L'histiocytose Langerhansienne

et le polyomavirus de Merkel :

de la culture cellulaire au modèle animal

Ma. Victoria Ayala Victor Chaumeton Léonid Velikovsky

Sous l’encadrement du Pr. Laurence Nieto

M2P EGPR

2015 - 2016

Remerciement

En tout premier lieu, nous souhaitons vivement remercier notre professeur encadrante, Laurence,

qui a su nous guider, avec toute la pédagogie dont elle est capable, pour la réalisation de ce projet.

Nous saluons aussi sa patience (il en a fallu beaucoup), et son accessibilité. Son recul dans le domaine

de la recherche nous a été indispensable au cours de la mise en place de ce travail (ou jeu ?).

Nous remercions Laurent, pour nous avoir permis de suivre le cursus d’expression génique et de

protéines recombinantes, ainsi que pour sa vision de l’enseignement, à notre sens d’une qualité rare,

et pour les nombreuses discussions qui découlaient de ses interventions.

Nous tenons à remercier Remy pour ses conseils et ses éclaircissements, particulièrement au sujet

des maladies chroniques inflammatoires.

Nous souhaitons également remercier le reste de l’équipe pédagogique, Pascal, Samuel, Eric,

François, Vincent et Sylvie. Ensemble, ils ont participé à notre épanouissement intellectuel et

scientifique.

Enfin, nous remercions vivement la promotion n°16 du M2P EGPR, pour la qualité du travail fourni et

pour la bonne humeur régnant dans notre petite salle.

Abréviations

CCL20: chimiokine CCL20

DC: dendritic cell

Gluc : luciférase Gaussia

GM-CSF : facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages

HL-MS : HL multi-systémique

HL-RO - : HL dans les organes non à risque élevé

HL-RO + : HL dans les organes à risque élevé

HL-SS : HL à système unique

hPBMC : cellules mononucléaires humaines du sang périphérique

IFN- γ : interféron-γ

IL : interleukine-1

IL-17A : interleukine 17A

IL-1R : récepteur de l’interleukine 1

LC : cellules de Langerhans

HL : Histiocytose Langerhansienne

MCC : Merkel Cell Carcinoma

MCMV : cytomégalovirus murin

MCPyV/MCV : Merkel cell polyomavirus

MGCs : cellules géantes multinuclées

MoDC : cellules dendritiques dérivées de monocytes

NCRR: non-coding regulatory region

PAMP: pathogen-associated microbia pattern

Pfu : unités formant des plages

Tg : Transgenic

Th17: lymphocytes T auxiliaires 17

TLR: Toll-like receptor

TNF-α : facteur de nécrose tumorale α

TRAP : phosphatase acide tartrate-résistante

Sommaire

I - Introduction

L'histiocytose langerhansienne

Mutation BRAF

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) et HL

Le virus

La réponse immunitaire contre l'infection viral

Epidémiologie

« Cytokine storm »

IL-17A

IL-1

CCL20

II - Analyse d'une publication

Etude de l'IL-17A dans les sérums des sujets avec HL

L’action d’IL-17A

Caractérisation fonctionnelle des DCs stimulées par IL-17A

III - Projet de Recherche

Établissement du modèle murin

Prise de sang dans le sinus orbitaire

Sacrifice de la souris et prélèvement des organes et du sang

Rôle du virus : Infection par MCPyV

Analyse sanguine

Analyse tissulaire

Modèles cellulaires

Différenciation des iPSC en cellules de la lignée myéloïde

Transduction des iPSC par un vecteur lentiviral

VI - Perspectives

V - Bibliographie

Résumé

Figure 1 : Présentation des différents stades de maturation des cellules de l’immunité.

Dans la moelle osseuse, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) vont se différencier en précurseurs

myéloïdes (MP) et lymphoïdes (ML). Les MPs donneront naissance à un précurseur commun des monocytes

et des cellules dendritiques (MDP) qui pourra se différencier en monocytes ou en précurseurs de DCs (CDP).

Ces CDP subiront une dernière étape de différentiation en pré DCs (Pre-c DC) avant d’être libérées dans la

circulation sanguine. Ils termineront leur maturation en infiltrant les différents tissus ciblés.

Le lignage des cellules dendritiques communes est indiqué par une étoile rouge, celui des cellules dendritiques

dérivées de monocytes par une étoile orange.

cDC: classical dendritic cell ; CDP : common dendritic cell precursor ; HSC : hematopoietic stem cell ; LCs :

Langherans cell ; LP : lymphoid precursor ; lpDCs : lamina propria dendritic cells ; M macrophage ; MDP :

monocyte/macrophage and dendritic cell progenitors ; moDCs : monocyte-derived dendritic cells ; MP :

myeloid precursor ; Pre-c DC : preclassical dendritic cell ; Pro-B : B cell progenitor ; Pro-T :T cell progenitor

Introduction

L'histiocytose Langerhansienne

Les maladies orphelines sont caractérisées comme étant des maladies rares dont on ne

dispose pas de traitements efficaces. Parmi elles, l’histiocytose Langheransienne n’échappe pas à la

règle : elle reste une maladie peu caractérisée et mal comprise. De plus, les thérapies actuellement

proposées n’ont pas étaient développées à la base pour soigner l’HL mais plutôt pour des maladies

présentant un spectre symptomatique proche de l’HL, comme une inflammation chronique

(psoariasis, maladie de Crohn’s, sclérose en plaques), la formation de granulome avec la présence de

cellules géantes multinuclées (MGCs) (infection à Mycobacterium tuberculosis) ou une résorption

osseuse (poly arthrite rhumatoïde). L’HL est une maladie rare (1/200000 environ) (Guyot-Goubin et

al, 2008) qui se caractérise par une infiltration tissulaire excessive de cellules dendritiques de type

Langerhans conduisant à la formation de cellules géantes multinuclées et de granulomes (Morimoto

et al, 2014).

Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes, localisé au sein des

tissus. Elles jouent un rôle notamment dans l’induction de la réponse immunitaire adaptative et dans

la tolérance du ‘’soi’’. Elles dérivent généralement d’un progéniteur hématopoïétique (Fig 1) présent

dans la moelle osseuse. Au cours de la différentiation, les précurseurs des cellules dendritiques

(cellules progénitrices myéloïdes, progéniteur monocytaire) vont s’orienter vers la lignée dendritique

via la stimulation par différentes cytokines qui sont majoritairement le GM-CSF et le TNF et seront

libérées dans le sang et la lymphe. Le recrutement tissulaire des DCs est la dernière phase de leur

maturation, dans le sens ou après cette étape, les DCs seront capable de présenter un antigène aux

cellules de l’immunité (lymphocyte T notamment). L’infiltration tissulaire est stimulée par la

libération de cytokines et chimiokines chimio-attractives (CCL20 et l’INF-) par les tissus

inflammatoires ou néoplasiques. Il est important de noter que le lignage des DCs est extrêmement

complexe dans le sens où il existe différentes sous populations de cellules dendritiques qui dérivent

parfois de progéniteurs différents. De plus, ces cellules sont également capables de se former à partir

de monocytes par stimulation au TGF-, IL-4 et GM-CSF (Caux et al, 1992).

Dans la pathologie HL, l’infiltration excessive des DCs peut toucher un ou différents organes,

avec une agressivité variable, ce qui permet de diviser la maladie en deux classes : L’HL focale, encore

appelée histiocytose « single system », ou un seul système organique est touché et L’HL multifocale

ou histiocytose « multi system ». Le caractère disséminé de l’HL est établi par la mise en évidence

d’au moins une atteinte hépatique, pulmonaire, hématopoïétique ou splénique et représente la

forme la plus grave de la maladie. L’os, la peau et l’hypophyse sont les organes les plus souvent

1

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3

4

5

Figure 2 : Implication de la voie NF-B dans l’histiocytose Langheransienne

NF-B joue un rôle dans la répression ou l'activation des gènes codants, et est retenue dans le cytoplasme par

la protéine inhibitrice IB. La dégradation d’IB par phosphorylation et ubiquitination permet la translocation

de NF-B jusqu'au noyau et l'activation de la transcription des gènes cibles

1) L’induction de la voie NF-B débute par l’activation d’un récepteur de la famille des TLR (toll like receptor)

par des cytokines pro-inflammatoires (IL-1, TNF-…). 2) Ce TLR va induire la phosphorylation d’I-B, le

répresseur fonctionnel d’NF-B. I-B phosphorylé va ensuite être ubiquitinylé par une ubiquitine ligase et est

envoyé au protéasome. 3) I-B est dégradé dans le protéasome, les ubiquitines sont libérées dans le

cytoplasme. 4) NF-B se retrouve libre dans le cytoplasme (retrouvé actif dans les DCs et MGCs). 5) NF-B

pourra traverser la membrane nucléaire et jouer son rôle d’activateur transcriptionnel, activant la libération

de cytokines pro inflammatoires, de facteurs mitogéniques ou encore de facteurs de résistances à l’apoptose.

P : phosphate ; Ub : ubiquitine ; Il : interleukine ; NF-B : nuclear factor-kappa B ; IB : inhibitor of kappa B ; IL

: interleukine

touchés. De ces atteintes organiques découlent des dérégulations métaboliques et fonctionnelles qui

dépendent du tissu atteint tel qu’une résorption osseuse, l’apparition d’un diabète insipide, le déficit

en facteurs de croissances, la présence de lésions tissulaires cutanées notamment (Bandalian-Very et

al, 2013).

La maladie est caractérisée notamment par la formation de granulome avec la présence de

MGCs. Ces cellules ressemblent aux ostéoclastes, et proviennent de la fusion des DCs (Coury et al,

2008). Elles sont capables de dégrader la matrice extra cellulaire grâce à l’activité de plusieurs

enzymes (TRAP, MMP-9, cathepsine K). La présence anormale de MGCs dans les tissus joue un rôle

dans l’apparition des lésions.

La variabilité des tableaux cliniques retrouvés pose de grandes difficultés dans le dépistage et

les soins promulgués aux patients. Les stratégies thérapeutiques actuelles reposent sur l’utilisation

d’anti-inflammatoires stéroïdiens (corticoïdes) et d’anti tumoraux classiquement utilisé dans le

traitement des lymphomes tel que le méthotrexate ou les vinca-alcaloïdes. Par manque de

caractérisation de la maladie, ces thérapies donnent des résultats plus qu’aléatoires (Gadner et al,

2001 et 2008). Chez les patients atteint de la forme ‘’single system’’, les traitements recommandés

reposent sur une stratégie ‘’wait and see’’ adapté à l’évolution de la maladie. Pour les cas présentant

des lésions cutanées ou osseuses, l’injection locale de corticostéroïde (prednisolone) permet de

maitriser les poussées de la maladie. Lorsque plusieurs os présentent des lésions (on reste dans une

forme « single system »), la mise en place d’une corticothérapie à long terme (6 à 12 mois) et à plus

forte dose, associée à l’utilisation de vinca-alcaloïde (vinblastine) présente de bons résultats, à savoir

une stabilisation de la maladie (Morimoto et al, 2010). Cette même thérapie est utilisée lorsque la

maladie évolue vers une forme ‘’multi système’’, mais reste sans risque majeur pour le patient. En

revanche, si un ou plusieurs organe(s) à risque est/sont touché(s) (10% des malades) à savoir le foie,

la rate, les poumons ou le système hématopoïétique, la thérapie évolue vers l’utilisation de vinca-

alcaloïde (vincristine) associé à un anti mitotique, la cytarabidine et à une corticothérapie sur le long

terme. Ces patients présentent un risque élevé de développer des séquelles à vie, tel que l’apparition

d’un diabète insipide ou une fragilité osseuse importante. Pour les individus atteints de la forme

multi-systémique de l’HL, ces thérapies présentent un taux de rechute d’environ 30% (Gadner et al,

2013).

Deux voies métaboliques se retrouvent impactées dans l’HL, NF-B (Fig 2) et la voie des

MAPK (Fig 3A). La voie NF-B, activé notamment par l’IL-1 (Murakami et al, 2014) va entrainer la

libération de facteur pro-inflammatoire, mitogénique, de résistance à l’apoptose et d’attraction

expliquant en partie la formation de granulomes et le potentiel migratoire anormal des DCs dans les

A

B

Figure 3 : Impact des mutations retrouvées chez les patients sur la voie des MAPK :

A) Schéma récapitulatif de la voie des MAPK, les mutations retrouvées chez les malades sont indiquées par une

étoile rouge. Après activation d’un récepteur (cytokine, hormone de croissance), la sérine thréonine kinase Ras

va se retrouver activée par la fixation d'un GTP. Ras, de son côté ira activer la protéine Raf, Raf activera les

protéines MAP2K1 (ou MEK1) et MAP2K2 (ou MEK2), qui elle-même active ERK en le phosphorylant. ERK est le

dernier maillon connu de cette cascade, il pourra directement activer des facteurs de transcription, entrainant

la libération de cytokines et l’activation du cycle cellulaire entre autre.

B) Impact d’ERK phosphorylé sur l’agressivité de l’histiocytose Langheransienne. Plus le précurseur présentant

une forte concentration en ERK phosphorylé est précoce, plus la maladie risque d’évoluer vers une forme multi-

systémique grave.

MAPK: mitogen-activated protein kinases ; ERK : extracellular signal-Regulated Kinases ; MEK : mitogen-

activated extracellular signal-regulated protein kinase ; HL : histiocytose Langheransienne.

tissus touchés. Cette voie, dans le cadre de l’HL (Coury et al, 2008) et de la poly arthrite rhumatoïde

(Kotake et al, 1999) est retrouvée active dans les DCs et les MGCs des sujets malades. La voie des

MAPK joue un rôle dans la régulation de la prolifération, la survie, la différentiation et la migration

cellulaire.

Des analogies existent au niveau des symptômes retrouvés entre l’HL et d’autres maladies

chroniques inflammatoires comme la poly arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn’s et l’infection à

Mycobacterium tuberculosis. De plus des études basées sur l’utilisation de modèles animaux (Zhou et

al, 2007 ; Umemura et al, 2007) ont mis en évidence l’impact de l’IL-17A sur la formation de

granulome et la résorption osseuse dans les pathologies cités précédemment. La publication que

nous allons présenter en seconde partie analyse en détail les mécanismes impliquant l’IL-17A dans

l’apparition des symptômes de l’HL et de la fusion des DCs en MGCs.

L’étiologie de la maladie reste actuellement un mystère, même si la découverte récente

d’une mutation de BRAF (V600E BRAF) présente chez des patients atteints pousse l’argumentation en

faveur d’une cause néoplasique (Bandalian-Very et al, 2010).

Mutation BRAF

L’équipe de Badalian-Very a montré que la protéine BRAF présentait la mutation V600E dans 50% des

patients atteint de l’HL (sur une cohorte de 41 patients) conduisant à une expression constitutive

d’ERK phosphorylé. Cette mutation est retrouvée dans certains cas de mélanomes, de cancers

colorectaux et de leucémies myéloïdes (Chan et al, 2009 ; Davies et al, 2002). Cependant, l’impact de

cette mutation sur l’origine et l’évolution de la maladie n’est pas clairement définit (Badalian-Very et

al, 2010). Afin de mieux comprendre le rôle de cette mutation, de nouvelles études ont été réalisées.

Elles ont permis de dire que l’agressivité de la maladie n’est pas corrélée avec la présence directe de

la mutation (Berres et al, 2014 ; Chakraborty et al, 2014). En revanche la présence anormalement

forte d’ERK phosphorylé dans les DCs des sujets malades peut être reliée avec l’agressivité de l’HL

(Fig 3B) (R. Chakraborty et al, 2014). Lorsque les premiers précurseurs des DCs tel que les

progéniteurs myéloïdes ou sanguins, présentent de fortes concentrations en ERK phosphorylé, les

sujets atteints présentent plus souvent une évolution multi systémique grave (Chakraborty et al,

2014). Alors que la présence d’ERK phosphorylé dans des concentrations élevées au niveau des DCs

matures ou dans leurs précurseurs tissulaires (plus tardif que les progéniteurs myéloïdes et

circulants) entraine plus souvent l’atteinte d’un seul système organique. D’autre part, il est décrit la

présence d’autres mutations au niveau de la protéine MAP2K1 (Fig 3A et 3B), pouvant jouer un rôle

dans la surexpression d’ERK phosphorylé dans les cellules touchées (Chakraborty et al, 2014).

Figure 4 : Présentation du polyomavirus de Merkel : structure et génome

A) Schéma représentant la structure de la capside du virus et l’agencement de l’ADN au sein de la capside. Les

protéines structurales VP1, VP2 et VP3 sont représentées ainsi que l’ADN enroulé autour des histones. A

droite, une vision externe de la capside est présentée.

B) Organisation génétique de l’ADN viral. Les séquences codantes pour les protéines VP1, VP2 et VP3 sont

indiqué respectivement en vert, orange et jaune. Celles codantes pour les antigènes T sont représentées de la

manière suivante : Small T en bleu, Large T en violet et 57kT en bleu clair et le cadre blanc correspond à

l’origine de réplication.

MCPyV : Merkel cell polyomavirus ; VP : viral protein

A

B

MCPyV

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) et l’histiocytose Langheransienne

Le Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV ou MCV) est un polyomavirus humain découvert en

2008 grâce aux progrès technologiques réalisés dans le domaine du séquençage à haut débit.

L’intérêt porté à ce virus par la communauté scientifique s’est largement accru depuis que son

implication dans l’oncogenèse des carcinomes cutanés épithéliaux et en particulier au Merkel Cell

Carcinoma (MCC) a été démontrée (Feng et al., 2008).

Les cellules de Merkel se situent dans la couche basale de l’épiderme et au niveau du bulbe

des follicules pileux, et sont plus abondants dans les zones de la peau impliquées dans la sensation

du toucher. Elles forment des synapses avec les extrémités terminales des fibres nerveuses sensitives

et servent comme mécanorécepteurs traduisant la sensation tactile (Halata et al.,2003). Les cellules

de Merkel et les cellules de Langerhans (LC) partagent certaines caractéristiques telles que la

localisation et l´association étroite avec des nerfs périphériques. Il existe une interaction

fonctionnelle entre eux. Ainsi, ces cellules pourraient communiquer par des dendrites dans lesquelles

certains neuropeptides ou cytokines peuvent être stockés (Kayo et al.,2002).

Le virus

Le MCPyV est un virus non enveloppé portant un ADN double brin d'environ 5400 paires de

bases (Johne et al., 2011) (Fig 4A). Son génome est similaire aux autres polyomavirus humains : il

comprend une origine de réplication conservée entre tous les virus de cette famille, ainsi que deux

régions codantes non chevauchantes et en orientation inverse. Une de ces régions est codée en

phase précoce et permet l’expression des antigènes T (Small T, Large T (LT) et 57kT) alors que la

deuxième, codée en phase tardive, permet l’expression des protéines de la capside (VP1, VP2, VP3).

Ces régions sont séparées par une région régulatrice non codante (non-coding regulatory region

(NCRR)) qui contient l'origine de réplication virale (Feng et al., 2008) (Shuda et al., 2008) (DeCaprio et

al., 1988) (Schowalter et al.,2013) (Fig 4B).

La réponse immunitaire contre l'infection viral

Les récepteurs TLR ("Toll-like receptor") sont des récepteurs présents à la surface de certains

types cellulaires chez l'homme et les mammifères. Ces récepteurs très conservés par l'évolution

jouent un rôle important dans l'immunité innée, notamment dans les défenses contre les

microorganismes. Ils peuvent reconnaître des motifs moléculaires dénommés PAMP pour "pathogen-

associated microbia pattern". Des virus seront détectés par différents TLRs et, lors de la liaison avec

leurs ligands, tous (sauf TLR3) recrutent la protéine adaptatrice MyD88. Cette protéine a la capacité

d’activité (par l’intermédiaire du complexe IRAK/ TRAF6 et de TAK1) la voie NF-B et la voie des

MAPK (Fig 5A) (Li et al., 2012 ; Murakami et al., 2015 ; Takeda et al., 2004).

Figure 5 : Rôle et influence du polyomavirus de Merkel dans l’histiocytose Langheransienne.

A) Schéma récapitulatif du mécanisme d’activation des TLRs. Les TLR possèdent des séquences très conservées

inter-espèce, et sont capable de reconnaître le polyomavirus des cellules de Merkel. Cette reconnaissance

induit le recrutement de la protéine adaptatrice MyD88 qui, par l’intermédiaire du complexe IRAK/TRAF6 et

de la protéine TAK1, va activer la voie NF-B et la voie des MAPK. L’action conjointe de ces deux voies va

entrainer une libération importante de cytokines pro inflammatoire notamment.

B) Etude épidémiologique sur la présence du polyomavirus de Merkel chez les patients atteint d’HL. La

prévalence de l’infection par le MCPyV est représentée en ordonnée. La cohorte est divisée en cinq groupe

selon l’âge, de gauche à droite au niveau de l’axe des abscisses : de 0 à 5 ans ; de 6 à 15 ans ; de 16 à 25 ans ;

de 26 à 50 ans et plus de 50 ans

MCPyV/MCP : Merkel cell polyomavirus ; TLR : toll-like receptor ; MyD88: myeloid differentiation primary

response gene 88 ; IRAK: interleukin-1 receptor-associated kinase ; TRAF6: TNF receptor associated factor 6 ;

TAK1: TGF-beta activated kinase 1; MKK: mitogen-activated protein kinase kinase; ERK: extracellular signal-

regulated kinase: JNK: c-Jun N-terminal kinase ; AP-1: activator protein-1 ; NF-B : nuclear factor-kappa B ; HL :

histiocytose Langheransienne

A

B

Le MCPyV est détecté par le TLR9 intracellulaire qui détecte les nombreux motifs CpG non-méthylé

de l’ADN double brin viral (Shahzad et al., 2013). Son activation entraine, par l’intermédiaire de la

voie NF-B, la production et la libération de cytokines et de chimiokines pour réprimer l'infection

viral (Ishii et al., 2006 ; Tsujimura et al., 2004). Dans le contexte de la HL, l'infection du MCPyV peut

stimuler la production d’IL-1 des précurseurs des DCs. La production d’IL-1 pourrait être accentuée

par la présence de la mutation BRAF V600E comme nous verrons plus tard (Murakami et al., 2014).

Epidémiologie

Des immunodosages enzymatiques spécifiques de VP1 ont montré que jusqu'à à 80% de la

population adulte ont des anticorps sériques dirigés contre MCPyV (Carter et al., 2009 ; Tolstov et

al.,2009). La séropositivité est quasi inexistante chez les nouveau-nés (Gustafsson et al., 2012) mais

devient largement répandue chez les enfants dans leur première décennie de vie, continuant à

augmenter avec l'âge, ce qui suggère que l'exposition au virus se produit au début l'enfance (Chen et

al., 2011).

Le même profil est retrouvé chez les patients atteint de l’ HL : le sérum des enfants âgés d’un

an ou moins n’étaient pas positifs aux anticorps contre MCPyV. En revanche, la valeur augmente

jusqu’à 43% chez les enfants âgés de 2 à 5 ans et 49% chez des enfants et des jeunes adultes entre 6

et 15 ans. Enfin, 80% dans des patients de plus de 50 ans sont séropositifs pour ce virus (Tolstov et

al.,2009) (Fig 5B).

L'ADN viral a été détecté dans une large variété de localisations anatomiques mais de façon

relativement faible par rapport à la peau, où à la fois l'ADN viral et le virions encapsulés peuvent être

détectés (Feng et al.,2008). Ce virus fait partie de la microflore physiologique, principalement de la

peau, où se trouvent les cellules de Merkel. Cependant, chez des sujets immunodéprimés, on peut

observer la réactivation du virus (Spurgeon et al.,2013).

Le groupe de Murakami a détecté la présence du MCPyV dans les monocytes sanguins des

patients présentant la forme disséminée de la maladie avec une atteinte d’organes à risque élevé

(HL-RO +). Alors que le virus n’est pas détéctable dans les monocytes des patients présentant des

formes moins sévères de la HL, sans atteinte d’organes à risque élevé (HL-RO -). Parmi les patients

HL-RO -, la présence de l’ADN MCPyV n’a été détecté que dans les LC lésionnelles (Murakami et

al.,2013).

Le tropisme cellulaire reste peu décrit, ainsi que les modes de diffusion et les réservoirs du

MCPyV dans le corps humain (Spurgeon et al.,2013). Le virus pourrait persister dans les monocytes

inflammatoires et profiter de leur capacité migratoire pour ce propager dans l’hôte et se maintenir

dans les tissus inféctés (Mertz et al.,2010). Au niveau de la HL, l’équipe de Murakami émettent

Figure 6 : Cellules et cytokines impliquées dans « l’orage de cytokine » chez les patients atteint d’HL

Les quatre types cellulaires majoritairement impliqués dans l’orage de cytokines sont présentées : les

macrophages (rose), les lymphocytes T (violet), les polynucléaires éosinophiles (rouge) et les cellules de

Langerhans des patients malades (orange). Les cytokines et les chimiokines retrouvées au niveau des lésions

des patients sont indiquées. Les effets activateurs et inhibiteurs des cytokines et des chimiokines sur les types

cellulaires concernés sont respectivement représentés en bleu et en rouge.

CCL : chemokine (C-C motif) ligand ; TGF : transforming growth factor ; GM-CSF : granulocyte-macrophage

colony-stimulating factor ; TNF : tumor necrosis factor ; IL : interleukine ; IFN : interferon ; PGE2 :

prostaglandine E2 ; CD : cluster of differentiation ; LIF : Leukemia inhibitory factor ; LCH : histiocytose

Langheransienne

l’hypothèse que si des monocytes porteurs de la mutation BRAF V600E reconnaissent le MCPyV dans

les vaisseaux sanguins, il pourrait plutôt induire une HL-RO + tandis que s’il est reconnu dans les

tissues périphériques par des précurseurs de LC ou par des LCs matures, portant tous les deux la

mutation, on observera plutôt une HL-RO - (Murakami et al.,2014).

« Cytokine storm »

On observe, dans les lésions des patients atteints de HL une grande variété de cytokines à

des niveaux élevés. Ce phénomène est désigné par l’expression « orage de cytokines » (« cytokine

storm »). Parmi ces cytokines, on trouve l’interféron-γ (IFN- γ), le facteur de nécrose tumorale α

(TNF-α), le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF) et de

nombreuses interleukines, notamment IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-10 et IL-17A (Egeler et al.,

1999, Laman et al., 2003, Coury et al., 2008). Les différents types cellulaires présents au niveau des

lésions, à savoir les éosinophiles, les macrophages, les lymphocytes T et les cellules dendritiques

anormales (les cellules HL) se partagent la production de ces facteurs. La Fig 6 tirée de la publication

de Laman représente les types cellulaires impliqués et les cytokines produites.

Dans la suite de cette introduction, l’accent sera mis sur l’interleukine-1, la chimiokine CCL20

et sur l’interleukine 17A.

IL-17A

IL-17A est une interleukine pro-inflammatoire. L’équipe de C. Delprat a détecté de l’IL-17A

dans les lésions, ainsi que dans le sérum des patients atteints de l’HL. Ces auteurs ont montré que

l’IL-17A était synthétisée par les cellules dendritiques et était responsable de la fusion de ces cellules,

aboutissant à la formation des cellules géantes multinuclées (MGCs). Ces MGCs seraient à l’origine

des lésions observés chez les malades (Coury et al, 2008). Ces résultats seront présentés en détail

dans la deuxième partie.

IL-1

L’interleukine 1 (IL-1), une autre interleukine pro-inflammatoire, a également été détectée dans les

sites de lésion chez des patients atteints de HL (De Graaf et al., 1996 ; Egeler et al., 1999), ainsi que

dans la salive de ces mêmes patients (Preliasco et al., 2008). Un des rôles connus d’IL-1 est de

participer à la différentiation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T auxiliaires 17 (Th17), et

de maintenir leur état de différentiation (Chung et al., 2009). Les lymphocytes auxiliaires Th17 sont

reconnus comme des producteurs majeurs d’IL-17A (Annunziato et al., 2012) et pourraient être une

des sources d’IL-17A détectée chez les patients. Bien qu’on détecte peu ou pas de Th17 dans les

lésions des patients atteints de l’HL, leur implication dans la maladie ne peut pas être complètement

écartée.

De plus, une boucle autocrine de régulation positive a été décrite pour IL-1. En effet, le

récepteur à l’interleukine 1 (IL-1R) sollicite la voie de signalisation NF-B. Parmi les gènes

positivement régulés par cette voie, se trouve le gène codant l’interleukine-1.

Ainsi, IL-1 est capable d’induire sa propre production. La voie de signalisation intracellulaire

du récepteur IL-1R implique l’adaptateur protéique MyD88 (Muzio et al., 1997). Comme dit

précédemment les TLRs reconnaissent des motifs conservés des pathogènes et activent également la

voie NF-κB en sollicitant MyD88 (O’Neill et al., 2008). Murakami et al. émettent l’hypothèse selon

laquelle MCPyV serait reconnu par les TLRs. Ainsi, la production d’IL-1 serait suractivée par l’action

concomitante de MCPyV et d’IL-1 elle-même sur les récepteurs TLR et IL-1R respectivement

(Murakami et al, 2015).

La mutation BRAF V600E aboutit à la phosphorylation constitutive de la kinase ERK, un des

intermédiaires de la voie de signalisation des MAP kinases. Cependant ERK est rapidement

déphosphorylée par la phosphatase DUSP6. L’adaptateur MyD88, libéré suite l’activation des

récepteurs TLR et IL-1R auxquels il est associé, est capable de se lier à la protéine ERK phosphorylée,

et d’empêcher l’interaction entre ERK phosphorylée et la phosphatase DUSP6 (Coste et al., 2010).

Ainsi ERK reste phosphorylée plus longtemps et provoque la suractivation de la voie des MAP

kinases. Cette voie contrôle l’expression de gènes impliqués dans la prolifération. Ce mécanisme

permettrait d’expliquer le nombre anormalement élevé de cellules dendritiques observé chez les

patients atteints de HL.

CCL20

La chimiokine CCL20 est surexprimée par les cellules dendritiques présentes dans les lésions

des malades (Annels et al., 2003). CCL20 exerce un effet chimioattracteur sur les cellules portant

l’unique récepteur à CCL20, le récepteur CCR6. Les DCs immatures expriment CCR6, et un des rôles

connus de CCL20 est de recruter et de retenir ces cellules immatures sur les sites d’inflammation, au

niveau de la peau notamment (Dieu et al., 1998). Quand les DCs immatures rencontrent et

phagocytent un antigène, la maturation a lieu et se traduit entre autres par un arrêt d’expression de

CCR6 et par l’expression de récepteurs à d’autres chimiokines. Ainsi, les cellules dendritiques

matures peuvent quitter le site d’inflammation et migrer dans les ganglions lymphatiques où elles

présentent l’antigène aux lymphocytes T. Pour des raisons mal élucidées, dans le contexte de HL, la

maturation des cellules dendritiques est incomplète ; elles portent conjointement des marqueurs des

DCs matures et immatures : on parle de phénotype semi-mature (Laman et al., 2003). Notamment,

les DCs des patients présentent constitutivement le récepteur CCR6 (Annels et al., 2003). Par

conséquent, CCL20 joue probablement un rôle dans le recrutement de nouvelles DCs immatures ou

Fig 7 : Dérégulation des voies de signalisation NF-B et MAPK, et implication des interleukines dans

l’histiocytose Langheransienne.

A). L’activation des récepteurs membranaires de la famille Toll-like (TLR) et du récepteur à l’interleukine 1 (IL-

1R) par le Polyomavirus de Merkel (MCPyV), et par l’interleukine 1 (IL-1) respectivement, libère l’adaptateur

protéique MyD88 dans les cellules dendritiques des patients (cellule HL). D’une part, MyD88 empêche la

déphosphorylation de la kinase ERK, elle-même constitutivement phosphorylée par la protéine Raf mutée, ce

qui provoque une suractivation de la voie des MAP kinases. Cela aboutirait à la prolifération des cellules HL.

D’autre part, MyD88 active la voie NF-B, en induisant ainsi l’expression de la chimiokine CCL20 et de l’IL-1.

Une boucle autocrine de régulation par l’IL-1 de l’expression de l’IL-1 pourrait ainsi se mettre en place.

B). L’interleukine 1 produite par les cellules HL pourrait stimuler la différenciation des lymphocytes T en

lymphocytes T helper 17 (Th17).

Les lymphocytes Th17 sont connus pour sécréter de l’interleukine 17 (IL-17)

C). La chimiokine CCL20, produite par les cellules HL serait capable d’attirer d’autres cellules HL sur les sites de

lésion, ainsi que des lymphocytes Th17 (Recrutement).

D). CCL20 et IL-17, produites par les cellules HL et les Th17, provoquent la fusion des cellules HL en cellules

géantes multinucléées (MGC) qui seraient à l’origine des lésions observées chez les patients.

MCPyV : Merkel cell polyomavirus ; TLR : toll-like receptor ; MyD88: myeloid differentiation primary response

gene 88 ; NF-B : nuclear factor-kappa B ; CCL : chemokine (C-C motif) ligand ; IL : interleukine ; LCH :

histiocytose Langheransienne ; MGC : cellule géante multinucléée ; Th17 : lymphocytes T helper 17 ; ERK :

extracellular signal-Regulated Kinases

IL-1

A).

Cellule LCH

MCPyV

IL-1

TLR

IL-1R

MGCs

IL-17

Th17

CCL20

Recrutement

CCL20

Stimule

la différenciation

Stimule

la prolifération

B). C).

D).

Fusion

semi-matures sur les sites des lésions. Il est à noter que les lymphocytes Th17 portent également le

récepteur CCR6 (Hirota et al., 2007, Annuziatoet al., 2012) et pourraient être recrutés au niveau des

lésions. De plus, la région promotrice du gène codant CCL20 on trouve un site de liaison de NF-κB

(Zhao L. et al., 2014). En conséquence, l’expression de CCL20 pourrait être induite par IL-1,

contribuant à l’activation du cercle vicieux décrit dans la Fig 7.

II- Présentation d’une publication : Langherans cell histiocytosis reveals a new IL-17A

dependent pathway of dendritic cell fusion. F. Coury et al, nature medecine, 2007.

Les études de Coury et al portent sur une cohorte de 13 patients présentant différentes formes

(focale ou disséminé) et phases (active ou inactive) de la maladie.

1) Etude d’IL-17A

Etant donné que l’os est l’organe majoritairement atteint par la HL, leurs recherches ont débuté par

le dosage sanguin du RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), cytokine qui

contrôle la régénération et le remodelage osseux en induisant la formation d’ostéoclaste à partir de

monocytes sanguins. Une concentration élevée du RANKL chez les patients en phase active de la

maladie, synonyme d’une ostéoclastogénèse importante, a ainsi été mise en évidence (Fig 8A,

gauche). La production et la sécrétion de RANKL étant stimulé par trois cytokines : Il-1, le TNF- et

l’IL-17A (Page et al, 2005), les auteurs ont dosé ces 3 protéines et, ontpu montrer que seule la

concentration d’’IL-17A était significativement différente chez les sujets en phase active de la

maladie, comparé aux sujets sains où l’Il-17A n’est pas détectable (Fig 8A, droite). IL-17A étant

caractérisée comme une cytokine spécifique des Lymphocytes T (Yao et al, 1995), les auteurs se

posent la question de la provenance de l’IL-17A. En effet, l’HL est surtout caractérisée par une

infiltration de DCs (Beverley et al, 2005). Ainsi, via un triple marquage immunohistochimique dirigé

contre le marqueur CD-3 (spécifique des lymphocytes T), la langhérine (ou CD 207, spécifique des

cellules de Langerhans) et l’IL-17A sur des coupes tissulaires de peau et d’os, les auteurs ont montré

la présence de DCs positifs au marquage IL-17A (Fig 8B, gauche et centre). Ce type de DCs est absent

sur des coupes de tissus sains marqués de la même manière (Fig 8B, droite). Les auteurs ont aussi

remarqué la présence de cellules géantes multinuclées positive au marquageIL-17A (Fig 8B, centre).

Ces MGCs sont caractérisées grâce à l’expression majoritaire de trois enzymes de dégradation de la

matrice extra cellulaire qui sont la tartrate resistant acidic phosphatase (TRAP), les

métalloprotéinases matricielles 9 et 12 (MMP-9 et 12) (da Costa et al, 2005). Leur présence dans des

lésions de patients HL a précédemment été montrée (Bechan et al, 2006). En désaccord avec ce

Commenté [NL1]: reprendre

Figure 8 : Etude de l’IL-17A dans le sérum, les lésions et le sang chez les patients atteint de l’HL.

A : Dosage des cytokines indiquées dans le sérum de patients sains ou atteints de l’HL par utilisation de Kit

ELISA.

B : Marquage immunohistochimique sur coupe tissulaire au niveau des lésions cutanées (gauche), osseuse

(droite) et sur tissu sain (à droite). Les anticorps primaires sont dirigés contre le marqueur CD3 (révélé en

rouge), la langhérine (en bleu) et l’IL-17A (en vert) révélé par des anticorps secondaires couplés à des

fluorophores. La ligne blanche (en pointillé à gauche et pleine à droite) représente la jonction dermo-

épidermique. Les DCs IL-17A+ sont visualisées en bleu clair (gauche) et les lymphocytes T IL-17A+ en jaune

(gauche et centre).

C : Dosage de la sécrétion d’IL-17A des lymphocytes T activés ou non in vitro, des monocytes et des Mo-DCs

(dérivés in vitro) chez les patients sains et malades (gauche) par test ELISA. (à droite) Evaluation de la quantité

d’IL-17A intra cytoplasmique de ces quatre types cellulaires par cytométrie de flux après triple marquage

immunohistochimique (CD3, langhérine, HLA-DR) chez les patients sains et malades

HL : histiocytose Langheransienne ; IL : interleukine ; Mo-DCs : cellules dendritiques dérivées de monocytes ;

ELISA : enzym-linked immunosorbent assay ; HLA : human leukocyte antigen

* : p<0.05 ; ** : p<0.01 ; *** : p<0.001. Echelle : 50µm

qui avait été précédemment décrit (l’IL-17A serait une cytokine spécifique des lymphocytes T et

particulièrement des LTH-17 selon l’équipe de Zao et al), les auteurs détectent de très faible quantité

de Lymphocyte T positifs à l’IL-17A au niveau des lésions tissulaires. Ces résultats leurs permettent de

conclure que, chez les patients en phase active de la maladie, l’IL-17A provient essentiellement des

DCs et MGCs.

Les auteurs ont ensuite testé la capacité des Lymphocytes T immatures et activées, des monocytes et

des DCs dérivées de monocytes à secréter l’IL-17A (Fig 8C, droite). Ces cellules sont prélevées chez

des patients en phase active et inactive de la maladie. Les lymphocytes T activées sont obtenus à

partir de Lymphocytes T immatures après stimulation in vitro par des anticorps anti CD3 et CD28. Les

DCs dérivées de monocytes sont générées après culture in vitro en présence de GM-CSF et d’IL-4.

Dans chaque cas, l’expression intra cytoplasmique d’IL-17A est mesurée par cytométrie de flux après

triple marquage immunohistochimique contre CD3, HLA-DR (spécifiques du CMH II) et IL-17A. Par ces

expériences, les chercheurs montrent d’une part que seulement les lymphocytes T activées à la fois

chez les patients sains et malades sont positifs au marquage de l’IL-17A. Mais aussi que les Mo-DCs

des patients malades seulement sont positifs au marquage contre l’IL-17A. Ces résultats sont

confirmés en quantifiant la secrétions d’IL-17A par test ELISA (Fig 8C, gauche). Aucunes différences

n’est observable au niveau du profil d’expression et de sécrétion de l’IL-17A des lymphocytes T

activées entre les patients sains et malades. En revanche, seules les Mo-DCs de patients malades

sont capables de sécréter spontanément de l’IL-17A.

L’action de l’IL-17A

Après avoir montré la présence d’IL-17A dans les lésions des patients atteints de l’HL, les

auteurs se sont intéressés à l’action d’IL-17A sur les cellules dendritiques. Les effets d’IL-17A

recombinante ont été étudiés d’une part sur un modèle de cellules dendritiques saines, d’autre part

sur des cellules dendritiques de patients. Pour finir, la fonction d’IL17-A endogène et sa spécificité

ont été investiguées. Les cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDC) constituent un modèle

classique pour l’étude des cellules dendritiques. Pour obtenir les MoDC, les monocytes circulants

provenant du sang de donneurs sains sont isolés et cultivés pendant 6 jours en présence d’IL-4 et de

GM-CSF.

Dans un premier temps les MoDC ont été incubés en présence d'IL-17A recombinante. Après

incubation, les cellules résultantes, analysées par cytométrie en flux, présentaient un phénotype

immature mixte monocyte-macrophage-cellule dendritique d'après les antigènes de surface qu'elles

portaient. Ce phénotype a été précédemment décrit dans les lésions de patients atteints de HL.

De plus, ces cellules résistaient à l'apoptose spontanée. Par conséquent les effets d’une

Commenté [NL2]: Pour ne pas alourdir le texte et complexifier l’histoire, je mettrai ça dans la légende (en expliquant mieux pourquoi le triple marquage et ne mettrai ici que la conclusion Pensez à ceux qui vous reliront !!!

Commenté [NL3]: Dans la fig c’est le contraire non ? Elisa puis cyto

Figure 9 : Caractérisation de l’impact de l’IL-17A sur les monocytes et les cellules dendritiques de malades

A) Des monocytes isolés à partir de prélèvement sanguins de donneurs sains sont dérivés en cellules dendritiques

et sont cultivés pendant 12 jours en présence d’IL-17A, avec (droite) ou sans (milieu) IFN-γ. A gauche est présenté

le profil d’une MoDC avant la culture. Les noyaux sont marqués par le colorant Hoechst (bleu). L’activité TRAP

cytoplasmique est détectée (rose : activité normale, violet : forte activité). Les MGCs sont indiquées par une étoile

blanche.

B) Des DCs de patient atteint de LH sont prélevées et cultivées pendant 12 jours en présence (droite) ou non

(centre) d’IFN-γ. A gauche est présent une DCs de patient avant la culture. Le même marquage nucléaire et le

même test d’activité de la TRAP sont réalisés.

C) Comptage des MGCs (gauche) et du nombre moyen de noyaux par MGC (droite) après 12 jours de culture de

MoDCs provenant de donneurs sains (DCs saines) ou de patients atteints de LCH (LCH DCs), en présence de

cytokines indiquées. Le traitement par M-CSF + RANKL, inducteurs connus de la fusion des DCs, est utilisé en

contrôle positif.

MoDC : cellule dendritique dérivée de monocyte ; DCs : cellules dendritiques ; MGCs : cellules géantes

multinucléées ; LCH DCs : cellules dendritiques de patient ; TRAP : tartrate resistant acide phophatase ; IFN :

interféron ; RANKL : receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand ; M-CSF : macrophage colony-stimulating

factor ; IL : interleukine

A

B

C

culture prolongée ont été étudiés par microscopie confocale. Afin de visualiser les cellules, les

noyaux et le cytoplasme ont été colorées par l'intercalant fluorescent de l'ADN Hoechst 33342 et par

l'essai TRAP respectivement. L'essai TRAP est une méthode de détection d'activité de la phosphatase

acide tartrate-résistante (TRAP). La TRAP est une enzyme détectable dans le cytoplasme des

ostéoclastes de manière physiologique, mais également dans les cellules géantes multinucléées

(MGC), responsables des lésions dans le contexte de l’HL. Une faible activité TRAP se traduit par une

coloration rose, et la suractivation de TRAP par une coloration violette du cytoplasme.

Après 12 jours de culture de MoDC en présence d’IL-17A, des MGCs à quatre noyaux et à

forte activité TRAP cytoplasmique (coloration violette) ont été observées (Fig 9A, panel du milieu).

Les auteurs ont conclu à la fusion des monocytes médiée par IL-17A. Un doute peut subsister quant à

la fusion des monocytes plutôt qu’à un éventuel défaut de division. Cependant la formation des

MGCs par fusion cellulaire a été précédemment montrée et est actuellement la théorie

communément admise. La taille des MGCs et le nombre de noyaux a été augmentée en incubant les

MoDC avec Il-17A et l’interféron γ (IFN-γ, Fig 9A, panel de droite). La culture en présence d’IFN- γ

seul n’a pas eu d’effet sur les MoDC.

Dans un deuxième temps, les cellules dendritiques provenant de patients atteints de HL (HL

DCs) ont été cultivées pendant 12 jours. Les HL DCs ont subis la fusion spontanément (sans ajout d’IL-

17A) pour former des MGCs à 4 noyaux et à forte activité TRAP (Fig 9B, panel du milieu). L’ajout de

l’IFN-γ a également augmenté la taille des MGCs (Fig 9B, panel de droite). De plus, le comptage des

cellules a montré que l’IFN-γ augmente fortement la quantité de MGCs formés, dans le cas des MoDC

traités par IL-17A, comme dans le cas des HL DCs (Fig 9C, panel de gauche). Le comptage confirme

aussi l’augmentation du nombre moyen de noyaux par MGC, provoquée par l’IFN-γ (Fig 9C, panel de

droite).

La fusion spontanée des HL DC est comparable à celle qu’on observe avec les MoDC traités

par l’IL-17A recombinante. Cependant les MoDC ne fusionnent pas en présence d’IFN-γ seul. Il

semble donc que la fusion soit due à l’IL-17A seule, et l’interféron γ ne fait qu’augmenter son effet.

De plus, comme les HL DC semblent produire de l’IL-17A, les auteurs ont émis l’hypothèse d’un effet

autocrine de l’IL-17A endogène.

Afin de confirmer l’efficacité de l’IL-17A endogène d’une part, et la spécificité d’action de l’IL-

17A et de l’IFN-γ d’autre part, des expériences de transwell ont été réalisées. Une membrane

imperméable aux cellules mais perméable aux cytokines sépare deux chambres de culture cellulaire.

Les HL DC ont été cultivées dans la chambre de haut et les cellules dendritiques saines dans celle du

bas.

DCs

saines

Po

urc

enta

ge

de

noyaux i

ncl

us

dan

s le

s M

GC

s /

nom

bre

tota

le d

e no

yau

x a

u j

our

12

DCs saines

10 DCs saines

Figure 10 : Expérience de transwell.

Les LCH DCs sont cultivées dans la chambre du haut, les DCs saines dans celle du bas. a: Détermination de

l’activité d’IL-17A présente dans le surnageant des LCH DCs, avec ou sans IFN-γ. L’efficacité de fusion est

représentée par le nombre des noyaux inclus dans les MGCs sur le nombre total de noyaux au jour 12.

L’abscisse représente la quantité relative de cellules. b: Etude de la spécificité des effets d’IL-17A et d’IFN-γ.

Les cellules sont cultivées avec ou sans anticorps bloquants dirigées contre IL-17A ou IFN-γ (Anti-IL-17A et

Anti-IFN-γ). Ajout d’IL-17A recombinante en excès (+IL-17A). Un anticorps non-relevant (isotype ctrl) est

utilisé comme contrôle négatif.

MoDC : cellule dendritique dérivée de monocyte ; DCs : cellules dendritiques ; LCH DCs : cellules

dendritiques de patient ; IFN : interféron ; IL : interleukine

Sous l’effet des HL DC et sans ajout d’IL-17A, la fusion des cellules dendritiques saines a été observée

dans la chambre du bas (Fig 10). Ce résultat suggère que l’IL-17A produite par les HL DC est

fonctionnelle. Après traitement par des anticorps bloquants dirigés contre IL-17A, la fusion a été

abolie, et restaurée en ajoutant de l’IL-17A recombinante en excès (Fig 10). Ce résultat montre que la

fusion est bien due à l’IL-17A, de manière spécifique. L’ajout d’IFN- γ a augmenté l’efficacité de la

fusion (Fig 10). En présence d’IFN-γ et d’anticorps bloquants l’IFN-γ, la fusion s’est déroulé de même

manière qu’en l’absence d’IFN-γ (Fig 10). Ce résultat suggère la spécificité de l’effet de l’IFN-γ.

Caractérisation fonctionnelle des DCs stimulées par IL-17A :

Comme le montrent des études antérieures, les MGCs ont un profil enzymatique particulier.

Notamment, les MGCs expriment la TRAP et les métalloprotéases matricielles 9 et 12 (MMP-9 et -12)

actives. Par conséquent, l’étude des activités de ces enzymes a été réalisée sur les DCs saines traitées

par l’IL-17A.

La suractivation de la TRAP est observée par un changement rapide de la coloration

cytoplasmique du rose au violet, dans le cas des DCs saines traitées par IL-17A, mais aussi pour les HL

DCs sécrétant spontanément IL-17A. A l’inverse, le cytoplasme des ostéoclastes et des DCs saines

non traitées reste coloré en rose. L’observation de l'activité TRAP dans le surnageant des DCs saines

après 12 jours de culture avec Il-17A et IFN-γ montre une augmentation par rapport au contrôle.

Cette augmentation est bloquée par l’anticorps anti-IL-17A mais pas par l’anticorps anti-CCL20.

Cependant, en utilisant des anticorps anti-CCL20 la formation des MGC est réprimée (Fig. 11A).

La sécrétion de MMP-9 par les DCs saines augmente après traitement par l'IL-17A, mais

diminue en traitant uniquement avec de l'IFN-γ. La MMP-12 n’est détectée dans le surnageant que

lorsque l’on active les DCs saines en les traitant avec du lipopolysaccharide (LPS) (Fig 11B). La

recherche de la forme catalytique de la MMP-12 intracytoplasmique par cytométrie en flux a montré

que l'IFN-γ induit la production de la métalloprotéase active, et que l’expression augmente avec l’IL-

17A. Le LPS renforce cette expression et induit la sécrétion de MMP-12.

Après s’être intéressé au profil enzymatique des DCs traitées par l’IL-17A, les auteurs ont

étudié le sérum de patients atteints de différents stades de la HL. Les concentrations sériques de

RANKL et d’IL-17A sont corrélées l’une à l’autre mais ne semblent pas être liées à l'activité de la

maladie (Fig 11C). Par exemple, les quantités de ces deux composés sont très variables dans le sérum

des patients atteints de la HL de classe d’activité 3. Enfin, des DCs saines ont été cultivées en

présence d’IFN-γ et du sérum de patients atteints de différents stades de la HL. L’efficacité de la

fusion, représentée par le rapport du nombre de noyaux inclus dans les MGCs sur le nombre de

noyaux total, a été quantifiée. Une corrélation semble exister entre l’activité de la maladie et

A

D

C B

Figure 11 : Etude fonctionnelle des cellules dendritiques, lien avec l’agressivité de l’HL

A) Des cellules dendritiques saines sont cultivées pendant 12 jours en présence d’IL-17A et d’IFN en présence

d’anticorps anti IL-17A (centre) ou d’anticorps anti CCL20 (droite). L’activité de la TRAP est révélée en rose ou violet

dans le cytoplasme par l’utilisation du kit TRAP assay et le noyau des cellules est marqué en bleu par le Hoechst.

B) Mesure de la sécrétion de MMP-9 et 12 par test ELISA de DCs cultivé pendant 12 jours en seul ou en présence

des cytokines indiquées, avec ou sans LPS.

C) Histogramme représentant l’absence de corrélation entre l’IL-17A et RANKL et la gravité de la maladie. En

abscisse sont classés les patients en fonction de l’activité de la maladie (indice de 1 à 4 ou 1 représente la forme la

moins agressive de la maladie) et en ordonnée sont présentées les concentrations sanguines d’IL-17A et de RANKL.

D) Histogramme montrant la corrélation entre la quantité de MGCs et l’agressivité de la maladie. En abscisse sont

présentés les patients classés de la même manière que dans la figure 11C. Le nombre de MGC est représenté en

ordonné.

TRAP : tartrate resistant acid phosphatase ; IFN : interféron ; MMP : métalloprotéase matricielle ; LPS :

lipopolysaccharide ; RANKL : receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand ; MGCs : cellules géantes

multinuclées ; LCH : histiocytose Langheransienne ; DC : cellule dendritique

l’efficacité de la fusion. L’ajout d’anticorps anti-IL-17A diminue drastiquement le nombre de MGCs,

ce qui semble confirmer l’implication d’IL-17A dans le phénomène. Cependant, une autre molécule,

que les auteurs ont appelé IL-17A-like a également été capable de provoquer la fusion des DCs. IL-

17A-like a été reconnue par les anticorps neutralisants, mais pas par ceux utilisés dans le test ELISA.

Ce fait pose la question de la spécificité des anticorps bloquants anti-IL-17A utilisés dans cette étude

(Fig 11D).

III - Projet de Recherche

Établissement du Modèle Murin :

Malgré l'amélioration des connaissances sur le HL, les facteurs et la genèse de la maladie

sont encore mal compris. Un obstacle majeur est l'absence de modèles animaux fiables, qui sont

nécessaires pour évaluer les caractéristiques pathologiques et pour fournir plus d’information

concernant l'étiologie des lésions.

Il a été déjà établi un modèle murin par transgénèse qui présente certains des symptômes

retrouvés dans la HL. Notamment, ces souris développent des lésions ostéolytiques observés chez

les patients HL : le Mushi Transgenic (Tg) mice (CD11c::SV40LgT-transgenic C57BL/6 background

mice) (Grosjean et al.,2015 ; Steiner et al.,2008) mais l'influence de la mutation BRAF V600E ne peut

pas être testé par ce modèle. Les souris Mushi montrent une apparition précoce de la maladie, et qui

évolue de manière générale vers une forme plus grave disséminée, caractérisée chez ces souris par

l'accumulation de DCs provoquant une augmentation de la taille de la rate et le foie et une

diminution de l'hématocrite. Les DCs touchés représentent un sous-type spécifique avec un

phénotype Langérine / CD207 + CD8a + CD11b- / CD24 + CD205 +. Compte tenu de la large diffusion

des DCs transformées au sein de l’organisme, ces souris peuvent servir de modèle pour l’étude de la

HL multi-système.

D'autre part, un modèle murin portant la mutation BRAF dans différents précurseurs des DCs

existe depuis 2014. Il s’agit des souris langhérine::BRAF V600E, obtenues en croisant des souris

Langhérine::CRE (elles expriment la CRE recombinase sous la dépendance du promoteur de la

langhérine) avec une souris BRAF V600E hétérozygote floxée au niveau de la séquence génique

codant la mutation(BRAF V600E ca/wt) et CD11c::BRAF V600E, obtenues en croisant des souris

CD11c::CRE avec une souris BRAF V600E ca/wt (Berres et al., 2014). Chez la souris, CD11c est exprimé

sur les progéniteurs engagés vers la différenciation en DCs et reste exprimé tout au long de la

différentiation. (Merad et al., 2013). La langhérine est un marqueur de différentiation des DCs, elle

n’est exprimée que chez les DCs tissulaires, y compris les LCs, mais elle est absente des précurseurs

Tableau 1 : Nombre de souris nécessaire à la réalisation du projet.

Table 1- Groupe

des souris par

condition

Mushi BRAF

Monocyte

BRAF

Precurseur

DCs

BRAF

DC, LC

Mushi-

BRAF

Monocyte

Mushi-BRAF

Precurseur

DCs

Mushi-

BRAF DC,

LC

WT

(Control)

MCPyV - 5 5 5 5 5 5 5 5

MCPyV + 5 5 5 5 5 5 5 5

MCMV + 5 5 5 5 5 5 5 5

Total 120

Figure 12 : Croisement et suivi des souris

A) Nous croiserons une souris BRAF V600E ca/wt avec la souris CD11b::CRE (haut gauche) afin d’obtenir des souris

CD11b::BRAF V600E qui expriment la mutation au niveau des monocytes. Les souris encadrées en jaunes

(langhérine::BRAF V600E, CD11c::BRAF V600E, CD11b::BRAF V600E) seront croisesé avec des souris mushi (en

bleue) afin d’obtenir des modèles de l’histiocytose Langheransienneexprimant la mutation dans les différents

cellulaires étudiés (dans les cellules de Langherans, les progéniteurs des cellules dendritiques et les monocytes,

encadrées en vert)

B) Exemple deKaplan-Meyer qui sera réalisé pour le suivi de la survie des sourie. Chaque saut de palier correspond

au décès d’un animal

A

B

circulants et médullaires (Merad et al., 2008). Ainsi la souris langhérine::BRAF V600E exprimera

lamutation, sous la dépendance du promoteur de la langhérine, uniquement au niveau des DCs

matures alors que la souris CD11c::BRAF V600E exprimera la mutation, sous la dépendance du

promoteur de CD11c, chez tous les précurseurs médullaires, sanguins et tissulaires des DCs ainsi que

chez les DCs matures. L’expression de BRAF V600E dans les DCs est suffisante pour entraîner une

maladie « HL-like » chez la souris.

Les données sur l’apparition et l’évolution de la maladie obtenues chez ces souris sont

comparables à celles observées chez l'Homme. L'expression de BRAF V600E dans les progéniteurs

précoces des DCs est relié à au développement d’une forme multi systémique grave de l’HL, tandis

que l'expression du gène BRAF V600E dans les DCs matures des souris, ressemble plutôt à une forme

unifocale sans conséquence dramatique pour les patients atteints (Berres et al, 2014).

Pour l'obtention de la mutation BRAF V600E dans les monocytes, un souris BRAF V600E ca/wt

(Merad et al.,2013) sera croisé avec un souris exprimant la cre-recombinase sous le control du

promoteur CD11b et nous formeront des souris CD11b::BRAF V600E (Ferron et al.,2005). Le génotype

de ces souris sera confirmé par PCR.

Dans le but de réaliser des études sur des modèles murins plus exhaustive de la maladie,

capable d’exprimé la mutation BRAF au cours des différentes étapes de différenciation, nous

croiserons la souris Mushi avec les différents souris BRAF V600E citées ci-dessus (langhérine::BRAF

V600E, CD11c::BRAF V600E et CD11b::BRAF V600E) (Fig 12A). Des PCRs permettront génotyper la

descendance obtenue en utilisant les amorces décrient par Steiner et al 2008 pour Mushi Tg et

Szankasi et al.,2013 pour BRAF V600E transgénique. Ces PCRs seront réalisées à partir d’un morceau

de queue, prélevée à l’âge de 10 jours.

Sachant que nous avons besoin d'au moins 5 souris par groupe d`intérêt, plus un groupe de

souris sauvage (WT) contrôle (souris sur fond génétique C57BL/6), nous estimons un total d'au moins

120 souris pour tester les différentes conditions qui seront détaillées plus tard (Tableau 1).

Après l'obtention de chacune des souris, nous commencerons à observer leur évolution. Les

courbes de survie seront tracées en utilisant la méthode de Kaplan-Meier, un exemple est présenté

dans la Fig 12B, chaque saut de pallier correspond au décès d’une souris. Les critères d'euthanasie

seront basés sur une évaluation de plusieurs données : une perte de poids, rapide ou progressive, de

plus de 15 % (jeunes animaux) à 20 % (adultes) par rapport au poids initial de l’animal, une

automutilation, une diminution de la mobilité interférant avec l’activité basale de l’animal

(alimentation, toilettage) ainsi que la mise en évidence d’une réduction générale de l’activité.

Nous effectuerons un marquage d'identification dans l'oreille des souris au début des

Figure 13 : Prise de sang, marquage et dissection des souris étudiées

A) Un pipette pasteur sera insérée dans le sinus retro orbitaire (schématisé en violet) pour les prélèvements

sanguins.

B) Le marquage des souris au niveau des oreilles permettra de les différencier au cours de nos études. Il sera

réalisé à l’aide d’un poinçon particulierement conçu à cet effet.

C) Les organes prélevés seront : la peau saines et lésionnelle, les os, le cerveau, les poumons, la rate et le foie.

Tableau 2 : Prélèvements sanguins en fonction du poids de la souris

A

C

B

expériences pour un meilleur suivi (Fig 13B). Nous garderons les souris dans des conditions sans

pathogènes standard avec de la nourriture, de l'eau ad libitum et un cycle lumière-obscurité 12h12.

On logera jusqu’à cinq souris par cage en fonction de l’âge et du sexe des souris, selon les directives

de la « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals »

Prise de sang dans le sinus orbitaire

Nous prendrons en considération la fréquence des prélèvements et la vitesse de

régénération des cellules sanguines décrits dans Joint Working Group of Refinement of the

BVA/FRAME/RSPCA/UFAW 1993. Nous choisirions les volumes à extraire comme décrit dans le

Tableau 2 en suivant le protocole décrit par Parasuraman, et al.,2010 pour prélever le sang dans le

sinus orbitaire, à partir de la sixième semaines de vie, toutes les deux semaines pendant six mois (Fig

13A).

Cette technique est difficile et doit être effectuée que par du personnel ayant de l’expérience

en la matière (Parasuraman, et al.,2010). Des manipulations inadéquates peuvent provoquer des

hématomes ou une cécité. Les lésions dans le plexus rétrobulbaire, provoqués par le prélèvement

sanguin, ne guérissent en règle générale pas avant deux semaines, nous n’effectuerons pas de

nouvelle ponction du même œil pendant ce laps de temps au minimum.

Sacrifice de la souris et prélèvement des organes et du sang

Après six mois ou moins si nous considérons que l'animal souffre, les souris seront sacrifiées

par inhalation de CO2 à concentration (Conlee et al., 2005) et les organes sont prélevés (Fig 13C). Au

moment du sacrifice, les animaux seront d'abord inspectés pour l’apparence générale.

Rôle du virus : Infection par MCPyV

L'isolement de virions infectieux du MCPYV n'a pas encore été rapporté mais des particules

virales seront obtenues comme déjà décrit par Touze et al.,2010 et Pastrana et al.,2012. Un tiers des

souris seront inoculées par voie s.c. avec 1 x 104 unités formant des plages (pfu) de virus MCPyV. Les

souris seront infectées à l’âge de 4 semaines, pour se trouver dans la période normale de l'exposition

du virus observé chez l'homme, c'est-à-dire, pendant l'enfance.

Etant donné que les TLR9 des souris sont semblables à les humaines (Schneberger et

al.,2013 ; Paul, 2013), nous espérons obtenir une réponse immunitaire similaire.

Pour confirmer que, comme décrit par le groupe de Murakami, la boucle de l'IL-1 est

déclenché manière spécifique par MCPyV, nous allons vérifier sa spécificité en infectant un tiers des

souris de chaque groupe génétique avec un autre virus non relié au MCPyV : le cytomégalovirus

murin (MCMV).

Le MCMV est un virus de l'herpès de la sous-famille des herpesviridae . C’est un virus à ADN

double brin enveloppé. Il infecte spécifiquement les souris. Le groupe de Tabeta et al., 2004 ont

démontré que la voie TLR9 est activée par l'inoculation virale MCMV. Le virus sera préparé in vivo par

inoculation, (1 x 104 pfu) chez une souris BALBc âgée de trois semaines, par injection i.p. comme

décrit par Tabeta et al.,2004. Une fois que les particules virales seront isolées de la souris BALBc,

nous infecterons un tiers des souris de chaque groupe avec le même titre viral que pour le MCPyV.

Pour confirmer que les souris n'ont pas le virus avant l'inoculation, nous réaliserons une PCR

pour détecter le MCPyV et le MCMV, avec les mêmes amorces utilisées par Sroller et al.,2014 et

Vliegen et al., 2003 respectivement.

Nous allons suivre le titre des anticorps dirigés contre la protéine VP1 du MCPyV toutes les

deux semaines à partir des prélèvements sanguins. Nous suivrons le titre viral en dosant l’activité

d’un vecteur rapporteur, précédemment décrit par Pastrana et al.,2009. Les particules virales du

MCPyV encapsulent le plasmide rapporteur phGluc, codant pour la luciférase Gaussia (Gluc). Lorsque

les vecteurs infectent les cellules, le plasmide rapporteur phGluc, qui porte une origine de réplication

SV40, pourra être répliqué si le virus est présent. Cela conduit à la production de Gluc qui est sécrété

dans le milieu de culture, et pourra être facilement dosé. Cette approche permettra de caractériser

précisément les cellules préférentiellement inféctées par le MCPyV. La neutralisation du MCPyV avec

le vecteur rapporteur médiée par les anticorps conduits à une réduction de l'expression

correspondante Gluc.

À six mois, lorsque la souris est mise à mort, nous quantifierons la charge virale par l’ADN

viral présent dans les différentes types cellulaires étudiées (monocytes, différents précurseurs de

DCs, DCs et LCs) par qPCR, comme décrit par Pastrana et al.,2012. La quantification des anticorps du

MCMV sera réalisée par la technique de fixation du complément, décrite par Lussier et at, 1987.

Analyse sanguine

Comme il a été précisé, le sang sera prélevé toutes les deux semaines à partir de la sixième

semaine de vie des souris, dans tous les groupes étudiés (Tableau 1, 24 groupes). Directement à

partir de ces prélèvements, on dosera le taux de diverses cytokines (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-23,

IFN-γ, TNF-α, GM-CSF et CCL20) par test ELISA (MILLIPLEX MTH17MAG-47K, Merckmillipore) et du

RANKL. Le taux d’insuline circulante sera aussi mesuré pour suivre l’apparition progressive d’un

diabète insipide, qui est une des complications graves de la maladie, synonyme d’une aggravation de

la maladie (Chakraborty et al, 2014). La charge virale sera suivie au cours du temps, selon les

méthodes décrites ci-dessus.

Les interleukines IL-1, IL-6, IL-17A et IL-23 ainsi que l’IFN- et le TNF- sont des cytokines pro-

inflammatoires et leurs dosages sanguins permettront de suivre l’apparition d’une réponse

inflammatoire au cours du temps. L’IL-17A et IL-23 ont était particulièrement choisies car dans leurs

études, l’équipe de Coury et al montre un impact de l’IL-17A sur la fusion des cellules dendritiques

dans l’HL, cependant, l’impact de l’IL-17A sur la maladie reste controversé (Peters et al, 2011). L’IL-23

est une cytokine favorisant la différenciation des lymphocytes T CD4+ en lymphocytes T helper 17,

ces lymphocytes Th17 sont capables de sécréter de l’IL-17A (Wilson et al, 2007) et pourraient jouer

un rôle dans la maladie. Par la suite, des études visant à caractériser la résorption osseuse seront

réalisées. Elles se baseront sur le dosage sanguin du RANKL, de la chemokine CCL20 et de l’IL-17A par

test ELISA. Une caractérisation plus approfondie sera menée plus tard par des marquages

immunohistochimiques réalisés sur des coupes tissulaires.

Analyse des prélèvements tissulaires :

A l’âge de six mois, les souris sont euthanasiée et les tissus suivants sont prélevés : peau

saine, lésions cutanées, os, foie, rate, cerveaux et poumons. Tous ces tissus, dans différentes

proportions en fonction de la gravité de la maladie, sont touchés dans le cadre de l’ HL (Morimoto et

al., 2014). Après inclusion dans la paraffine, les tissus seront coupés au microtome et déposé sur une

lame en verre. Les marquages immunohistochimiques réalisés auront pour but de caractériser le type

de DCs (mature et/ou immature) présent dans les tissus. Nous utiliserons un panel d’anticorps dirigé

contre des récepteurs spécifiques de ces cellules. Les DCs immatures sont CD14+, CD68+(marqueurs

de DCs immatures), CD83-, CD86- (marqueurs de DCs matures) et CD207+ (marqueur des LCs), tandis

que les DCs mature sont CD14-, CD68+, CD86+ et CD207+. Sachant que les LCs des patients atteint de

l’HL multifocale disséminée présentent plus souvent un phénotype indifférencié (CD14+, CD68+,

CD83-, CD86- et CD207+) par rapport aux patients atteints de forme moins grave de la maladie

(Geissmann et al., 2001). Le taux de chaque sous- type de DCs sera déterminé par FACS comme décrit

par Merad et al., 2008. Toujours sur ces coupes tissulaires, la caractérisation de la présence des

MGCs dans un premier temps et leur activité par la suite seront analysé. Le taux de MGCs sera établi

par comptage des cellules multinuclées par rapport aux cellules totales, après une coloration TRAP

(Coury et al, 2008) et un immunomarquage dirigé contre CD68, la MMP-9 et la cathepsin K (catK) (da

Costa et al., 2005). La MMP-9, la catK ainsi que la TRAP joue un rôle dans la dégradation de la matrice

extra cellulaire et permet de déterminer l’activation métabolique des cellules ostéoclastes ‘’like’’,

dont les MGCs font partie. Le nombre de MGCs positifs à la coloration TRAP et aux marquages dirigés

contre la MMP-9 et la catK sera déterminé et permettra d’avoir une idée de l’impact de ces MGCs sur

les lésions organiques observées. Le marquage contre CD68 permet de discriminer les MGCs

provenant de la fusion des DCs, des ostéoclastes (CD68-) (da Costa et al., 2005). Les données

obtenues pour le tissu osseux malades seront normalisées par rapport aux données obtenues pour

un tissu osseux sain car des ostéoclastes exprimant la TRAP, la catK et la MMP-9 y sont naturellement

présents.

Modèles cellulaires

Selon l’hypothèse émise par Murakami, l’infection des cellules mononucléées du sang par le

virus MCPyV, associée à la mutation BRAF V600E de ces cellules, pourrait induire la phosphorylation

constitutive de la protéine ERK et être à l’origine de l’HL (Murakami et al., 2015). De plus, la gravité

de l’HL semble liée à la précocité de la présence d’ERK phosphorylée dans les cellules de la lignée

myéloïde (Chakraborty et al., 2014). Nous nous proposons de tester cette hypothèse.

Deux types cellulaires seront choisis comme point de départ des expériences : les

progéniteurs hématopoïétiques (HPC) circulants CD34+ provenant du sang de donneurs sains et les

cellules souches pluripotentes induites (iPSC). D’une part, les iPSC présentent l'avantage de se diviser

de manière illimitée et permettent d'étudier tous les stades de différenciation cellulaire. Cependant,

ces cellules sont obtenues par transduction des facteurs de transcription Oct3/4, Sox2, Klf4, et c-Myc

(Takahashi et al., 2007) ce qui pourrait représenter un biais dans l’expérimentation. De ce fait,

l’utilisation des cellules de donneurs sains semble souhaitable. D’autre part, il existe des progéniteurs

hématopoïétiques circulants dans le sang humain. Cependant leur proportion est faible : ils

représentent approximativement 0,1 % des cellules mononucléées du sang périphérique (Strunk et

al., 1996). Cette faible proportion pourrait soulever des difficultés lors de la purification des HPC. En

fonction de la disponibilité des échantillons sanguins et des résultats expérimentaux, l’utilisation des

iPSC ou de HPC seules, ou bien des deux en parallèle, peut être envisagée.

La mutation BRAF V600E sera introduite dans le progéniteur hématopoïétique CD34+ à l’aide

d’un vecteur lentiviral. L’expression du transgène BRAF V600E sera inductible à la doxycycline. La

différenciation du progéniteur hématopoïétique en monocytes et en cellules dendritiques sera

induite, et les cellules seront infectées par le virus MCPyV. Les cellules obtenues seront

caractérisées : leur sécrétome sera étudié par ELISA, les éventuelles cellules géantes multinuclées

seront comptées, des tests de migration et d’invasion seront effectués.

Différenciation des progéniteurs hématopoïétiques circulants en cellules de la lignée myéloïde

La différenciation des HPC en monocytes et en cellules dendritiques sera effectuée comme

décrit par Montesoro (Montesoro et al., 2005). Après centrifugation sur gradient de densité des

échantillons sanguins, les cellules mononuclées seront récoltées et les HPC seront purifiées par tri

cellulaire magnétique en utilisant des nanoparticules greffées par des anticorps anti-CD34.

Cellules souches

hématopoïétiques

Monocytes

en suspension

Cellules dendritiques

Figure 14 : Différenciation des cellules souches pluripotentes induites en monocytes et en cellules

dendritiques (Yanagimachi et al., 2013).

La différenciation se fait en 5 étapes, en présence des facteurs de croissance et des cytokines indiqués. Au jour

6, on obtient les progéniteurs hématopoïétiques. Entre les jours 13 et 28, les monocytes

sont prélevés dans le surnageant. Les monocytes sont différenciés en cellules dendritiques lors de la dernière

étape.

Les milieux de culture utilisés sont le mTeSR1 (STEMCELL Technologies) et le StemPro34 (Gibco).

BMP4 : Bone Morphogenetic Protein 4 ; VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor ; SCF : Stem Cell Factor ;

bFGF: basic Fibroblast Growth Factor ; FL3 : Flt-3 Ligand ; TPO : Thrombopoïétine ; M-CSF : Macrophage

Colony-stimulating Factor ; GM-CSF : Granulocyte M-CSF ; IL-3/-4 : Interleukine 3/4

Les HPCs seront cultivés en présence de M-CSF et d’IL-6 pendant deux à trois semaines, pour induire

la différenciation en monocytes. Les monocytes obtenus seront cultivés pendant 5 à 6 jours en

présence de GM-CSF et d’IL-4, afin de produire des cellules dendritiques.

Différenciation des cellules souches pluripotentes induites en cellules de la lignée myéloïde

Nous allons procéder à la différenciation des iPSC selon la méthode décrite par Yanagimachi

(Yanagimachi et al., 2013). Le principe de cette méthode est semblable à celle utilisée pour les HPC

mais comporte des étapes supplémentaires en amont. La culture se fait en 5 étapes. Les conditions

de culture (milieu de culture, cytokines et facteurs de croissance utilisés, présentées sur la Fig 14)

sont changées à chaque étape pour permettre une différenciation progressive des iPSC en cellules

dendritiques.

A la deuxième étape, au bout de 6 jours de culture, on obtient des cellules CD34+ KDR+

adhérentes, correspondant aux cellules souches hématopoïétiques. A la quatrième étape, entre les

jours 13 et 28, les cellules en suspension comportent 50 à 90 % de monocytes. A cette étape, les

cellules du surnageant sont prélevées tous les 4 jours, et sont triés par FACS : les cellules CD14+

correspondent aux monocytes.

Enfin, la culture des monocytes CD14+ pendant 5 à 6 jours en présence de GM-CSF et d’IL-4,

permet de produire des cellules dendritiques.

Transduction des iPSC par un vecteur lentiviral

Un vecteur lentiviral comportant un système d’induction Tet-On et utilisable pour transduire

des cellules souches a été précédemment décrit (Zhou et al., 2007). L’ADNc de l’allèle BRAF V600E

sera cloné dans le vecteur lentiviral en aval du promoteur inductible à la doxycycline. Les iPSC

indifférenciées et les HPC seront transduites de manière stable avec ce vecteur. Les iPSC et les HPC

non-transduites et infectés par un vecteur vide seront utilisées comme contrôle. L’induction à la

doxycycline sera déclenchée aux stades de différentiation plus ou moins précoces, à savoir le

progéniteur hématopoïétique, le monocyte et la cellule dendritique. La différentiation se poursuivra

comme décrit dans les paragraphes précédents, mais en présence continue de doxycycline, afin de

mimer des mutations somatiques BRAF V600E survenues à différents moments du développement

des cellules dendritiques.

Culture cellulaire

Les cellules dendritiques dérivées des iPSC et des HPC seront cultivées dans le milieu -MEM

complété avec 10% de sérum fœtal de veau, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg

de streptomycine, comme décrit par Coury (Coury et al., 2008). Etant donné que la différenciation

des progéniteurs en cellules dendritiques se fait en présence de cytokines, plusieurs lavages seront

effectués à l’issu de la différenciation afin d’éliminer les traces de ces cytokines.

Des puits en triplicate contenant des monocouches de cellules sous-confluentes seront

inoculés avec le MCPyV (MOI=5) (Schowalter et al.,2012). L’ADN plasmidique sera quantifié après

quatre jours par qPCR comme déjà décrit par Schowalter et al.,2011. Nous ferons des contrôles en

triplicate avec des monocouches des cellules non-traitées par MCPyV et traitées par un virus

différent pour confirmer la spécificité de virus MCPyV. Nous allons utiliser le même virus contrôle

que pour le modèle animal, le MCMV, avec un MOI = 5 (Ghazal et al 2003). Nous quantifierons l`ADN

viral par qPCR comme décrit par Wheat et al.,2003. La culture se fera en induisant ou pas

l’expression de l’allèle BRAF V600E par la doxycyline. Cette induction se fera à différentes étapes de

la différenciation : à partir du stade de progéniteur hématopoïétique jusqu’à la cellule dendritique, à

partir des monocytes jusqu’à la cellule dendritique, ou sur les cellules dendritiques directement.

La présence de la mutation BRAF V600E sera confirmée par qPCR, et la phosphorylation de la

protéine ERK sera testée par Western Blot.

Le sécrétome des cellules obtenues sera étudié par ELISA avec un kit permettant la détection

de plusieurs cytokines (e.g. MILLIPLEX MTH17MAG-47K, Merck Millipore).

Les cellules seront visualisées par microscopie confocale avec une double coloration

Hoechst/TRAP, et les éventuelles cellules géantes multinucléées seront comptées (Coury et al.,

2008). L’expression des immunomarqueurs CD14, CD68, CD83, CD86 et CD207 sera étudiée par FACS,

comme dans le cas du modèle murin.

Tests de prolifération, de migration et d’invasion

En parallèle et sur les trois types cellulaires cultivés, portant ou non la mutation BRAF V600E,

infecté ou non par le virus, seront menées des études visant à caractériser le potentiel prolifératif,

migratoire et invasif des cellules dendritiques. Ces études auront pour but de caractériser l’influence

du Polyomavirus sur les aspects néoplasiques de l’HL

Pour le potentiel prolifératif, des immunomarquages seront dirigés contre la protéine

nucléaire Ki-67. La fonction de Ki-67 reste inconnue cependant elle est exprimée dans les cellules

proliférative et est absente des cellules quiescentes, ce qui en fait un bon marqueur de la

prolifération cellulaire. Le rapport entre le nombre de noyau positif au marquage Ki-67 et les noyaux

négatifs est un indicateur utilisé en recherche et en médecine pour caractériser l’agressivité tumorale

et le risque métastatique, notamment pour le mélanome (Marinaccio et al, 2015). En parallèle, un

quadruple immunomarquage sera réalisé contre des marqueurs d’indifférenciations (CD14 et CD68)

A

B

Figure 15 : Présentation schématique des tests de migrations et d’invasions

A) Pour tester le potentiel migratoire (à gauche) et invasif (à droite), les cellules testées sont chargées dans la

chambre de boyden qui ne contient pas de molécules chimio-attractantes (CCL20). Pour le test d’invasion (à

droite), les cellules sont séparées de la membrane semi-perméable par une matrice, représentée en bleue

(matrigel).

B) Après 3H, à 37°C, les cellules migratrices (à gauche) et invasives (à droite) se retrouvent sur la face

inférieure du puit. Elles sont quantifiées soit par marquage à la rhodamine et observation au microscope à

fluorescence (pour les cellules souches hématoïétiques et les monocytes), soit par FACS (pour les cellules

dendritiques dérivées de monocytes), après un quadruple immunomarquage contre CD14, CD68, CD83 et

CD86.

CCL20 : chemokine (C-C motif) ligand ; CD : cluster of differentiation ; FACS : Fluorescence-activated cell

sorting

cellules

invasives

et des marqueurs de différenciations (CD83 et CD86) de DCs, sur les DCs dérivées de monocytes. Le

but étant de caractériser le niveau de différentiation de ces DCs obtenues in vitro, car chez les

patients ayant développés une forme multi systémique de la maladie, les LCs retrouvées présentent

un phénotype indifférencié (CD14+, CD68+, CD83- et CD86-) (Geissmann et al, 2001). De plus, elles

sont capables d’un auto-renouvellement indépendant des cellules souches hématopoïétiques de la

moelle osseuse (Chorro et al, 2009). Les résultats seront analysés par FACS et un rapport entre les

cellules marquées et les cellules non marquées par l’anticorps anti Ki-67 nous permettra de

déterminer le potentiel prolifératif de ces trois types cellulaires.

Dans un second temps, nous étudierons les capacités migratoires de ces cellules. La maladie

étant caractérisée par une infiltration excessive de DCs conduisant à la formation de granulome, on

se pose la question de l’impact que pourrait avoir la mutation BRAF V600E et le polyomavirus sur

cette infiltration. Ainsi, les CSH, les monocytes et les DCs dérivées de monocytes seront cultivées

dans une chambre de boyden (Figure 15) selon la méthode décrite par N. Bertho (Bertho et al, 2005).

La migration des cellules sera stimulée par la chemokine chimio-attractante CCL20 recombinante,

ayant la capacité d’attirer les DCs et est retrouvée au niveau des granulomes des patients malades

(Annels et al, 2003). Pour les CSH et les monocytes, une fois le test de migration terminé (3H, à 37°C),

les cellules n’ayant pas migré (présentent sur la face du haut de la membrane) sont lavées et les

cellules ayant migré sont fixées puis colorées à la rhodamine (possède une affinité aux fibres

d’actines) et comptées au microscope à fluorescence (Bertho et al, 2005). Pour les DCs dérivées de

monocytes, les mêmes étapes seront réalisées pour le lavage mis à part que les cellules migratrices

sont récupérées et comptabilisées par FACS après le quadruple immunomarquage détaillé

précédemment, afin de séparer les DCs complétement matures des DCs présentant le phénotype

immature des DCs retrouvées chez les malades.

Enfin, des tests d’invasions seront réalisés pour déterminé si les monocytes et les DCs sont

‘’suffisantes’’ pour infiltrer les tissus. Dans les granulomes, en plus des monocytes et des DCs, sont

retrouvées des MGCs (da Costa et al, 2005), qui ne sont pas étudiées ici et qui pourraient jouer un

rôle dans la sévérité de l’HL, comme cela a été montré dans des infections à Mycobacterium

tuberculosis (Lay et al, 2007). Les tests d’invasions sont très similaires aux tests de migration (Figure

15), détaillés dans le paragraphe précédent. Ils diffèrent seulement par la présence d’une matrice (du

matrigel) au fond de la chambre de boyden. Seules les cellules capables de dégrader cette matrice

pourront traverser le puit. Les CSH, les monocytes et les DCs dérivées de monocytes invasives seront

fixées ou non, marquées et comptabilisées de la même manière que pour le test de migration.

Perspectives

Une fois que nous aurons plus d'informations sur les cytokines impliquées, le rôle du virus, et

de la mutation BRAF V600E au niveau des différents progéniteurs des cellules dendritiques sur la

maladie grâce aux modèles in vitro et in vivo que nous proposons, il faudra confirmer ces résultats

sur des patients atteints de l’histiocytose Langheransienne.

Nous espérons qu’en sachant plus sur les mécanismes impliqués dans la maladie, de

nouveaux traitements pourront voir le jour afin d’améliorer la bonne prise en charge des patients.

De plus, l’étude de nouvelles thérapeutiques plus spécifiques de la maladie pourra être

réalisée à partir des modèles cellulaires et animaux que nous présentons.

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Résumé

Histiocytose langerhansienne (HL) est une maladie rare d'étiologie inconnue et manquant un

modèle animal fiable. La maladie accumule des symptômes trouvés séparément dans diverses

maladies IL-17A-liés, tels que la formation de granulome chronique agressive, la résorption osseuse

et des lésions des tissus mous avec neurodégénérescence occasionnelle.

L’HL est un trouble lympho-prolifératif des cellules anormales, en particulier des cellules de

Langerhans (LC), et se présente soit comme un HL multi-systémique (HL-MS) ou un HL à système

unique (HL-SS). Il y a beaucoup de controverse au sujet des résultats obtenus par l'analyse des

échantillons provenant de patients malades : il y a des groupes qui croient que l'IL-17A joue un rôle

majeur, et d'autres groupes qui par contre ne trouve pas d’interleukine. En outre, dans la dernière

année il a été suggéré l’intervention d'un virus dans gravité de la maladie.

Dans ce contexte, notre projet de recherche visera à clarifier l'étiologie de la maladie en

générant un modèle cellulaire et un modèle animal pour l’HL.