYERAHAN HAK CIPTA .. ii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI .......................................................... iii
PERSEMBAHAN ........................................................................................... iv
KATA PENGANTAR .................................................................................... v
ABSTRAK ...................................................................................................... vi
ABSTRACK ................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ................................................................................................... viii
DAFTAR TABEL .......................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xi
BAB I. PENDAHULUAN .............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 4
1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 4
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 4
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 5
2.1 Profil Tanah Tambang Batubara ....................................................... 5
2.2 Bakteri .............................................................................................. 6
2.2.1 Definisi Bakteri ...................................................................... 6
2.2.2 Bentuk Bakteri ....................................................................... 6
2.2.3 Cara Mengidentifikasi Bakteri ............................................... 8
2.2.4 Faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri ............... 10
2.3 Bakteri Penghasil P(3HB) ................................................................ 13
2.4 Biopolimer ....................................................................................... 14
2.5 Bioplastik ......................................................................................... 15
2.6 Poli Hidroksialkanoat (PHA) ............................................................ 15
2.7 Poli (3-Hidroksibutirat) .................................................................... 16
2.8 Peranan P(3HB) di Dalam Sel Bakteri ............................................. 18
2.9 Sifat fisika Kimia P(3HB) ................................................................ 18
2.10 Media Pertumbuhan Bakteri P(3HB) .............................................. 19
2.11 Biosintesis PHA dan P(3HB) .......................................................... 19
2.12 Jalur Biosintesis P(3HB) Menggunakan CPO ................................ 20
2.13 Spektroskopi FT-IR ......................................................................... 21
BAB III. METODE PENELITIAN .............................................................. 24
x
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 24
3.2 Alat dan Bahan .............................................................................. 24
3.2.1 Alat .................................................................................... 24
3.2.2 Bahan ................................................................................ 24
3.3 Prosedur Penelitian ......................................................................... 24
3.3.1 pengambilan Sampel di Lapangan .................................... 24
3.3.2 Sterilisasi Alat .................................................................. 25
3.4 Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah ................................................. 25
3.4.1 Pembuatan Media Isolasi .................................................. 25
3.4.2 Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah .................................... 26
3.4.3 Pemurnian dan Penyimpanan Isolat Bakteri ..................... 26
3.5 Skrining Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB) ............................ 26
3.5.1 Larutan Nile Blue A ......................................................... 26
3.5.2 Skrining Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB) ............... 26
3.5.3 Pemurnian dan Penyimpanan Isolat Bakteri P(3HB) ........ 27
3.6 Produksi P(3HB) dengan Isolat Bakteri ......................................... 27
3.6.1 Penyiapan Medium Isolat Bakteri Penghasil P(3HB) ....... 27
3.6.2 Pembuatan Suspensi Bakteri Peenghasil P(3HB) ............. 28
3.6.3 Pembuatan Inokulum Bakteri Bakteri Penghasil P(3HB) . 28
3.6.4 Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri Penghasil P(3HB) 28
3.6.5 Pemisahan Biomassa dan Supernatan ............................... 28
3.7 Karakterisasi Bakteri Penghasil P(3HB) Menggunakan FT-IR ..... 29
3.8 Karakterisasi Bakteri Penghasil P(3HB) ........................................ 29
3.8.1 Makroskopik ................................................................... 29
3.8.2 Mikroskopik ..................................................................... 29
3.8.3 Pewarnaan Gram ............................................................... 29
3.8.4 Pewarnaan Endospora ....................................................... 30
3.9 Uji Biokimia ................................................................................... 30
3.9.1 Uji Katalase ....................................................................... 30
3.9.2 Uji Motilitas ...................................................................... 31
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 32
4.1 Hasil ............................................................................................... 32
4.2 Pembahasan ................................................................................... 33
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 40
5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 40
5.2 Saran ............................................................................................. 40
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 41
LAMPIRAN .................................................................................................... 45
xi
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Struktur PHA ..................................................................................... 16
Tabel 2. Isolasi Tanah Tambang Menggunakan Media CPO-Bakto Agar ...... 47
Tabel 3. Pengamatan Makroskopik Isolat Bakteri P(3HB) .............................. 47
Tabel 4. Pengamatan Mikroskopik Isolat Bakteri P(3HB) .............................. 47
Tabel 5. Pengamatan Uji Biokimia .................................................................. 47
Tabel 6. Biomasaa Bakteri Penghasil P(3HB) ................................................. 48
Tabel 7. Karakterisasi FTIR ............................................................................. 48
Tabel 8. Sampel Tanah Tambang, Bengkulu Utara ......................................... 49
Tabel 9. Isolasi Bakteri dari Tanah Tambang Menggunakan Media CPO Bakto
Agar ...................................................................................................... 51
Tabel 10. Pengamatan Bentuk Sel Bakteri pada Pewarnaan Gram ................. 66
Tabel 11. Pengamatan Pewarnaan Endospora ................................................. 67
Tabel 12. Pengamatan Uji Katalase ................................................................. 68
Tabel 13. Pengamatan Uji Motilitas................................................................. 69
Tabel 14. Dokumentasi Penelitian ................................................................... 70
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Bentuk-bentuk Bakteri ................................................................... 6
Gambar 2. Struktur Kimia PHA ....................................................................... 16
Gambar 3. Struktur Kimia P(3HB) .................................................................. 17
Gambar 4. Jalur Biosintesis P(3HB) Sumber Karbon CPO ............................. 22
Gambar 5. Skrining Bakteri P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A ITB 4.2 ... 54
Gambar 6. Skrining Bakteri P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A ITB7.3.1 . 55
Gambar 7. Skrining Bakteri P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A ITB 8.1.2 . 56
Gambar 8. Skrining Bakteri P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A ITB 10.1 .. 57
Gambar 9. Isolat Bakteri Penghasil P(3HB) pada Media Agar Miring ........... 58
Gambar 10. Fermentasi Bakteri Penghasil P(3HB) ........................................ 59
Gambar 11. Biomassa Kering Bakteri Penghasil P(3HB) ............................... 60
Gambar 12. Spektrum FTIR P(3HB) Standar .................................................. 61
Gambar 13. Spektrum FTIR PHB Sel Kering Isolat Bakteri ITB 4.2 ............. 62
Gambar 14. Spektrum FTIR PHB Sel Kering Isolat Bakteri ITB 7.3.1 .......... 63
Gambar 15. Spektrum FTIR PHB Sel Kering Isolat Bakteri ITB 8.1.2 .......... 64
Gambar 16. Spektrum FTIR PHB Sel Kering Isolat Bakteri ITB 10.1 ........... 65
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Skema kerja ................................................................................. 45
Lampiran 2. Isolasi Bakteri P(3HB) Media CPO-Bakto Agar ......................... 47
Lampiran 3. Pengamatan Uji Makroskopik ..................................................... 47
Lampiran 4. Pengamatan Uji Mikroskopik ...................................................... 47
Lampiran 5. Pengamatan Uji Biokimia ............................................................ 47
Lampiran 6. Berat Biomassa Bakteri Penghasil P(3HB) dan Pengukuran pH 48
Lampiran 7. Karekterisasi FTIR ...................................................................... 48
Lampiran 8. Sampel Tanah Tambang Bengkulu Utara .................................... 49
Lampiran 9. Isolasi Bakteri dari Tanah Tambang Menggunakan Media CPO
Bakto Agar .................................................................................... 51
Lampiran 10. Skrining Bakteri Penghasil P(3HB) ........................................... 54
Lampiran 11. Isolat Bakteri Pada Media Agar Miring .................................... 58
Lampiran 12. Fermentasi Bakteri Penghasil P(3HB) ....................................... 59
Lampiran 13. Biomassa Kering Bakteri Penghasil P(3HB) ............................. 60
Lampiran 14. Karakterisasi Spektrum FTIR Bakteri Penghasil P(3HB) ......... 61
Lampiran 15. Pengamatan Pewarnaan Gram ................................................... 66
Lampiran 16. Pengamatan Endospora ............................................................. 67
Lampiran 17. Pengamatan Uji Katalase ........................................................... 68
Lampiran 18. Pengamatan Uji Motilitas .......................................................... 69
Lampiran 19. Dokumentasi Penelitian ............................................................ 70
xiv
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kebutuhan yang tinggi akan plastik menjadikan para pelaku industri
memproduksi plastik dalam jumlah yang tak terbatas, plastik merupakan polymer
yang mempunyai kemampuan untuk dibentuk berbagai bentuk, apabila terpapar
panas dan tekanan. Plastik dapat terbentuk batangan, lembaran, atau blok, bila
dalam bentuk produk dapat berupa botol, pembungkus makanan, sehingga barang
yang berlaku hanya untuk sekali pakai ini akan terbuang begitu saja kemudian
menumpuk menjadi sampah. Luasnya penggunaan bahan plastik sebagai bahan
baku kemasan disebabkan oleh berbagai keunggulan dari plastik tersebut antara
lain ringan, kuat, mudah dibentuk, anti karat, tahan terhadap bahan kimia, dan
dapat dibuat berwarna maupun transparan namun kekurangnnya yaitu sulit terurai
secara biologis oleh mikroba, kemudian tidak adanya fauna seperti cacing dan
mikroorganisme tanah, dan kadar oksigen didalam tanah berkurang dan
berdampak langsung pada tumbuhan karena tumbuhan membutuhkan
mikroorganisme tanah sebagai perantara dalam kelangsungan hidup (Irwandi et,
al.,2018).
Pada tahun 2015, sebanyak 300 juta ton plastik diproduksi diseluruh dunia
pertahunnya (Arikan & Ozsoy, 2015). Plastik menjadi sumber bahan utama
pembentukan limbah karena memiliki kemampuan degradasi yang rendah.
Sampah plastik tidak dapat diurai oleh mikroorganisme tanah, walaupun telah
terkena cahaya matahari maupun hujan. Sampah plastik berdampak negatif serta
menimbulkan masalah cukup serius terhadap lingkungan. Proses pengolahan
2
kembali (recycle) tidak dapat mengatasi permasalahan sampah plastik yang
menumpuk.
Beberapa penelitian telah menghasilkan teknologi pembuatan plastik dari
bahan alami yang dapat terdegradasi dalam waktu singkat yang disebut sebagai
plastik biodegradable atau bioplastik. Bioplastik adalah plastik yang dapat
diuraikan secara alamiah di karenakan sifat dari bioplastik dapat diuraikan oleh
mikroorganisme di dalam tanah dan air sehingga tidak merusak lingkungan seperti
yang banyak ditimbulkan oleh plastik sintetis. Oleh karena sifatnya tersebut,
bioplastik dikenal sebagai plastik yang ramah lingkungan. Dampak yang terlihat
nyata oleh penggunaan plastik tersebut memberikan satu solusi yang tepat untuk
menangani menumpuknya limbah plastik tersebut yaitu dengan membuat material
plastik dari bahan-bahan yang mudah diurai oleh mikroorganisme. Plastik
biodegradable terbuat dari bahan polimer alami seperti pati, gliserol, dan kitosan.
Bahan utama yang sering digunakan dalam pembuatan plastik biodegradable
adalah pati dan Poly Lactic Acid (PLA) (Samsul, et al,. 2017; Afiifah et al,. 2015).
Salah satu subjek yang mendapat perhatian akhir-akhir ini adalah metode
biosintesis secara fermentasi dengan menggunakan mikroorganisme penghasil
poli (3-hidroksialkanoat) P(3HA). Poli (3-hidroksialkanoat) dan kopolimernya
diproduksi dari substrat tertentu yang kaya sumber karbonya tapi minimum
kandungan mineralnya (Yogesh,et al,. 2012). Kelompok senyawa P(3HA),
polimer poli (3-hidroksibutirat) P(3HB) dan kopolimernya poli (3-hidroksi
butirat-ko-3-hidroksi velerat) P(3HB-ko-2HV) merupakan senyawa yang paling
banyak diteliti karena mempunyai sifat 100 % mudah terurai dalam waktu tertentu
bila dibuang ke lingkungan (Djamaan, 2015).
3
Pada umumnya bakteri dapat tumbuh pada suhu 35ºC, pertumbuhan
bakteri dikenal dengan pertumbuhan minimum dan pertumbuhan maksimum.
Setiap spesies bakteri tumbuh pada suatu kisaran suhu tertentu. Atas dasar ini
maka bakteri dapat diklasifikasikan sebagai: Psikrofil yang tumbuh pada suhu 10-
15°C, Mesofil yang tumbuh pada suhu 25-37°C dan Termofil pada suhu 45-55°C
(Nureleana H, et al,, 2015). Sebelumnya telah dilakukan penelitian Penapisan
Bakteri Penghasil Bioplastik poli(3-hidroksibutirat) dari tanah hutan Pendidikan
Penelitian Biologi, Kampus Unand, Limau Manih, Padang. Pada penelitian
tersebut empat puluh isolat bakteri teridentifikasi menghasilkan P(3HB)
(Harianto, 2011). Selanjutnya penelitian yang telah dilakukan oleh Gemeidiya
(2016), penampisan bakteri penghasil bioplastik Poli (3-Hiroksibutirat) dari
sampel tanah puncak Gunung Merapi yang terletak dalam kawasan Kabupaten
Agam dan Kabupaten Tanah Datar. Penapisan bakteri yang dilakukan dengan
menggunakan larutan Nile Blue A, diperoleh sepuluh isolat bakteri yang
koloninya memberikan flourisensi jingga yang berindikasikan penghasil P(3HB)
atau bioplastik.
Tanah tambang batubara mengandung sumber karbon yang tinggi, serta
memiliki kandungan hidrogen, nitrogen, dan oksigen, sehingga memungkinkan
bagi tempat hidupnya bakteri penghasil P(3HB). Pada penelitian ini, peneliti akan
melakukan penapisan bakteri penghasil biopolimer P(3HB) dari sampel tanah
daerah Tambang, Bengkulu Utara. Proses isolasi bakteri menggunakan media
minyak kelapa sawit mentah sehingga, dapat dikembangkan menjadi biopolimer
PHB secara fermentasi menggunakan bakteri penghasil PHB.
4
1.2 Rumusan Masalah
1. Apakah bakteri penghasil biopolimer P(3HB) dari tanah di daerah
tambang Bengkulu Utara, dapat diisolasi dan menghasilkan bakteri
biopolimer P(3HB)?
2. Apakah karakteristik bakteri penghasil biopolimer P(3HB) yang diisolasi
dari tanah di daerah tambang Bengkulu Utara?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui apakah bakteri penghasil P(3HB) dari tanah di daerah
tambang Bengkulu Utara, dapat diisolasi dan menghasilkan biopolimer
P(3HB)
2. Untuk mengetahui karakteristik bakteri pengasil biopolimer P(3HB) yang
diisolasi dari sampel tanah di daerah tambang Bengkulu Utara.
1.4 Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi tentang bakteri biopolimer P(3HB) yang diisolasi
dari sampel tanah di daerah tambang.
2. Memberikan informasi tentang karakteristik penghasil biopolimer P(3HB)
dari sampel tanah di daerah tambang.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Profil Tanah Tambang Batubara
Potensi sumber daya batubara di Indonesia sangat melimpah, terutama di
pulau Sumatera dan pulau Kalimantan. Di Indonesia batubara merupakan bahan
bakar utama selain solar (diesel fuel) yang telah umum digunakan pada banyak
industri. Batubara yang mempunyai kualitas tinggi memiliki kandungan air yang
rendah dan kandungan karbon yang tinggi, umumnya di ekspor ke luar negeri.
Sedangkan batubara yang berkualitas rendah mempunyai kandungan air yang
tinggi dan kandungan karbon yang rendah, umumnya mempunyai kendala dalam
memanfaatkannya, karena mempunyai kandungan air bawaan (inherent moisture)
yang tinggi sehingga kurang ekonomis dalam proses pengangkutan atau
transportasi dan juga menimbulkan permasalahan dalam proses pembakaran.
Selain itu adanya kandungan air yang tinggi akan mengurangi nilai kalori
batubara sehingga diperlukan jumlah batubara yang banyak untuk proses
pembakaran. Akibatnya, gas CO2 yang dihasilkan akan lebih banyak sehingga
menimbulkan dampak negatif terhadap lingkungan. Sebagai contoh meningkatnya
efek rumah kaca yang turut andil dalam pemanasan global (Jaya, 2017).
Batubara adalah salah satu bahan bakar fosil yang terbentuk dari endapan,
batuan organik yang terutama terdiri dari karbon, hidrogen dan oksigen. Batubara
terbentuk dari tumbuhan yang telah terkonsolidasi antara strata batuan lainnya dan
diubah oleh kombinasi pengaruh tekanan dan panas selama jutaan tahun sehingga
membentuk lapisan batubara.
6
2.2 Bakteri
2.2.1 Definisi Bakteri
Bakteri merupakan organisme uniseluler yang relatif sederhana. Karena
materi genetik tidak diselimuti oleh selaput membran, sel bakteri disebut dengan
sel prokariot. Dinding sel bakteri mengandung kompleks karbohidrat dan protein
yang disebut peptidoglikan. Bakteri umumnya bereproduksi dengan cara
membelah diri menjadi dua sel yang berukuran sama, bakteri rata-rata berukuran
lebar 0,5-1 micron dan panjang hingga 10 mikron (1 mikron = 10-3 mm)
pembelahan yang dilakukan oleh bakteri di sebut pembelah biner. Untuk nutrisi,
bakteri umumnya menggunakan bahan kimia organik yang dapat diperoleh secara
alami dari organisme yang sudah mati. Beberapa bakteri dapat membuat makanan
sendiri dengan proses biosintesis, sedangkan beberapa bakteri yang lain
memperoleh nutrisi dari substansi organik (Misnadiarly & Husjain, 2014)
2.2.2 Bentuk Bakteri
Terdapat tiga bentuk sel bakteri yang paling umum yaitu cocci (spherical
dari kata Yunani untuk biji/berry), bacilli (berbentuk batang dari kata Yunani
untuk staff) dan spirila (bentuk melengkung dari spiral). Ada berbagai cara untuk
membagi ketiga bentuk menyeluruh ini sebagian besar didasarkan pada
bagaimana mereka disusun dalam bentuk multiselular (Al-Mohanna, 2016).
Gambar 1. Bentuk-bentuk bakeri (Al-Mohanna, 2016)
7
a. Kokus
Kata kokus berasal dari bahasa yunani yang berarti biji buah. Semua jenis
kokus mempunyai bentuk bulat menyerupai biji buah. Tetapi ada kokus yang
tidak bulat seluruhnya tetapi mempunyai bagian yang gepeng disatu sisi, ada pula
yang agak lonjong (Misnadiarly & Husjain, 2014)
b. Basil
Kata basil berasal dari bahasa latin yang bearti tongkat atau batang kecil.
Bentuk basil menyerupai batang kecil atau suatu silinder. Tiap jenis basil
mempunyai bentuk khas. Ada yang bentuknya pendek menyerupai kokus dan ada
yang bentuknya panjang dan halus.
Ujung-ujungnya dari basil dapat pula bermacam-macam. Ada yang
ujungnya persegi, ada yang ujungnya bulat dan ada pula yang ujungnya lancip.
Umumnya basil berbentuk lurus dan kaku, ada pula yang sedikit bengkok
(Misnadiarly & Husjain, 2014)
c. Spiral
Dalam kelompok ini termasuk kuman-kuman bakteri yang mempunyai
bentuk menyerupai pili atau pencabutan gabus, ada spiral yang pendek, tidak
sampai satu putaran spiral atau menyerupai koma, kuman demikian digolongkan
dalam genus vibrio.
Spiral lain yang lebih panjang dan lebih halus, digolongkan dalam genus
spirallum. Spiral dapat bergerak dengan pertolongan berbeda dengan spirokheta,
yang bersifat mudah melentur dan berbentuk halus menyerupai per kawat.
Spirokheta tergolong dalam satu ordo tersendiri, spirochaetales (Misnadiarly &
Husjain, 2014)
8
2.2.3 Cara mengidentifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri meliputi pemeriksaan morfologi, pewarnaan gram, dan
uji biokimia antara lain : uji O/F, uji oksidase, uji katalase, uji motilitas, produksi
indol, uji TSIA, uji gula. Identifikasi bakteri dilakukan dalam beberapa uji antara
lain:
a. Pengamatan morfologi koloni bakteri
Pengamatan morfologi koloni bakteri dilakukan setelah mendapatkan
biakan murni. Pengamatan ini meliputi warna, bentuk, tepian koloni, elevasi atau
permukaan koloni dan struktur dalam koloni (Kismiyati, et al., 2009).
b. Pewarnaan gram
Pewarnaan bertujuan untuk menentukan apakah bakteri tersebut termasuk
didalam kelompok bakteri gram positif atau kelompok bakteri gram negatif. Cara
kerja dari pewarnaan gram yaitu suspensikan bakteri dengan ose, kemudian
letakkan pada obyek dan difiksasi, tetesi dengan larutan gram A yang
mengandung kristal violet, kemudian tetesi dengan larutan gram B yang
mengandung lugol, tetesi dengan larutan gram C yang mengandung alkohol,
danyang terakhir tetesi dengan larutan gram D yang mengandung safranin
(Kismiyati, et al., 2009).
c. Uji katalase
Tujuan uji katalase adalah untuk mengetahui sifat bakteri dalam
menghasilkan enzim katalase. Cara kerja dari uji katalase yaitu larutan H2O2 3%
diteteskan pada obyek, kemudian suspensikan koloni bakteri dengan ose
(Kismiyati, et al., 2009).
9
d. Uji oksidase
Tujuan uji oksidase adalah untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase
pada bakteri dengan menggunakan paper oksidase yang dapat dilihat perubahan
warna yang terjadi pada paper oksidase (Kismiyati, et al., 2009).
e. Uji O/F (Oksidatif/Fermentatif)
Uji O/F medium (Oksidatif/Fermentatif) bertujuan untuk mengetahui sifat
oksidasi atau fermentasi bakteri terhadap glukosa dengan menggunakan dua
tabung media yang salah satunya ditutup dengan parafin, sehingga diharapkan
didalam media tidak terdapat udara yang dapat mendukung terjadinya fermentasi
(Kismiyati, et al., 2009).
f. Uji motilitas dan mroduksi indol
Uji motilitas bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut motil
atau tidak dan untuk mengetahui produksi indol dari Tryptophane. Uji ini
menggunakan media MIO (Motility Indole Ornitin) (Kismiyati, et al., 2009).
g. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) bertujuan untuk membedakan jenis
bakteri berdasarkan kemampuan memecahkan dextrose, laktosa, sukrosa dan
pembebasan sulfida, selain itu uji TSIA berfungsi untuk mengetahui apakah
bakteri tersebut menghasilkan gas, H2S atau tidak. Media yang digunakan
mempunyai dua bagian, yaitu slant (miring) dan butt (tusuk) (Kismiyati, et
al.,2009).
h. Uji gula
Uji gula bertujuan untuk mendeterminasi kemampuan bakteri dalam
mendegradasi gula dan menghasilkan asam organik yang berasal dari tiap-tiap
10
jenis gula, yaitu glukosa, sukrosa, maltosa, arabinosa, manitol dan inositol
(Kismiyati, et al., 2009).
2.2.4 Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri
a. Bahan-bahan Nutrisi yang Terkandung dalam Nutrien
Mikroorganisme membutuhkan makanan untuk pertumbuhannya yang
berupa sumber energi berupa lemak, karbohidrat dan alkohol, sumber nitrogen
diambil dari asam amino dan protein, sumber vitamin berupa golongan vitamin-
vitamin tertentu dan sumber mineral berupa ion-ion logam dalam konsentrasi
kecil yang terdiri dari K, Na, Mg, Ca, Fe, Cl (makroelemen) dan Cu, Mn, Co, Zn
(mikroelemen) (Nureleana H, et al,, 2015)
b. Kadar Air
Semua sel membutuhkan air termasuk mikroorganisme. Air merupakan
komponen utama dalam kehidupan bakteri karena 70-80% dari berat protoplasma
terdiri dari air. Air bertindak sebagai media transformasi makanan dan hasil
metabolisme sel, serta diperlukan juga pada proses enzimatis (Nureleana H, et al,,
2015).
c. pH
Sebagian besar bakteri tumbuh baik pada pH mendekati netral dan basa
berkisar antara pH 6,5 7,5. pH optimal dari bakteri patogen adalah 6,8-7,2 dan
untuk bakteri saprofit 5-8,5 (Nureleana H, et al,, 2015).
d. Tekanan Osmotik
Pada umumnya bakteri dapat hidup pada daerah dengan kandungan garam
yang encer. Tekanan osmotik tergantung pada bahan terlarut, dimana bakteri pada
umumnya dapat tumbuh pada rentang tekanan osmotik yang cukup besar karena
11
adanya enzim permease sehingga konsentrasi garam dalam sel dapat diatur. Akan
tetapi bila konsentrasi ini cukup tinggi, maka air akan keluar dari sel sehingga
pertumbuhan bakteri akan berhenti (Nureleana H, et al,, 2015).
e. Suhu
Umumnya bakteri dapat tumbuh baik pada suhu 35°C. Pada pertumbuhan
bakteri dikenal adanya pertumbuhan minuman dan pertumbuhan maksimum.
Setiap spesies bakteri tumbuh pada suatu kisaran suhu tertentu. Atas dasar ini
maka bakteri dapat diklasifikasikan sebagai: Psikrofil yang tumbuh pada suhu 10-
15°C, Mesofil yang tumbuh pada suhu 25-37°C dan Termofil pada suhu 45-55°C
(Nureleana H, et al,, 2015).
f. Oksigen
Mikroorganisme juga dikelompokkan berdasarkan kebutuhan yaitu
oksigen. Peranan oksigen sebagai penerima hidrogen, banyak jasad renik bersifat
aerobobligat, memerlukan secara khusus oksigen sebagai penerima hidrogen.
Beberapa bersifat fakultatif dalam hal konsentrasi oksigen, sanggup hidup secara
aerob atau anaerob dan yang lain lagi bersifat anaerob obligat yang memerlukan
suatu zat yang lain dari oksigen sebagai penerima hidrogen dan sangat peka
terhadap hambatan oleh oksigen. (Nureleana H, et al,, 2015).
g. Nutrisi Bakteri
Media harus memenuhi persyaratan seperti dibawah ini sehingga bakteri
dapat tumbuh dengan baik yaitu:
a. Harus mengandung semua nutrien yang dibutuhkan oleh bakteri untuk
tumbuhnya
12
b. Harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai
dengan kebutuhan bakteri yang ditumbuhkan
c. Tidak mengandung bahan-bahan yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri
d. Dapat tumbuh dengan baik
Media dapat digolongkan berdasarkan susunan kimianya, sifat wujudnya
dan fungsinya yaitu:
a. Penggolongan media berdasarkan susunan kimianya
1. Media anorganik adalah media yang disusun oleh bahan-bahan anorganik.
2. Media organik adalah media yang disusun oleh bahan-bahan organik.
3. Media sintetis adalah media yang susunan kimianya tidak diketahui secara
pasti, pada umumnya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan
suatu bakteri.
4. Media non sintetik adalah susunan kimianya tidak diketahui secara pasti dan
umumnya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi
bakteri.
b. Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya
1. Media cair adalah media yang berbentuk cair tanpa penambahan zat
pemadat.
2. Media padat adalah media yang berbentuk padat dengan penambahan zat
pemadat. Media ini dapat berupa bahan organik alamiah, misalnya terbuat
dari kentang, wartel dan lain-lain, dan juga dapat berupa agar atau bahan-
bahan anorganik seperti silika gel.
13
3. Media semi padat adalah media dengan jumlah zat pemadat yang
ditambahkan sekitar 50%.
c. Penggolongan media berdasarkan fungsi
1. Media diperkaya adalah media yang ditambahkan dengan zat-zat tertentu.
Misalnya serum darah, ekstrak tanaman dan lain sebagainya, sehingga dapat
digunakan untuk menumbuhkan bakteri yang bersifat heterotrof. Media ini
memberikan kesempatan pada satu jenis bakteri untuk berkembang lebih
cepat.
2. Media differensial adalah media yang ditambah dengan zat kimia tertentu
untuk mencegah pertumbuhan dari mikroba lain yang tidak diharapkan,
misalnya media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu yang
dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi
pertumbuhan bakteri gram negatif.
3. Media penguji adalah media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk
pengujian vitamin-vitamin, asam amino-asam amino dan antibiotik.
Media khusus adalah media yang digunakan untuk menentukan tipe pertumbuhan
mikroba dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan kimia tertentu.
2.3 Bakteri Penghasil P (3-Hidroksibutirat)
Beberapa bakteri yang dapat mensintesis PHB yaitu bakteri dari genus
Bacillus sp. Beberapa bakteri-bakteri tersebut antara lain, Bacillusmycoides,
Bacillus sp, Bacillus cereus (Valappil dkk., 2011). Bakteri Alcaligenes eutrophus,
pseudomonas oleovorans, Rhodospirilium rubrum, Zogloea ramigera. Sebagian
bakteri genus Bacillus sp memiliki kemampuan amilolitik dan memiliki
kemampuan mensintesis PHB. Pada beberapa bakteri PHB merupakan cadangan
14
makanan energi, dan dapat mencapai 90% dari berat sel kering (Handrick, et.al.
2004).
2.4 Biopolimer
Biopolimer adalah polimer yang dapat diuraikan secara alamiah oleh
mikroorganisme seperti bakteri dan jamur (Djamaan & Dewi, 2014). Sedangkan
polimer merupakan molekul besar yang terbentuk dari unit-unit berulang
sederhana. Nama ini diturunkan dari bahasa Yunani yaitu poly (yang berarti
banyak) dan mer (yang berarti bagian). Jika hanya ada beberapa unit monomer
yang bergabung bersama, disebut oligomer dari bahasa yunani oligos (beberapa)
atau polimer dengan berat molekul rendah. Makromolekul merupakan istilah yang
sinonim dengan polimer (Djamaan, 2015). Menurut Scott (1994), biopolimer
dapat dibagi dua kelompok, yaitu: fotourai dan biourai. Biopolimer fotourai
mempunyai gugus yang sensitif terhadap cahaya dan hanya dapat menguraikan
polimer menjadi fragmen kecil yang tidak dapat diuraikan lagi. Sementara itu,
biopolimer biourai merupakan polimer yang dapat diuraikan oleh reaksi enzimatis
yang dapat menyebabkan hidrolisis. Hidrolisis polimer dapat juga terjadi di dalam
larutan berair tanpa adanya enzim.
Salah satu cara yang mendapat perhatian serius dari berbagai peneliti
dewasa ini adalah produksi polimer bakteri secara fermentasi menggunakan
bakteri penghasil poli (3-hidroksialkanoat) atau P(3HA). Dilaporkan oleh banyak
peneliti bahwa bakteri tertentu dapat mengakumulasi P(3HA) didalam selnya
yang berguna sebagai cadangan makanan dan energi pada keadaan pertumbuhan
yang kurang menguntungkan misalnya: kekurangan nitrogen, fosfat, oksigen dan
magnesium (Lee & Dawes, 1990). Selanjutnya biopolimer yang dihasilkan oleh
15
bakteri tersebut diekstrak keluar dari dalam selnya dan diproses lebih lanjut sesuai
dengan keperluan yang diinginkan, terutamanya sebagai pengganti pengguanan
plastik yang berasaskan petrokimia.
2.5 Bioplastik
Biopastik adalah suatu plastik yang dapat mengalami perubahan secara
alamiah oleh aktifitas seperti bakteri, jamur dan alga (Swift, 1996). Bioplastik
adalah plastik yang berbahan dasar dari bahan yang dapat diperbaharui. Bioplastik
merupakan plastik yang dapat digunakan untuk menggantikan plastik sintetis yang
umum digunakan oleh masyarakat dunia. Plastik sintetis berasal dari minyak bumi
memiliki sifat sulit diregradasi oleh mikroba di alam. Bioplastik dapat dijadikan
alternatif untuk menggantikan plastik sintetis yang tidak dapat terdegradasi yang
sekarang menjadi masalah utama lingkungan. Substitusi dari plastik sintetis yang
nondegradable ke bioplastik yang degredable merupakan pengganti plastik
konvensional yang memiliki kelebihan dapat hancur setelah dibuang ke
lingkungan karena terurai oleh aktivitas mikroba (Van Der Zee, et al., 2001).
Bioplastik dapat digolongkan menjadi dua, yaitu fotodegradasi dan
biodegradasi. Senyawa bioplastik fotodegradasi merupakan plastik yang
mempunyai kelompok tambahan yang sensitif terhadap cahaya dan hanya
menguraikan plastik menjadi fragmen kecil yang tidak dapat diuraikan lagi.
Plastik biodegradasi adalah plastik yang diuraikan oleh aktifitas enzim yang dapat
menyebabkan hidrolisis (Scott, 1994).
2.6 Poli Hidroksialkanoat (PHA)
Poli Hidroksialkanoat merupakan poliester yang disintesa oleh berbagai
jenis bakteri dan diakumulasikan sebagai cadangan energi dan karbon dalam
16
bentuk granula didalam sitoplasma. Bagi bakteri tersebut polimer ini berguna
sebagai cadangan bahan makanan dan energi yang akan digunakan pada keadaan
pertumbuhan yang kurang mengguntungkan atau kehabisan sumber makanan
(Djamaan, 2015).
Secara umum, struktur kimia P(3HA) dapat dilihat pada gambar dibawah
ini :
n=1
n=2
n=3
R= hydrogen
methyl
ethyl
propyl
pentyl
nonyl
R= hydrogen
R=hydrogen
Poly(-3-hydroxypropionate)
Poly(-3-hydroxybutyrate)
Poly(-3-horoxyvalerate)
Poly(-3-hydroxyhexanoate)
Poly(-3-hydroxyoctanoate)
Poly(-3-hydroxydodecanoate)
Poly(-4-hydroxybutyrate)
Poly(-5-hydroxyvalerate)
Gambar 2. Struktur kimia PHA (Muhammadi,et.,al 2015)
2.7 Poli (3-Hidroksibutirat) P(3HB)
Diantara keluarga PHA, poli (3-hidroksibutirat) atau P(3HB) adalah
polimer biodegradable yang paling umum dan alternatif yang menjanjikan untuk
plastic nondegradable sintetis. Senyawa biopolimer poli (3-hidroksibutirat)
pertama kali ditemukan oleh Lemoigne pada tahun 1925 seorang ahli
mikrobiologi dari Institut Pasteur di Paris. Lemoigne mengisolasi polimer tersebut
dari bakteri Bacillus megaterium dan mengekstrak dengan kloroform (Harianto,
2011).
Pada tahun 1982 perusahaan kimia di Inggris, Imperial Chemical Industry
(ICI), mulai memproduksi P(3HB) secara komersial dengan menggunakan bakteri
17
Alcaligenes eutrophus yang ditumbuhkan dalam glukosa. Bakteri A. Eutrophus
mampu berkembang biak dalam media yang mengandung mineral sederhana, gas
hidrogen, CO2 dan O2. Beberapa bakteri A. Eutrophus mampu memproduksi
P(3HB) dari lingkungan yang mengandung gas H2 dan CO2 yang kemudian akan
dipergunakan sebagai sumber energi (Harianto, 2011).
Poli (3-Hidroksibutirat) atau P(3HB) merupakan cadangan makanan bagi
bakteri dan terbentuk sebagai granular-granular di dalam cairan sitoplasma sel
bakteri dengan ukuran yang berbeda tiap-tiap spesies. Pasokan yang tidak
memadai akan membuat sel-sel mendepolimerisasi cadangan makanan
menghasilkan β-hidroksibutirat yang bersifat dapat larut dan mudah dicerna.
Polimer ini diakumulasi intraseluler hingga 90% dari berat kering sel dalam
kondisi stres nutrisi dan bertindak sebagai bahan cadangan energi. Pada
Azospirillum brasilense dilaporkan mempunyai jangka waktu hidup lebih lama
karena mempunyai kandungan P(3HB) yang lebih tinggi pada keadaan yang
buruk sehingga P(3HB) dimanfaatkan sebagai energi untuk bertahan hidup
(Djamaan, 2015).
Poli (3-Hidroksibutirat) memiliki polimer makromolekul yang terdiri dari
unit berulang 3-hidroksibutirat, 3HB, aktif secara optik karena mempunyai atom
karbon asimetrik pada posisi C3 dengan bobot molekul 200.000 hingga 3.000.000
dalton. P(3HB) memiliki rumus empiris yaitu (C4H6O2)n:
Gambar 3. Struktur Kimia P(3HB) (Djamaan, 2015)
18
Jumlah unit n dapat berubah-ubah dari 600 hingga 35.000. Beberapa faktor
dapat mempengaruhi jumlah unit n yang antaranya: strain mikroorganisme
penghasil, metoda pemisahan yang dipakai, jenis substrat yang digunakan,
peringkat pertumbuhan sel sewaktu pengambilan sel dilakukan, faktor
penghambat pertumbuhan dan keadaan fermentasi seperti: suhu, pengudaraan dan
penggoncangan (Djamaan, 2015).
2.8 Peranan P (3-Hidroksibutirat) di Dalam Sel Bakteri
Pada kebanyakan bakteri, P(3HB) berperan sebagai sumber karbon dan
tenaga dalam keadaan kekurangan nutrien. Azospirillum brasilense dilaporkan
mempunyai jangka waktu hidup yang lebih lama karena mempunyai kandungan
P(3HB) yang lebih tinggi pada keadaan lingkungan yang buruk. Fungsi biologi
P(3HB) dapat dikatakan sama dengan glikogen dalam sel mamalia dan kanji pada
tumbuhan. Dalam keadaan ketiadaan sumber karbon serta kepekatan nitrogen
yang sesuai, sintesis protein dapat terjadi dengan P(3HB) bertindak sebagai
sumber karbon untuk proses metabolisme normal di dalam sel bakteri didukung
oleh sifatnya dihasilkan dalam berat molekul yang tinggi serta tingkat
kelarutannya yang rendah sehingga tidak akan meningkatkan tekanan osmotik sel
(Djamaan, 2015).
2.9 Sifat Fisika Kimia P (3-Hidroksibutirat)
Tahap penghabluran dari P(3HB) relatif tinggi yaitu 55-80% yang
menyebabkan timbulnya masalah dalam pemanfaatan P(3HB) sebagai kemasan
dalam bentuk tunggal. Adanya sifat rapuh dan mudah pecah yang dimiliki oleh
P(3HB) dapat diatasi dengan menggunakan unit polimer lain yaitu poli (3-
hidroksivalerat). Berat molekul P(3HB) berkisar antara 166.000 - 737.000
19
bergantung pada strain bakteri penghasil dan sumber karbon yang digunakan.
Sifat kelarutan sudah banyak diteliti, P(3HB) memiliki kelarutan pada pelarut
organik yang bersifat non polar (Susanti, 2010).
2.10 Media Pertumbuhan Bakteri P(3HB)
Minyak kelapa sawit merupakan alternatif sumber karbon yang banyak
digunakan dalam produksi senyawa biopolimer. Hal ini disebabkan karena
minyak kelapa sawit mengandung banyak asam lemak jenuh dan tidak jenuh,
yang dapat diuraikan oleh enzim lipase yang terdapat pada sel bakteri sehingga
dapat diuraikan sebagai substrat dasar untuk menghasilkan biopolimer (Susanti,
2010). Untuk itu dilakukan berbagai terobosan antara lain menjadikan minyak
kelapa sawit menjadi produk yang bernilai jual tinggi menjadi biopolimer poli (3-
hidroksibutirat) (Djamaan & Dewi, 2014).
2.11 Biosintesis Poli Hidroksialkanoat (PHA) dan Poli (3-Hidroksibutirat)
P(3HB)
Poli (3-hidroksibutirat) adalah polimer biodegradable yang paling umum
dan alternatif yang menjanjikan untuk plastik non degradable sintesis. Senyawa
biopolimer P(3HB) pertama kali ditemukan oleh Lemoigne pada tahun 1925
seorang ahli mikrobiologi dari institut Pasteur di Paris. Lemoigne mengisolasi
polimer tersebut dari bakteri Bacillus megaterium dan mengekstrak dengan
kloroform (Chen et al., 2007).
Beberapa bakteri mensintesis dan mengumpulkan PHA sebagai sumber
karbon dan sumber cadangan energi atau untuk mengurangi kelebihan energi
dibawah kondisi kekurangan nutrisi seperti pada tempat yang kelebihan unsur
karbon. Simpanan PHA dapat diregradasi oleh depolimer intraseluer dan
20
metabolisme sebagai sumber karbon dan energi yang dapat dihasilkan secara
cepat untuk menyuplai kekurangan nutrisi. Mayoritas PHA disusun oleh monomer
asam R(-)-3-hydroxyalkanoic berkisar dari C3 sampai C14 atom karbon dengan
variasi jenuh dan tidak jenuh dan lurus atau rantai bercabang mengandung grup
alifatik dan aromatik. Berat molekul dari polimerase ini berkisar dari 2x105
sampai 3x106 dalton berdasarkan tipe mikroorganisme dan kondisi pertumbuhan
(Chen et al., 2007).
2.12 Jalur Biosintesis P(3HB) dari Sumber Karbon Minyak Kelapa Sawit
Dijelaskan pada gambar 4 bahwa, jalur biosintesis P(3HB) dari sumber
karbon minyak kelapa sawit dimulai dari perubahan minyak kelapa sawit yang
terdiri dari asam-asam lemak menjadi asil-KoA dan krotonil sebelum masuk
kedalam β-oksidasi dengan tindakan enzim asil-KoA dehidrogenase. Selanjutnya
krotonil akan membentuk L(+)-β-hidroksi asil-KoA dengan tindakan enzimenoil-
KoA dehidrogenase. Kemudian dilanjutkan dengan pembentukan β-ketoasil oleh
tindakan enzim asetoasetil-KoA reduktase, dan pembentukan asil-KoA untuk
kemudian berubah menjadi asetil-KoA. Akhirnya dari astil-KoA dengan tindakan
β-ketothiolase asetoasetil-KoA redukatse dan P(3HB) sintesa secara berurutan
akan menghasilkan asam poli (3-hidroksibutirat) (Djamaan & Dewi, 2014).
21
Gambar 4. Jalur biosintesis P(3HB) dari sumber karbon minyak kelapa sawit
(Djamaan & Dewi, 2014).
2.13 Spektroskopi FT- IR (Fourier Transform Infra-Red Analysis)
Spekroskopi inframerah, juga disebut spektroskopi vibrasi, adalah metode
standar farmasi analitik dan kimia, memberikan gambar getaran atom senyawa.
Spektroskopi inframerah adalah salah satu teknik spektroskopi yang paling umum
digunakan oleh ahli kimia organik dan anorganik. Ini didasarkan pada sifat
interaksi radiasi IR dengan metode getaran molekul. Spektroskopi IR cepat,
teknik yang relatif murah digunakan untuk menentukan gugus fungsi kimia dalam
sampel karena kelompok fungsional yang berbeda menyerap karakteristik
frekuensi radiasi IR serta membantu dalam penjelasan struktur (Rakesh &
Charmi, 2014).
Dalam industri farmasi, spektroskopi IR telah mendapatkan popularitas
tidak hanya dalam kemudahan dan kecepatan sampel yang diukur tetapi juga
dalam kualitas yang di peroleh (Rohman, 2012).
Spektroskopi FTIR (Fourier Transform Infrared) merupakan spektroskopi
inframerah yang di lengkapi dengan transformasi Fourier untuk deteksi dan
analisis hasil spektrumnya. Ini spektroskopi FTIR adalah interferometer
22
Michelson yaitu alat inframerah untuk menganalisis frekuensi dalam sinyal
gabungan. Spektrum inframerah tersebut dihasilkan dan pentrasmisin cahaya yang
melewati sampel, pengukuran intensitas cahaya dengan detektor dan
dibandingkan dengan intensitas tanpa sampel sebagai fungsi panjang gelombang
(Anam, Sirojudin, Firdausi, 2007).
Spektrum inframerah yang diperoleh kemudian diplot sebagai intensitas
fungsi energi, panjang gelombang (µm) atau bilangan gelombang (cm-1). Analisis
gugus fungsi suatu sampel dilakukan dengan membandingkan pita absorbsi yang
terbentuk pada spectrum infra merah menggunakan tabel korelasi dan
menggunakan spektrum senyawa pembanding (yang sudah diketahui) (Vino,
Kulkarni, Sulochanaa, 2018).
Biopolimer poli (3-hiroksibutirat) (P3HB) dianalisis oleh FTIR untuk
mengetahui gugus fungsi yang ada dalam struktur kimia P3HB pada tingkat
molekuler, diambil sebagai referensi standar. Fase kloroform yang mengandung
P3HB menjadi sasaran analisis Spektroskopi FTIR. Untuk mengetahui kelompok-
kelompok fungsional yang ada dalam P3HB, 1 mg sampel P3HB yang diestraksi
dilarutkan dalam 5 mL kloroform. Kloroform diizinkan untuk menguap untuk
mendapatkan bubuk P3HB, yang menjadi sasaran analisis FTIR menggunakan
spektrofotometer FTIR. Spektrum direkam dalam rentang 4000 cm-1 hingga 400
cm-1. Puncak karakteristik pada 1044,38 cm-1, 1454,38 cm-1 dan 1743,77 cm-1
sesuai dengan C-O, C-H, dan C = O menunjukan kelompok fungsional yang hadir
dalam struktur P3HB murni (Vino, Kulkarni, Sulochanaa, 2018).
Analisis menggunakan spektrofotometer FTIR memiliki beberapa
kelebihan antara lain (Vino, Kulkarni, Sulochanaa, 2018) :
23
1. Dapat digunakan pada semua frekuensi dari sumber cahaya secara
simultan, sehingga analisis dapat dilakukan lebih cepat dari pada
menggunakan cara scanning.
2. Sensitivitas FTIR adalah 80-200 kali lebih tinggi dari instrumentasi
dispersi standar karena resolusinya lebih tinggi. Sensitivitas dari metode
spektrofotometer FTIR lebih besar dari pada cara dispersi sebab radiasi
yang masuk ke sistem detektor lebih banyak karena tanpa harus melalui
celah (slitless).
3. Pada FTIR mekanik optik lebih sederhana, dapat mengidentifikasi
material yang belum diketahui, serta dapat menetukan kualitas dan jumlah
komponen sebuah sampel.
24
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari – Juli 2020, di Laboratorium
Biota Sumatera, Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi, dan Laboratorium
Dasar dan Sentral, Universitas Andalas.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain, autoklaf
(GEA®), oven, inkubator (Memmert®), cawan petri (Pyrex®), tabung reaksi
(Pyrex®), erlenmeyer (Pyrex®), pipet tetes, beaker glass (Iwaky®), mikropipet,
gelas ukur (Iwaky®), lampu spritus, lampu ultraviolet, jarum ose, spatel, batang
pengaduk, lemari pendingin (LG), rotary shaker incubator, laminar air flow
(Elisa®), timbangan analitik, sentrifus, spektrofotometer FTIR.
3.2.2 Bahan
Bahan – bahan yang akan digunakan dalam penelitian adalah sampel tanah
yang diambil di daerah tambang batubara, Bengkulu Utara. Media yang
digunakan yaitu (Crude Palm Oil/CPO), bakto agar (Oxoid), air suling, Nacl
Fisiologis 0,85%, Nile Blue A 1%, larutan dapar fosfat, Nutrient agar (Oxoid),
Alkohol 70%, medium fermentasi, metanol (Merk), kloroform (Bratacem), asam
sulfat (Merk).
25
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pengambilan Sampel di Lapangan
Sampel yang diambil adalah sampel tanah di daerah tambang, Bengkulu
Utara. Tanah diambil pada 10 titik. Tanah yang di ambil sebanyak 500 gram.
Jarak masing-masing pengambilan sampel ± 25-30 meter. Sampel diambil pada
tanggal 20 Oktober 2019
3.3.2 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian terlebih dahulu di cuci
bersih dan dikeringkan. Alat-alat yang memiliki mulut ditutup dengan kapas yang
dibalut dengan kain kasa dan dibungkus dengan kertas perkamen. Kemudian di
sterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C tekanan 15 lbs selama 15 menit.
Spatel dan jarum ose disterilkan dengan cara flamber diatas nyala api
lampu spiritus selama 20 detik. Lemari aseptis dibersihkan dari debu dan
disterilkan dengan cara menyemprotkan alkohol 70% keseluruh bagian dalam
lemari. Semua pengerjaan dilakukan secara teknik aseptik.
3.4 Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah
3.4.1 Pembuatan Media Isolasi Bakteri CPO-Bakto Agar
Sebanyak 7,5 gram serbuk bakto agar (Oxoid), dilarutkan dalam 500 mL
air suling, kedalam erlemeyer, dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk hingga
larut sempurna dan bewarna jernih. Kemudian disumbat dengan kapas yang di
balut dengan kasa lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan
tekanan 15 lbs selama 15 menit, dan minyak sawit sebanyak 4,6 gram disterilkan
dalam erlemeyer bersumbat kapas yang dibalut dengan kasa yang sama.
Dimasukan CPO steril ke dalam larutan bakto agar yang telah disterilkan tadi.
26
Kemudian dituangkan ke dalam masing-masing cawan petri sebanyak 15 mL
(Djamaan & Dewi, 2014).
3.4.2 Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah
Sampel tanah ditimbang 1,0 gram dan dibuat suspensi kedalam Na
Fisiologis 0,85% dan di buat pengenceran bertingkat 10-4. Pada pengenceran 10-4
tersebut diinokulasikan kedalam media CPO-bakto agar sebanyak 1 mL. Setelah
diinokulasi ke inkubator pada suhu 35-37°C selama 24-48 jam. Kemudian
dihitung dan dicatat jumlah bakteri yang tumbuh. Bakteri yang telah tumbuh di
pilih bakteri yang terpisah dan dipindahkan kedalam media CPO baru. (Haedar,et
al,.2013).
3.4.3 Pemurnian dan Penyimpanan Isolat Bakteri
Dilakukan pembuatan stok murni dengan cara menginokulasikan koloni
bakteri yang memberi hasil positif dengan Nile Blue A 1% pada CPO-bakto agar,
diinokulasi satu koloni masing-masing pada medium agar miring CPO-bakto agar
dengan metode gores. Inkubasi pada suhu 35-37°C selama 24 jam. Kemudian
disimpan pada suhu 4°C (Djamaan, 2015).
3.5 Skrining Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB)
3.5.1 Larutan Nile Blue A 1%
Serbuk Nile Blue A (C4OH4ON6O6S) sebanyak 1 gram dilarutkan dalam
etanol absolut hingga volume 100 mL (Djamaan, 2015).
3.5.2 Skrining Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB)
Medium yang sudah ditumbuhi oleh koloni bakteri, diteteskan dengan Nile
Blue A 1% dan didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit. Setelah itu di lihat
dibawah sinar Ultraviolet pada panjang gelombang 365 nm. Jika koloni bakteri
27
menghasilkan fluoresensi jingga maka bakteri tersebut menghasilkan granul
P(3HB) didalam selnya.
3.5.3 Pemurnian dan Penyimpanan Isolat Bakteri P(3HB)
Dilakuakan pembuatan stok murni dengan cara menginokulasikan koloni
bakteri yang telah menghasilkan hasil positif P(3HB) lalu di pindahkan pada
media agar miring medium CPO-Bakto Agar dan diinkubasi pada suhu 35-37°C
selama 24 jam. Kemudian disimpan pada suhu 4°C.
3.6 Produksi P(3HB) dengan Isolat Bakteri
3.6.1 Penyiapan Medium Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB)
1. Sumber Karbon
Sumber karbon yang digunakan dalam penelitian ini adalah CPO dengan
konsentrasi 4,6 g/L (Djamaan, 2014).
2. Sumber Nitrogen
Sumber nitrogen dibuat dengan melarutkan 1,1 (NH4)2HPO4 kedalam 1
liter air suling. Sumber nitrogen disterilkan dengan autoklaf pada suhu
121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit (Djamaan, 2015).
3. Pembuatan Larutan Mikroelemen
Pembuatan larutan mikroelemen dilakukan dengan cara melarutkan
sebanyak 2,78 g FeSO4.7H2O; 1,98 g MnCl2.4H2O; 2,81 g CuSO4.7H2O;
1,67 g CaCl.2H2O; 0,17 g CuCl2 dan 0,29 g ZnSO4.7H20 kedalam 1 liter
HCL 0,1 N. Larutan mikroelemen ini disterilkan dengan autoklaf pada
suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.
28
4. Pembuatan Larutan MgSO4.7H2O 1 M
Larutan MgSO4.7H2O 1 M dibuat dengan melarutkan 5 g MgSO4.7H2O 1
M ke dalam 20 mL air suling. Kemudian disterilkan dengan autoklaf pada
suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit (Djamaan, 2015).
5. Pembuatan Larutan Dapar Posfat pH-7
Larutan Dapar Posfat pH-7 dibuat dengan cara melarutkan 3,7 g KH2PO4
dan 5,8 K2HPO4 ke dalam 1 liter air suling, pH larutan diatur hingga
mendekati 7. Jika pH kurang dari 7 maka menaikinya dengan cara
penambahan NaOH 0,1 M. Kemudian larutan dapar ini disterilkan dengan
autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit (Djamaan,
2015).
3.6.2 Pembuatan Suspensi Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB)
Pembuatan suspensi bakteri bakteri penghasil P(3HB) dilakukan dengan
cara mengambil 1-2 ose koloni bakteri uji dari stok agar miring lalu dimasukan
kedalam 10 mL Na. Fisiologis 0,85% steril lalu divortex sampai homogen.
3.6.3 Pembuatan Inokulum Isolat Bakteri Penghasil P(3HB)
Kemudian isolat bakteri dibuat stok agar miring dan diinokulasikan 1-2
ose ke dalam 10 mL medium NaCl 0,85% steril untuk produksi P(3HB),
selanjutnya di shaker selama 24 jam dengan kecepatan 200 rpm. Setelah 24 jam,
sebanyak 3 mL kultur benih dipindahkan ke dalam 100 mL medium mineral
yang mengandung CPO 4,6 g/L di shaker kembali selama 24 jam pada suhu 30°C
dengan kecepatan 200 rpm di dalam labu erlemeyer.
29
3.6.4 Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri Penghasil Bioplastik
P(3HB)
Medium pengkulturan bakteri yaitu medium mineral spesifik dengan
komposisi untuk 1 liter medium adalah sebagai berikut : KH2PO4 3,7 g/L
(NH4)2HPO4 1,1 g/L, MgSO4.7H2O 0,25 g/L dan larutan mikroelemen 10 mL.
3.6.5 Pemisahan Biomassa dan Supernatan
Proses pemisahan biomassa dan supernatan dilakukan dengan proses
sentrifugasi, 100 mL sampel dengan menggunakan alat sentrifuge pada kecepatan
3000 rpm selama 20 menit. Lapisan bening supernatan dipisahkan dari endapan
biomassa dengan cara pemipetan. Lapisan supernatan digunakan untuk
menentukan pH, sedangkan biomassa yang dikeringkan dengan menggunakan
oven untuk menentukan berat kering dari kandungan P(3HB) (Djamaan, 2016).
3.7 Karakterisasi Penghasil P(3HB) Menggunakan FTIR (Fourier
Transform Infra-Red Analysis)
Sebanyak 1 mg sel kering bakteri dilarutkan dalam 5 mL kloroform.
Kloroform untuk memperbanyak PHB yang ada di dalam selnya. kloroform
kemudian diuapkan untuk mendapatkan bubuk P3HB, yang menjadikan sasaran
analisis FTIR menggunakan spektrofotometer FTIR. Spektrum direkam dalam
rentang 4000 cm-1 hingga 500 cm-1.
3.8 Karakterisasi Bakteri Panghasil Biopolimer
3.8.1 Makroskopik
Dilakukan identifikasi secara makroskopis dengan cara mengamati warna
koloni, bentuk koloni, pinggir koloni, permukaan koloni, dan elevasi koloni,
kemudian dicatat hasil pengamatan dalam bentuk tabel.
30
3.8.2 Mikroskopik
Dilakukan karakterisasi secara mikroskopis dengan cara mengamati
bentuk Sel, Pewarnaan Gram, dan Pewarnaan Endospora.
3.8.3 Pewarnaan Gram
Dilakukan pewarnaan gram dengan cara menyiapkan kaca objek bersih,
kemudian teteskan Nacl 0,85% steril diatas kaca objek tersebut, secara aseptis
diambil inokulum bakteri yang akan di periksa lalu difiksasi diatas nyala api
spiritus. Kemudian diteteskan kristal violet diatas sediaan dan ditunggu selama 10
menit lalu dibilas dengan aquadest, kemudian diteteskan larutan iodine pada
sediaan tersebut dan didiamkan selama 10 menit lalu di bilas dengan aqudest,
kemudian ditetesi dengan alkohol 96% dan dibiarkan selama 10 menit. Lalu di
bilas dengan aquadest. Kemudian di teteskan larutan safranin dan di diamkan
selama 3 menit lalu di bilas dengan aquadest. Kemudian dikeringkan lalu
diperiksa dibawah mikroskop. Bila sel bakteri bewarna unggu maka bakteri
tersebut merupakan kelompok bakteri Gram positif. Apabila sel bakteri tersebut
berwarna merah atau merah muda maka bakteri tersebut merupakan kelompok
bakteri Gram negatif. Dengan pewarnaan ini juga dapat terlihat bentuk sel bakteri
(Yulvizar, 2013).
3.8.4 Pewarnaan Endospora
Pewarnaan ini dilakukan menggunakan metode pewarnaan Klein. Kaca
objek yang kering dan bebas lemak dilewatkan diatas nyala api. Kemudian
diteteskan inokulum dan dikeringkan dan di keringkan dengan lampu spritus.
Kemudian diteteskan Melachit Green dan dipanaskan selama 10 menit, lalu di
dibilas dengan aquadest. Kemudian diteteskan Safranin dan didiamkan selama 20
31
detik, lalu dibilas dengan aquadest. Kemudian dikeringkan dan diamati dibawah
mikroskop (Misnadiarly & Husjain, 2014).
3.9 Uji Biokimia
Uji biokimia bakteri berupa dilakukan di Laboratorium Biota Sumatera,
Universitas Andalas. Uji yang dilakukan antara lain : uji katalase dan uji motilitas.
(Djamaan & Dewi, 2014).
3.9.1 Uji Katalase
Uji katalase dilakukan dengan cara meneteskan H2O2 3% pada kaca objek,
kemudian diambil satu ose bakteri lalu difiksasi di kaca objek setelah itu teteskan
H2O2 3% tersebut. Hasil dinyatakan positif apabila ada gelumbung atau gas yang
terbentuk (Cappucino & Welsh, 2017).
3.9.2 Uji Motilitas
Pengujian ini dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri pada
media tegak semi solid yang di inkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC.
Kemudian diamati perubahan yang terjadi. Jika bakteri tumbuh hanya di bagain
inokulum saja berarti bakteri non-methyl sedangkan bakteri motil akan tumbuh
dan menyebar hingga permukaan (Cappucino dan sherman, 2014).
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
1. Hasil isolasi dari sampel tanah tambang dengan menggunakan media CPO
bakto agar di dapatkan 30 isolat bakteri. Di antaranya 4 isolat bakteri yang
menghasilkan fluoresensi jingga yang berindikasi sebagai penghasil
bakteri P(3HB) (Lampiran 2).
2. Hasil Karakterisasi Bakteri Penghasil P(3HB), didapatkan :
a. Pengamatan uji makroskopik hasil yang diamati berupa bentuk,
warna, permukaan, elevasi, dan pinggir dari isolat bakteri penghasil
P(3HB) sebagai berikut: (Lampiran 3)
- ITB 4.2 : bulat, putih, kasar, timbul, bergelombang
- ITB 7.3.1 : bulat, putih, kasar, timbul, bergelombang
- ITB 8.1.2 : bulat, putih, licin, timbul, bergelombang
- ITB 10.1 : bulat, putih, licin, timbul, rata
b. Pengamatan uji mikroskopik berdasarkan bentuk bakteri dan
pewarnaan Gram : (Lampiran 4)
- ITB 4.2 : Basil, Gram positif
- ITB 7.3.1 : Basil, Gram positif
- ITB 8.1.2 : Basil, Gram positif
- ITB 10.1 : Basil, Gram positif
33
c. Pengamatan uji mikroskopik berdasarkan pewarnaan endospora :
(Lampiran 4).
- ITB 4.2 : positif endospora
- ITB 7.3.1 : positif endospora
- ITB 8.1.2 : positif endospora
- ITB 10.1 : positif endospora
d. Pengamatan uji biokimia hasil yang diamati berupa karakteristik uji
katalase dan uji motilitas (Lampiran 5).
e. Hasil sentrifus untuk mengetahui berat dari biomassa dan pH
(Lampiran 6).
f. Hasil karakterisasi menggunakan spektroskopi FTIR ( Lampiran 7).
4.2 Pembahasan
Pada penelitian ini dilakukan, isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil
P(3HB) dari tanah tambang batubara Bengkulu Utara, dimana sampel tanah di
ambil di daerah tambang sebanyak 10 titik pada jarak 25-30 meter. Kemudian
tanah di masukan kedalam plastik klip lalu dimasukan kedalam lemari pendingin
bertujuan untuk pengawetan tanah sehingga tidak di tumbuhi oleh jamur. Sampel
tanah ini diambil karena tanah mengandung unsur seperti karbon yang tinggi,
hidrogen, dan oksigen dalam tanah tambang sehingga berpotensi menghasilkan
bakteri penghasil P(3HB). Karena tanah tambang ini sudah memiliki unsur karbon
yang tinggi sehingga media yang digunakan yaitu CPO bakto agar, CPO
mengandung unsur karbon sehingga unsur nitrogen yang di dapat sangat sedikit
sekali. Hal ini di dukung oleh Djamaan (2015), yang menyatakan bahwa bakteri
yang ditumbuhkan dengan sumber karbon berlebih dan mengurangi unsur penting
34
lainnya, seperti nitrogen mengakibatkan pertumbuhan bakteri yang tidak
seimbang, sehingga bakteri cenderung untuk mengkonsumsi sumber karbon
secara berlebihan dan menyimpan sebanyak-banyaknya granul cadangan makanan
di dalam selnya. Cadangan makanan ini yang merupakan biopolimer P(3HB).
Pour Plate Method, metode yang digunakan dalam penelitian untuk
menumbuhkan bakteri. Tanah di suspensikan pada pengenceran 10-4,
pengenceran ini bertujuan agar bakteri yang telah di inkubasi pada suhu 35-37ºC
selama 24-48 jam terbentuk koloni pada cawan yang berisi media dalam jumlah
yang dapat di hitung serta memudahkan pengidentifikasian. Setelah bakteri
tumbuh dalam bentuk beberapa koloni yang tersebar di atas permukaan media,
maka di lakukan pemurnian pada koloni berdasarkan bentuk, ukuran, permukaan,
elavasi dan warna. Setelah koloni semuanya sama maka di lakukan skrining
menggunkan larutan Nile Blue A dan di amati di bawah sinar UV 365 nm, jika
bakteri berfluoresensi jingga maka bakteri positif penghasil P(3HB). Nile Blue A
merupakan larutan senyawa yang larut dalam lipid yang berikatan dengan P(3HB)
dalam sel bakteri. Butiran PHA yang terkandung dalam tubuh bakteri akan
berfluoresensi jingga ketika ditetesi dengan larutan Nile Blue A dan diamati
dibawah sinar Uv dengan panjang gelombang 365 nm.
Dari 30 isolat bakteri yang didapat, kemudian di lakukan penapisan
dengan larutan Nile Blue A yang diamati di bawah sinar UV dengan panjang
gelombang 365 nm, didapatkan 4 isolat bakteri positif penghasil P(3HB) dengan
kode bakteri ITB 8, ITB 15, ITB 20, dan ITB 29 yang positif menghasilkan warna
fluoresensi jingga yang berindikasi sebagai penghasil bakteri P(3HB) (Lampiran
2). Hal tersebut disebabkan ke empat bakteri menghasilkan senyawa enzim
35
P(3HB) di dalam sel yang ditunjukan oleh adanya gen pha A, pha B dan pha C
oleh sebab itu bakteri tersebut memiliki kemampuan untuk membentuk granula-
granula cadangan makanan P(3HB) bagi bakteri yang dapat di deteksi dengan
terpacarnya warna fluoresensi jingga pada saat penambahan larutan Nile Blue A
yang dapat di amati di bawah sinar UV 365 nm. Ostle and Holt (1982),
melaporkan bahwa larutan Nile Blue A mampu berikatan dengan senyawa P(3HB)
di dalam sel bakteri. Granula P(3HB) yang terdapat dalam sel bakteri yang positif
P(3HB) akan menunjukan warna fluoresensi jingga dengan pemberian larutan
Nile Blue A yang dilihat dari sinar UV 365 nm. Dua puluh enam bakteri yang
tidak berfluoresensi jingga munculnya warna kehitaman pada beberapa koloni.
Hal ini terjadi karena gen yang mengkode enzim PHB-synthase tidak
terepreksikan sehingga enzim tersebut tidak tersintesis. Sesuai dengan pendapat
Agustien dan Hakam (2002).
Bakteri positif penghasil P(3HB) yang berbeda di inokulasi kan ke dalam
media CPO, lalu di fermentasi di rotary shaker inkubator pada kecepatan 200 rpm
dengan suhu 30ºC. Pengoncangan dengan menggunakan rotary shaker inkubator
ini adalah agar campuran dalam medium pertumbuhan bakteri menjadi homogen
sehingga nutrisi yang terdapat pada medium dapat digunakan dengan efektif dan
dapat digunakan secara maksimal (Djamaan, 2015). Media sumber karbon yang
digunakan bakteri penghasil P(3HB) yaitu CPO, tujuannya agar bakteri penghasil
P(3HB) ini dapat beradaptasi serta merangsang dan memperbanyak terbentuknya
P(3HB). Di dalam sel bakteri P(3HB), biopolimer tersebut di simpan berupa
granul-granul cadangan makanan yang tersebar di dalam cairan sitoplasma yang
akan digunakan kembali oleh bakteri jika kondisi pada lingkungan kurang
36
mengutungkan atau kehabisan sumber makanan. Menurut Agustien (2001) bahwa
strain AAP-17 mampu mengakumulasikan granul polimer P(3HB) dalam selnya
sebesar 60% Alcaligenes eutropus merupakan satu dari bakteri penghasil P(3HB)
yang dilaporkan mampu menghasilkan P(3HB) di dalam selnya mencapai 85%
dari berat selnya dengan menggunakan asam butirat sebagai sumber karbon
tunggal.
Setelah di lakukan fermentasi selanjutnya inokulum fermentasi di
sentrifugasi dengan alat sentrifuge pada kecepatan 3000 rpm dalam waktu 20
menit. Untuk memisahkan antara supernatan dan biomassa, dimana lapisan bawah
adalah biomassa. Larutan supernatan di ukur kadar pH. Pengukuran kadar pH
menggunakan pH meter. Pengukuran pH dilakukan untuk mengetahui tingkat
keasaman dari hasil akhir proses fermentasi dan melihat pengaruhnya terhadap
produksi biomassa lalu dikeringkan dalam oven 70ºC hingga bobot konstan.
(Lampiran 6). Bakteri yang positif menghasilkan bakteri P(3HB) kemudian di
remajakan pada stok agar miring untuk dilanjutkan uji karakterisasi berupa uji
pewarnaan Gram, pewarnaan endospora, karakterisasi FTIR serta uji biokimia
seperti uji katalase dan uji motilitas.
Pada pengujian karakteristik mikroskopik pewarnaan Gram ke empat
isolat bakteri penghasil P(3HB) yang di amati di bawah mikroskop perbesaran
10x100 pada pewarnaan Gram ini empat isolat bakteri menunjukan Gram positif,
bakteri Gram positif memiliki dinding sel seperti jala yang tebal yang terbuat dari
peptidoglikon yang tebal dimana kelompok bakteri Bacillus spp ini memiliki
kandungan lemak yang rendah, sehingga dinding sel lebih mudah terhidrasi akibat
perlakuan alkohol yang menyebabkan pori-pori sel menjadi lebih kecil dan
37
permeabilitasnya berkurang sehingga zat warna kristal violet yang merupakan zat
warna utama tidak dapat keluar dari sel (Lampiran 4.)
Pada pengujian pewaranaan endospora ke empat isolat bakteri penghasil
P(3HB) positif endospora di dalam sel bakteri (Lampiran 4). Pembentukan
endospora ini terjadi karena struktur bakteri dapat bertahan pada keadaan seperti
kekeringan, kekurangan nutrisi, dan suhu ekstrem. Pembentukan endospora
disebabkan karena adanya gen spesifik yang digunakan dalam proses sporulasi
yaitu spo HA, spo HE, dan spo HG. Menurut Errington (2003), komponen
regulator transkripsi sangat berperan penting dalam pembentukan spora yang
disebut dengan Spo OA. Spo OA dibentuk untuk mengontrol proses transkripsi
dan aktivitas protein melalui proses fosforilasi. Fosforilasi Spo OA merupakan
regulator sporulasi yang sangat penting dan bekerja mengaktifkan transkripsi pada
beberapa proses sporulasi. Menurut Willey (2008), endospora dapat di temukan
pada bagian ujung sel vegetatif (terminal), sentral, subterminal, dan swollen
sporangium.
pengujian biokimia ke empat isolat bakteri penghasil P(3HB) di lakukan
uji katalase dan empat isolat bakteri tersebut positif katalase (Lampiran 5).
Berdasarkan uji katalase terbentuknya gelembung udara (gas) merupakan
kelompok bakteri Aerob, bakteri in menggunakan oksigen untuk menghasilkan
energi. Hidrogen peroksida (H2O2) bersifat toksik sehingga dengan cepat dapat
merusak komponen sel bakteri. Dengan adanya enzim superoxide dismustase
sehingga memecah superoxide menjadi air. Sehingga H2O2 akan di katalis
menjadi H2O menjadi O2. Pada pengujian biokimia motilitas ke empat isolat
bakteri penghasil P(3HB) positif motilitas (Lampiran 5). Menurut Tarigan (2008),
38
bakteri di katakan motil apabila bakteri bergerak tumbuh dan menyebar ke seluruh
media dan dikatakan non motil jika tumbuh pada daerah inokulasi saja.
Pergerakan bakteri dapat disebabkan karena bakteri memiliki flagel (gerak aktif)
atau pun karena faktor dari luar (gerak Brown). Gerak Brown merupakan gerakan
secara acak yang disebabkan karena adanya benturan dari molekul-molekul dalam
medium.
Karakterisasi menggunakan FTIR (Fourier Transform Infra-Red Analysis)
pada bakteri penghasil P(3HB) dihasilkan beberapa puncak bilangan di setiap
rentang wilayahnya (Lampiran 7). Pada rentang wilayah I pada isolat bakteri
dengan kode sampel ITB 8, terdapat puncak dengan bilangan gelombang 2921.63
cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-H, pada wilayah II rentang
bilangan gelombang 1742.34 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C=O
dan pada wilayah III rentang bilangan gelombang 1233.68 cm-1 puncak tersebut
merupakan gugus fungsi C-O. Pada isolat bakteri dengan kode sampel ITB 15,
terdapat pada puncak dengan bilangan gelombang 2922.46 cm-1 puncak tersebut
merupakan gugus fungsi C-H, pada wilayah II rentang bilangan gelombang
1701.33 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C=O, pada wilayah III
rentang bilangan gelombang 1232.89 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus
fungsi C-O. Pada isolat bakteri dengan kode sampel ITB 20 terdapat pada puncak
dengan bilangan gelombang 2918.56 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus
fungsi C-H, pada wilayah II rentang bilangan gelombang 1647.55 cm-1 puncak
tersebut merupakan gugus fungsi C=O, dan pada wilayah III rentang bilangan
gelombang 1233.39 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-O. Pada
isolat bakteri dengan kode sampel ITB 29 terdapat pada puncak dengan bilangan
39
gelombang 2922.08 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-H, pada
wilayah II rentang bilangan gelombang 1740.92 cm-1 puncak tersebut merupakan
gugus fungsi C=O, dan pada wilayah III rentang bilangan gelombang 1233.28 cm-
1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-O. Yang dapat dilihat pada tabel di
bawah :
Tabel karakterisasi FTIR
Gugus
Fungsi
Rentang
Bilangan
Gelombang
(cm-1)
(Literatur)
Bilangan Gelombang cm-1
Standar ITB 4.2 ITB 7.3.1 ITB 8.1.2 ITB 10.1
C – H 1852-2976 2932 2921 2922 2918 2922
C = O 1640-1790 1719 1742 1701 1647 1740
C – O 1057-1277 1275 1233 1232 1233 1233
Hasil karakteristik dengan FTIR ini menunjukan bahwa, pada rentang
FTIR standar dan FTIR sampel uji dapat terbaca dan terdapat gugus fungsi
dimana C-H itu gugus (alkana), C-O terdapat gugus (Alkohol, ester, asam
karboksilat), dan gugus fungsi C=O terdapat gugus (keton dan aldehid).
Pada struktur di atas merupakan struktur dari bakteri penghasil P(3HB),
(Djamaan, 2015) pada struktur P(3HB) diatas menunjukan dimana terdapat gugus
C-H, C=O, dan C-H.
40
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan, dapat di peroleh kesimpulan sebagai
berikut :
1. Dari hasil isolasi tanah tambang dengan menggunakan media CPO bakto agar
ini di dapatkan 30 isolat bakteri dan yang menghasilkan bakteri penghasil
P(3HB) ini ada 4 isolat diantarnya dengan kode sampel ITB 4.2, ITB 7.3.1,
ITB 8.1.2 dan ITB 10.1.
2. Pada pengujian pewarnaan Gram bakteri penghasil P(3HB) memiliki
karakteristik seperti bentuk koloni bulat, dinding sel tebal, membran sel
selapis, dan tidak memiliki membran luar, pada ke empat isolat bakteri
menunjukan bakteri Gram positif dimana secara pengamatan bentuknya basil
dan menunjukan warna ungu pada selnya. Pada pengujian uji biokimia bakteri
penghasil P(3HB) ke empat isolat bakteri positif katalase, positif motilitas dan
berdasarkan identifikasi pewarnaan yang telah dilakukan didapatkan ke empat
bakteri bentuknya basil, Gram Positif dan positif endospora. Gugus fungsi
yang terdapat pada bakteri penghasil P(3HB) yang di analisis menggunakan
FTIR diantaranya adalah C-H, C=O dan C-O.
5.2 Saran
Disarankan untuk melakukan optimasi fermentasi pada ke empat isolat
bakteri penghasil P(3HB), uji biokimia, dan identifikasi uji molekuler pada ke
empat isolat bakteri tersebut.
41
DAFTAR PUSTAKA
Afiifah, R,. Novita, I,. M. Hendra,. S. Ginting, 2015. Pengaruh berat pati dan
volume Plasticizer gliserol terhadap karakteristik film bioplastik pati
kentang. Jurnal Teknik Kimia USU. 4 : 35-39.
Agustien, A. Dan A. D. Hakam,. 2002. Produksi bioplastik poli (3-hidroksibutirat)
dari bakteri rekombinan Escherichia coli. Jurnal Kimia Andalas Volume.
8 : 38-41.
Agustien, A,. 2001. Produksi bioplastik dan bakteri isolat lokal. JUMPA
Volume 10 : 22-25.
Al-Mohanna MT,. 2016. Morphology and Classification of bacteria. University of
Al-Qadisiyah.
Anam C, Sirojudin, Firdausi KS,. 2007. Analisis gugus fungsi pada sampel uji
bensin dan spiritus menggunakan metode spektroskopi FTIR.
Berkala Fisika Volume. 10 : 79-80.
Arikan E, B., and Ozsoy H. D., 2015. A Review: Investigation of Bioplastics,
Civil Engineering and Architecture. 9 : 188-192.
Chen J, Zhang L, Chen J, Chen G,. 2007. Biosynthesis and Characterization of
polyhydroalkanoate copolyvesters in Ralstonia eutropha P3HB - 4
harboring a low-substrate-specifity PHA synthase PhaC2Ps From
Pseudomonas stutzeri 1317. Chin. J. Chem. Eng. 15 : 391-396.
Capuccino J.G, Sherman N,. 2014. Microbiology: A Laboratory Manual. 10th
Ed. New York : Person.
Capuccino J.G, Chad Welsh,. 2017. Microbiology: A Laboratory Manual. 11th
Ed. New York : Person.
Djamaan, A. dan Dewi, A. P., 2014. Metode produksi Biopolimer dari minyak
kelapa sawit, Asam Oleat, dan Glukosa. Padang : Andalas University Press.
Djamaan, A,. 2015. Konsep Produksi Biopolimer P(3HB) dan (P3HB-ko-3HV)
secara Fermentasi. Padang: Andalas University Press.
Daniel RA, Errington J,. 2003. Control of cell morphogenesis in bacteria : two
distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 6 : 767.
Gemeidiya, R,. 2016. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Penghasil Bioplastik Poli
(3–Hidroksibutirat) Dari Tanah Puncak Gunung Merapi yang Ditumbuhkan
Dalam Media Minyak Kelapa Sawit-Bakto Agar. [Skripsi]. Farmasi Unand.
Padang.
42
Gill, M,. 2014. Bioplastic: A Better Alternative To Plastics, International Journal
Of Research in Applied. 2 : 115-120.
Haedar A, RB Gobel, R Umar, Ambeng,. 2013. Seleksi Bakteri dari Limbah dan
Tanah Pabrik Gula Arasoe-Kab.Bone. Sebagai Penghasil Poli-B-
Hidroksibutirat (Bioplastik). Bandung: Universitas Padjajaran.
Handrick, R., S. Reindart, D. Schultheiss, T. Reichart, D. Schuler, V. Jendrossek
and D. Jendrossek,. 2004. Unravelling the fuction of the Rhodospirilium
rubrum. Activator of Polyhydroxybutirate (PHB) Degradation: The
activator is PHB granule-bound protein (Phasin).
J. Bacteriology 186 : 2466-2475.
Harianto F,. 2011. Penapisan Bakteri Penghasil Bioplastik Poli (3-Hidroksibutirat)
dari Sampel Tanah Hutan Pendidikan dan penelitian Biologi, Kampus
Unand, Limau Manis, Padang. [Skripsi]. Padang. Universitas Andalas.
Irwandi, Djamaan A, Agustien A,. 2018. Produksi Bioplastik P(3HB) Dari Bahan
Dasar Minyak Kelapa Sawit dengan Isolat Bacillus sp.
Chempublish Journal, Volume 3 : 85-93.
Jaya, D,. 2017. Dewatering of Coal from Jorong Kalimantan Selatan using
Residu of Cooking Oil and Kerosene. Eksergi. 14 : 35.
Kismiyati, Subekti S, Yusuf RWN, Kusdarwaty S,. 2009. Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Maskoki (carassius auratus) Akibat
Infestasi Ektoparasit argulus sp Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan 1: 2.
Kusuma, F., Haedar, N. dan Abdullah A,. 2014. Optimalisasi Produksi Poli-𝜷-
Hidroksi Butirat (PHB) Dari Berbagai Sumber Karbon Oleh Isolat Bakteri
Dari Limbah Pabrik Gula Takalar. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin. Makassar.
Lee AJ, Dawes EA,. 1990. Occurence, metabolism, metabolic role, and industrial
uses of bacterial of polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. 54 : 450-472.
Misnanadiarly, AS, Husjain Djajaningrat,. 2014. Mikrobiologi Untuk Klinik Dan
Laboratorium. PT Rineka Cipta, Jakarta.
Nureleana H, Sarudu, Onni S, Selaman, Rubiyah Baini, and Nor Azalina Rosli,.
2015. Evaluation on factors affecting bacteria growth in collected
rainwater. Journal of Faculty of Engineering. 6 : 11-17.
Ostle, G. A and Holt, J. G,. 1982. Nile Blue A as a flourescent stain for poly-β-
hidroxybutyrate. Appl environ microbial. 44 : 23-241.
43
Rakesh P, Charmi P,. 2014.Quantitative Analytical applications of FTIR
Spectroscopy in Pharmaceutical and Allied Areas; J. Adv. Pharm. Edu. &
Res. 4 : 145-57.
Rohman, A,. 2012. A Review : Applications Of Fourier Transform Infrared
Spectroscopy For Quality Control Of Pharmaceutical Products. 23 : 1-8.
Seon-Won Kim, Pil Kim, Jung H. Kim,. 1999. Production of Poly (3-
hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from Methylobacterium
organophilum by potassium-limited feed-batch culture. Enzyme and
Microbial Technology. 24 : 555-560.
Samsul, A, Bungaran, S, Elvi, K,. 2017. Studi pembuatan bahan alternatif plastik
biodegradable dari pati ubi jalar dengan plasticizer gliserol dengan metode
melt intercalation. Jurnal Teknik Mesin Universitas Bhayangkara.
06 : 79-84.
Scott, G,. 1994. Enviromental Biodegradation of hydrocarbon polymers, in
Biodegradable Plastic and polymers, (Eds. Doi. Y and K. Fukuda),
Amsterdam: Elsevier sciene. B. V. 79-105.
Suardi M, Hamdani AS, Ariyati B, Suci RP, Djamaan A,. 2018. Utilization of
Rice Straw (Oryza sativa Linn) Agricultural Waste as Substrate for Poly (3-
Hydroxybutarate) Production Using Pseudomonas aeruginosa. Journal of
Pure and Applied Microbiology. 12 : 3.
Susanti, M,. 2010. Produksi Bioplastik Poli (3-Hidroksibutirat) (P(3HB)) Secara
Proses fermentasi Menggunakan Bakteri Bacillus brevis FACC-20801 dari
Minyak Kelapa Sawit Sebagai Sumber Karbon. [Skripsi]. Padang. Stifarm.
Swift, YA,. 1996. Bacteriacal Polyhidroxyalkanoates. Biotechnology.
Bioenginering. 49 : 1-14.
Tarigan, J,. 2008. Penghantar Mikrobiologi. Depdiknas. Jakarta.
Valappil, S.P, Misra, S.K, Boccaccini, A, R., Keshavarz, T, Bucke, C. Dan Roy,
I,. 2007. Large scale production and efficient recovery of phb with desirable
material properties, from the newly characterised Baccilus cereus SPV.
Journal of Biotechnology. 132 : 251-258.
Van Der Zee M, E Pras, J Van Haveren, R Van Tuil,. 2001. Recent Advencement
in The Development of Material and Products from Renewble Resources.
ATO, Business Unit Renewble Resources. Department Polymer
Composites and Additives Wageningen. Netherland.
Vinod PS, Kulkarni DS, Sulochana MB,. 2018. Production and
Characteriization of Polyhyroxybutirate from Halophilic Bacteria. Volume
4 : 44-52.
44
Watson D G,. 2010. Analisis Farmasi, Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan
Praktisi Kimia Farmasi edisi 2. Jakarta: EGC.
Yogesh C, Bhavana P, Fulekar,. 2012. PHA production Application and its
Bioremidiation in environment. I. Res. J.Environment Sci Volume 1 : 46 -52.
Yuniarti L.I, Hutomo Gatot S, dan Abdul Rahim,. 2014. Sintesis dan karakterisasi
bioplastik berbasis pati Sagu (metroxylon sp). Agrotekbis, 21 : 38-46.
Yuwono, S, S,. Waziiroh E,. 2017. Teknologi Pengolahan Pangan Hasil
Perkebunan. Malang: UB Press. 103-104.
45
Sampel Tanah Tambang
Lampiran 1. Skema Kerja
Isolasi Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB)
Pengenceran
bertingkat 10-4
Inkubasi pada suhu
35-37°C
selama 24-48 jam
Inkubasi pada suhu
35-37°C
selama 24-48 jam
panjang gelombang
Uv 365
Suspensi Tanah
Media Bakto Agar
+CPO
Media Bakto Agar + CPO Media Bakto Agar + CPO
Koloni Terpisah
Koloni Terpisah
Dipilih Bakteri yang
menunjukan positif P(3HB) Fluorensensi jingga
Stok Agar Miring
Bakteri positif P(3HB)
46
Fermentasi Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB)
Ditambah
(CPO), Shaker
200 rpm
selama 24 jam
Suhu 30°C
Sentrifus
Cairan
Dikeringkan
suhu 70°C 24 jam, di timbang
Stok Bakteri
Agar Miring Suspensi Bakteri
Isolat Bakteri
Inokulum Bakteri Uji Biokimia Uji Mikroskopis Uji Makroskopis
PH
Hitung Jumlah
Biomassa
Kultur Bakteri
Supernatan
Endapan
Sel kering dilarutkan dalam
kloroform
FTIR
Pengamatan Warna,
bentuk, Pinggir,
Permukaan, Elevasi.
Pengamatan,
Bentuk Sel,
Pewarnaan
Gram,
Pewarnaan
Endospora
Uji Katalase
Uji Motilitas
47
Lampiran 2. Isolasi Tanah Tambang Menggunakan Media CPO Bakto Agar
Titik Pengambilan Sampel Jumlah Koloni Bakteri Positif P(3HB) / Kode
Sampel
Titik 1 2 koloni -
Titik 2 2 koloni -
Titik 3 2 koloni -
Titik 4 2 koloni 8
Titik 5 2 koloni -
Titik 6 2 koloni -
Titik 7 6 koloni 15
Titik 8 8 koloni 20
Titik 9 2 koloni -
Titik 10 2 koloni 29
Jumlah 30 koloni 4 isolat
Lampiran 3. Pengamatan Makroskopik Isolat Bakteri
Kode Isolat
Bakteri
Bentuk Warna Permukaan Elevasi Pinggir
ITB 4.2 Bulat Putih Kasar Timbul Bergelombang
ITB 7.3.1 Bulat Putih Kasar Timbul Bergelombang
ITB 8.1.2 Bulat Putih Licin Timbul Bergelombang
ITB 10.1 Bulat Putih Licin Timbul Rata
Lampiran 4. Pengamatan Uji Mikroskopik
Kode Isolat
Bakteri
Pewarnaan Gram
(+/-)
Bentuk Sel Bakteri Pewarnaan Endospora
(+/-)
ITB 4.2 + Basil +
ITB 7.3.1 + Basil +
ITB 8.1.2 + Basil +
ITB 10.1 + Basil +
Lampiran 5. Pengamatan Uji Biokimia
No Pengamatan Isolat Bakteri
ITB 4.2 ITB 7.3.1 ITB 8.1.2 ITB 10.1
1. Aerob/Anaerob Aerob Aerob Aerob Aerob
2. Uji Katalase + + + +
3. Uji Motilitas + + + +
48
Lampiran 6. Jumlah Biomasaa Bakteri Penghasil P(3HB)
No Kode Isolat Biomassa (mg/100 mL) pH
1 ITB 4.2 0,542 g 5,72
2 ITB 7.3.1 0,542 g 5,82
3 ITB 8.1.2 0,551 g 5,71
4 ITB 10.1 0,342 g 5,55
Lampiran 7. Karakterisasi FTIR
Gugus
Fungsi
Rentang
Bilangan
Gelombang
(cm-1)
(Literatur)
Bilangan Gelombang cm-1
Standar ITB
4.2
ITB
7.3.1
ITB
8.1.2
ITB
10.1
C – H 1852-2976 2932 2921 2922 2918 2922
C = O 1640-1790 1719 1742 1701 1647 1740
C – O 1057-1277 1275 1233 1232 1233 1233
49
Lampiran 8. Sampel Tanah Tambang, Bengkulu Utara
Kode
Sampel
Penampakan Tanah Keterangan
Titik 1
Warna: coklat gelap
Titik 2
Warna: merah gelap
Titik 3
Warna: merah terang
Titik 4
Warna: hitam
Titik 5
Warna: merah terang
50
Titik 6
Warna: coklat gelap
Titik 7
Warna: coklat gelap
Titik 8
Warna: merah terang
Titik 9
Warna: coklat terang
Titik 10
Warna: merah gelap
51
Lampiran 9. Isolasi Bakteri Penghasil P(3HB) Menggunakan Media CPO
Bakto Agar
No Nomor
Sampel
Jumlah
Koloni
Jumlah
Sel CFU
Foto Hasil Isolasi
1. Sp 1 Tersebar
2. Sp 2 92 9,2 X 105
3. Sp 3 Tersebar
4. Sp 4 30 3,0X 105
52
5. Sp 5 300 3,0 X 106
6. Sp 6 Tersebar
7. Sp 7 80 8,0 X 105
8. Sp 8 94 9,4 X 105
9. Sp 9 58 5,8 X 105
53
10. Sp 10 Tersebar
54
Lampiran 10. Skrining Bakteri P(3HB) Menggunakan Sinar UV 365 nm
Gambar 5. Skrining Bakteri Penghasil P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A pada
media CPO Bakto Agar, Kode Isolat ITB 4.2
ITB 4.2
55
LANJUTAN
Gambar 6. Skrining Bakteri Penghasil P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A pada
media CPO Bakto Agar, Kode Isolat ITB 7.3.1
ITB 7.3.1
56
LANJUTAN
Gambar 7. Skrining Bakteri Penghasil P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A pada
media CPO Bakto Agar, Kode Isolat ITB 8.1.2
ITB 8.1.2
57
LANJUTAN
Gambar 8. Skrining Bakteri Penghasil P(3HB) dengan Larutan Nile Blue A pada
media CPO Bakto Agar, Kode Isolat ITB 10.1
ITB 10.1
58
Lampiran 11. Isolat Bakteri P(3HB) pada Media Agar Miring
Keterangan :
1. Isolat Bakteri ITB 4.2
2. Isolat Bakteri ITB 7.3.1
3. Isolat Bakteri ITB 8.1.2
4. Isolat Bakteri ITB 10.1
ITB 4.2 ITB
7.3.1
ITB 8.1.2
ITB 10.1
59
Lampiran 12. Fermentasi isolat bakteri P(3HB)
Keterangan :
1. Cairan Fermentasi Isolat Bakteri ITB 4.2
2. Cairan Fermentasi Isolat Bakteri ITB 7.3.1
3. Cairan Fermentasi Isolat Bakteri ITB 8.1.2
4. Cairan Fermentasi Isolat Bakteri ITB 10.1
60
Lampiran 13. Biomassa Kering Bakteri Penghasil P(3HB)
Keterangan :
1. Biomassa Bakteri P(3HB) ITB 4.2
2. Biomassa Bakteri P(3HB) ITB 7.3.1
3. Biomassa Bakteri P(3HB) ITB 8.1.2
4. Biomassa Bakteri P(3HB) ITB 10.1
61
Lampiran 14. Karakterisasi FTIR
Gambar 9. Spektrum FTIR P(3HB) Standar (Aldrich, Chemical)
62
LANJUTAN
Gambar 10. Spektrum FTIR Senyawa PHB yang di isolasi dari Sel Kering Isolat
Bakteri ITB 4.2
63
LANJUTAN
Gambar 11. Spektrum FTIR Senyawa PHB yang di isolasi dari Sel Kering Isolat
Bakteri ITB 7.3.1
64
LANJUTAN
Gambar 12. Spektrum FTIR Senyawa PHB yang di isolasi dari Sel Kering Isolat
Bakteri ITB 8.1.2
65
LANJUTAN
Gambar 13. Spektrum FTIR Senyawa PHB yang di isolasi dari Sel Kering Isolat
Bakteri ITB 10.1
66
Lampiran 15. Pengamatan Bentuk Sel Bakteri pada Pewarnaan Gram
Bakteri Penghasil P(3HB)
Kode
Sampel
Gambar Keterangan
ITB 4.2
Kode Isolat : 8
Pewarnaan Gram : Gram Positif (+)
Bentuk Sel : Basil
ITB
7.3.1
Kode Isolat : 15
Pewarnaan Gram : Gram Positif (+)
Bentuk Sel : Basil
ITB
8.1.2
Kode Isolat : 20
Pewarnaan Gram : Gram Positif (+)
Bentuk Sel : Basil
ITB 10.1
Kode Isolat : 29
Pewarnaan Gram : Gram Positif (+)
Bentuk Sel : Basil
67
Lampiran 16. Pengamatan Pewarnaan Endospora
Kode
Sampel
Gambar Keterangan
ITB 4.2
Positif Endospora
ITB
7.3.1
Positif Endospora
ITB
8.1.2
Positif Endospora
ITB 10.1
Positif Endospora
68
Lampiran 17. Pengamatan Uji katalase
Kode
Sampel
Gambar Keterangan
ITB 4.2
Positif Katalase
ITB
7.3.1
Positif Katalase
ITB
8.1.2
Positif Katalase
ITB 10.1
Positif Katalase
69
Lampiran 18. Pengamatan Uji Motilitas
Keterangan :
1. Positif Motilitas ITB 4.2
2. Positif Motilitas ITB 7.3.1
3. Positif Motilitas ITB 8.1.2
4. Positif Motilitas ITB 10.1
70
Lampiran 19. Alat yang digunakan pada penelitian ini
No Alat Keterangan
1
Inkubator digunakan untuk
menginkubasi atau
menyimpan sampel pada
temperatur tertentu.
2
Laminar Air Flow (LAF)
digunakan untuk
memindahkan atau
mensubkultur biakan
mikroorganisme.
3
Autoklaf sterilisasi basah
yang digunakan untuk
mensterilisasi peralatan
kimia dan media terhadap
suhu dan tekanan tinggi
yaitu 121ºC selama 15-20
menit.
71
4
Hot Plate digunakan untuk
memanaskan larutan dan
mehomogenkan larutan
media.
5
Timbangan Analitik
digunakan untuk
menimbang bahan atau
media yang akan
digunakan.
6
Rotary Shaking Inkubator
digunakan untuk
memelihara atau
menginkubasi biakan
mikroorganisme pada suhu
optimum dengan
pengocokan dengan
kecepatan 200 rpm pada
suhu 30ºC.
7
Vortex digunakan untuk
homogenisasi cairan.
72
8
Sentrifuse: digunakan
untuk memisahkan suatu
larutan berdasarkan berat
jenisnya.
9
FTIR (Fourier Transform
Infra-Red Analysis)
digunakan untuk
menetukan gugus fungsi
yang terdapat pada sampel
yang di uji.
10
P(3HB) Standar
(Alderich, Chemical)