Jurnal de cromatografie A, 1319 (2013) 72–79

Cuprinsul se gaseste laScienceDirect

Jurnal de cromatografie A

pagina de internet: www.elsevier .com/locate /chrom a

Cromatografie lichida de inalta performanta in combinatie cu spectrometria de masa pentru detreminarea acizilor perfluorinati in laptele de vacaAnna Laura Capriotti a , Chiara Cavaliere a,∗ , Alberto Cavazzini b , Patrizia Foglia a , Aldo Laganà a , Susy Piovesana a , Roberto Samperi a

a Departmentul de chimie, Universitatea “La Sapienza”, Piazzale Aldo Moro 5, Roma, 00185, Italiab Departmentul de chimie si stiinte farmaceutice, Universitatea din Ferrara, Ferrara, Italia

Detalii ale Articolului A B S T R A C T

Istoricul articolului:

Primit in 4 aprilie 2013

Primit in forma revizuita in 3 September 2013

Acceptat in 9 October 2013

Disponibil online din 17 October 2013

Cuvinte cheie:

Acizi Perfluorici

Lapte

Carbon negru grafitizat

Faza de extractie a solidului

(SPE)

Design experimental LC–MS

Se descrie o noua metoda de determinare a 12 compusi perluorinati (PFC) din laptele de vaca, prin intermediul cromatografiei lichide / electrospray – in combinatie cu metoda spectrometrica de masa (LC/ESI–MS/MS). Au fost extrase cu acetona mostre de lapte, care au fost indepartate prin intermediul fazei de extractie a solidului cu ajutorul carbonului negru grafitizat optimizandu-se intreaga procedura prin utilizarea unei metode de screening experimental. LC/ESI–MS/MS a fost executata prin procedeul de ionizare negativa prin utilizarea modulului de monitorizare a reactiei multiple. Derularea metodei a fost evaluata avandu-se in vedere conditiile optimizate in ceea ce priveste efectele de matrice, gama de linearitate, acuratete si repetabilitate. Linearitatea matricei a fost observata la toti compusii din gama LOQ-10 gL−1 si la coeficientii determinarii R 2 pornind de la valorile 0.9982 pana la 0.9999. Regenerarile analitice legate de standardul isotopic intern, masurat la 10 si 50 ng L−1 aveau valori intre 91-105%, cu unele devieri standard sub 6%, iar limita de detectare metodica, pornind de la valoarea incompleta +3 masoara deviatia standard a blank-lui, cu valori de la 0,5 la 3 ng L−1 . Cea din urma metoda utilizata a avut drept scop determinarea concentratiei de PFC in cadrul a 15 mostre de lapte de consum. Nici unul dintre aceste componente nu a fost detectat in mostrele de lapte de vaca analizate.

© 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introducere

Compusii perfluorinati (PFC), cunoscuti si ca substante alchilare perfluorinate (PFAS) sunt o grupa de chimicale antropogenice care se produc de peste 60 de ani, cu aplicatie larga in productia industriala. Se utilizeaza in productia de vopseluri, adezivi, ceruri, substante de lustruit, metale, electronice, spume anti-foc si chituri, precum si a invelisurilor de protectie impotriva grasimilor in industria alimentara (pungi de popcorn pentru microunde, cutii pentru cartofi prajiti, ambalaje pentru hamburger, etc). PFAS au proprietati unice precum activitatea de suprafata (high surface activity), rezistenta termica si la acizi, sunt in acelasi timp hidrofobice si lipofilice si contin una dintre cele mai puternice legaturi C-F cunoscute. Datorita proprietatilor lor, acestea sunt foarte stabile si foarte persistente in mediul incojurator (si in mostrele biologice) si detin profiluri unice de distributie in corp, precum si potential de bioacumulare. Timp indelungat, s-a presupus ca aceste substante chimice sunt inerte si astfel prezinta siguranta, insa in ultimii ani, multe dintre studii au relevat distributia ubicuua a PFAS intr-o varietate de matrice din mediul inconjurator, precum aer, sedimente, apa de suprafata si cea potabila, apa marina si oceanica, fructele de mare si, mai ales in fauna salbatica, precum pesti, pasari si mamifere marine, dar si in tesuturile si fluidele umane, precum sange, ficat si rinichi [1–5].

Printre aceste componente, acidului sulfonic perfluoroctanic (PFOS) si acidului perfluoroctanic (PFOA) li s-a acordat cea mai mare atentie in ultimii ani, datorita efectelor adverse asupra sanatatii omului. Cu toate acestea, mai recent, unei alte serii de PFAS i s-a acordat o atentie crescuta, deoarece sunt produse ca substante alternative pentru PFOS si PFOA, ca intermediare in productia de PDAS si ca produse (bio)degradabile. Prin urmare, a aparut moitorizarea aditionala, concentrata nu doar pe PFOS si PFOA, ci si pe PFAS. Acestea includ perfluorcarboxiliti (PFCA) si perfluorsulfoniti (PFSA) cu lungimi diferite de lanturi (cele mai intalnite intre C4 si C14), acizi carboxilici fluortelomerici (FTCA) si compusi non-ionici (volatili) precum alcooli fluortelomerici (FTOH), perfluorsulfonamida si sulfonamidele cu substitut de N [3]. Cu toate acestea, transformarea alcoolilor si a sulfonamidelor in acizi se produce relativ repede si se regasesc numai in atmosfera [6].

S-a descoperit ca PFAS prezinta hepatoxicitate, toxicitate in procesul de dezvoltare, imuno-toxicitate si potential carcinogenic [7]. Din aceasta cauza aceastea sunt incluse in prezent in Studiul de Examinare a Sanatatii Nationale si Alimentatiei Publice (NHANES), fiind efectuat de Centrele pentru Prevenirea si Controlul Afectiunilor (CDC) pentru a oferi o mai buna evaluare a distributiei acestor substante chimice in alimentatia copiilor si a adultilor din Statele Unite( www.cdc.gov/nchs/nhanes.htm ) [8].

Recomandarile preventive de sanatate (de ex. marjele orientative referitoare la apa potabila) stabilite de catre Agentia de Protectie a Mediului

din SUA (EPA) pentru PFOA si PFOS sunt 0,2 si respectiv 0,4 g L−1 [9]. Pen t ru s t ab i l i r e a une i eva lua r i a r i s cu lu i a soc i a t cu expune rea l a PFAS in d i e t a , Au to r i t a t e a pen t ru S igu ran t a A l imen t e lo r (EFSA) a stablit doza zilnica digerabila si tolerabila (TDI) la

150 si 1500 ng (kg unui corp uman)−1 ziua−1 pentru PFOS si repsectiv PFOA [10]. In 2009

Conventia de la Stockholm a clasificat PFAS as Substante Organice Poluante Persistente (POP) [11] iar astazi sunt categorizate ca substante chimice Bio-acumulative Persistente Toxice (PBT) (PBT) sau Micro Poluanti Organici Toxici (TOMP).

In ciuda ingerarii de PFAS, chiar si in concentratii mici, acestea constituie un pericol semnificant pentru sanatatea umana, indeosebi pentru copii. In prezent avem date relativ mici referitoare la expunerea corpului uman la PFAS provenit din hrana. Astfel, se observa o cerere ridicata pentru implementarea unor strategii analitice noi, eficiente si selective pentru determinarea PFAS in diferite matrice.

Metoda instrumentala preferata pentru determinarea PFCA si PFSA este cromatografia lichida de inalta performanta cuplata cu spectrometria de masa prin aplicarea interfetelor negative de electro-distribuire a ionilor (negative electrosprayionization interfaces) (LC/ESI–MS/MS) [1,5,12–15].

Datorita nivelelor foarte scazute la care se gasesc PFAS in mostrele reale (valorile de concentratie tipice sunt sub – spre scazut – nanograme pe litru), inaintea analizei de impune imbogatirea cu analiti prin faza de extractie a solidului (SPE) sau exctractia lichid lichid (LLE) [5,12,14–18].

Mai mult, indepartarea extractelor brute este esentiala pentru distrugerea si indepartarea lipidelor si a altor substante co-extractive care s-ar putea interfera determinarii instrumentale. Deoarece deseori pentru acesti compusi se obtin redresari variabile, o alta precautie care are trebui avuta in vedere este utilizarea standardelor isotopice interne (IS) [5,13,15].

Datorita consumului general de lapte pe scara larga de catre intreaga populatie a lumii, in special de catre copii, precum si datorita utilizarii acestuia in alte produse precum formula pentru sugari, laptele ar putea constitui un factor de larga contributie pentru expunerea umana fata de PFAS in cadrul dietei generale.

Conform cunostintelor autorilor, exista cateva metode de investigare a concentratiilor de PFAS in produsele lactate si laptele matern[5,15,18–21]; cu toatea acestea, descrieri detaliate ale parametrilor acestor metode s-au limitat la doua dintre ele [5,15].

Acest studiu descrie noua si facila metoda LC/ESI-MS/MS pentru determinarea a 12 acizi perfluorinati din lapte. In mod specific, am dezvoltat o metoda de imbogatire, folosind carbonul negru grafitizat (GCB) care poate permite izolarea selectiva a analitilor tinta de matrice complexe, datorita variatelor tipuri de interactiuni (hidrofobic, electronic si schimburi de ioni) cu analitii. S-au aplicat absorbante GCB in tehnici variate de imbogatire, indeosebi in SPE [22,23]. Acestea sunt in primul rand absorbante non-specifice si neporoase cu o suprafata de aproximativ 100 sau 200 m2 g-1 [24,25]. Datorita prezentei pe suprafata acestora a eterogenizarii chimice incarcate pozitiv, acestea pot fi considerate a fi atat absorbante de faza-reversibila (RP), cat si transmitatori anionici. Prin urmare, GCB ofera avantajul afinitatii crescute pentru compusii organici acizi si poate constitui un absorbant potrivit scopului nostru de a izola PFO si PFOA din lapte.

2. Experimentul2.1. Reactivii si chimicalele

Standarde ale tuturor PFAS selectate, de ex. acidul perfluorpentanoic (PFPeA), acidul perfluorbutanesulfoic (PFBS), acidul perfluorohexanoic (PFHxA), acidul perfluoroheptanoic (PFTrDA) si acidul perfluorotetradecanoic (PFTeDA) au fost cumparate de la Sigma-

Aldrich (St. Louis, MO, USA). Standardele lor corespondente, disponibile in comert, etichetate 13 C (13 C5 -PFPeA, 13 C5 -PFHxA, 13 C4 -

PFHpA, 13 C4 -PFOA,13 C4 -PFOS, 13 C5 -PFNA, 13 C2 -PFDA, 13 C2 -PFUdA, 13 C2 -PFDoA) au fost achizitionate ca solutie metanolica 50 gmL-1 (1,2

mL) de la Laboratoarele Wellington (Toronto, Ontario; Canada) si au fost folosite ca IS. Pentru a calcula revenirile absolute in decursul procesului, H-PFOS a fost utilizat ca standard intern (IS2). Pentru PFBS, PFTrDA si PFTeDA, pentru care nu exista standardele

comercializate sub eticheta s-au utilizat 13C4 – PFOS, pentru primul si 13 C2 -PFDoA pentru celelalte doua componente. S-a preparat un amestec standarde izotopice etichetate la 100 g-1 si a fost utilizat pentru a fixa mostre si standarde la concentratia de 1 g L-1 in extractul final.

Denumirea completa, abrevierile, formula chimica si ionii precursori ai compusilor selectati sunt descrise in Tabelul 1S din materialul suplimentar.

Solutii individuale analite de tulpina au fost preparate in acetonitril la nivelul 1 g L-1, introdus la -200C si adus la temperatura camerei inainte de utilizare. S-au preparat solutii de standarde de lucru prin diluarea potrivita a tulpinilor. Aceste solutii au fost pastrate la 40C si reinnoite saptamanal.

Toti solventii organici au fost de gradul HPLC de la Sigma-Aldrich. Amoniacul concentrat, acidul formic, acetatul de amoniu si acidul hidrocloric au provenit de la Carlo Erba (Milano, Italia). Apa ultrapura (rezistenta 18,2 M cm) a fost obtinuta printr-un sistem de purificare Arium (Sartoriu, Florenta, Italia).

2.2. Precautii si controlul calitatii: Pierderi si contaminare

Stocarea si conservarea mostrelor pentru analiza acidica PFAS este critica, datorita pierderilor (ex. absorbtia din timpul prelevarii, pastrarea, extractia si indepartarea/curatarea), contaminarea putand aparea foarte usor in stadiile prelevarii si a analizei. Acestea pot ingreuna analiza PFO si PFOA; astfel incat se recomanda testarea pentru blankuri de camp, blankuri de matrice si blankuri de reactiv. Este de preferat ca mostrele sa fie analizate imediat dupa prelevare.

Mai mult, desi acizii perfluorinati nu se vor degrada in cazul asigurarii conditiilor potrivite de stocare, se recomanda ca mostrele sa ramana in permanenta refrigerate sau inghetate pentru evitarea degradarii moleculelor care pot fi precursorii acizilor perfluorinati. Stocarea la -200C este in general potrivita pentru conservarea mostrelor [3]. Cu toate acestea, pentru evitarea oricarei probleme legate de solubilizare, mostrele au fost sonicate inainte de utilizare.

Deoarece PFAS au sunt foarte utilizate ca plastifianti, acestia pot fi intalniti in orice nou material. Aceasta poate genera o problema serioasa din punct de vedere analitic, deoarece datele obtinute din analiza mostrei poate fi afectata de contaminare provenita de la unul dintre materialele utilizate (recipientele de prelevare, recipientele de sticla, solventii, filtrele, cartusurile, echipamentul, etc.). Au existat cateva dezbateri referitor la intrebarea daca si care PFAS se adsorb pe suprafetele de sticla [26]. Am observat o adsorbtie ireversibila a acestor compusi pe suprafata recipientului de mostrare; din acest motiv, toate recipientele si ustensilele din sticla utilizate in cadrul acestui studiu au fost curatate extensiv utilizand solventi precum apa, metanol, diclorometan si apoi din noi metanol, in secvente. De asemenea cartusurile SPE si fritele au fost pre-curatate prin sonificare cu metanol intr-o baie ultrasonica de doua ori pentru cate 10 minute fiecare. In plus, toti solventii utilizati au fost atent verificati pentru a fi non-analitici, prin utilizarea procedurii de analiza a blankului. Am observat

A.L. Capriotti et al. / J. Chromatogr. A 1319 (2013) 72–79

3

contaminari ale solventului, astfel incat toti solventii organici au fost redistilati inainte de utilizare, intr-un aparat din sticla (vezi Sectiunea 3).

Pentru fiecare set de analiza a unei mostre reale, s-au analizat un blank de procedura si un blank contaminat la 30 ng L -1 .

2.3. Extractia si dispozitivul de curatare/indepartareS-au folosit o centrifuga ALC PK131R refrigranta cu viteze si o baie ultrasonica model ST, la frecventa de 50 ± 3 Hz, din Stimin, Milano, Italia. Tuburile, fritele si colectorul cu vacuum au fost din Supelco (Bellefonte, PA, SUA).

Toate mostrele au fost extrase si curatate prin cartusuri SPE, utilizang GCB, Carbograph-4 [22,27–30] a fost furnizat de LARA (Roma, Italia). Carbograph-4 este un GCB cu o suprafata de 210 m2 g-1 si gama de marime a particulelor , similar Carboprep 200 (Restek) si Envicarb X (Supleco). Cartusele au fost pregatite prin umplerea cu 6 mL tuburi din polipropilena pre-curatate cu 500 mg de adsorbent plasat intre doua frite de polietilena. Inaintea procesarii mostrelor, aceste cartusuri au fost atasate unui colector vacuum si spalat secvential cu 5 mL metano, 10 mL de apa cu pH = 2 si 10mL apa.

2.4. Prelevarea mostreiAu fost utilizate cateva procedee experimentale, pentru a studia influenta variabilelor asupra recuperarilor analite ale mostrei. Procedeele de Experimente (DoEs) sunt o colectie de tehnici chimometrice care permit investigarea factorilor care ar putea afecta o procedura experimentala si identificarea valorilor lor optimale. Procedeele de screening sunt indeosebi de utile atunci cand se studiaza multi factori ale caror influente semnificative asupra rezultatelor nu sunt cunoscute. Un procedeu factorial fractional [31] a fost utilizat pentru a scana cei mai importanti factori si pentru a gasi cele mai bune conditii ale extractiilor acide de PFAS din lapte. Pentru optimizarea procedeului experimental au fost selectate sapte variabile. Nivelul variabil al valorilor testate pentru fiecare proprietate a fost doi (-1+1). Variabilele (V) au fost: (1) temperatura solventului de extractie; (2) solventul in raport cu volumul de lapte; (3) apa pentru volumul de lapte extras inaintea SPE; (4) tipul de solvent de eluare provenit din cartusul SPE; (5) cantitatea de modificator pentru solventul de eluare; (6) acidificarea mostrei. Factorii stabili au fost cartusul SPE si volumul de lapte. Variabila „acidificare” a avut 3 posibile variatii: (1) nici un fel de acidificare; (2) acidificare la pH stabil, inaintea extractiei si acidificare dupa extractie si etapele de dilutie. Deoarece ultima variabila are trei nivele, procedeul experimental a fost repetat de doua ori: in cadrul primului, acidificarea inainte sau dupa extractia solventului si in cel de-al doilea, variabila „acidificare” s-a stabilizat la 0. Mai mult, procedeul experimental a fost repetat pentru trei solventi de extractie, precum acetonitrilul, acetona si metanolul. Experimentele au fost realizate la intamplare, pentru maximizarea efectelor variabilitatii inexplicabile in cadrul raspunsurilor observate, datorita factorilor straini.

2.5. Colectarea si pregatirea mostrelorS-au cumparat de la magazinele locale mostre de lapte imbuteliat si pasteurizat (in sticle sau cutii). Au fost selectate diferite marci

(atat de la producatori consacrati, cat si de la mici producatori).

Cinci mL de mostra de lapte, in care au fost adaugate in prealabil 20 L de IS, au fost turnati intr-un tub de centrifuga din policarbonat, cu capac infiletat si dimensiunea de 115 x 30 mm. Un volum de 20 mL de acetona a fost turnat incet in mostra, tubul a fost inchis strans si scuturat viguros timp de 1 min. Mostra a fost centrifugata 10 min la 9000 rpm si 25oC pentru a amesteca substantele insolubile. Toate substantele supernatante (care pluteau la suprafata) au fost indepartate, diluate in 250 mL de apa, acidificate pana la pH=2 cu HCl 6 M si trecute prin cartusul pregatit in prealabil cu Carbograph-4. Apoi cartusul a fost spalat cu 10 mL de apa, iar PFAS au fost eluate cu 10 mL de metanol/diclorometan (1:1, v/v), 10mmolL-1 format de amoniu. Eluatul a fost colectat intr-un flacon de sticla cu fund rotund, de 1,4 cm i.d. si s-a evaporat la 37oC sub o scurgere usoara de nitrogen. Reziduul a fost reconstituit cu 500 L de matanol/apa (40:60, v/v). Solutia obtinuta a fost centrifugata, iar apoi s-au transferat 200 L de supernatant clar intr-un flacon de auto-mostrare. O parte alicota de 10 L din solutia finala a fost analizata prin LC/ESI–MS/MS. S-a folosit o elutie gradient cu apa 20 mmolL-1 format de amoniu ca faza mobila A si acetonitril, ca faza mobila B. Compozitia incipienta in faza mobila era de 30% B. B a fost crescut liniar la 50% in 15 min, apoi adus la 100% in 10 min si mentinut constant timp de 10 min. In cele din urma, continutul B a fost scazut la 30%, iar coloana re-echilibrata timp de 10 min, pentru un interval total al ciclului de 46 min. Debitul a fost de 200 Lmin-1.

2.6. Analiza cu LC-MS/MS

A fost folosit un spectometru in masa cu Applied Byosistems / MDS CIEX API 3000, triplu qvadruplu (QqQ) din Concord, Ontario, Canada, cuplat cu un turboionspray (TISP). Pentru obtinerea si procesarea datelor, s-a folosit versiunea 1.4.1. a sofware-ului Applied Biosystems/MDS SCIEX Analyst. Calibrarile de masa si ajustarile de rezolutie au fost realizate automat, asa cum este descris in alta lucrare [22]. Interfata TISP a fost operata in modul de ionizare negativa, iar ionii [M-H] au fost selectati de primul quadrupol si fragmentat in celula de coliziune operata la presiune medie (scala arbitrara). In urma scanarii spectrale complete MS/M s-au selectat cele mai potrivite tranzitii pentru achizitie in modul de monitorizare a reactiilor multiple segmentate in timp (MRM).

Analitii au fost cuantificati Analitii au fost cuantificati folosindu-se cea mai intensa tranzitie prezentata in Tabelul 1S. Confirmarea analitilor necesita prezenta

a cel putin doua tranzitii, iar cea de-a doua tranzitie trebuia sa fie una de tip S/N cu intensitate in crestere ≥3.

2.7. Evolutia canitativa si statisticaS-au preparat solutii standard de calibrare prin diluarea volumelor potrivite standardului de lucru si solutiior IS, in legatura cu faza mobila cromatografica. In plus, s-au preparat solutii standard la sase nivele de concentratie, in gama de la 0.2-20 ng mL-1 si 10 L au fost injectate. Pentru fiecare dinte analiti, cea mai intensa tranzitie a fost extragerea din LC-MRM data set, iar punctul culminant vs. cantitatea sau concentratia injectata a fost obtinuta prin masurarea zonei de varf si conectarea acestei zone cu cea pentru IS corespondent. Pentru evaluarea efectului de matrice asupra intensitatii semnalului, liniile de regresie ale isotopicului IS au fost calculate prin divizarea zonei de punct culminant vs. cantitati injectate din ambele solutii standard si extractiile cumulate de lapte, comparand pantele liniilor de regresie neponderate. Linearitarea a fost evaluata in experimente separate in care liniile de calibrare au fost construite intr-o gama de concentratie mai mare decat cea utilizata pentru cuantificarea mostrelor. Acuratetea si precizia au fost esitmate prin recuperari analitice de la mostre contaminate. Recuperarea analitica a fiecarui PFAS s-a adaugat mostrelor si orice concentratie data a fost evaluata pentru masurarea zonei de varf, calculand rata de vard relativa la cea a isotopicului IS, iar prin comparatia acestui rezultat cu cel obtinut pentru o solutie standardcontinand acelasi cantitati analite nominal si isotopic IS.

Comparatiile statistice au fost efectuate de ANOVA (p=0,05).

3. Rezultate si discutii

3.1. Verificarea contaminarii de fondAsa cum s-a mentionat in Sectiunea 2, datorita utilizarii pe scara larga a PFC, contaminarea de fond provenite din surse diverse in laborator, ar

putea reprezenta o problema serioasa. Cercetarea blankurilor, executata la initierea procedurii, a confirmat aceste temeri. Toate blank-urile (chiar si cele provenite din apa ultrapura) prezentau existenta varfurilor corespunzatoare catorva dintre analitii in

cauza. Acest fapt denota o contaminare generalizata. Mai mult, era dificil de prevazut sursa contaminarii, deoarece varia de la lot la lot, atat in ceea ce priveste solventii, cat si in ceea ce priveste materialele plastice. Ulterior am resdistilat in recipiente de sticla solventii si am pretratat toate materialele utilizate in cadrul analizei. Deoarece apa ultrapura a fost obtinuta printr-un sistem de purificare a apei, aceasta poate reprezenta o posibila sursa de contaminare. Din acest motiv, am folosit pentru etapele de spalare apa oliominerala imbuteliata in recipient de sticla, iar apa ultrapura a fost utilizata doar pentru pregatirea fazei mobile HPLC. Ca rezultat, s-a obtinut un blank chromatogram mai curat, dar totusi a mai persistat o contaminare cu PFUdA si (mai putin intensa) cu acid perfluoroctanesulfonic. Dupa excluderea contaminarii cu solvent organic si apa, asa cum am mentionat mai sus, si dupa eliminarea sistematica a altor posibile surse provenite din procesul de extractie (vezi Sectiunea 2.2), am concluzionat faptul ca contaminarea provenea de la instrumente, probabil de la sistemul de tuburi chromatografice. [5]. Din acest motiv, am schimbat intreaga tubulatura HPLC si am inlocuit un tub in PEEK. La final, s-a determinat ca contaminarea cu PFUdA origina de la membrana degazare [17]. Din aceasta cauza, o scurta coloana C18 a fost montata intre mixer si deschiderea spre mostra pentru a retine interferentele PFC ce veneau provenite din faza mobila si din instalatia HPLC [5]. Astfel, timpii de retentie a PFC provenit de la sistem erau mai mari decat cei ai analitilor injectati. Mai precis, coloana scurta intarzia timpii de retentie ai compusilor veniti din sistemul LC si in acest fel erau separati de analitii continuti de mostra. In Fig. 1 A si B sunt relevate cromatogramele unui blank inainte si respectiv dupa tratamentele descrise mai sus.

3.2. Desfasurarea metodei (procedeului)Extractia de PFAS din lapte a fost executate atat in conditii acide, cat si alcaline. Conditiile acide au fost obtinute prin intermdiul

acidului formic; cu toatea acestea, o concentratie ridicata de acid formic putea sa determine o contaminare cu PFOA, in timp ce o concentratie scazuta a avut un impact negativ asupra limitei de detectie [15]. Conditiile alcaline au fost obtinute cu NaOH metanolic, timp de aproximativ 16 ore, pentru a absorbi mostra pana la momentul extractiei [5,15]. Se pare ca in cazul laptelui o extractie rapida ar putea fu o cerinta prioritara pentru a evita interactiuni puternice dintre PFAS si proteine sau grasimi. Apoi, s-a executat o etapa de curatare cu ajutorul unei rasini anionice, slabe, de schimb, pentru a reduce interferentele. Doar intr-o recent publicata metoda, un alicot de mostra a fost injectata direct, prin metoda QuEChERS de extractie (Rapid, Usor, Ieftin, Eficient, Solid si Sigur), dar matricea a aratat faptul ca era necesara calibrarea. Pentru curatarea extractului brut am selectat o coloana GCB. Alegerea acestui material pentru curatirea exctractelor s-a bazat pe caracteristicile neobisnuite ale acestuia. Asa cum s-a specificat anterior, acest absorbant se poate manifesta atat ca un RP, cat si ca un absorbant de schimb anionic. Aceste caracteristici il fac a fi potrivit pentru izolarea substantelor acide de cele neutre, bazice [30,32] si, prin urmare, ar putea fi un absorbant potrivit pentru scopul nostru de a izola PFAS acidic din extractul de lapte.

S-au folosit DoEs pentru studierea conditiilor de pregatire a mostrei. Atunci cand se utilizeaza o procedura experimentala, variabilele care ar putea afecta performantele metodei ar trebui sa fie descoperite in stadiu incipient, pentru a evita reiterarea DoE. In cadrul studiui nostru am redus variabilele DoE prin stabilizarea cantitatii de lapte, precum si a marimii coloanei SPE, avand la baza experiente anterioare de aplicare a procedurii [22]. Patru variabile trebuia sa influenteze recuperarile de la mostra de lapte: doua calitative, precum solventul pentru precipitatia de proteine (acetonitril, acetona si metanolul) si acidificarea mostrelor (fara acidificare, acidificare pana la pH 2 inaintea adaugarii solventului deproteinizator) si doua cantitative: temperatura (V1) si raportul solvent – spre – mostra (V2). Cunostintele despre suprafata GCB, precum si experientele anterioare [23,33] ne-au permis sa limitam numarul de variabile de cadrul procedurii de curatare. Prin urmare, doua variabile precum o diluarea a mostrei (V3) si / sau acidificarea mostrei (V7) au fost banuite ca ar putea afecta retentia de analiti pe coloana SPE. Mai mult, pentru elutia analytica din coloana GCB, volumul de eluent a fost fixat la 10 mL, in timp ce alegerea pentru variabila eluentului s-a redus la metanol sau la o combinatie de metanol: metilena – clorid 1:1 (v/v) (V4), cu completare, ca o deplasare de la zonele de schimb anion [34] pentru o sare precum HCOONH4, solubila in mixtura de solvent si compatibila cu MS la doua niveluri de concentratie (V5). In final, datorita problemei solubilitatii compusilor , reconstituirea solventului trebuia sa fie critica. Odata stabilizat volumul de reconstituire dupa evaporarea solventului (0,5mL) si realizarea sonicarii (10 min), a fost testat si raportul metanol – apa in solvent V6). Unii dintre acesti parametri ar putea varia atat cantitativ, cat si calitativ, realizand cresterea unui foarte coplex DoE. Prin urmare, nivelele de variatie a valorilor testate pentru fiecare trasatura cantitativa a fost, in prima faza, 2 (-1+1).

DoE putea fi mult mai simplificat in cazul in care cei trei pasi ar fi fost considerati independenti unul fata de celalalt. Cu toate acestea, experienta noastra indelungata in SPE cu GCB, ne-a sugerat ca interactiunea nu era doar posibila, ci foarte probabil sa se intample. Apoi, datorita economiei acestora in sensul numarului de experimente de executat atunci cand un anumit numar de factori trebuie sa fie verificati, sase procedee factoriale fractoriale 2 (7-4) care ne-au permis folosirea a 8 scheme de experimente saturate pentru fiecare dintre ele au fost alese ca fiind potrivite pentru acest studiu. In primul DoE, acetona a fost aleasa ca solvent de deproteinizare / extractie si acidificarea mostrei anterior si ulterior extractiei ca alta variabila. In al doilea DoE, acidificarea nu s-a aplicat. Aceeasi schema a fost folosita cu metanol si acetonitril. Patru experimente, aplicate punctului central, au fost folosite pentru masurarea variabilitatii datorita erorilor accidentale si, ca urmare, poate fi ales sa evalueze deviatia standard a efectelor pornind de la premisa ipotezei nule. Rezultatele extractiei solventului acetona sunt prezentate in Tabelele 2S si 3S.

Din nefericire, DoE nu a oferit rezultate clare pentru toate variabilele, pentru ca analizele statistice au relevat o deviatie de standard neobisnuit de mare (>10). Aceasta inseamna nu doar ca pot fi identificati doar factorii care afecteaza foarte mult recuperarilor de analiti. Am descoperit ca atat erau necesare dilutia cat si acidificarea mostrei dupa deproteinizare si inaintea SPE in timp ce acidificarea mostrei inaintea extractiei nu a imbunatatit semnificabil recuperarii. Acestea au crescut, de asemena, ca urmare a cresterii concentratiei HCOONH4 de la 5 la 10mmmoL-1 si a schimbarilor solventului de la metanol la metanol: clorid de metilena, 1:1 (v/v). Interactiunea dintre aceste doua variabile este posibila, dar nu a fost evidentiata de catre DoE. raportul solvent – mostra, devreme ce temperatura de extractie si solventul de restituire nu au aratat o schimbare semnificativa. Nici o alta interactiune efectuare nu ar putea fi evidentiata prin aplicarea DoE, pana la extractia analitelor cu metanol si acetonitril in loc de acetona.

Avand in vedere aceasta dificultate, aminvestigat efectul extractiei / deproteinizarii solventului cu studiul univariat (alte conditii in care: dilutia de extract 1:9 si acidificare pana la pH 2). Rezultatele sunt prezentate in Tabelul 1, unde se observa recuperarile absolute a compusilor tinta. Probabil cu exceptia PFPeA pentru care poate fi ipotetizat un fenomen de progres, sursa majora a impreciziilor apar

A.L. Capriotti et al. / J. Chromatogr. A 1319 (2013) 72–79

5

in acest stadiu al procedurii. Desi nu sunt evident imbunatatite, rezultatele recuperarilor obtinute cu acetona par, cel putin, nu mai rele decat cele aferente altor solventi, iar faza de separare a fost mai usoara; in plus, acetona este mai putin toxica decat atat metanolul, cat si acetonitrilul. Optimizarea pH-ului si factorii de dilutie ai extrasilor ( cei doi factori care afecteaza in principal adsorbtia de analiti prin GCB) atat cat permite compozitia fazei de desorbtie. Posibilitatea unei ajustari a acestor parametri, cu toatea acestea, ar fi exclusa a priori, datorita unui raport foarte ridicat de polaritate si polarizabilitate a compusilor tinta. Desi experientele anterioare cu analiza sulfonatilor lineari alchilbenzen (LAS) si a metabolitilor lor carboxilati au aratat ca o crestere a pH-ului de la 2 la 1 nu a fost pe placul unui lant scurt de metaboliti carboxilati de pe suprafata GCB [35], deoarece PFAS detine pka mai mare decat acizii carboxilici, am testat, de asemenea si aceasta variatie, dar au inceput sa scada foarte mult recuperarile lantului mai scurt. De asemenea, factorul de dilutie mostra-apa acidificata poate fi optimizat mai mult, deoarece s-a observat ca depinde atat de matrice cat si de compus [22.29]. Un factor de disolutie 1:25 nu a imbunatatit recuperarile, in timp ce dilutia in scadere 1:5 a scazut recuperarile de PFPeA, PFHeA si PFBS. Este posibil sa apara o crestere ulterioara a raportului dintre clorura de metilen si metanol, iar concentratia ar putea creste mai mult recuperarile de izomeri mai mari (mai polarizabili), dar, de asemenea, ar putea produce problema solubilitatii sarii si ar creste compusii coextrasi cu o contaminare ESI in consecinta. Prin urmare, tinand seama ca au fost utilizati si isotopii IS, conditiile extractiei selecatate au fost acelea obtinute in urma screening-ului DoE, prezentata in Sectiunea 2.5.

3.3. Validarea metodeiAplicarea metodei a fost evaluata tinandu-se seama de conditiile optimizate in ceea ce priveste efectele de matrice, plaja

linearitatii instrumentale, acuratetea, repetabilitatea si linearitatea la concentratie mica. Efectul de matrice a fost estimat, asa cum e specificat in Seciunea 2.7, prin compararea pantelor de sase puncte ale curbelor de calibrare ale isotopicului IS ca solvent pur si in extracte de lapte. Prin utilizarea isotopicului IS in locul analitilor, nu a fost necesara extragerea varfurilor corespunzatoare analitilor nativi prezenti in mostra sau in blank-uri. Raportul de scadere a liniilor regresive (standard/matrice) aveau valori cuprinse intre 0,96 si 1,04, prin umrare efectul de matrice nu putea fi considerat neglijabil.

Linearitatea instrumentala a fost evaluata in experimente separate in care liniile de calibrare au fost contruite cu o gama mai larga de concentratie dacta aceea folosita pentru cuantificarea analitilor din mostre. Pentru toti compusii, linearitatea in matrice a fost

observata in gama LOQ–10 g L−1 . Coefcientii de determinare R2 au valori cuprinse intre 0.9982 to 0.9999. Linearitatea metodei a fost de

asemnea testata, utilizandu-se isotopicii IS adaugati la cinci alicote dintr-o mostra de lapte, cu valori cuprinse intre 2.5–100 ng L−1 si s-a aplicat mostrelor din intreaga procedura. In acest caz, R2 au avut valori cuprinse intre 0,81 – 0,88, dar interceptarile nu au diferit semnificativ de la 0 la p=0,05 si au fost distribuite simetric.

Desi recuperarile noastre absolute de analiti au fost mai mari decat cele raportate intr-o lucrare anterioara referitoare la metoda de extractie QuEChERS [5], acestea avand o destul de mare imprecizie, probabil datorita unuia sau mai multor factor neverificati in timpul extractiei din lapte. PFAS detine caracteristici fizico-chimice neobisnuite, uneori fiind foarte dificil de prezis sau razionalizat. Din acest motiv, se recomanda utilizarea izotopicilor IS potriviti. Materiale de referinta pentru determinarea PFAS in laptele de vaca nu existau; prin urmare, acuratetea si precizia metodei au fost evaluate folosind mostre de lapte fortifiat la doua nivele de concentratie, precum 50 si 10 ng L -1 (Fig 2).

Sase alicote din trei stocuri diferite de lapte fortifiat au fost procesate individual si analizate. A fost folosit 13 C4 -PFOS c a IS pentru PFBS, iar 13 C2 –PFDoA pentru PFTrDA si PFTeDA. Rezultatele sunt prezentate in Tabelul 2, unde sunte prezentate si limitele instrumentale de detectie (LOD), de

cuantificare (LOQ) , metoda detectiei (MDL) si limitele de cuantificare (MQL). Asa cum se poate vedea, utilizarea isotopicelor ISs imbunatatesc profund atat acuratetea, cat si reproductibilitatea.

Criteriile de identificare sunt bazate pe Decizia Comisiei nr. 2002/657/EC. Prin urmare, o toleranta de 2,5% a tR si o diferenta mai mica de 20% intre cele doua rapoarte de tranzitie au fost considerate acceptabile pentru a fi confirmate. Cu toatea acestea, pentru PFPeA a fost diponibila o singura tranzitie, astfel incat conformarea poate fi posibila numai cu MS/MS de inalta rezolutie. Ca si consecinta a criteriilor alese, bazate pe conceptul ca un compus poate fi cantitate – relativ masurat cu conditia ca acesta sa fi fost identificat fara ambiguitate, LOD si MDL au fost calculate folosindu-se tranzitia cu intensitate mai mica. LOD si LOQ au fost estimate pronindu-se de la raportul semnal – zgomot (S/N) in solutie standard, ca si cantitate care are valoarea de S/N = 3 si respectiv = 10. Cu toate acestea, cand LOQ este aparent mai jos decat corespondentul lui LOD, se considera = LOD. MDL si MQl au fost estimati ca fiind valoarea blank +3 si 10 inmultit cu deviatia standard a blank-ului si acelasi criteriu a fost aplicat atunci cand MQL era aparent mai mic decat corespondentul sau MDL. Prin urmare, valoarea estimata a MDL corespunde CC (Deciziei Comisiei nr. 202/657/EC), dar trebuie subliniat ca acestea sunt obtinute prin utilizarea aceluiasi esantion de solventi si materiale. Tinand seama de faptul ca reproductabilitatea poate diferi de la laborator la laborator, rapoartele legate de MDL si MQL ar putea fi foarte variate si ar trebui considerate ca fiind aproximative.

4. Analiza mostrelor reale

Am analizat 15 mostre de lapte provenind de la marcile care se gasesc in mod curent in magazinele din Roma.10 au fost lapte proaspat pasteurizat (patru bucati lapte integral, trei semi-degresat, unul – lapte fara lactoza, doua – lapte de inalta calitate) si cinci – lapte UHT. Toate mostrele au fost analizat ein duplicat. Prin metoda noastra am obtinut MQL mai scazut decat celelalte recent publicate metode [5,15], nici una dintre ele nu a fost gasita contaminata, conform MQL, pentru nici unul dintre compusii analizati. Pentru 4 din 15 mostre am gasit o cantitate de unul sau mai multe componente intre MDL si MQL, dar acest lucru nu s-a confirmat in mostra duplicat. Acest fapt s-a datorat, probabil, dificultatii in a-i pastra constanta, cu valori blank scazute in conditii de reproductabilitate.

Fig. 1. Cromatogramele unui blank inainte (a) si dupa (b) distilarea solventului curatarea plastica si plasareau unei coloane scurte C18 intre mixer si mostra pentru

retinerea PFC provenit din fazele mobile si cromatografie.1: Perfluoropentanoic acid (PFPeA), 2: perfluorohexanoic acid (PFHxA), 3: perfluorobutanesulfonic acid (PFBS), 4: perfluoroheptanoic acid (PFHpA), 5: perfluorooctanoic acid (PFOA), 6: perfluorononanoic acid (PFNA), 7: perfluorodecanoic acid (PFDA), 8: perfluorooctane- sulfonic acid (PFOS), 9: perfluoroundecanoic acid (PFUdA), 10: perfluorododecanoic acid (PFDoA), 11: perfluorotridecanoic acid (PFTrDA), 12: perfluorotetradecanoic acid (PFTeDA), and IS2: 1H,1H,2H,2H-perfluorooctanesulfonic acid (H-PFOS). In paranteze sunt componente total absente.

A.L. Capriotti et al. / J. Chromatogr. A 1319 (2013) 72–79

7

Tabel 1

Recuperarea si precizia metodei LC/ESI-MS/MS pentru determinarea PFAS in laptele contaminat la 50 ng L−1 si folosind trei solventi diferiti.

Recovery (RSD %)a

Acetone Methanol Acetonitrile

PFPeA 58 ± 15 31 ± 18 32 ± 13PFHxA 98 ± 8 90 ± 14 88 ± 17

PFBS 92 ± 9 75 ± 14 92 ± 17

PFHpA 90 ± 8 87 ± 9 94 ± 15

PFOA 89 ± 10 86 ± 11 89 ± 7PFNA 93 ± 12 86 ± 15 80 ± 11

PFDA 90 ± 10 78 ± 10 63 ± 18

PFOS 88 ± 13 80 ± 11 68 ± 12

PFUdA 86 ± 8 67 ± 18 61 ± 16

PFDoA 80 ± 12 72 ± 16 65 ± 8PFTrDA 81 ± 13 60 ± 11 63 ± 12

PFTeDA 78 ± 18 60 ± 16 53 ± 9

a RSD a fost calculat pe sase mostre

Fig. 2. Chromatograms of a milk sample spiked at 10 ng L−1 . 1: Perfluoropentanoic acid (PFPeA), 2: perfluorohexanoic acid (PFHxA), 3: perfluorobutanesulfonic acid

(PFBS),

4: perfluoroheptanoic acid (PFHpA), 5: perfluorooctanoic acid (PFOA), 6: perfluorononanoic acid (PFNA), 7: perfluorodecanoic acid (PFDA), 8: perfluorooctanesulfonic acid

(PFOS), 9: perfluoroundecanoic acid (PFUdA), 10: perfluorododecanoic acid (PFDoA), 11: perfluorotridecanoic acid (PFTrDA), 12: perfluorotetradecanoic acid (PFTeDA), and

IS2: 1H,1H,2H,2H-perfluorooctanesulfonic acid (H-PFOS).

Table 2

Perfomantele analitice ale metodei LC/ESI-MS/MS pentru determinarea PFAS selectati (perfluorinated acids and sulfonates) in lapte.

Compus (abbreviere) Rta ± (min) Recoveryb ±RSDd (%) Recoveryc ±RSDd (%) LODe (pg) LOQf (pg) MDLg (ng L−1 ) MQLh (ng L−1 )

PFPeA 4.1 ± 0.1 107 ± 4 91 ± 3 0.3i 1.0 3.0 10.0

PFHxA 6.1 ± 0.1 101 ± 3 95 ± 2 1.4 1.4 1.7 1.7

PFBS 6.3 ± 0.1 99 ± 4 97 ± 4 0.4 0.4 1.5 1.5

PFHpA 8.6 ± 0.1 103 ± 4 95 ± 3 0.8 2.1 2.0 4.1

PFOA 11.5 ± 0.1 101 ± 3 101 ± 3 0.3 0.4 0.9 1.2

PFNA 14.5 ± 0.1 105 ± 6 99 ± 2 0.7 0.7 1.6 1.6

PFDA 17.4 ± 0.1 101 ± 6 93 ± 5 1.0 1.0 3.0 3.0

PFOS 18.2 ± 0.1 105 ± 4 105 ± 4 0.7 1.0 2.0 2.5

PFUdA 19.4 ± 0.1 98 ± 4 96 ± 3 0.4 0.4 1.5 1.5

PFDoA 20.7 ± 0.1 100 ± 5 97 ± 2 0.6 1.0 1.6 2.9

PFTrDA 21.8 ± 0.1 100 ± 9 92 ± 6 0.7 1.4 0.8 1.4

PFTeDA 22.7 ± 0.1 98 ± 6 94 ± 4 0.3 0.6 0.5 0.8

aTimpul de retentie.b Pentru experimente de recuperare, mostrele de lapte erau condimentate cu PFAS at

10 ng L−1 .

c Pentru experimente de recuperare, mostrele de lapte erau condimentate cu PFAS at

50 ng L−1 .

d RSD a fost calculat la n = 6.e Limita instrumentala de detectie (S/N = 3 pt a doua cea mai intensa tranzite in MRM).f Limita instrumentala de cuantificare (S/N = 10 pentru cea mai intensa tranzitie in MRM).g Metoda de detectie a limitei (text).h Methoda cuantificarii limitei (vezi text).i O singura tranzitie a fost disponibila pt acest compus..

5. Concluzii

A fost dezvoltata o metoda analitica foarte sensibila bazata pe SPE, urmata de LC-MS/MS, permitand determinarea a zece acizi carboxilici perfluoroacrilici si doua sulfonate perfluoroacrilice in laptele de vaca. Respectand alte doua metode publicate recent, una bazata pe extractia QhEChERS [5] si celalalta bazata pe extractia alcalina cu metanol urmata de SPE anion slab [15], metoda noastra, bazata pe o simpla precipitatie de acetona a proteinelor de lapte si curatarea SPE selectiva cu coloana GCB, pare a fi mai selectiva, ba mai mult, efectele de matrice nu au fost prezente, iar recuperarile au fost mai mari. Cu toate acestea, folosirea standardelor isotopice etichetate pentru cuantificare sunt recomandate pentru a se asigura acuratetea si corectitudinea rezultatelor. Experienta noastra a consfirmat ca recucerea valorilor blank reprezinta o problematica majora in analiza PFAS. In cele din urma, un scurt studiu asupra laptelui de vaca comercial, de diferite tipologii, a confirmat de asemenea ca contaminarea cu PFAS in laptele de vaca nu este frecvent in brand-urile comerciale vandute in tarile dezvoltate.

Multumiri

Autorii doresc sa multumeasca Dr. Riccardo Nescatelli pentru asistenta in aplicarea si supravegherea acestei proceduri experimentale.

Appendix A. Date suplimentare

Date suplimentare legate de acest articol se pot gasi in varianta online http://dx.doi.org/10.1016/ j.chroma.2013.10.029 .

Referinte

[1] P. de Voogt, M. Sáez, TrAC, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 326.[2] Y.G. Zhao, C.K.C. Wonga, M.H. Wonga, Chemosphere 89 (2012) 355. [3] S.P.J. van Leeuwen, J. de Boer, J. Chromatogr. A 1153 (2007) 172.[4] J. Thompson, A. Roach, G. Eaglesham, M.E. Bartkow, K. Edge, J.F. Mueller, Mar.

Pollut. Bull. 62 (2011) 2869. [5] O. Lacina, P. Hradkova, J. Pulkrabova, J. Hajslova, J. Chromatogr. A 1218 (2011)

4312.[6] N. Yamashita, K. Kannan, S. Taniyasu, Y. Horii, G. Petrick, T. Gamo, Mar. Pollut.

Bull. 51 (2005) 658.[7] U.S. Environmental Protection Agency, Draft Risk Assessment of the Potential Human Health Effects Associated with Exposure to Perfluorooctanoic Acid and its Salts,

2005.

[8] S.D. Richardson, T.A. Ternes, Anal. Chem. 83 (2011) 4614.[9] U.S. Environmental Protection Agency, Provisional Health Advisories for Per- fluorooctanoic Acid and Perfluorooctanoate Sulfonate, 2009.

[10] J. Alexander, et al., EFSA J. 653 (2008) 1–131 http://www.efsa.europa.eu/en/ efsajournal/pub/653.htm

[11] Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants. Geneva, Switzerland,2009.

[12] A. Jahnke, U. Berger, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 410.[13] M. Onghenaa, Y. Moliner-Martinez, Y. Pico, P. Campíns-Falcó, D. Barcelóc, J.Chromatogr. A 1244 (2012) 88. [14] Y. Chang, W. Chen, F. Bai, P. Chen, G. Wang, C. Chen, Anal. Bioanal. Chem. 402 (2012) 1315. [15] W.M. Young, P. South, T.H. Begley, G.W. Diachenko, G.O. Noonan, J. Agric. Food

Chem. 60 (2012) 1652. [16] N. Marchetti, L. Caciolli, A. Laganà, F. Gasparrini, L. Pasti, F. Dondi, A. Cavazzini, Anal. Chem. 84 (2012) 7138. [17] M. Sundström, D.J. Ehresman, A. Bignert, J.L. Butenhoff, G.W. Olsen, S. Chang, Å.

Bergman, Environ. Int. 37 (2011) 178. [18] Z. Kuklenyik, J.A. Reich, J.S. Tully, L.L. Needham, A.M. Calafat, Environ. Sci. Tech- nol. 38 (2004) 3698.

[19] M. Llorca, M. Farre, Y. Pico, M.L. Teijon, J.G. Alvarez, D. Barcelo, Environ. Int. 34 (2010) 584.[20] O.S. von Ehrenstein, S.E. Fenton, K. Kato, Z. Kuklenyik, A.M. Calafat, E.P. Hines, Reprod. Toxicol. 27 (2009) 239. [21] L. Tao, K. Kannan, C.M. Wong, K.F. Arcaro, J.L. Butenhoff, Environ. Sci. Technol.

42 (2008) 3096.[22] C. Cavaliere, P. Foglia, E. Pastorini, R. Samperi, A. Laganà, J. Chromatogr. A 1101 (2006) 69.[23] C. Cavaliere, G. D’Ascenzo, P. Foglia, E. Pastorini, R. Samperi, A. Laganà, Food

Chem. 92 (2005) 559.[24] L. Campanella, A. Di Corcia, R. Samperi, A. Gambacorta, Mater. Chem. (1982)

429.[25] C. Crescenzi, A. Di Corcia, G. Passariello, R. Samperi, M.I. Turnes Carou, J. Chro- matogr. A 733 (1996) 41. [26] Holm, S.R. Wilson, P. Molander, E. Lundanes, T. Greibrokk, J. Sep. Sci. 27 (2004)

1071.[27] C. Cavaliere, P. Foglia, C. Guarino, F. Marzioni, M. Nazzari, R. Samperi, A. Laganà, J. Chromatogr. A 1135 (2006) 135. [28] C. Cavaliere, P. Foglia, C. Guarino, M. Nazzari, R. Samperi, A. Laganà, Rapid

Commun. Mass Spectrom. 21 (2007) 550. [29] C. Cavaliere, P. Foglia, E. Pastorini, R. Samperi, A. Laganà, Rapid Commun. Mass

Spectrom. 19 (2005) 2085. [30] C. Cavaliere, P. Foglia, C. Guarino, M. Motto, M. Nazzari, R. Samperi, A. Laganà, N. Berardo, Food Chem. 105 (2007) 700.[31] T. Lundstedt, E. Seifert, L. Abramo, B. Thelin, A. Nyström, J. Pettersen, R. Bergman, Chemom. Intell. Lab. Syst. 42 (1998) 3. [32] Faberi, P. Foglia, E. Pastorini, R. Samperi, A. Laganà, Rapid Commun. Mass Spec- trom. 19 (2005) 275. [33] F. Andreolini, C. Borra, F. Caccamo, A. Di Corcia, R. Samperi, Anal. Chem. 59 (1987) 1720.[34] G. D’Ascenzo, A. Di Corcia, A. Gentili, R. Mancini, R. Mastropasqua, M. Nazzari, R. Samperi, Sci. Total Environ. 302 (2003) 199.[35] A. Di Corcia, L. Capuani, F. Casassa, A. Marcomini, R. Samperi, Environ. Sci.

Technol. 33 (1999) 4119.