la terza dimensione nella depurazione - ante associazione … · 2016-07-27 · possibilità di...
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La terza dimensione nella depurazione La terza dimensione nella depurazione
extracorporeaextracorporea
XXIV Corso Nazionale di Aggiornamento
Giuseppe Palladino
Scientific Affairs Manager Bellco
XXIV Corso Nazionale di Aggiornamento, Riccione 12 Aprile 2015
Piccole Molecole Peptidi e proteine a basso PM Tossine legate alle proteine• Indoxyl-solfato• Acido Ippurico (179)• Spermina(203)• Spermidina (145)• Putrescine (88)• p-cresolo (108)
albumina(66 k)
fattore Ba
endotelina(4,3 k)
ß2-microglobulina
Peptidi - AGE
leptina
(16 k)
interleuchine(21-26 k)
Tossine Uremiche
3,51 3,8 4,3 9,4 11,8 15 17,5 20 24 33 661,4
Peso Molecolare (kDa)
ß-endorfina(3,5 k)
fattore Ba(33 k)
Interleuchina-1(17,5 k)
calcitonina(3,8 k)
ß2-microglobulina(11,8 k)
Fattore D(24 k)
PTH(9,4 k)
angiogenina(14 k)
TNFα
(45 k)
Creatinina (113)Fosfati (96)Urea (60)Omocisteina (135)
Adattato da: Vanholder R et al, Kidney International (2003), 63; 1934-1943 4
water soluble
Protein bound
Middle molecules
Normal and Pathologic Concentrations of Uremic Toxins
46%
25%
28%
Duranton F et al. J Am Soc Nephrol 23: 1258–1270, 2012
Tipologia di “passaggio” dei soluti: diffusione
Fattore limitante: permeabilità diffusiva (Ko)
Soluti a piccolo peso ���
Soluti a medio-alto peso Soluti a medio-alto peso �
Selettività di rimozione in base al peso
molecolare
Piccole molecole
Medie molecole
Tossine legate alle proteine
Parte libera delle tossine legate alle proteine
Tipologia di “passaggio” dei soluti: convezione
Fattore limitante: permeabilità idraulica (Kuf)
Soluti a piccolo peso ��
Soluti a medio-alto peso ��Soluti a medio-alto peso
Nessuna selettività in base al peso molecolare
fino al cut-off della membrana
Piccole molecole
Medie molecole
Tossine legate alle proteine
Parte libera delle tossine legate alle proteine
Fattore limitante: emo-compatibilità dei sistemi
Rimozione più o meno selettiva, si evita la perdita di
nutrienti
Rimozione di tossine non dializzabili
La “terza dimensione”: adsorbimento
Rimozione di tossine non dializzabili
Possibilità di aumento della permeabilità della membrana
dialitica
Perché i sorbenti?
• Capacità di rimuovere specifiche tossine o classi di tossine
• es. β2 Microglobulina, citochine (sepsi)…
• Incrementare la rimozione di soluti oltre il trasporto convettivo/diffusivo
• es. tossine legate alle proteine
• Possibilità di uso orale
• per pazienti in CKD non ancora in dialisi (AST-120)
• Capacità di purificare il dializzato (riduzione acqua necessaria)
• es. Sistema REDY e successive modifiche
Vantaggi
• Permettono di rimuovere un particolare soluto e nello stesso tempo
evitano la perdita di altri
• Sorbenti altamente specifici permettono di rimuovere soluti specifici
• Rimozione non selettiva
• Sorbenti a bassa selettività possono rimuovere differenti soluti contemporaneamente• Sorbenti a bassa selettività possono rimuovere differenti soluti contemporaneamente
• Possono essere usati per il trattamento di avvelenamenti o per la rimozioni di tossine
del fegato
• Rimozione di tossine non dializzabili (o difficilmente dializzabili)
• L’adsorbimento di soluti permette la diffusione di altri e la liberazione di tossine
legate alle proteine
Animals / in vitro
Depurazione dell’urea
Emolisi
Severi effetti collaterali
Muirhead EE, Reid AFResin artificial kidney
J Lab Clin Med 1948; 33: 841-4
Amberlite IR-100 H
(Cation / anion exchange resin)
Scopo Effetti collaterali
L’uso dei sorbenti in sistemi di purificazione del sangue è
arte nota…
Avvelenamenti
(Pentobarbital)
Problemi con gli elettroliti
Emolisi
Reazioni febbrili
Schreiner GEThe role of hemodialysis (artificial kidney) in acute
poisoning
AMA Arch Intern Med 1958; 102 (6): 896 - 913
Lactate anion exchange resin
Shaldon S et al.
Sorbent regeneration of ultrafiltrate as a long-term
treatment of end-stage renal failure
Artif Organs 1978; 4: 343-7
Urease cartridge, zirconium phosphate (Redy ®)
Rigenerazione del dialisato
(HD) o uf (HF)
Problemi con gli elettroliti
Rilascio di alluminio
Che cos’è la cromatografia?
� Insieme di tecniche atte a separare una miscela
nei suoi componenti, per permetterne il
riconoscimento qualitativo e quantitativoriconoscimento qualitativo e quantitativo
� Basate sulla distribuzione differenziale dei vari
componenti il sorbente e l’eluente che fluisce in
continuo attraverso la fase fissa
Alcune definizioni
�Sorbente: Materiale poroso con elevata area
superficiale in grado di adsorbire differenti soluti
mediante forze intermolecolari
Eluente
Fase stazionaria
mediante forze intermolecolari
�Eluente (fase mobile): il vettore che provoca il
trasporto dei soluti all’interno della colonna
�Eluato: fase mobile contenente i soluti che
fuoriescono dalla colonna
Eluato
Come lavorano i sorbenti?
• Adsorbimento: adesione di una molecola alla superfice
• Generalmente è reversibile => equilibrio chimico
• Elevata concentrazione in soluzione => maggiore soluto legato
• Diversi meccanismi di legame:
• Forze di Van der Waals
• Legami a idrogeno
• Forze elettrostatiche
• Legami covalenti (molto rari)
Caratteristiche strutturali
• Elevate aree superficiali, diverse dimensioni dei granuli
• Aree superficiali tipiche vanno dai 300 – 800 m2/g
• Più piccole sono le particelle maggiore è la resistenza al flusso (aumento
pressioni)
pore diameter
Stephan Harm et al Blood Purif 2016;41:55–63
BEAD diameter
pore diameter
Fase mobile e fase stazionaria
� Sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si
distribuiscano tra le due fasi
� Quelli più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa
fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema
� Quelli più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente
Equilibrio e Ripartizione
La migrazione dei soluti è legata alla diversa affinità dei componenti per il sorbente e la
loro solubilità nel solvente
� La natura chimica delle sostanze da separare
� Tipo e la natura del solvente
� Tipo e la natura del sorbente
Tanto più kD è alta, tanto più il soluto trascorre tempo nella fase stazionaria e migra lentamente.
Am
As
Flusso fase mobile
kD(A) < k
D(B)
A B
A B
Teoria Cinetica: fattori influenzanti gli equilibri
� Velocità di flusso
� Percorsi multipli o alla diffusione vorticosa (A)
� Resistenza al trasferimento di massa (C)
Equazione di van DeemterEquazione di van Deemter Valore minimo di H
(max efficienza) per
valori bassi di μ.
J.J. van Deemter et al. Chem Eng Sci; 1956, 5 (6): 271-289
I meccanismi della separazione
E’ possibile suddividerli in base ai tipi di interazione tra le due fasi
� Adsorbimento
� Ripartizione
� Scambio ionico
� Esclusione
� Affinità
La fase stazionaria interagisce con i componenti da separare in maniera diversa con
l’effetto di diversificare la loro velocità e quindi il tempo di transito
Adsorbimento
• Fase stazionaria: granuli (o polvere stesa su un supporto)
• Possibilità di siti attivi sulla superficie che possono stabilire legami deboli con le
molecole della miscela da separare.
• Fase mobile: Può essere un gas o un liquido• Fase mobile: Può essere un gas o un liquido
Uso: utilizzata per separare sostanze neutre polari o
non polari, di natura organica o inorganica
Soluti adsorbiti sulla superfice della fase
fissa
Soluti disciolti nella fase mobile
Ripartizione
• Fase stazionaria: un liquido che impregna la superficie di un solido inerte. Le molecole da
separare sono solubili nel liquido
� Immiscibilità tra fase stazionaria e fase mobile
• Fase mobile: Può essere un gas o un liquido
• Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono tra le due fasi secondo la diversa solubilità • Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono tra le due fasi secondo la diversa solubilità
di ognuna
• Uso: separazione di sostanze organiche
• Si distingue in:
� fase normale: fase stazionaria più polare della fase mobile
� fase inversa: fase stazionaria meno polare della fase mobile. Fase fissa
Soluti disciolti
nella fase mobile
Soluti adsorbiti sulla
superfice della fase fissa
Scambio ionico
Fase stazionaria: polimero inerte contenente siti attivi ionizzati o
ionizzabili
Meccanismo di separazione: competizione per i siti di scambio tra gli ioni
presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione.
Uso: impiegata per la separazione
di sostanze ioniche o ionizzabili
Esclusione dimensionale
Fase stazionaria: solido poroso o un gel.
Meccanismo di separazione: i soluti si separano se hanno dimensioni compatibili con i pori del sorbente. Le molecole più grandi sono escluse ed escono per prima
Si parla di cromatografia di esclusione dimensionaleSi parla di cromatografia di esclusione dimensionale
(SEC)
• Gel permeazione per la separazione di sostanze
insolubili in acqua
• Gel filtrazione per la separazione di sostanze
solubili in acqua
Uso: separazione di molecole di grandi dimensioni
Affinità
Fase stazionaria: matrice solida con siti di legame specifici
Meccanismo di separazione: reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche
Molecola A
Uso: separazione di molecole di
interesse prevalentemente biochimico
Ligando specifico per A
Altre molecole
non affini al
ligando
Idrofobicità - Idrofilicità
Sito polare Sito non polare
Siti polari sull’esterno in grado
di formare legami H con l’acqua
Regione interna idrofobica
siti di catena non polari
Come funziona le resine?
micro 1. Interfase
2. Intrafase
3. Sottile film superficiale
nano
4. Molecole grandi si legano
alla superficie
5. Quelle piccole diffondono
all’interno
6. Adsorbimento o Eluizione
L’idrofobicità o l’idrofilicità delle proteine gioca un ruolo importante nelle separazioni
Terapie adsorbitive: applicazioni biologiche
RitenzioneReinfusione
AlbuminaIgG
tempo
Tossine
Tossine
Effetto della velocità lineare
Flusso, ml/min Velocità lineare, cm/h
r= 2 r=4 r=6
30 143 36 1630 143 36 16
50 238 60 27
60 286 72 32
80 381 96 42
100 476 120 53
120 571 143 64
180 857 215 96
300 1429 359 159
r
Differenze nelle velocità lineari (r= 2 cm)
Situazione Ideale
Situazione reale
0 50 100 150 200 250 300 350
0
25
50
75
100
Ad
so
rbim
en
to (
%)
Velocità lineare, cm/h
Emo-perfusione
0 50 100 150 200 250 300 350
0
500
1000
1500
Flusso, ml/min
Velo
cit
à l
ineare
, cm
/h
Uf - Plasma perfusione
0 50 100 150 200 250 300 350
0
500
1000
1500
Flusso, ml/min
Velo
cit
à l
ineare
, cm
/h
Emo-perfusione vs Plasma/ultrafiltrato perfusione
Qb=180 ml/min
Quf ~ 30-50 ml/min
Flow rate
Qb=180-300 ml/minFlow rate
Quf ~ 30-50 ml/min
• Volume di sangue trattato maggiore
• Fouling Superfice
• Velocità lineare elevata
• Attivazione cellulare
• Adsorbimento Limitato
• Tempo di contatto maggiore tra resina e
plasma
• Maggiore diffusione e adsorbimento
• Migliore adsorbimento
Conclusioni
� L’uso di terapie extracorporee adsorbitive è in costante
aumento
� L’adsorbimento è governato dalle leggi delle cromatografia� L’adsorbimento è governato dalle leggi delle cromatografia
� La velocità lineare è un fattore differenziante
� La plasma/uf perfusione è preferibile all’emo perfusione