Elektroforeza serumskih proteina

Jasna Pavela

Elektroforeza

Elektroforeza

Koristi se za separaciju makromolekula (proteini,nukleinske

kiseline ,lipoproteini itd.)

Putovanje nabijenih čestica u elekričnom polju

U vodenoj otopini proteini imaju nabijene skupine npr,

karboksilna COO- ( Asp, Glu ), amino NH3+ (Lys, Arg) stoga

mogu putovati u električnom polju. Amino skupine disociraju u

alkalnom pH, a karboksilne kod kiselog pH. pH kod kojeg je

molekula neutralna ( Zwitter ion ) zove se izoelektrična točka pI

proteina

Elektroforeza

Migracija molekula ovisi o naboju molekule ( kationi ili anioni )- mrežni naboj ( -ve, +ve)

veličini i obliku molekule ( veće molekule sporije putuju)

jačini el.polja ( gustoća ionskog polja utječe na brzinu

putovanja-gušće polje usporava migraciju)

svojstvima nosača na kojem se odvija ( veličina pora,

interakcija sa uzorkom)

temperaturi

efektu endoosmoze

Elektroforeza

Vrste elektroforeze

1.) slobodna eletroforeza izvodi se u tekućem mediju razdvajanje

se vrši na osnovu različite gustoće proteina

2.) zonska elektroforeza odvija se u solidnom mediju ( škrob,

papir, celuloza acetat, agaroza, poliakrilamid gel )

Prva elektroforeza izvedena je 1930 god. Tiselius

Kapilarna elektroforeza- CZE

Kombinira principe razdvajanja

konvencinalnih oblika elektroforeze sa

HPLC i kapilarnom tehnologijom

Odvija se u tekućem sistemu u kapilarma

od stopljenog silikata koje imaju

negativan naboj na površini

Mehanizam zaslužan za radvajanje –

elektroosmotski protok( EOF)

Elektroendosomoza – negativno nabijeni

proteini putuju prema negativno

nabijenom polu- katodi zbog vezivanja

iona pufera na negativno nabijene

silanolne skupine u zidu kapilare

Posljedica - putovanje iona vode i

nabijenih proteinskih molekula prema

katodi

www.elchem.kaist.kr

Sastav proteinskih frakcija u serumu

Ƴ globulini: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE

β1 globulini: transferin, LDL

β2 globulini: C3 komplement

α2 globulini: α2 makroglobulin i

haptoglobin

α1 globulini: α1 antitripsin i AAG

Albumin

Prealbumin

www.sciencedirect.com

v

Klinička stanja

Oboljenja bubrega

Oboljenja jetre

Reakcija akutne faze

Hipogamaglobulinemije

Hipergamaglobulinemije

Monoklonske gamapatije

Izrazito povišena α2 frakcija te smanjena albuminska i Ƴ globulinska frakcija ukazuju na renalni gubitak proteina. Povišenje

α2 frakcije posljedica je rasta α2 makroglobulina zato jer zbog veličine α2 makroglobulin ne prolazi glomerularnu bazalnu

membranu a osim toga kompenzatorno se sintetizira radi održavanja koloidnoosmotskog tlaka plazme. α1 frakcija nije

promijenjena što ukazuje da nije prisutan neki upalni proces uz postojeći glomerularni poremećaj. Primjetno je da je β1

frakcija snižena zbog gubitka transferina kao i Ƴ globulinska frakcija zbog gubitka imunoglobulina.

Nefrotski sindrom

Snižena frakcija albumina uz povišenu frakciju gama globulina i pojavu beta gama mosta karakterištična je slika ciroze jetre.

Beta gama most se javlja i kod imunoloških bolesti npr. RA ili npr. Chronove bolesti.

Ciroza jetre

. Hipergamaglobulinemija uz visoku koncentraciju IgM. Gama frakcija je pravilna i na anodnom i na katodnom dijelu

bez pojave pikova. Iako je IgM visok riječ je o poliklonskoj sintezi. Visoke vrijednosti poliklonskog IgM karakteristične su za PBC.

Primarna bilijarna ciroza

U relativnom udjelu α1 frakcija je na donjoj granici referentnog intervala dok je u apsolutna koncentracija α1

frakcije snižena. Imunonefelometrijsko mjerenje dokazalo je sniženu vrijednost AAT-a koji je glavni protein

α1 frakcije.

Ref.vrijednost

AAT= 0.93 g/L (0.9-2.0)

Manjak α1 antitripsina

Snižena koncentracija albumina i povišene koncentracija α1 i α2 frakcije ukazuju na akutnu upalnu reakciju. Na albuminu

je primjetan nagib na anodnom dijelu koji potječe od visoke koncentracije bilirubina. α2 frakcija podijeljena je na α2

makroglobulin te na haptoglobin dok se katodno najvjerojatnije nalazi kompleks hemoglobin- haptoglobin zbog prisutne

intravaskularne hemolize. Iako je prisutna izrazita anemija transferin je snižen jer je negativni reaktant akutne faze. U Ƴ

frakciji su vidljive nepravilnosti koje nisu monoklonski proteini što je dokazano sa IFE, ali mogu potjecati i od visoke

koncentracije CRP-a.

Reakcija akutne faze

Izrazita hipogamaglobulinemija uz povišenje relativnog udjela albumina. Sa IFE nije dokazano

prisustvo monoklonskog proteina iako hipogamaglobulinemije često prati pojava Bence-Jones

proteina.

IgG 1.92 g/L

IgA < 0.58 g/L

IgM <0.046 g/L

Slobodni laki lanci kapa 8.21 mg/L

Slobdni laki lanci lambda 0.33 mg/L

Hipogamaglobulinemija

Visoke vrijednosti ukupnih proteina kao i Ƴ globulina uz sniženje svih ostalih globulinskih frakcija upućuje na

moguće prisustvo M- proteina. Ipak unatoč visokom piku u Ƴ globulinskoj frakciji ta frakcija je simetrična. Sa IFE

nije dokazano prisustvo M- proteina. Izrazito visoka poliklonska sinteza imunoglobulina može se javiti kod

sarkoidoze, Gaucherove bolesti.

IFE

Hipergamaglobulinemija

Monoklonski proteini

Produkcija imunoglobulina koji imaju iste antigene i fizikalne

karakteristike od strane plazma stanica

Elektroforetski se vide kao zaseban pik obično u gama frakciji ali se

mogu javiti i ostalim globulinskim frakcijama

Mogu se pojaviti u malignim kao i u nemalignim stanjima

Najčešća stanja: - Multipli mjielom

- Waldenstrom- makroglobulinemija

- kronična limfatična leukemija

- MGUS- monoklonska gamapatija neodređenog

značaja

Laboratorijska detekcija monoklonskih proteina

Elektroforeza – zone restrikcije u području gamaglobulina,

najčešće u Ƴ globulinima

Imunotipizacija monoklonskog proteina metodom imunofiksacije

(IFE) ili imunosuptrakcije (ISUB)

Imunokemijsko određivanje koncentracije imunoglobulina

Ostale pretrage: ESR, KKS, Ca, β2 mikroglobulin u serumu

Biopsija koštane srži

Određivanje BJP proteina

Kapilarna elektroforeza

Slika 10. Izrazito visoka koncentracija ukupnih proteina i visoka oštra frakcija gamaglobulina te snižena albuminska i

ostale globulinske frakcije ukazuju na prisutan monoklonski protein. Sa IFE je dokazano prisustvo dva klona IgG tip

lambda te BJP protein tip lambda.

IgG 94.6 g/L

IgA 0.10 g/L

IgM 0.05 g/L

Slobodni laki lanci kapa 6.17 mg/L

Slobodni laki lanci lambda 4440.00

mg/L

IFE

Monoklonska

gamapatija

Kapilarna elektroforeza

Slika 9. Sniženi albuminini i povišene sve globulinske frakcije osim gama globulina. U području β1 frakcije

nalazi se izrazit pik koji pripada monoklonskom proteinu. Sa IFE je dokazano prisustvo BJP proteina.

IgG 5.64 g/L

IgA 0.13 g/L

IgM 0.06 g/L

Slobodni laki lanci kapa >33700 mg/L

Slobodni laki lanci lambda 21.00 mg/L

IFE

Bolest lakih lanaca

Kapilarna elektroforezaKapilarna elektroforeza

Slika 11. Elektroforeza i IFE istog pacijenta u vremenskom razmaku od tri mjeseca. I u jednom i drugom slučaju dokazano je

prisustvo monoklonskog proteina i BJP proteina s tom razlikom da se u prvom slučaju na krivulji uočava samo jedan pik,dok se u drugom

slučaju uočavaju dva pika. Oba pripadaju BJP proteinu ali je u prvom slučaju koncentracija iznosi 1760 mg/L, a u drugom

5360 mg/L.

IFE

Monoklonska gamapatija

Slika 12. Usporedba kapilarne elektroforeze i gel elektroforeze

Sa obje tehnike moguće je uočiti više pikova u Ƴ području pikova koji pripadaju monoklonskim proteinima što je i

dokazano imunofiksacijskom elektroforezom.

.

Agaroza gel elektroforeza

IFE

Kapilarna elektroforeza

CZE vs agaroza gel elektroforeza

CZE vs agaroza gel elektroforeza

prednosti mane

Visoka rezolucija frakcija Interferencija komponenata koje apsorbiraju u UV području

Mala količina uzorka Povećan broj imunotipizacija

Nema procedure bojanja-direktno mjerenje peptidne veze u UV području

Ponekad teško detektirati male monoklonske proteine

Nema grešaka pri aplikaciji uzorka

Jasno vidljiva α1 frakcija

Jasno razdvajanje β1 i β2 frakcije

Interferncije u CZE

Hemoliza- slobodan hemoglobin migrira u β području

Bilirubin se ne opaža do koncentracije 250 μmol/L – iskrivljuje

albuminsku frakciju u anodnom dijelu

Visok CRP se može zamijeniti za monoklonski protein u Ƴ području

Lipoproteinske frakcije se mogu pojaviti npr. VLDL između albumina i

α1 frakcije

Zaključak

Elektroforeza serumskih proteina je tehnika probiranja za razdvajanje i

kvantifikaciju pojedinih skupina proteina a ne poejdinih proteina

Najznačajnija klinička značajnost je detekcija M-proteina

CZE osjetljiva, brza i reproducibilna tehnika koja daje visoku rezoluciju

proteinskih frakcija