UNIVERSITATEA “LUCIAN BLAGA”

FACULTATEA DE ŞTIINŢE

SPECIALIZAREA: ECOLOGIE ŞI PROTECŢIA

MEDIULUI

LUCRARE DE LICENŢĂ

COORDONATOR:

Prof. Univ. Dr. Biolog LETIŢIA OPREAN

STUDENT:

- 2010 -

2

UNIVERSITATEA “LUCIAN BLAGA”

FACULTATEA DE ŞTIINŢE

SPECIALIZAREA: ECOLOGIE ŞI PROTECŢIA

MEDIULUI

LUCRARE DE LICENŢĂ

Populaţii de microorganisme în contextul

sistemelor ecologice ale cavităţii bucale

COORDONATOR:

Prof. Univ. Dr. Biolog LETIŢIA OPREAN

STUDENT:

- 2010 -

CUPRINS

PARTEA I

Date actuale despre unele bacterii

din microflora cavităţii bucale

1. Introducere

2. Caracterul de sistem ecologic al cavităţii bucale

2.1. Ecosistemul cavităţii bucale

2.2. Integralitatea

2.3. Echilibrul dinamic

2.4. Autoreglarea

2.5. Caracterul informaţional

2.6. Caracterul istoric

3. Microflora cavitaţii bucale

3.1. Modul de poluare a cavitaţii bucale cu microorganisme

3.1.1. Aderarea prin producera de polimeri extracelulri

3.1.2. Aderarea prin polimeri salivari

3.1.3. Aderarea prin înveliş fibrilar

3.1.4. Ataşarea prin intermediul altor bacerii

3.1.5. Retenţii mecanice

3.2. Dezvoltarea microorganismelor din cavitatea bucală

3.3. Repertizarea şi numărul bacteriilor din cavitatea bucală

3.4. Mecanisme de autoprotecţie antibacteriană a cavităţii bucale

4

PARTEA A II-A

Materiale şi metode

4. Identificarea agentului etiologic

4.1. Consideraţii generale

4.1.1. Metode moderne de control microbiologic şi de diagnostic

4.2. Bacterii gram pozitive aerobe

4.2.1. Cocii gram pozitivi

5. Testarea sensibilităţii germenilor la agenţii antimicrobieni

5.1. Indicaţiile antibiogramei

5.2. Antibiograma prin metoda difizimetrică

5.3. Standardizarea candiţiilor tehnice şi a reactivilor de lucru

6. Rezultate şi concluzii

Concluzii

Bibliografie

5

CAPITOLUL 1

INTRODUCERE

Abordez în prezenta lucrare de diplomă, date actuale despre unele bacterii din

microflora cavităţii bucale, datorită marilor implicaţii pe care le are în sănătatea omului

modern, în societate şi nu în ultimul rând în dezvoltatrea durabilă a acesteia.

Pe lângă modul de tratare strict stomatologic care se limitează strict la prevenţie,

stabilizare şi combaterea cariei, îmbinând cunoştinţele din domeniul ecologiei, am

considerat necesară o analiză mai globală a suportului şi a factorilor ce influentează

dezvoltatrea plăcii bacteriene generatoare de carie.

În acest sens, pornind de la similitudinea care există între organizarea unui sistem

ecologic, pe de o parte şi condiţiile care au ca rezultat apariţia cariei, pe de altă parte, am

căutat să integrez datele şi să studiez modelul de dezvoltare al fenomenului.

În acest fel am considerat că se realizează o abordare nouă, interdisciplinară şi

poate o mai bună înţelegere a complexităţii fenomenului cariogen şi a corelaţiilor pe care

acesta le are cu mediul său specific, cavitatea bucală.

Punctul de vedere prezentat în această lucrare, am căutat să aibă o orientare

obiectivă, comună celor două mari discipline, care au în centrul atenţiei lor omul şi

păstrarea unor condiţii sănătoase, durabile, de viaţă.

6

CAPITOLUL 2

CARACTERUL DE SISTEM ECOLOGIC

AL CAVITĂŢII BUCALE

2.1 ECOSISTEMUL CAVITĂŢII BUCALE

Microorganismele care trăiesc în cavitatea bucală sunt extrem de numeroase, de

ordinul bilioanelor, şi chiar în condiţiile unei riguroase asanări a ei şi a meţinerii igienei

bucale. De asemenea, ele sunt foarte variate ca specii. Unele specii sunt tranzitorii,

ocazionale, altele cvasipermanente. Ele nu trăiesc izolate nici ca specii , nici ca indivizi

celulari, ci într-un amestec mereu schimbător datorită fluxului continuu salivar,

mişcărilor mestecatorii şi de deglutiţie, chiar şi în perioada dintre mese. Aportul alimentar

şi cel lichid introduc de fiecare dată cantităţi noi de specii. Ele constau din bacterii,

protozoare, fungii, viruşi, levuri, etc., de aceea, cu un termen general le numim "microbi"

sau "microorganisme" şi la un loc constituie flora microbiană a cavităţii bucale, sau

prescurtat "microflora". Din ea, bacteriile reprezintă doar o parte, cea majoritară.

Între diferitele specii de microorganisme se stabilesc în timp şi spaţiu numeroase

feluri de relaţii, tocmai datorită amestecului lor permanent. Aceste relaţii constituie

sistemul ecologic al cavităţii bucale. Orice noţiune de ecologie, de la nivelul cavităţilor

naturale ale omului şi deci şi de la nivelul cavităţii bucale, trebuie înţeleasă în dublu sens:

pe de o parte, relaţiile interspeciale, adică cele dintre numeroasele specii de

microorganisme prezentate, pe de altă parte relaţiile fiecăreia şi în ansamblul cu mediul

lor de viaţă, în acest caz cavitatea bucală. Nici unele, nici altele, nu rămân limitate la

acest nivel, ele au răsunet asupra întregului oganism. În acelaşi timp trebuie înţelese şi

7

influenţele locale asupra microflorei bucale. Cavitatea bucală ca spaţiu şi condiţiile ce le

oferă microorganismelor constituie un "habitat". Aici ele au condiţii de dezvoltare pe

baza resturilor alimentare, caldură, umiditate, condiţii de aerobioză, un anumit pH, în

general favorabil lor. Dar tot aici există şi unii factori nefavorabili lor, ca lizozimul,

bacteriocine, numeroşi bacteriofagi, sulfocinaţi din saliva, anticorpi de tipul IgA şi altele.

Prin factorii de mediu pozitivi şi negativi, în raport cu viaţa şi persistenţa lor,

acest habitat exercită o acţiune selectivă asupra speciilor de microorganisme, rămânând

cele cu capacităţi mai bune de adaptare la aceste condiţii. Căci la rândul lor, fiecare dintre

aceşti factori sunt variabili, în jurul unei medii şi sunt ritmaţi de alimentaţie şi obiceiurile

personale.

Între microorganismele din cavitatea bucală se stabilesc tot felul de relaţii, potrivit

metabolismuiui fiecăruia în parte, şi al tuturor, ca ansamblu. În linii mari, aceste relaţii

pot fi de stimulare a dezvoltării unei specii sau de indiferenţă şi de inhibare. Cele de

stimulare pot fi unilaterale, privind beneficiul unei specii pe seama alteia, când o

denumim "toleranţă" şi "dependenţă", cum este cazul bacteriilor-doică.

Acestea furnizează diferite vitamine sau factori de creştere şi altora, prin sinteza

pe care o fac pentru sine. De exemplu, stafilococul favorizează in prezenţa sa dezvoltarea

lui Hemophilus influenzae, tot stafilococul poate fi sursă de vitamina K pentru

Bacteroides melaninogenicus, de care acesta din urmă are neaparată nevoie. Există relaţii

între organisme de beneficiu bilateral, când vorbim de simbioză. Astfel de relaţii se

instalează pe parcursul descompunerii alimentelor complexe, când în scindările făcute de

unele specii de bacterii anaerobe prin fermentaţii rezultă compuşi utili altor specii, celor

aerobe, de care profită.

Relaţiile de "inhibiţie", de asemenea pot fi de mai multe feluri: de inhibiţie

unilaterală, de inhibiţie reciprocă, de antibioză. Lactobacilli, prin producţia lor mare de

acid lactic şi de alte feluri de acizi, sunt nefavorabili, prin pH pe care îl scad, pentru multe

alte specii. În schimb, acidul lactic şi alti acizi produşi de lactobacilii heterofermentivi,

precum şi acizii produşi de streptococi sunt utilizaţi de veillonelle ca surse de energie

(Rogosa, 1964). Bacteriile secretoare de bacteriocine duc la scăderea numerică a speciilor

şi tulpinilor sensibile la acţiunea bactericidă a acestora. Streptococii viridans prin

peroxidul de hidrogen ce-1 eliberează în cantitate mare inhibă dezvoltarea bacteriilor ce

8

nu au catalaze şi peroxidaze ca să îl descompună, cum este cazul anaerobilor. Unii fungi

(actinomicetele) din cavtitatea bucală produc cantităţi mici de substanţe cu caracter de

antibiotice pentru alte specii. Tot prin scăderea pH ca urmare a producerii de acizi

organici din fermentaţii la care contribuie alături de streptococi şi lactobacili,

antinomicetele, stafilococii epidermilis, difteromorfii şi alte specii zaharolitice, sunt

inhibate în dezvoltarea lor bacteriile proteolitice (pseudomonas aeruginosa, bacilul

proteu, bacteroides fragilis şi alţii) care au nevoie de un mediu alcalin pentru activitaţile

lor. Cercetările facute pe animale germ-free au arătat că bacteriile anaerobe nu pot

coloniza cavitatea bucală decât dupa prealabila ei colonizare cu bacterii aerobe, ceea ce

subliniază dependenţa unora de celelalte ca să le consume oxigenul molecular nociv

anaerobilor.

Deosebim deci relaţii favorabile de dezvoltare, de întrajutorări interspeciale, dar şi

numeroase relaţii de antagonism la nivelul cavităţii bucale. Ele sunt într-o dinamică

permanentă, când în favoarea unora sau unei specii, când în defavoarea unei sau mai

multor specii. În acelaşi timp distingem în cavitatea bucală în diferite regiuni, pe

suprafaţa unor mucoase sau în interiorul unor cavităţi cu pH-uri diferite, condiţii de

aerobioză şi anaerobioză, concomitente sau alternative, care duc la relaţii diferite şi

creează microflorei un tablou foarte variat.

Dar bacteriile nu se înmulţesc la infinit în cavitatea bucală. Din acest punct de

vedere, alături de relaţiile de proliferare şi de cele de antagonism, mai distingem relaţii de

limitare per ansamblul microflorei al numărului de bacterii. Acestea din urmă nu sunt şi

cele mai lipsite de importanţă întrucât putem presupune unde ar duce un exces bacterian.

La limitarea bacteriilor contribuie diferiţi factori. Unul dintre ei este lizozimul, cu acţiune

deosebită asupra florei grampozitive, depolimerizându-i peretele celular şi transformând-

o în protoplaşti ce nu pot persista ca atare în condiţiile cavităţii bucale.Un al doilea factor

limitativ este sistemul lacto-peroxidaza-SCN-H2O2.

Alţi factori sunt peroxidul de hidrogen produs de numeroase specii, şi în primul

rând de streptococii salivarius, precum şi de acizii graşi volatili (Rosebury, 1962). De

asemenea, în gură există, mai ales în cele cu carii, sau cu igiena deficitară, numeroase

protozoare avide mâncătoare de bacterii, precum şi numeroşi bacteriofaci ce lizează

bacteriile. Dar un rol deosebit îl are saliva, care prin cantitatea ei de 1 - 1,5 l/24 ore le

9

spală de pe dinti şi mucoase şi le transportă spre aciditatea bactericidă a stomacului şi

alcalinicitatea de la nivelul intestinului. Rolul salivei de îndepărtare a bacteriilor reiese

din faptul că dimineaţa la sculare gura conţine o cantitate excesiv de mare de bacterii, ce

se corelează cu reducerea la maximum peste noapte a salivei. Descuamarea continuă a

celulelor epitetului bucal are şi ea un rol în îndepărtarea microorganismelor.

Din cele expuse rezultă că există într-un anumit sens un echilibru numeric al

microorganismelor bucale, cum se poate vorbi de un anumit echilibru între specii. Acest

echilibru nu este întâmplător, ci este dictat de necesităţi, iar baza lui materială sunt

caracteristicile de specie şi condiţiile de dezvoltare. Relaţiile ce se creează între

microorganisme nu sunt relaţii simple de prezentă, ci sunt organizate în sistem.

Ansamblul lor cu cavitatea în care au loc constituie un "ecosistem". El este specific

acestei cavităţi întrucat este diferit prin numeroase particularităţi de ecosistemul intestinal

sau vaginal. În acelasi timp, el nu este un ecosistem standard, deoarece prin foarte multe

variante ce le poate avea, ecosistemul cavităţii bucale diferă de la un organism la altul. El

are urmatoarele caractere:

a) Este stabil, în sensul unui relativ echilibru între specii la acelaşi individ în

timp şi condiţii obişnuite, cu variaţiile mici pe care le-am semnalat.

b) Controlează rezidenţa şi stabilirea tulpinilor bacteriene nou intrate. Ca o

tulpina să se poată menţine, ea trebuie să aibă capacitatea de integrare în ecosistem, ţinînd

cont de numeroasele condiţii nefavorabile ei ce le întâmpină din partea celorlalte tulpini

şi specii. În acest sens, ecosistemul realizează în mod automat o împărţire a speciilor

bacteriene, în permanente şi trecătoare prin cavitatea bucală. Nu orice bacterii se pot

adapta şi integra la condiţiile găsite şi create de sistemele numeroase ce determină variaţii

de pH, aerobioză - anaerobioză, diferite feluri de metabolisme concomitente cu

complexitatea de enzime ce le pun în joc, fenomenele de dependenţă, antagonisme,

factori limitativi. Spre exemplu, Escherichia coli este o specie uşor adaptabilă la

condiţiile de mediu, nepretenţioasă, ca dovadă marea ei posibilitate de răspândire. Şi

totuşi, ea nu este capabilă să fie adaptată ca o specie permanentă în cavitatea bucală, în

condiţiile de aici. Face parte din cele trecătoare, incidentale. Deci ecosistemul are pentru

unele bacterii o acţiune eliminatorie.

10

c) Altă caracteristică a lui este temperarea virulenţei diferitelor specii sau

tulpini în condiţiile prezenţei in ecosistem. Cu alte cuvinte, unele specii sau tulpini, cu cât

sunt mai încadrate în ecosistem sunt obligate de numeroşi factori constituenţi ai acestuia

să-şi modereze patogenitatea, să trecă din patogene în condiţionat-patogene. Ele numai

când părăsesc ecosistemul îşi pot căpăta eventual agresivitatea. Aşa este cazul

stafilococului auriu sau a lui Pseudomonas aeruginosa. Sau devin agresive în condiţii

speciale de receptivitate a organismului, cum este cazul marilor traumatisme, sau după

extracţii anevoioase, când ei pot cauza osteomielite. La fel este cazul streptococilor

sanguis, care în condiţiile integrării în ecosistem sunt comensali, inofensivi, dar când

pătrund de aici în torentul circular cauzează acea boală numită endocardita bacteriană

subacută. Plecând din ecosistemul bucal, întâlnesc alte condiţii.

Pentru ca o tulpina nou intrată, de la început să-şi manifeste patogenitatea,

învingând condiţiile ecosistemului, ea trebuie să fie dotată sau cu o virulenţa deosebit de

mare, sau ca organismul să aibă forţele de apărare foarte scăzute generale sau locale în

acel moment biologic.

Ce înseamnă întreruperea echilibrului dintre specii, o dereglare a ecosistemului la

un moment dat, o subliniază cazurile administrării masive sau îndelungate de tetracicline

sau alte antibiotice cu spectru larg. Omorând speciile sensibile, cu rolul lor bine definit

antagonist şi limitant, speciile rezistente, cum sunt candidele, cresc şi se înmulţesc

nestânjenite, până la exces. Din situaţia dinaintea dereglării ecosistemului, când ele erau

în număr redus şi comensale, deodată se dezvoltă extrem de mult, colinizând întrega

suprafaţă a cavitaţii bucale, cu puncte albe de diferite mărimi, coloniile lor caracteristice.

În acelaşi timp devin patogene, formează filamente, apoi micelii ce pătrund prin mucoase

în profunzimea ţesuturilor şi au tendiinţa de invadare a torentului sanguin.

Alte două exemple sunt la fel de grăitoare: Gibbons a încercat implantarea

streptococului mutans in mod experimental într-o cavitate bucală indemnă de carii, de

mai multe ori, fără succes. Ulterior însă a reuşit prin zdruncinarea influenţei oponente a

ecosistemului în urma administrării de eritromicina, antibioticul cu care a omorat o parte

din speciile prezente. La fel, administrarea de penicilina în doze mari zilnic, pe o

perioadă anumită, unui organism, produce treptat o înmulţire abundentă a florei

gramnegative şi în special a bacililor. Ei vor predomina asupra celorlalţi în ecosistem.

11

Dacă însă penicilina este administrată apoi numai intermitent, relaţiile anterioare dintre

specii se refac, şi o dată cu refacerea lor, scade numărul speciilor gramnegative şi a

coliformilor la nivelul anterior.

d) Ecosistemul cavităţii bucale are o caracteristică ce îl diferenţiază de alte

ecosisteme, cum este cel intestinal sau vaginal, etc., în el predomină numeric streptococii

dintre bacteriile viabile, in cel intestinal predomină speciile de Bacteroides şi Escherichia

coli.

2.2 INTEGRALITATEA

Integralitatea este o trăsătură a sistemelor deschise, cu mari semnificaţii pentru

sistemele ecologice.

Părţile ecologice ale unui sistem ecologic se diferenţiază morfo-funcţional, se

stabilesc între ele conexiuni şi interacţiuni care determină funcţionarea sistemului ca un

întreg. Fiecare sistem ecologic este delimitat faţă de celelalte sisteme şi se comportă ca

un tot datorită conexiunilor care leagă componentele lui.

Însuşirile întregului nu pot fi reduse la suma însuşirilor lui. Din însuşirea

componentelor întregului apar trăsături noi, ale părţilor, şi trăsături noi, ale întregului,

fapt de o mare generalitate la toate nivelele de organizare a materiei.

În fapt, bacteriile din cavitatea bucală, se hrănesc cu resturi de alimente care

tranzitează acest segment al tubului digestiv, dar acest lucru, coraborat cu activitatea lor

metabolică, producătoare a cariei dentare, face ca acestea să se constituie împreună cu

substratul dento-parodontal într-un sistem ecologic de sine stătător.

Aceste bacterii se găsesc oriunde în tubul digestiv şi chiar în alimente, însă

coexistenţă lor în cavitatea bucală creează un sistem ecologic cariogen, sistem ecologic

specific şi bine delimitat în cadrul organismului uman.

Fiind o multitudine de specii (aproape 400) cu conexiuni strânse, ele constituie un

sistem cu o integritate bine conturată. Dezvoltarea integralităţii coincide cu însaşi

dezvoltarea organizării sistemului, şi are ca efect sporirea eficacităţii autocontrolului şi a

echilibrului dinamic.

12

2.3. ECHILIBRUL DINAMIC

Starea caracteristică tuturor sistemelor ecologice este echilibrul dinamic sau starea

staţionară. Este consecinţa însuşirii fundamentale a sistemelor deschise, de a întreţine

permanent schimb de substantă şi energie cu mediul şi sistemele înconjurătoare.

Toate sistemele ecologice care efectuează permanent schimburi de materie şi

energie cu mediul ambiant se autoreînnoiesc continuu, ele însă işi pastreză

individualitatea determinată genetic, reuşind să realizeze astfel un echilibru dinamic, între

stabilitate şi schimbare. Acest echilibru se realizează prin compensarea metabolică a

pierderilor metaboilice şi materiale.

Biocenoza sistemului ecologic cariogen apare odată cu naşterea individului uman

şi se dezvoltă atâta timp cât individul uman trăieşte. Până în prezent nu s-a obţinut şi nici

nu s-au întrevăzut metode prin care să se obţină o cavitate bucală sterilă.

Biotopul acestui sistem constituie poarta de intrare a organismului uman, a

resurselor energetice, a alimentelor dar şi a microorganismelor. Aici în cavitatea bucală

este graniţa dintre mediul steril, propriu organismului, şi cel nesteril reprezentat de

mediul înconjurător.

Cavitatea bucală este bariera cea mai permisivă şi totodată cea mai selectivă care

permite trecerea lentă de la mediul homeostatic al organismului, la mediul înconjurător al

cărui parametrii sunt într-o continuă schimbare. În rest organismul uman este delimitat de

epidermă care este o barieră destul de fermă împotriva tendinţelor de variaţie a

parametrilor din mediul înconjurător.

În aceste condiţii, flora din cavitatea bucală, respectiv cea care produce placa

bacteriană nu poate fi eradicată, indiferent ce fel de mijloace am folosi. Eliminarea

completă a florei cavitaţii bucale prin antibiotice şi chimioterapie s-a dovedit a fi nefastă

pentru sanătatea cavitaţii bucale şi a organismului.

Sistemul ecologic cariogen are deci o stabilitate deosebită, şi încercarea de a-1

exclude din organismul uman produce dezechilibre altor aparate şi sisteme.

13

În condiţiile în care se încearcă reducerea numărului de microorganisme prin

mijloace fizice (periaj dentar) şi chimice (administrarea de antibiotice) potenţialul de

refacere a acestuia este considerabil.

Astfel în urma cercetarilor lui Loe (1965) şi Mandel (1970) de eradicare completă

a plăcii bacteriene se remarcă: dupa o zi, prezeţta de coci gram negativi incluşi într-o

matrice celulară, dupa trei zile, se adaugă fuzobacteriile şi bacteriile filamentoase, iar

după nouă zile, se adaugă spirilii, vibronii şi spirochetele.

Se remarcă deci o capacitate de regenerare destul de mare ceea ce face ca sistemul

ecologic să aibă un echilibru dinamic destul de stabil.

În condiţiile în care nu se intervine în nici un fel (mecanic sau chimic) asupra

sistemuiui ecologic cariogen acesta nu involuează. Limba si obrajii, prin mişcarile lor,

spală permanent dinţii, decolând volumul de masă bacteriană care nu mai poate fi susţinut

de matricea celulară a plăcii bacteriene. La aceste acţiuni participă şi alimentele de

consistenţă dură precum şi cele care au în compoziţia lor fibre vegetale care eliberează, în

timpul masticaţiei, dinţii de placa matură.

2.4 AUTOREGLAREA

Autoreglarea este una din cele mai importante caracteristici ale sistemelor

ecologice care sunt organizate de aşa natură încât să permită recepţionarea informaţiilor,

circulaţia lor în interiorul sistemuiui şi selecţia celui mai bun răspuns.

În ultima perioadă de timp se acordă o importanţă tot mai crescută şi formelor

inferioare de autoreglare de la nivelul celulei, studiate de biologia moleculară şi de

microcibernetică.

Acest tip de autoreglare întâlnit la nivel individual este întâlnit şi la nivelul

sistemului ecologic cariogen, sistem alcătuit din organisme inferioare: virusuri, bacterii şi

ciuperci.

Autoreglarea la nivel individual este un mecanism extrem de complicat de

explicat la o aşa mare diversitate de specii şi, după cum am mai afirmat este obiectul de

studiu al unor cercetări sofosticate. Însă autoreglarea la nivelul plăcii bacteriene ca

sistem, este un mecanism simplu prin care este controlat aportul de substanţe nutritive,

14

dispoziţia diferitelor specii în straturile plăcii dentare in raport cu evoluţia ei, prioritatea

sau limitarea accesului informaţiilor în procesele cheie ale plăcii.

Toate aceste procese vor fi tratate pe larg în capitolul III (Microflora cavitaţii

bucale) ocazie cu care se vor reliefa conexiunile care se stabilesc între variatele specii de

microorganisme din cavitatea bucală.

2.5 CARACTERUL INFORMAŢIONAL

Toate ecosistemele din punct de vedere fizic functionează ca nişte sisteme

cibernetice. Sistemele cibernetice sunt sisteme informaţionale care folosesc

transformările energetice ca mijloc pentru recepţionarea, prelucrarea, acumularea şi

tansmiterea informaţiilor.

Oricare din organismele vii, în activităţile sale metabolice, transformă energia

diverselor legături chimice în energie termică, mecanică, nervoasă, electrică, etc.

Această transformare de energie reprezintă forma cea mai adcvată, prin care

organismele, ca sisteme deschise, întreţin relaţii cu mediul înconjurător.

Astfel, o bacterie cu o structură simplă, procariotă, deţine mai puţine informaţii

decât o plantă sau organismul uman. Această informaţie este stocată la nivelul AND-ului

sau ARN-ului şi este transmisă foarte rapid, datorită succesiunii mari de generaţii şi,

foarte exact datorită faptului că este într-o cantitate mult mai redusă decât în cazul

macroorganismelor.

Eventualele erori apar datorită ritmului alert de înmulţire, ştiindu-se faptul ca

erorile apar în corelaţie directă cu numărul de diviziuni celulare.

Dar semnalele se mai pot transmite şi: biochimic prin intermediul produşilor de

secreţie sau excreţie celulară, sau electric ca urmare a metabolismului celular şi a

funcţionării pompelor ionice.

Tendinţa generlă este de creştere a informaţiei pe masura dezvoltării; sistemele

ecoiogice nu tind spre o creştere maximă ci spre un optim al gradului de informaţie.

15

2.6 CARACTERUL ISTORIC

Evoluţia, privită larg, ca un proces de dezvoltare, mişcare, este o proprietate

generală a tuturor corpurilor materiaie. La sistemele ecologice, acest proces este foarte

complex şi calitativ diferit in comparaţie cu sistemele lipsite de viaţa.

Oricât de profund am cunoaşte alcătuirea unui sistem ecologic, utilizând metodele

cele mai adecvate, analitice şi toxonomice, nu vom putea reuşi să explicăm structura şi

funcţiile lui dacă nu îi cunoaştem etapele apariţiei lui, mai bine zis istoria lui.

Fiecare organism, de la cel mai simplu, până la cel mai evaluat, conservă şi

rezumă în patrimoniul său ereditar, istoria populaţiei din care face parte, istorie a

nenumărate generaţii.

Prin coevoluţie, organismul uman şi microorganismele formează exo-şi

endosimbioze. După Sturgen "...atunci când microbii populează permanent organismele

animale, se formează simbioze mult mai strânse între ele, denumite endosimbioze

animale-microorganisme" (în cazul nostru endosimbioze om-microorganisme) pe fondul

cărora sunt edificate ecosisteme, în cazul nostru -sistemul ecologic cariogen.

Microorganismele din cavitatea bucală, reprezentate de virusuri, bacterii şi fungii

au o dezvoltare filogenetică bine stabilită pentru fiecare specie în parte (există circa 380

de specii diferite), iar coevoluţia lor în cavitatea bucală datează de la apariţia omului.

16

CAPITOLUL 3

MICROFLORA CAVITAŢII BUCALE

3.1 MODUL DE POPULARE A CAVITAŢII BUCALE CU

MICROORGANISME

Pentru ca o bacterie să devină parte integrantă din microflora bucală, ea trebuie să

fie reţinută, să poată persista la nivelul acestei cavităţi. Altfel există riscul de a fi repede

spălată de salivă şi îndepărtată prin deglutiţie. De aceea ea trebuie să aibă o serie de

calităţi morfologice, sau enzimatice, sau de altă natura, care să-i confere un anumit fel de

a rezista la influenţa celorlalte microorganisme şi la condiţiile din ecosistem. Implantarea

unui agent microbian nou venit este un fapt simplu şi uşor, fiindcă el nu vine pe un loc

"gol".

Ca urmare, retenţia unei bacterii poate fi adezivă sau neadezivă (mecanică).

Retenţiile adezive se pot datora:

1.) sintezei de polimeri extracelulari de catre unele bacterii;

2.) întâlnirii cu diferiţi polimeri de către o bacterie nesintetizantă de polimeri

proprii şi ataşarea la ei;

3.) ataşării prin înveliş fibrilar;

4.) ataşării prin intermediul altei bacterii.

Înainte de a vedea pe rând fiecare din aceste moduri cu particularităţile lui, trebuie

subliniată proprietatea generală a bacteriilor de a se ataşa şi de a adera la unele suprafeţe.

Deosebirea între ataşare şi aderare constă în fermitatea fixării. Microorganismele au o

tendiinţă continuă, deşi foarte lentă, să se depună, să sedimenteze în apă, sau din aer pe

17

obiecte, pe sol. Acest fenomen se datorează greutăţii lor specifice mai mare pe unitatea de

volum, decât a acestor factori de mediu. La rândul lor sunt ridicate de curenţii de apă, aer

şi mobilizate în dezordine, după intensitate şi direcţie.

Simpla depunere, sedimentare este temporară, pe când ataşarea, şi mai ales

aderarea tind spre stabilizare.

Capacitatea de aderare este diferită pentru fiecare specie şi este corelată cu

dimensiunea celulei, forma ei, sistemul enzimatic al peretelui celular şi structura peretelui

celular. Speciile cu celule mari sedimentează mai uşor decât cele cu celule mici şi foarte

mici. Cele cu celule rotunde sedimentează mai greu decât bacilii şi încă mai greu decât

formele filamentare. Suprafaţă rugoasă a peretelui celular furnizează mai degrabă o

aderare, dacât o suprafaţă netedă, iar secreţiile ce se depun pe perete sau trec prin peretele

celular au o importanţă deosebită în ajutarea aderării, în fixare, chiar în conglomerare,

cum este cazul mycobacteriilor prin cond - factorul lor (lipide şi ceride), ce le determină

să se lipească sub formă de şuviţe lungi, întortocheate.

Pentru bacteriile cu habitat în cavitatea bucală aderenţa are o valoare de

determinant ecologic pentru că majoritatea din ele se stabilesc aici prin unul din modurile

de aderare.

Nu orice aderare este o garanţie că bacteria va coloniza, pentru că numeroase

aderări pot fi reversibile. De aceea, facem distincţia între ataşare-aderare pe de o parte, şi

colonizare pe de alta. Colonizarea trebuie socotită ca o interacţiune între bacterie,

suprafaţa pe care a aderat şi ecosistem. Felul suprafeţei din cavitatea bucală poate

favoriza mai mult sau mai puţin o aderare.

Cele rugoase sunt mai favorabile adeziunii decât cele netede, asigură o menţinere.

Detaşarea este mai dificilă de către salivă, din cauza acestor suprafeţe, şi a contactului

mai ferm dintre bacterie şi suprafaţă.

Streptococii mutans şi Streptococii sanguis au preferinţe pentru astfel de suprafeţe

rugoase de pe dinţi şi proteze, pe când streptococii salivarius când nu colonizează în mod

primar limba, aderă numai la suprafeţe netede, dar cu toate acestea, ataşarea lui este tot

atât de fermă, întrucât nu se detaşează nici cu enzime, nici cu detergenţi (Hoffman, 1967).

Din partea bacteriei, în fenomenul de colonizare are o mare importanţă

preferinţele de specie. Ele determină în cele din urmă, că întotdeauna Streptococul

18

salivarius să se fixeze ca loc pe dosul limbii, Streptococul mitis pe mucoasa obrajilor,

Streptococul mutans pe dinţi şi streptococul sanguis pe dinţi şi între dinţi.

Prin urmare, în aceleaşi condiţii ale ecosistemului, preferinţele fiecăreia dintre

specii sunt altele şi constante, cel puţin în cazul streptococilor, din motive prea puţin

cunoscute încă.

Dupa ce a aderat, ca o bacterie să se colonizeze, adică să aibă o dezvoltare

numerică abundentă până la formarea de colonii, trebuie în condiţiile ecosistemului să

aibă o rată de înmulţire care să exceadă pe cea oponentă a altor bacterii şi pe cea de

spălare continuă prin secreţie, în cazul gurii, saliva. De aceea se apreciază că şi cantitatea

iniţială de pătrundere în gură a unei bacterii nou venite trebuie să fie destul de mare, peste

108. Sub această cantitate şansele ei de implantare scad.

Totuşi, unele specii, ca streptococul sanguis, se pot coloniza şi când se găsesc

numai într-o cantitate de 103-104 per ml salivă. Dar streptococul mutans necesită cantităţi

iniţiale de cel puţin 10 ori mai mari ca să poată coloniza. Prin urmare, colonizarea este în

raport şi cu atributul de specie.

3.1.1 Aderarea prin producere de polimeri extracelulari

Exemplul cel mai elocvent despre modul acesta de adeziune prin polimeri îl

constituie streptococul mutans. El produce din sucroză polimer de aderare extracelular,

cu care aderă şi se menţine pe orice suprafaţă atât în vivo cât şi în vitro. Dovada rolului

jucat de acest polimer a făcut-o Fitzgerald (1969) tratând suprafeţele cu dextronază,

enzimă ce degradează dextronul şi constatând astfel prevenirea formării plăcii dentare la

hamsterii cărora li s-a încercat implantarea de streptococi mutans. Spre deosebire de

animalele tratate cu dextronază, martorilor li s-au putut implanta streptococi mutans

tuturor. Specificitatea acestui polimer se vede şi din faptul că streptococul mutans se lasă

uşor şi repede aglutinat la contactul cu dextronul, pe când alte bacterii nu aglutinează cu

el. În schimb, acestea din urmă, aglutinează în prezenţa altor polimeri salivari, dar cu care

nu aglutinează streptococul mutans. Aşa e cazul streptococului sanguis, sau al speciei

Actinomus viscosis.

19

Se poate vorbi deci în cazul unor bacterii de aglutinare specifică (s. mutans), iar în

al altora de aglutinare nespecifică (s. sanguis). Evident că în cazul aglutinării specifice

aderenţa la suprafeţe este mai mare, detaşarea experimentală mai dificilă, ceea ce s-a

constatat în cazul streptococului mutans şi al plăcilor dentare produse de el.

Proprietatea adezivă a unor polimeri, cum este aceea a dextronului nu favorizează

numai aderenţa propriei specii, a streptococului mutans, ci şi a altor specii bacteriene în

mod nespecific, prin simplul fenomen fizic al vâscozităţii. Se deosebesc şi din acest punct

de vedere bacterii ce se lasă uşor alipite la un contact cu dextronul şi altele ce reuşesc să

se detaşeze. Aceasta este în funcţie şi de gradul lui de polimerizare, vâscozitatea şi

aderenţa fiind proporţionate cu acest grad, pentru că o dată cu polimerizarea creşte şi

greutatea moleculară şi proporţia înălţimii axiale. În absenţa unui regim bogat în sucroză,

streptococul mutans are slabe capacităţi adezive, el este repede spălat şi îndepărtat de

salivă, ceea ce explică absenţa lui, sau procentul redus, in cavitatea bucala. Dar avand

multa sucroza la dispozitie, el este capabil să colonizeze dinţii până la exces. Sucroza este

mai importantă pentru el ca mijloc de aderenţă decât ca substrat nutritiv.

Funcţie de aderenţă este mai mare când polimerul este secretat de novo, adică

după ce bacteria vine în contact cu suprafaţa dintelui, ca urmare a acestui contact ea

fixându-se ferm în acest caz; dacă însă polimerul era secretat dinainte,aderenţa este mai

slabă şi bacteria chiar poate fi îndepărtată.

Şi alte microorganisme posedă un mecanism aproximativ de aderenţă prin sinteza

de polimeri extracelulari. Actinomices naeseundii aderă prin acidul hialuronic pe care-1

secretă sub o formă alterată a acestuia, deoarece aderarea lui este înlăturată de

hialuronidază (Socrovski, 1970). Ca şi streptococul mutans, actinomicerul trebuie să se

ataşeze mai întâi de dinte, apoi să secrete polimerul, şi numai prin acesta el aderă propriu-

zis. Alte specii de actinomices sintetizează levoni, iar mai nou s-a arătat că unele

actinomicete elaborează în jurul lor un văl de heteropolizaharid ce conţine o cantitate

mare de acetilglucizonina cu rol evident în aglutinarea specifică a actinomicetelor, rolul

aproximativ al dextronului pentru streptococul mutans (Hammond, 1974).

20

3.1.2. Aderarea prin polimeri salivari

În salivă se gasesc în mod permanent polimeri ai glicoproteinelor, cu greutăţi

moleculare diferite. Prin faptul că ei dau un caracter vâscos salivei, au o importanţă

deosebită în aderarea numeroaselor specii bacteriene cu care vin în contact, pe de o parte,

pe de altă parte ei umectează în continuu dinţii şi aderă de hidroxiapatit, favorizând

aderarea la acesta a microorganismelor. Cu cât greutatea moleculară a polimerului

mucoid este mai mare, cu atât vâscozitatea lui creşte şi este mai uşoară ataşarea şi

aderenţa la contactul bacteriei cu polimerul. Rolul polimerilor salivari reiese şi din faptul

ca ei constituie matricea de baza a placii dentare pe care se face aglomerarea celulară.

Mai mult chiar, se ştie că unele specii se lasă aglomerate numai de unele tipuri de

polimeri salivari, spre exemplu, streptococul mitis, pe când streptococul sanguis numai de

altele.

Cercetările lui Hillman (1970) au demonstrat că streptococul salivarius şi sanguis

aderă în mod egal pe pulberea de smalţ netratată cu salivă. Dar tratat cu salivă,

streptococul sanguis devine dintr-o dată mult mai aderent şi pe suprafeţe mai mari decât

streptococul salivarius, în proporţie de peste 100 de ori. Alături de acesta, autorul citat a

constatat încă masive aglomerari in vivo pe dinţi de alţi streptococi bucali decât

streptococul sanguis. Şi diferite mucine din secreţia bronşică au rol în aderarea bacteriilor

şi pe tractul arborelui respirator, servind ca un fel de filtre al aerului.

3.1.3. Aderarea prin înveliş fibrilar.

O serie de specii din cavitatea bucală au la periferia celulei lor un înveliş,

supraadăugat peretelui. El are un aspect franjurat sau fibrilar. A fost descris întâi de

Zobell la sterptococul piogen. S-a văzut că el dispare morfologic la microscopul

electronic după tratarea celulelor cu pepsină, deci este de natură proteică. Ulterior s-a

constatat că el există şi la alţi streptococi, de exemplu la streptococul salivarius şi la

streptococul mitis, sau la alte specii bacteriene, ca Leptotrichia buccalis, fiind însă diferit

de la o specie la alta. Tururor le serveşte evident la aderarea în cavitatea bucală pe diferite

suprafeţe. Se deosebeşte net de pilii bacteriilor gram-negative prin faptul că este mai scurt

21

în lungime decât aceştia şi altfel distribuit pe periferia celulei. Spre exemplu,

actinomicetele îl au sub aspectul unor fibrile lungi, rare. Bacteriilor care-1 posedă le

permite o ataşare directă de feţele dure sau moi, fară ajutorul polimerilor. Nu toate

speciile îl au însă, spre exemplu, lactobacilii cozec, de aceea ei nu pot adera direct de

dinte.

Unele bacterii gram-negative mai pot adera probabil prin pilii lor, mai ales bacilii.

3.1.4. Ataşarea prin intermediul altor bacterii.

Ea a fost postulată de Gibbson şi Nygaard pe baza aglutinărilor ce se constată

frecvent între bacterii de specii diferite. Cauza este fie înrudirile antigenice, cazuri mai

rare, fie structura lor de suprafaţă, mai des, ce le face să intre în reacţii de afinitate unele

cu altele.

Parson şi colaboratorii (1973) au izolat 8 specii de bacterii din gură ce nu

produceau nici una din ele aglomerari pe tijă de metal implantată în mediu cu sucroză

(model pentru producerea de plăci dentare în vitro), din care 6 coci gram-pozitivi şi 2

bacili gram-negativi. Cu aceste bacterii a realizat 35 de combinaţii diferite şi a constatat

că 21 combinaţii în condiţii de amestec au produs placă dentară în vitro prin aderenţă cu

diferite grade defermitate pe tija de metal, asemănătoare plăcii bacteriene în vivo. Prin

urmare, specii cu o slabă capacitate adezivă pe parţi dure, când sunt singulare, în amestec

se potentează.

Un rol deosebit în aderarea speciilor cu slabă capacitate proprie adezivă îl are

ajutorul dat de speciile care în mod primar sunt formatoare de plăci dentare, cu mare

putere de aderare, cum este sterptococul Actinomices mutans şi Actinomices viscosis.

Genul Veillonella, spre exemplu, dotată cu o slabă aderenţă în vivo şi în vitro, devine

aderentă şi se fixează pe placa dentară formată de actinomices viscosus (Bladon, 1970).

22

3.1.5. Retenţii mecanice.

Alături de retenţiile adezive văzute mai sus, datorita proprietăţilor de specie,

există în cavitatea bucală o serie de posibilităţi de retenţii mecanice ale bacteriilor. Ele se

fac în două feluri. Unele prin absorbirea grosolană a microbilor pe substratul format de

resturile alimenatre ce stagnează temporar ăn gurile cu igiena dinţilor neglijată.

Răspândirea lor poate fi foarte inegală, cu deosebire sunt prezente în diferite faze, în

pliuri ale mucoaselor, în spaţiile interdentare. Al doilea fel constă în pătrunderea

incidentală cu saliva a bacteriilor în fisurile dinţilor, în leziunile cariare, între suprafeţe

neregulate, crenelate ale gingiilor, în spaţiul gingiilor, în pungile parodontale. În ambele

cazuri bacteriile se aglomerează şi depozitează, se înmulţesc, fiindcă sunt protejate într-

un anumit mod de acţiunea de spălare a salivei. Acestea sunt modalitatile de menţinere în

gură a unor specii cu o aderenţă proprie scazută, care altfel s-ar implanta greu numai prin

proprietăţile lor, ca lactobacilii, Bacteroides melaninogenicus, levurile, fuzobacteriile.

Dovada acestui mod de reţinere reiese din faptul că aceste specii se găsesc într-o cantitate

extrem de mică la edentaţi, dar îndată după montarea de proteze, numarul lor creşte

semnificativ. Spre exemplu, lactobacilii se găsesc într-o cantitate foarte mică, sau chiar

lipsesc din gurile fară carii dentare. Dar ei abundă în carii şi în jurul lor, numărul

lactobacililor fiind proporţional cu al cariilor. După asanare, numărul acestora se reduce

puternic. Astfel de constatări 1-au determinat pe Krane să creadă că lactobacilii îşi au

habitatul numai în carii, fiind adăpostiţi în ele, unde au pătruns o dată cu saliva. La fel

este cazul lui Bacteroides melaninogenicus, care la copii şi edentaţi lipseşte, dar reapare

după punerea de proteze şi dispare iar o dată cu ele. Cu cât o dantură este mai neregulată,

mai rugoasă, mai fisurată, sau o proteză, cu atât favorizează mai usor o reţinere mecanică

de bacterii, şi un numar mai mare, căci le oferă un adapost din care periajul de întreţinere

a igienei le îndepărtează mai anevoie.

Tot la acest capitol mai trebuie amintit un alt fel de reţinere mecanică a

bacteriilor. Este cea datorată formelor filamentoase din cavitatea bucală: diferite genuri

de actinimices, leptotrichii, forme bacilare lungi, ramificate, de antracoizi (bacilul

mycoides, mezentericus, megatherium, etc.), micelii ale diverselor levuri. Acestea, pe

langă proprietăţile lor adezive, au tendiinţa să formeze ghemuri mai mici sau mai mari, cu

23

deosebire leptotrichiile, în ochiurile cărora îşi găsesc adăpost, ca într-o plasă, o mulţime

de alte bacterii şi protozoare, favorizându-le stagnarea. La randul lor, însăşi aceste forme

filamentare, sunt reţinute mecanic, cum am văzut, şi se găsesc mai mult într-o gură cu

dinţii implantaţi defectuos sau cu suprafeţe neregulate, cu adâncituri sau leziuni in ele.

3.2. DEZVOLTAREA MICROORGANISMELOR ÎN CAVITATEA

BUCALĂ

Comparativ cu alte cavităti naturale ale organismului, cavitatea bucală reprezintă

oarecum un loc ideal de dezvoltare pentru microorganisme. Aici ele găsesc temperatura

favorabilă, la punctul lor optimal, găsesc condiţiile de umiditate necesare, un mediu

alcalin care scaldă limba şi mucoasele. De asemenea, găsesc condiţii de aerobioză, sau

prezenţă de bioxid de carbon, cele care au nevoie. Microaerofilele găsesc în gură

numeroase locuri cu potenţial oxido-reductor scăzut, unde pot cantona bacteriile

obligatoriu anaerobe, de asemenea îşi găsesc în şanţul gingiilor şi în pliurile mucoaselor

condiţii unde Eh-ul este scăzut şi se pot multiplica, iar aportul de substanţe plastice şi

energetice le este permanent.

Substratul material al dezvoltării bacteriilor din cavitatea bucală poate fi furnizat

de gazdă însăşi prin diferitele lui componente constituţionale sau de secreţiile utile

acestora; poate fi furnizat de regimul alimentar al gazdei; poate fi furnizat de alte bacterii,

din alte specii.

Ca să se dezvolte, bacteriile au nevoie de o sursă de carbon, de una de azot, de

vitamine şi de ioni. Aceste alimente se găsesc din abundenţa chiar şi în cavităţile bucale

cu igiena cea mai riguroasă, cu atat mai mult în gurile cu igiena neglijată. Cutele

mucoasei, spaţiile interdentare, sanţul gingiilor sunt locuri în care întotdeauna rămân

suficiente resturi alimentare, cu mult mai mult decât au nevoie microorganismele bucale.

S-a constatat că şi pe dinţi lipsiţi de carii se pot pune în evidenţă resturi alimentare

infime.

Chiar dacă am face abstracţie de aceste resturi alimentare, bacteriilor le rămân

importante surse nutritive din cei 18 AMINOACIZI liberi prezenţi în saliva spontană,

24

alături de condroitin sulfat, acid hialuronic şi alte elemente provenite din celulele

epiteliale de descuamare a căror eliminare este permanentă.

Saliva are o compoziţie de proteine între 0.3 si 0.13% în schimb aerul eliminat

prin sanţul gingival este mult mai concentrat având un conţinut de aproximativ 20-30 de

ori mai mare în proteine pe care le devarsă în salivă, cu deosebire albuminele. Celulele de

descuamare sunt supuse acţiunii multiple de degradare enzimatică a bacteriilor prin

proteozele lor, lipozele şi hidrolazele glicozidice, cum este neurominidază, pregătind

acest substrat pentru a-1 utiliza, degradând polimerii. Rolul substratului nutritiv oferit de

gazdă bacteriilor a fost adeverit experimental prin cercetări independente, făcute de

Bowen(1970), de Egelberg (1967), de Littleton (1967), hrănind voluntari mai multe zile

cu sonda, dupa o riguroasă curaţire bucală şi constatând că totuşi numărul bacteriilor nu

scade din gură.

La acestea mai trebuie adăugat că în condiţiile obişnuite oricărei cavităţi bucale

diversele specii bacteriene se ajută adesea reciproc, în sensul că işi sustrag una alteia în

cadrul sistemului ecologic factorii de care au nevoie. Unele din ele nu şi-i pot sintetiza.

Importanţa gurii ca habitat bacterian o subliniază foarte expresiv cazul Treponemei

microdentium, care nu poate supravieţui decât în cavitatea bucală pentru că numai aici are

asigurat izobutiratul necesar şi poliaminele ce i se suplimentează difteroizii şi

fuzobacteriile şi un potenţial oxido-reducator controlat ce i-1 asigură de asemenea, alte

bacterii, fiind dependentă de ele (Socrovski, 1964).

La fel pentru Vibrio sputorum şi Veillonella alcalescens acidul formic şi acidul

lactic de care ele au nevoie şi-1 procură de la numeroase specii anaerobe şi aerobe, care

prin metabolismul lor eliberează aceşti acizi (Loesche Rogosa). Bacteriile aerobe

consumând oxigen pe ariile lor de dezvoltare, creează condiţii favorabile ulterior

bacteriilor anaerobe.

Spre exemplu, spirochetele, ca să-şi înceapă creşterea au nevoie în prima fază de

un Eh scăzut la aproximativ -18 mV pe care li-1 creează alte specii, dovadă abundenta lor

dezvoltare.

Testele de potenţiale oxido-reducatoare făcute în diferitele locuri din cavitatea

bucală de Eisenbrandt, Luro, Onisi şi Manganiellooy.

25

Se poate spune că flora bacteriană endogenă cel puţin al unor indivizi, se opune

într-o mare măsură implantării experimentale şi dezvoltării bacteriilor cariogene. Există

persoane cu o gură lipsită de carii sau cu foarte puţine carii, dar care după un tratament

mai îndelungat cu antibiotice, spre exemplu tetracicline sau alte antibiotice cu specific

lar, fac brusc un număr mare de carii ca urmare a distrugerii echilibrului dintre specii,

respectiv dispariţia unora dintre ele ce se opuneau implantării şi menţinerii în gură a

speciilor cariogene. Konig si Guggenheim au reprodus mecanismul pe animale de

experientă. Ei au luat o tulpină de streptococ mutans rezistent la eritromicină şi au

încercat fără success să-1 implanteze în cavitatea bucală a unui şobolan. Dar

administrându-1 animalului concomitent cu eritromicina, s-a reuşit implantarea şi

colonizarea lui aparând ulterior carii prin dereglarea şi reducerea masivă a unui total de

bacterii şi dispariţia speciilor oponente streptococilor cariogeni. Tratând cariile

şobolanului şi suprimând administrarea eritromicinei, din nou nu s-a mai putut implanta

streptococul în gură, pentru că redând eritromicina fenomenul să se reproducă. Se poate

trage din acest experiment concluzia practică a exploziilor leziunilor carioase la care se

poate aştepta un bolnav uneori după un tratament îndelungat cu antibiotice.

Dezvoltarea predominantă unor specii este favorizată uneori de dieta alimentara a

gazdei. Aceasta s-a demonstrat vel puţin în cazul streptococului mutans a cărui înmulţire

este condiţionată de prezenţa sucrozei, atât experimental pe animal, cât şi în încercările

de implantare la voluntari. Cercetările speciale au arătat că numărul plăcilor dentare este

direct proportional cu utilizarea mai frecventă a sucrozei în regimul alimentar şi invers

proporţional cu utilizarea glucozei.

Tot experimental s-a demonstrat că introducerea masivă în consum de sucroză la

un subiect care are deja plăci dentare schimbă atat densitatea populaţiei bacteriene căt şi

participarea diferitelor specii din plăci prin producerea excesivă de dextron extracelular,

după cum se schimbă şi proporţia din placă dintre azot şi hidrocarbonaţi (Carlson).

Această influenţă a regimului alimentar asupra înmulţirii deosebite a

streptococilor mutans se poate constata şi prin experimentul inversat.

Van Houtte a arătat că atunci când se reduce sau se stopează cantitatea de sucroză

din dieta, scade proporţional şi polizaharidul stocat în interiorul celulelor bacteriene. Mai

mult decat atât, Stoppelar şi colaboratorii (1970) au demonstrat o relaţie interspecifică

26

legată de regimul alimentar: introducerea unui regim lipsit de sucroză la o serie de

subiecţi duce la scăderea semnificativă a procentului streptococilor mutans ăn plăcile

dentare, crescând în schimb procentul streptococilor sanguis.

Dar nu numai cantitatea de sucroză în dieta unei persoane influentează

dezvoltarea şi felul speciilor bacteriene, ci şi proteinele. Hrănind şobolani cu un regim

foarte bogat în proteine, animalele devin purtătoarele unui număr mai mult decat dublu,

faţa de martori, de bacterii gram-pozitive şi bacili pleomorfi, acestora din urmă

atribuindu-li-se un rol determinant în formarea de tartru, ca dovadă că s-a putut induce

cu ajutorul lor formarea abundentă de tartru la specii de şobolan care fac greu această

complicaţie.

Se ştie că şi la copilul sugar, o dată cu introducerea unui regim mixt, i se schimbă

flora microbiană nu numai la nivelul cavităţii bucale, dar şi flora intestinală, bacilul coli

înlocuind treptat preponderenţa avută în timpul alimentaţiei naturale de lactobacilul

bifidus.

De asemenea, se ştie că şi la omul adult, o alimentaţie bogata în proteine

favorizează cu deosebire favorizarea unei flore proteolitice, în care predomină bacteriile

gram-negative, bacilare, pe când o alimentaţie bogată în hidraţi de carbon favorizează

dezvoltarea unei flore zaharolitice, cu predilecţie a speciilor gram-pozitive.

Egelberg a arătat că şi consistenţa dietei alimentare îşi are importanţa ei asupra

unei anumite flore, date confirmate de Carlson, Larson şi alţii. Atât la animale cât şi la

om, o dieta compusă din elemente moi favorizează un număr mai mare de plăci dentare şi

gingivite. Probabil că faptul se datorează adezivităţii mai mari a unor astfel de alimente şi

deci este marită posibilitatea retenţiei mecanice bacteriene şi aderarea de suprafeţe.

Laptele şi produsele lactate stagnează mai mult pe suprafaţa dinţilor şi între ei. La

unele persoane, consumul laptelui, neurmat de curăţirea cavitatăţii bucale, induce o

adevarată peliculă adezivă, ce cuprinde toţi dinţii şi se menţine aproape 60 de minute, ce

favorizează lipirea bacteriilor.

Dimpotrivă, un regim alimentar consistent are un rol de îndepărtare mecanică, de

dislocare a florei bacteriene, de curăţire a cavităţii bucale, cel puţin parţial. "Limba

încărcată" a bolnavilor cu boli febrile, ca urmare a alimentaţiei numai cu alimente lichide,

exprimă tocmai rolul pe care-1 au unele alimente dure în curăţirea ei mecanică. În orice

27

caz, alimentele moi favorizează într-o mai mare masură pătrunderea lor în şanţurile

gingivale, cu posibilităţi de retenţie şi înmulţire a florei, pe când o alimentaţie consistentă

limitează această retenţie, execută într-o anumită masură masaj asupra mucoasei

gingivale, activându-i circulaţia şi menţinând-o vitală.

Inflamaţiile gingivale însă au un efect asupra dezvoltării florei microbiene. În

inflamaţie creşte cantitatea exudatului la acest nivel şi o dată cu el şi unele elemente ce

pot servi ca stimulatori ai nutriţiei bacteriilor (aminoacizi, electroliţi, factori de creştere).

Ca dovadă că lucrurile se petrec aşa este faptul semnalat de Theilade şi

colaboratori, care au arătat că în gingivitele cronice plăcile dentare cresc în volum. Prin

urmare, nu numai plăcile dentare influenţează apariţia şi întreţinerea proceselor

parodontale, ci fenomenul este şi invers. Pungile parodontale întreţin condiţii deosebit de

favorabile în dezvoltarea bacteriilor anaerobe şi alte bacterii proteolitice.

Puroiul, sfacelarea ţesuturilor locale, este însăşi urmarea acţiunii bacteriilor. În

acelaşi timp, ele închid un cerc vicios deoarece produsele degradate de ele pe cale

fermentativă, acizii aminaţi, etc. - servesc la nutriţia şi dezvoltarea altor specii, după cum

a subliniat Loesche. Spre exemplu, Bacteroides melaninogenicus are neaparată nevoie în

dezvoltarea lui de hem, iar Treponema denticola are nevoie de α-α globuline; multe

substanţe aceste specii şi le procurş din sucul şanţului gingival, în condiţiile obişnuite de

dezvoltare a lor, iar în cazurile patologice şi le procură in plus din ţesuturi lezate (Evans,

Socrovski). Lactobacilli au nevoie de aminoacizi şi de vitamine din complexul B, în

schimb ei produc în exces, de care beneficiază alte specii, vitamina K. Levurile au nevoie

de inozitol pe care îl sustrag de la actinomicete, iar hemophilus influenzae de factori x şi

v pe care-i iau de la stafilococi şi micrococi. Brown a arătat că prin ţesuturile integre sau

lezate, sunt frecvent factori de creştere pentru bacterii cu rol în stimularea înmulţirii lor.

Lactobacillus arabinosus îşi procură acidul nicotinic de care are nevoie din dentina

dintelui ce îl parazitează, iar atunci când vitamina nu-i ajunge la suprafată în cantităţi

suficiente, bacteria invadează canaliculele dentinale.

28

3.3. REPARTIZAREA Ş1 NUMĂRUL BACTERIILOR DIN CAVITATEA

BUCALĂ

Microorganismele ce populează cavitatea bucală nu sunt în mod egal distribuite

nici ca spaţiu, nici ca timp. Unele specii au preferinţa de dezvoltare pe anumite arii.

Spunem că au "nişe" ecologice primare. De aici sunt apoi răspândite de salivă, de

mişcările limbii şi muşchilor obrajilor, în alte regiuni. Nişele ecologice în realitate

exprimă condiţiile optime de dezvoltare pentru specie, pe care le găsesc pe diferite

suprafeţe. Dar chiar şi acolo există o variţie de număr la mai multe determinari succesive.

Saliva în momentul secretării ei nu conţine bacterii, sau foarte puţine, dar se

încarcă repede cu ele, ajungând să conţină 10 microorganisme per ml prin dislocarea lor

de pe limbă, cât şi din detaşarea de pe mucoase. Concentraţia bacteriilor din salivă

fluctuează în decursul diferitelor ore ale zilei. Numărul cel mai mare se găseşte în

decursul masticaţiei, din cauza fluxului crescut al salivei care le mobilizează şi a

muşchilor obrajilor care le detaşează; de asemenea, un număr enorm de bacterii conţine

salivă dimineaţa la sculare, din cauza acumulării lor în decursul nopţii, când cantitatea

salivei este redusă (Lear 1965, Schneyer 1966).

Din punctul de vedere al raportării lor bacteriile din cavitatea bucală se împart în

bacterii viabile şi neviabile. Cele viabile sunt cele care pot fi uşor sau greu cultivabile pe

medii nutritive şi deci se poate face prin metoda diluţiilor o apreciere numerică a lor per

mililitru de salivă. Există o serie de specii bacteriene în gură ce se cultivă extrem de greu

pe medii, nu cresc sau nu se lasă întreţinute în subculturi. Acesta este cazul

fuzobacteriilor, al germenilor din grupul bacteroides, nocardia, actinomicetele şi al altora.

De aceea, ele apar rar în statistici, ceea ce nu înseamnă că au un număr sau o importanţă

mai scazută, dimpotrivă, unele din ele sunt predominante.

În salivă se găsesc în mod obişnuit peste 35 de specii bacteriene permanente

cunoscute şi recunoscute. Dintre bacteriile viabile din cavitatea bucală 80% sunt diferite

specii de streptococi, veillonelle şi difteromorhi anaerobi şi facultativ-anaerobi.

Streptococii şi veillonellele constituie majoritatea bacteriilor din salivă. Dar alături de ele

se mai găsesc stafilococi (cu deosebire specia epidermidis), leptotrichii, pneumococi,

corynebacterii, bacili gram-negativi, nocardii, micrococi, bacili gram-pozitivi, specii de

29

Rothia, Bacterionema, vibroni, spirili, spirochete, diferite specii de levuri. În plus, recent,

s-a demonstrat prezenţa in număr mare de hemofili, în special Hemophilus

influenzae şi H. parainfluenzae. Dintre speciile tranzitoare posibile amintim: stafilococul

aureu, streptococul betahemolitic, Escherichia coli, coliformi, mycobacterii, etc.

După modul de a respecta igiena bucală totalul bacteriilor ce pot fi pe dinţi este de

la câteva miligrame la un gram, sau mai multe grame. Numărul lor este de natura cifrelor

astronomice.

Ca grup, streptococii sunt cei mai numeroşi şi reprezintă 50% din bacteriile

viabile,1/4 din cele din placa dentară şi tot 1/4 din cele din şanţul gingival. Neisseriile se

găsesc în proporţie de 3-5%. Lactobacilli, stafilococii epidermidis, formele bacteriene

filamentoase (leptotrichii, actinomicete) într-o gură fără carii sau fără afecţiuni

parodontale se găsesc în cantităţi reduse, fiecare reprezentând cel mult 1% din totalul

bacteriilor viabile din salivă. Spirochetele (Treponemele şi boreliile), de asemenea 1%.

Dar toate aceste specii cresc într-un număr considerabil la indivizii cu carii mai multe şi

la cei cu parodontoze. Mycoplasmele au fost găsite însă aproape la fiecare individ, deşi

mereu prezente, dar nu permanente. Dintre speciile de levuri, candidele albicans sunt cele

mai frecvente, găsindu-se la 50% din persoanele adulte. Dupa sezon, vara şi mai ales

toamna, din cauza consumului de fructe, numărul şi varietatea speciilor de levuri cresc.

Protozoarele, de asemenea, se găsesc la majoritatea indivizilor, în număr foarte mic la cei

cu igiena bucală severă şi în număr foarte mare la cei cu igiena bucală neglijată. Numărul

lor creşte cu deosebire şi afecţiunile parodontale cronice. Hemofilul influenzei şi cel al

parainfluenzei, dar şi alte specii se găsesc circa 107 într-un ml salivă (Sims, 1970).

Escherichia coli este doar trecător prin cavitatea bucală, sub 1%, dar la copii poate atinge

şi cifra de 5% ocazional. Streptococii beta hemolitici se găsesc la fel numai ocazional, dar

există un număr mare de 12% purtători, cifra care ar varia după unii cercetatori pană la

16% şi chiar 30%. Bacteroides melaninogenicus constituie o medie de 4,5% din totalul de

10 probe luate din şanţul gingival, având limite între 0,23 - 19,8%. şi el creşte mult ca

număr în infecţiile parodontale.

Localizare. Streptococul salivarius şi veillonellele îşi au habitatul pe dosul limbii,

în criptele şi pe papilele ei. Colonizează limba la câteva zile dupa naştere. Celulele

epiteliale raclate de pe suprafaţa limbii conţin fiecare peste 100 de bacterii aderente pe

30

ele. Un loc atât de bogat în microorganisme este numai placa dentară şi abia în al treilea

rând vine suprafaţa dinţilor, în cazul lipsei de carii. Pe celulele raclate de pe obraji şi

palatul moale se gasesc doar 5 - 25 de bacterii aderente. Lactobacilii se găsesc cu

deosebire in carii şi în jurul lor pe mucoasa de contact, în fisurile ocluzale şi între pliurile

mucoaselor. Streptococul mutans are preferinţe de localizare pe suprafeţe dure (dinţi). De

aceea apare numai dupa erupţia primului dinte la câteva luni. Streptococul sanguis, la fel,

lipseşte din gură înaintea erupţiei dentare, apare totuşi înaintea streptococului mutans şi

dispare o dată cu ultimul dinte sau cu dantura. Dar ambii au o participare mare în placa

dentară. Streptococul mitis aderă numai de părţile moi, pe suprafaţa epitelială a obrajilor.

Şanţul gingival constituie un loc deosebit de propice pentru înmulţirea bacteriilor,

în special a acelora care au nevoie de condiţii de anaerobioză strictă, deoarece este

singura arie din cavitatea bucală unde Eh este sub 300 de milivolti. De aceea el

găzduieşte bacteriile anaerobe gramnegative (Bacteroides fragilis, melaninogenicus,

fiisobacteriile, vibrioni), pe cele grampozitive (difteromorfi, spirochete cu genurile

treponema şi borelia, actinomicete, enterococi, mycoplasma). Dovada dependenţei

acestor specii de condiţiile din şanţul gingival este faptul că majoritatea din ele apar în

cavitatea bucală numai şi îndată după erupţia dentară. Ultimele, în timp, apar spirochetele

si Bacteroides melaninogenicus, aproape spre pubertate.

La edentaţi ele lipsesc, cu deosebire Bacteroides melaninogenicus, spirochetele,

mycoplasmele, vibrionii, din cauza absenţei şanţului gingival.

3.4. MECANISME DE AUTOPROTECŢIE

ANTIBACTERIANĂ A CAVITĂŢII BUCALE

Din punctul de vedere al integrităţii ei morfologice şi funcţionale, cavitatea bucală

nu ramâne pasivă la ecosistemul bacterian instalat în interiorul ei. Este vorba de o serie de

mecanisme prin care se apară cel puţin parţial de unele microorganisme. Se face

abstracţie aici de relaţiile nefavorabile dezvoltării dintre diferite specii, care constau în

modificări de pH-uri antagonisme, antibioze.

Mecanismele de autoprotecţie sunt endogene şi ele includ constituenţi intrinseci,

care sunt secretaţi de salivă şi depind de gazdă. Nişte cercetştori au denumit acesti factori

31

inhibine, mutine, lizine, bacteriotoxine, zidine, -după criterii diferite, atribuindu-le cel

puţin unora o acţiune specifică, mai mult sau mai puţin confirmată ulterior. Intervenţia

fiecăruia dintre ei este mai mult sau mai puţin clarificată, dar acţiunea lor în ansamblu a

atras atenţia sub forma observaţiei ca unele persoane sunt complet lipsite de carii

(indemne de carii), şi în cavitatea bucală încercarea experimentală de implantare a unor

tulpini bacteriene incriminate direct şi indirect în etiologia cariei a ramas fără succes, ele

fiind repede eliminate. Deci există persoane cu o mare rezistenţă la acţiunea agenţilor

carioşi, după cum există alţii cu o rezistenţă moderată sau slabă, ceea ce ar explica

incidenţa diferită a afecţiunilor carioase. Alţi factori constituţionali şi mai ales hormonii

îşi au contribuţia lor la această rezistenţă. Este ştiut că persoanele ce nu au avut carii

niciodată pot face la un moment al vieţii lor brusc carii multiple, sau că femeile la vârsta

pubertăţii, sau la graviditate, sunt predispuse cu deosebire la carii numeroase.

Un prim factor de autoprotecţie este lizozimul. Aceasta este o enzimă

mucopolizaharidică, cu caracter de proteină bazică, introdus în organism o dată cu

anumite alimente: legume, ouă. Dar poate fi secretat şi de unele bacterii, în cantitate

mică. Se găseşte în diferite ţesuturi, leucocite, dar lipseşte din lichidul cefalorahidian, din

transpiraţie şi urina. Se elimină prin salivă, mucoasa bucală, fluidul şanţului gingival, prin

mucusul nazal şi lacrimi. Cantitatea lui creşte în inflamaţiile gingivale şi în afecţiunile

parodontale. Are acţiune asupra micrococilor, bacililor antracoizi, sarcinelor,

klebisellelor, a unor tulpini de stafilococi. Acestora le produce scindarea zaharurilor din

mucopeptidul constitutiv al peretelui bacterian dezorganizându-1 astfel şi transformând

celula în protoplast neviabil. Nu se epuizează în timpul activităţii sale, deci are valoare de

catalizator. În combinaţie cu anticorpii şi complementul accelerează liza bacteriilor

gramnegative. Ar mai avea şi o acţiune numai de inhibare a dezvoltării unor specii, fără

să le lizeze propriu-zis.

Un al doilea sistem de autoprotecţie a fost descris de Kerr, Wadeburn şi

colaboratori, sub numele de "sistem antibacterial lactoperoxidazo-thiocianat-H2O2". El

este un component normal de secreţie a glandei parotide şi submaxilare şi nu se găseşte în

serul sanguin. Acesta din urmă are chiar o acţiune depresivă a activităţii lui. Apare la

nou-nascut după primele zile de viaţa, şi îşi creşte nivelul în primii 10 ani, după care

stagnează. Ca să-şi desfăşoare acţiunea, are nevoie de doi factori complimentari: de ionul

32

de thiocianat §i de unul nedializabil cu caracter de peroxidază salivară. Se găseşte în

cantitate mare în gura persoanelor indemne de carii şi chiar la acestea el variază ca nivel

în funcţie de starea lor sanitară; la persoanele susceptibile la carii se găseşte foarte puţin,

sau deloc. Efectul lui este numai bacteriostatic, iar spectrul de acţiune este limitat la unii

lactobacili şi streptococi din grupa N.

Green descrie un alt component, care-i poartă numele, prezent în saliva

persoanelor indemne, care are efect antibacterian atât asupra lactobacililor

homofermentativi, cât şi asupra lactobacililor heterofermentativi, precum şi asupra

streptococului salivarius şi a streptococului mitis şi încă asupra unor specii cu structuri

antigenice comune acestora. Acţiunea începe la 4-6 ore de la contact şi el are valoare de

catalizator ca lizozimul, deoarece poate fi luat de pe bacteriile atacate şi îşi pastrează

activitatea.

Este foarte activ, suportând diluţii de până la 0,25 mgt per ml proteină totală

salivară. El este prezent în gammaglobuline şi precipită o dată cu ele, din acestea

ajungând în salivă. După proprietăţile lui flzice, chimice şi modul de acţiune trebuie

interpretat ca un anticorp natural, o izohemaglutinină. Cercetările făcute de autor l-au dus

la concluzia că la persoanele susceptibile la carii, comparativ cu cele indemne, există o

deficienţă fie de secreţie a glandei salivare a anticorpilor serici, fie una de transmisie din

glandă în salivă a lui, sub formă cantitativă sau calitativă, concluzie sugerată şi de alţi

cercetători.

Un al patrulea sistem de autoapărare este constituit de betazinele din serul

sanguin. Are un efect nespecific asupra bacilului subtilis şi a altor bacterii grampozitive

pe care le lizează încă după câteva minute de la contactul cu ele. Are drept cofactori ionii

de calciu şi bicarbonat, prin care se deosebeşte de sistemul lui Kerr §i Wedderburn

amintit, iar de anticorpul natural descris de Green se deosebeşte prin efectul lui foarte

rapid. Sursa lui ar fi plăcuţele sangiune.

În afara sistemelor de autoprotecţie amintite, saliva mai este îmbogăţită

incontinuu cu anticorpi sintetizaţi la nivelul local. Aceştia sunt de două feluri: IgA şi IgG.

Cei IgA predomină în salivă. Cei IgG predomină în lichidul şanţului gingival, unde sunt

produşi (Brandtzaeg). Dovada că formarea lor a fost indusă de bacteriile bucale şi nu de

altele, este că nu reacţionează imunologic decât cu acestea şi nu, spre exemplu, şi cu cele

33

intestinale (Sirisha). De aceea au şi o mare eficienţă ce se vede, pe de o parte, prin faptul,

ca numeroase bacterii prezente in mod natural în salivă au fost găsite având fixate pe

suprafaţa lor anticorpi IgA, pe de altă parte atât anticorpi IgA cât şi IgG au fost găsiţi în

număr mare fixaţi pe bacteriile depozitate pe dinţi (Brandtzaeg, Taubman). S-a

demonstrat că anticorpii IgA salivari au capacitatea inhibării aderenţei şi colonizării pe

suprafaţa mucoaselor a diferitelor specii de streptococi, deci cel puţin parţial ei asigură

protecţia împotriva acestora. Specificitatea lor mare se evidenţiază prin mai multe

aspecte. Unul constă în aceea că bacteriile puse în prealabil în contact cu ei (saliva

parotidiană) au o capacitate scazută sau nula de aderare când sunt reintroduse în gură.

Al doilea aspect arată că fixarea lor pe bacteriile aderente deja le face să fie foarte

uşor dislocate şi eliminate.

Al treilea aspect reiese din faptul că în acţiunea lor antibacteriană nu au nevoie

nici de fagocitoză nici de acţiunea complementului (Gibbons, Williams), ci simpla lor

fixare pe suprafaţa bacteriilor le schimbă acestora în mod hotărâtor caracterele de

aderenţă şi menţinere în gură. De asemenea pledează în acelaşi sens faptul că tirul lor

scade cu timpul, că să reapară, ceea ce arată fie că tulpina inductoare a suferit o mutaţie,

fie că ea a fost înlocuită cu alta, având o altă structură antigenică.

Intelegerea importanţei anticorpilor locali şi a marii lor specificităţi au condus pe

unii cercetători la ideea unui posibil vaccin anticarie dentară, deoarece s-a văzut că

anticorpii pot inhiba şi formarea de depozite aderente de streptococi mutans pe

suprafeţele solide, cel puţin în vitro (Evans, Mukasa, Olson).

Un rol de autoprotecţie o au şi glicoproteinele salivare, prin caracterul lor adeziv,

mucilaginos. Căci dacă în unele cazuri, cum am văzut, favorizează aderenţa şi

depozitarea bacteriilor pe suprafaţa dinţilor, este tot atât de adevărat că ele în unele cazuri

servesc la curăţirea cavităţii bucale de bacterii deoarece le fac aderente de ele, le

aglomerează şi sunt îndepartate prin deglutiţie. Cu atât mai mult, cu cât unele

glicoproteine au o specificitate de a lega, de a agiutina unele specii de bacterii, în primul

rând streptococii sanguis, deci acestea ar servi direct la detaşarea acestora de pe dinţi. Au

fost cercetări care au demonstrat o relaţie de înrudire a unor glicoproteine sau a unor

glicolipide cu substratul structural al grupelor sanguine umane şi în continuare au enunţat

posibilitatea ca şi aceste glicoproteine sau glicolipide salivare să aibă caractere de

34

fixatoare prin receptori similari a unor virusuri care dau fenomenul de hemaglutinare,

adică să le servească drept substrat adeziv, ca hematiile, şi astfel, să ducă la eliminarea

lor. Ar fi vorba de mixovirusuri şi paramixovirusuri, precum şi mycoplasmele (Ada,

Springer, Sobelavsky). Se pare că receptori similari ar exista pe suprafaţa celulelor

epiteliale din gură pentru streptococul sanguis deoarece după tratarea lor cu antiser

preparat cu grupele sanguine, celulele devin inapte de a fixa pe ele streptococul sanguis.

Glicoproteinele, scăldând acestea, le maschează receptorii pentru streptococ,acoperindu-i,

având afinitate pentru ei (Williams).

Un rol important protector la nivelul cavităţii bucale îl are şi procesul fagocitozei.

Au fost gasite leucocite intacte şi dezintegrate, de numeroşi cercetători, atăt în şanţul

gingival, cât şi pe epiteliul acestuia, ca şi în ţesuturile subiacente conjunctival. Aceste

fagocite în condiţii de sănatate ar servi la limitarea unei infecţii bucale în general şi în

special la extinderea unei gingivite.

De asemenea, în salivă se găsesc numeroase leucocite polimorfonucleare. Ele

ajung în ea prin mucoase şi în special prin mucoasa gingivală. Au un rol în fagocitoza de

la acest nivel, dovadă faptul că în inflamaţiile gingivale şi ale paradonţiului numărul lor

este crescut proporţional cu intensitatea proceselor patologice, iar după asanare, numărul

lor scade. Tot în acest sens pledează faptul că în astfel de procese în salivă se găsesc din

abundenţă enzime lizozomale deversate în timpul fagocitozei, ce se adaugă şi potentează

acţiunea lizozimului.

De asemenea în salivă difuzează atât prin glandele salivare, cât şi prin şanţul

gingival anticorpi din ser cu activitate specifică făţă de diferite bacterii din infecţia

generală a organismului. Ei trebuie diferenţiaţi ca origine, de cei produşi local, la nivelul

mucoasei bucale, mai ales în gingii şi glanda submaxilară care sunt IgA. Cei serici sunt

cu deosebire IgG şi ajung în mod pasiv în gură după ce au atins un anumit titru in ser, de

aceea în salivă ei intotdeauna ajută in procesul de fagocitare a bacteriilor bucale.

În plus, la nivelul cavităţii bucale se găsesc numeroşi bacteriofagi ce exercită rol

litic.

35

CAPITOLUL 4MATERIALE ŞI METODE

IDENTIFICAREA AGENTULUI ETIOLOGIC

4.1. CONSIDERAŢII GENERALE

Identificarea agentului etiologic este scopul final al examinării oricărui produs

patologic. În unele situaţii acest act poate fi realizat pe baza datelor de ordin morfologic

şi cultural prezentate în capitolele anterioare. În cele mai multe cazuri este nevoie de

completarea cu informaţii privind caracterele metabolice, de structură antigenică şi de

patogenitate ale germenului în cauză.

În investigarea proprietăţilor metabolice, accentul trebuie pus pe cele generale -

catalaza, oxidaza, modul de desfacere a glucozei (testul F/O) şi producerea de gaz. Numai

în situaţii în care identificarea nu poate fi realizată cu acest set de teste se va proceda la

determinări suplimentare, limitându-se însă la strictul necesar. Definirea caracterelor

antigenice; astfel, în unele situaţii, de exemplu în identificarea germenilor din grupurile:

Salmonella, Shigella, Vibrio (Holerae) procedeul este indispensabil. în alte cazuri,

determinarea structurii antigenice are o valoare mai redusă (meningococ, pneumococ,

Brucella, Bordetella, streptococ), în comparaţie cu proprietăţile morfologice, culturale şi

metabolice pe care le completează; uneori procedeul se foloseşte pentru precizarea

caracterelor de subspecie (serotip) nu întotdeauna necesară pentru orientarea terapeutică.

Cercetarea caracterelor antigenice se efectuează în mod predilect prin reacţia de

aglutinare pe lamă şi în tuburi, cu seruri imune, în unele cazuri (definirea grupului de

streptococ) se foloseşte reacţia de precipitare, de competenţă, în special a laboratoarelor

CSA şi a laboratorului de profil din institut.

Foarte rar se face apel la determinarea caracterelor de patogenitate prin inoculări

a animale (clostridii-toxigene, antrax) de fapt însăşi izolarea dintr-un produs a unui agent

36

etiologic conferă acestuia atributul de "patogen" indiferent de poziţia pe care o ocupă în

această ierarhie. Mai frecvent se utilizează cercetarea caracterelor de suspiciune de

patogenitate prin procedee "in vitro", de exemplu; coagulaza, toxigeneza prin metoda

difuziunii în gel, prezena hemolizei, etc.

Prezentăm în cele ce urmează criteriile minimale necesare identificării

principalelor specii sau genuri bacteriene de interes medical, precizând că toate

determinările trebuie executate pe culturi pure. Ordinea prezentării grupelor se bazează

pe aspectul morfologic; coci şi bacili gram-pozitivi; pentru fiecare grup se face o

apreciere privind semnificaţia determinării la substanţe antimicrobiene.

4.1.1.Metode moderne de control microbiologic

1. Sistemul automat de însămânţare în spirală

Metoda de însămânţare în spirală este un sistem automat de obţinere a numărului

de celule viabile . Prin folosirea unui tub capilar cu vârf, se poate distribui proba lichidă

în forma spiralată (spirala Arhimede) pe suprafaţa unei plăci cu agar preturnat (selectiv

sau neselectiv) având concentraţia gradientului descrescătoare dinspre centru înspre

exteriorul plăcii aflate în rotaţie ( Fig. 1 ). Se cunoaşte volumul lichidului depozitat în

orice segment al plăcii cu agar . După ce lichidul care conţine microorganisme este

distribuit, placa cu agar se incubează peste noapte la o temperatură adecvată dezvoltării

coloniilor. Coloniile apărute de-alungul traiectoriei spiralei pot fi numărate fie, manual,

fie electronic. Timpul pentru insămînţarea probei este de ordinul a câtorva secunde ,

comparativ cu metoda convenţională, în care este de ordinul minutelor.

De asemenea, utilizând un numărător cu laser, analistul poate obţine o

numărătoare corectă în câteva secunde, comparativ cu procedeul de numărare cu ochiul

liber a coloniilor care este greoi şi durează câteva minute .

Noile versiuni ale acestei metode automate de însămânţare în spirală sunt

cunoscute sub numele de Autoplater şi Whitly.

Cu aceste instrumente automate , analistul nu trebuie decît să introducă proba

lichidă şi instrumentul o va procesa complet şi automat incluzînd stilizarea unităţii pentru

o nouă probă.

37

Fig. 1 Moduri de distribuire a probei pentru maximă eficienţă

1.1. Sistemul avansat de însămânţare în spirală Autoplate

Sistemul automat de însămânţare în spirală a fost special conceput pentru a creşte

productivitatea şi pentru a îmbunătăţii rezultatele în cadrul laboratorului de

microbiologie.

Fig. 2 .Sistemul avansat de însămânţare în spirală Autoplate

38

1- Staţie inovativă de spălare pentru dezinfectare totală

2- Windows CE cu LCD şi ecran digital care garantează uşurinţa în utilizare

3- Tub unic capilar conceput pentru a permite umplerea din tuburile de

testare, cupele sau eprubetele pentru centrifugare.

4- Fascicul luminos de precizie care să asigure o operaţiune adecvată.

5- Compartiment pentru spălarea şi aruncarea recipientelor.

1.2. Avantajele sistemului

Acest aparat prezintă avantajele:

se elimină nevoia de diluţii repetate,

se economiseşte timp,

se economisesc bani,

are loc automatizarea laboratorului

Aparatul Autoplate® - este un microprocesor reglabil de însămânţare în spirală,

folosit pentru numărarea bacteriilor, testarea sensibilităţii antimicrobiene, precum şi

pentru testele de mutagenitate. Această tehnologie unică are drept rezultat reducerea a ¾

din materialele disponibile şi economisirea semnificativă de timp şi muncă. Autoplate

posedă o mai mare sensibilitate de detectare şi repetabilitate a probei decat în cazul

tehnicilor convenţionale de însămînţare.

Fig. 3 Prezentarea metodei de însămînţate în spirală în comparaţie cu

metoda de însămânţare standard

39

Autoplate - creşte productivitatea laboratorului, cu o performanţă intr-un

domeniu de 2 cfu / ml pâna la 1.000.000 cfu / ml, făra a fi necesară nici o diluţie,

reducând utilizarea elementelor consumabile de 3 / 4.

1.3. Aplicaţii

Metoda de însămânţare în spirală este utilizată într-un domeniu foarte larg ,

incluzând testări pentru bacterii patogene şi de alterare. În industria farmaceutică, aceasta

metodă de însămânţare în spirală este utilizată pentru testele de conservare(PET), şi

testele de sensibilitate efectuate de SGE (Spiral Gradient Endpoint). Agricultura şi

industriile de mediu utilizează această metodă pentru testarea aplicării biopesticidelor,

prevenirea îngheţurilor şi pentru studierea frunzelor.

2. Sistemul Petrifilm

Sistemul Petrifilm este un sistem ingenios cu nutrienţi rehidratabili

corespunzători, integraţi într-o serie de filme în unitatea respectivă. Unitatea este puţin

mai mare decât mărimea unei cărţi de credit. Pentru obţinerea unui număr de celule

viabile, stratul superior protector este ridicat şi se introduce 1 ml din proba lichidă în

centrul unitaţii, după care capacul este aşezat la loc. Pentru a se crea o formă rotundă se

aşează pe capac un şablon din plastic. După incubarea la temperatură şi timp adecvat,

mediul rehidratat va suporta dezvoltarea microorganismelor. Coloniile sunt numărate

direct în unitate. Acest sistem rezistă peste 1 an la temperaturi scăzute. Ceea ce atrage la

acest sistem este uşurinţa de utilizare, mărimea mică, durata mare de păstrare. Nu este

necesară prepararea agarului, şi rezultatele sunt uşor de citit.

Recent, companiile au introdus un numărator Petrifilm, la care analistul trebuie

doar să aşeze Petrifilmul cu coloniile în unitate, şi acesta va număra automat şi va

înregistra numărul de celule viabile pe calculator. Formatul manual al sistemului

Petrifilm a fost utilizat pentru multe sisteme , şi câştigă acordul internaţional, fiind o

metodă alternativă pentru numărarea celulelor viabile.

40

Rondelele Petrifilm conţin nutrienţi modificaţi bilă roşu violet, agenţi gelifianţi

solubili în apă rece şi indicatorul tetrazoliumn care facilitează deosebirea coloniilor.

Filmul de la partea superioară captează gazul produs în urma fermentării lactozei de

către coliformi. Timpul şi temperatura de incubare, precum şi interpretarea cutiilor Petri

variază în funcţie de metodă.

ISO defineşte coliformii în funcţie de abilitatea de a creşte în medii selective

utilizând metode specifice. Metoda ISO 4832, enumerând coliformii proveniţi din

metoda numărării de colonii, îi defineşte în funcţie de mărimea coloniei şi producerea

de acid pe mediu de VRB cu agar lactoză (VRBL). Pe rondelele CC Petrifilm , această

producere de acid de către coliformi este indicată de colonii roşii cu sau fără gaze (vezi

cercul 1). Metoda ISO 4831 enumerând coliformii după metoda celui mai probabil număr

(MPN), defineşte coliformii după abilitatea lor de a creşte şi de a produce gaz din lactoză

într-un mediu selectiv de bulion de carne. Pe aceste rondele Petrifilm CC coliformii sunt

indicaţi sub forma unor colonii roşii asociate cu gaz .

FDA (Administratia medicamentelor) /BAM definesc coliformii ca fiind

bastonaşe gram negative care produc acid şi gaz din lactoză în timpul fermentării

metabolice. Coloniile de coliformi care cresc pe rondelele Petrifilm CC , produc acid

determinând indicatorul de pH să închidă culoarea gelului. Gazul captat în jurul

coloniilor indică coliformii .

Utilizarea rondelei Petrifilm este indicată pentru detectarea coliformilor totali şi a

celor termorezistenţi ( fecali).

Plăcile Petrifilm pentru determinarea numărului de colonii aerobe

Plăcile Petrifilm pentru determinarea numărului de colonii aerobe sunt un

sistem bazat pe un mediu cultural gata preparat, ce conţine nutrienţi, un agent gelifiant,

solubil in apă rece, şi un indicator colorat ce determină vizibilitatea coloniilor.

41

Plăcile Petrifilm AC sunt concepute cu o grilă de fond care să uşureze

numărarea coloniilor.

Plăcile Petrifilm AC pot fi folosite în locul unui mediu cu nutrienţi

standard, precum plăcile de bulion-agar Luria, plăcile cu nutrient agar sau plăcile cu

soia-agar in multe aplicaţii:

Plăcile Petrifilm pot fi hidratate cu o cultură bacteriană, sau cu diluţia unei

culturi, pentru numărarea organismelor viabile prezente.

Plăcile de Petrifilm pot fi hidratate pentru început cu apă sau soluţie

tampon, iar apoi inoculate prin înţepare, striaţie, sau atingerea de suprafeţe.

Se pot adăuga antibiotice la fluidul de hidratare pentru selecţionarea

organismelor rezistente.

42

CAPITOLUL 5

TESTAREA SENSIBILITĂŢII GERMENILOR LA AGENŢI

ANTIMICROBIENI

Sensibilitatea germenilor la un agent antimicrobian se exprimă prin concentraţia

cea mai mică de medicament care în condiţii standardizate de lucru inhibă "in vitro"

creşterea bacteriană (CMI). Din motive de ordin clinic, adeseori este mai utilă

determinarea concentraţiei minime de medicament în stare - în aceleaşi condiţii standard -

să omoare germenul în cauză ( concentraţia minimă bactericidă - CMB).

Consecutiv administrării agenţilor antimicrobieni se obţine în organism, între

două administrări, concentraţii sau nivele variind de la maxim la minim ceea ce constituie

zona nivelelor critice. Felul relaţiei dintre concentraţia m in imă inhibantă sau

concentraţia minimă bactericidă, nivelul de antibiotic în sânge sau în focarul infecţios,

precum şi criteriul clinic, permit clasificarea germenilor în sensibili, intermediari şi

rezistenţi.

Un germen este sensibil atunci când este inhibat de acea concentraţie a agentului

antimicrobian care se poate obţine în organism consecutiv unei administrări uzuale. În

consecinţă o infecţie de formă clinică uşoară sau medie cu tulpină sensibilă va răspunde

favorabil terapiei cu medicamentul respectiv aplicat în doză adecvată localizării infecţiei.

Categoria de tulpini intermediare se referă la germenii pentru care răspunsul

favorabil la terapia infecţiei nu poate fi atins decât prin nivele obţinute după

administrarea de doze supramedii de medicament - date sub limita de toxicitate (în cazul

unei infecţii generalizate) sau în situaţia în care se obţine o concentrare fiziologică a

substanţei active chiar la locul infecţiei (urinare, biliare, etc.). Atributul de tulpină

rezistentă se referă la acel germen care necesită pentru inhibiţie o concentrare de

medicament superioară nivelului ce se poate obţine în organism, chiar după doze masive;

43

în consecinţă, infecţia nu va răspunde favorabil unei terapii cu medicamentul respectiv

indiferent de dozaj şi de localizare.

5.1 INDICAŢIILE ANTIBIOGRAMEI

Antibiograma este una din cele mai frecvente examinări fiind soilicitată pe

multiple considerente de ordin clinic, epidemiologie şi de cercetare. În scop clinic

antibiograma este necesară pentru alegerea sau realegerea agentului antimicrobian cel

mai indicat pentru o infecţie dată, provocată de germeni cu o creştere rapidă a căror

sensibilitate nu poate fi prevăzută. În mod deosebit este necesară efectuarea

antibiogramei în infecţii cu stafiiococi, enterococi, enterobacterii, bacili Gram-negativi

nefermentativi, cu condiţia ca rolul etiologic să fie precis stabilit iar infecţia respectivă să

necesite un tratament antimicrobian.

Antibiograma poate fi inutilă pentru unii germeni a căror sensibilitate la unul sau

mai multe medicamente este previzibilă cum ar fi streptococii pyogeni, Streptococcus

pmeumoniae, Neisseria meningitidis, Vibrio cholerae, etc. De subliniat totuşi că astfel de

situaţii devin tot mai rare o dată cu semnalarea de tulpini bacteriene din speciile

respective, rezistente la antibioticele de elecţie.

În scop epidemiologie antibiograma se practică în cadrul unui plan global de

supraveghere a evoluţiei spectrului de antibiotip, de urmărire a emergenţei de tulpini

rezistente la medicamentele de elecţie şi de rezervă şi pentru controlul difuziunii

tulpinilor multiplu rezistente.

În spitale îndeosebi, supravegherea antibiorezistenţei prin antibiograme de rutină

constituie o sursă de informare epidemiologică şi clinică foarte preţioasă. Astfel se poate

evidenţia la un moment dat prevalenţa unui anume antibiotip la o anumită specie

bacteriană, iar asocierea antibioticului cu alţi markeri biologici - spre exemplu serotip,

lizotip, etc. - face posibilă urmărirea eventualelor surse de infecţii intraspitaliceşti,

identificarea infecţiilor încrucişate, etc.

Informaţiile pe care le oferă prelucrarea rezultatelor antibiogramei de rutină sunt

utile şi pentru stabilirea unei politici raţionale în utilizarea antibioticelor în spitale

indicând la un moment dat necesitatea restricţiei şi/sau rotaţiei unor grupe de

44

medicamente implicate în emergenţa de tulpini rezistente. În scop ştiinţific antibiograma

se practică pentru cercetarea fenomenului de rezistenţă respectiv mecanismul de

rezistenţă, incidenţa rezistenţei plasmidice, relaţia între plasmide şi alţi determinanţi

genetici ai celulei bacteriene, etc.

În unele situaţii testarea sensibilităţii germenilor trebuie completată cu examinări

suplimentare cum ar fi determinarea concentraţiei minime bactericide, testarea activităţii

antimicrobiene a unor antibiotice în asociaţie, probleme care vor face obiectul unor

capitole separate. Testarea sensibilităţii germenilor la agenţii antimicrobieni se efectuează

după două metode de bază - fiecare cu variantele sale - respectiv metoda diluţiilor şi

metoda difuzimetrică.

5.2 ANTIBIOGRAMA PRIN METODA DIFUZIMETRICĂ

Cu toate avanatjele pe care le prezintă metoda diluţiilor, se recomandă pentru

laboratoarele clinice de spital testarea sensibilităţii prin metoda difuzimetrică, întrucât

este mai uşor de realizat, mai ieftină şi dacă se respectă cu stricteţe toate condiţiile de

lucru, poate asigura o reproductibilitate de aproximativ 90%.

Concordanţa rezultatelor între metoda difuzimetrică şi metoda diluţiilor este însă

mult diferită, cu variaţii mari în funcţie de germeni. În majoritatea ţarilor metoda Kirby-

Bauer standardizată şi reevaluată periodic de experţi OMS a fost acceptată ca procedeu

standard. Redăm mai jos această metodă adaptată unor condiţii de lucru din ţara noastră,

respectiv folosirea substanţelor antimicrobiene condiţionate sub formă de

microcomprimate în loc de rondele de hârtie de filtra. Pentru laboratoarele mici de spital,

rămâne valabilă posibilitatea utilizării metodei comparative Stokes-Balş care poate

furniza rezultate mulţumitoare chiar dacă ingredientele nu sunt de o calitate perfect

constantă. Deşi este mai laborioasă, metoda este mai ieftină şi mai precisă.

Prinicipiul metodei

Consecutiv depunerii de microcomprimate (discuri) cu antibiotice pe suprafaţa

unui mediu solid însămânţat cu cultură bacteriană au loc - în ordine sucesivă -

următoarele procese fîzico-biologice.

45

În primul rând, microcomprimatul sau discul absoarbe apa din mediu necesară

dizolvării substanţelor antimicrobiene active care ajunse în soluţie vor difuza în mediu

conform legilor fizice ce condiţionează difuziunea moleculeor în gelul de agar prezentând

o scădere constantă a gradientului de concentraţie de la marginea discului către periferie.

Pe măsură ce agentul antimicrobian difuzează, începe - după faza de lag -, faza de

creştere bacteriană logaritmică. După un anumit timp de incubaţie - peruioadă critică - se

vor contura două zone distincte: una în care creşterea bacterian ă este inhibată de

concentraţii suficiente de substanţă antimicrobiană şi o zonă de creştere în care

concentraţia de antibiotic este absentă sau prea mică pentru a inhiba creşterea.

Poziţia zonei de inhibiţie pentru cei mai mulţi germeni şi pentru cele mai multe

antiobiotice este determinată după primele ore de incubare şi include faza de lag şi timpul

necesar pentru 2-3 generaţii; din acest motiv cu tehnica difuzimetrică nu se pot testa decât

germenii care, în condiţii standard au o dezvoltare rapidă şi constantă. Cu cât diametrul

zonei de inhibiţie este mai mare, cu atât germenul este mai sensibil adică cantitatea de

antibiotic necesară inhibiţiei germenului - concentraţia minimă inhibantă (CMI) - este

mai mică şi invers.

Mărimea zonei de inhibiţie este evident condiţionată şi de rata de difuziune în

gelul de agar, variabilă de la un antibiotic la altul, ceea ce face ca zonele de inhibiţie

obţinute să fie proprii fiecărui agent antimicrobian. Există deci pentru un anumit agent

antimicrobian o relaţie inversă între diametrul zonei de inhibiţie — apreciată difuzimetric

- şi cantitatea cea mai mică de antibiotic ce produce inhibiţia germenului - CMI -

determinată prin metoda diluţiilor. Această corelaţie se stabileşte cantitativ, experimental,

efectuând 100-150 testări pentru fiecare antibiotic cu tulpini microbiene variate atât prin

metoda diluţiilor cât şi prin metoda difuzimetrică.

Rezultatele obţinute se exprimă grafic notând pe ordonată concentraţia de

antibiotic în mcg/ml în scară logaritmică şi abscisă diametrul zonelor de inhibiţie în mm

în scară aritmetică. Cunoscând, pentru un anume germen, diametrul zonei de inhibiţie,

faţă de un antibiotic se poate obţine uşor CMI prin proiectarea pe ordonată a punctului de

pe curba de concordanţă situat la locul de întâlnire cu verticala ridicată de pe abscisa din

dreptul valorii respective a diametrului zonei de inhibiţie. Linia trasată reprezintă curba

46

de regresie, reflectând media valorilor celor mai apropiate de deasupra şi de desubtul

liniei.

O dată aceste relaţii precizate trebuiesc comparate valorile concentraţiilor minime

inhibante cu nivelele de antibiotic ce se pot obţine în organism la nivelul focarului

infecţios de multiplicare bacteriană; prin această determinare este posibil a se stabili

valori critice ce definesc un germen sensibil şi rezistent. Dacă CMI este inferioară

nivelelor de antibiotice realizabile în organism printr-o terapie uzuală, germenul este

sensibil şi terapia are şanse de succes. Dacă CMI este sueperioară nivelelor ce se pot

obţine în organism - chiar prin supradozare - germenul este rezistent terapia constituind

un insucces.

Atributul de tulpină intermediară se acordă situaţiilor în care germenul poate fi

inhibat în doze masive accesibile sau este sensibil prin concentrarea antibioticelor în

produsul respectiv - bilă, urină, materii fecale, etc. În urma unui stadiu colaborativ între

laborator şi clinică s-a putut formula pentru tehinica Kirby-Bauer, care sunt diasmetrele

(şi implicit nivelele) critice care permit clasificarea germenilor studiaţi în "sensibili",

"rezistenţi" şi "intermediari" în cazul unor infecţii de gravitate medie şi folosind

antibioticele în doze admisibile.

Diametrele critice au o valoare orientativă statistic valabilă, dar nu reprezintă

criterii absolute universal acceptabile în clinică; în plus, orice abatere de la respectarea cu

extremă scrupulozitate a indicaţiilor date pentru tehnica Kirby-Bauer, vor compromite

rezultatele.

5.3 STANDARDIZAREA CONDIŢIILOR TEHNICE ŞI A REACTIVILOR

DE LUCRU

Fiecare din componentele ce concură la efectuarea antibiogramei pot influenţa

diametrul zonei de inhibiţie şi deci criteriile de interpretare. Astfel un mediu cu o

concentraţie mai mare de geloză va condiţiona zonă de inhibiţie mai reduse şi invers, un

inocul prea bogat va determina un siametru de inhibiţie mai mic şi invers. În consecinţă,

condiţiile tehnice referitoare la mediul de cultură ( compoziţie, pH), inocul, felul

discurilor, modul de incubare, de citire, trebuie precis standardizate.

47

Mediul de cultură

Mediul de cutlură recomandat este geloza Mueller-Hinton (M-H) pe motivul că

dintre mediile gelozate existente răspunde cel mai bine următoarele condiţii:

Asigură o dezvoltare bună a majorităţii germenilor patogeni cu creşterea rapidă;

Nu exercită anatgonism faţă de agenţi animicrobieni inclusiv sulfamide şi

trimetoprim în condiţiile unor concentraţii adecvate de ioni bivalenţi (Ca++ şi Mg+

+);

Este izotonic pentru sângele care trebuie adăugat în vederea asigurării dezvoltării

unor gemeni cu necesităţi de creştere deosebite;

Are o compoziţie relativ definită şi asigură performanţe reproductibile de la lot la

lot;

Mediul Mueller-Hinton a furnizat cele mai multe observaţii până acum în acţiunea

de standardizare a antibiogramei.

Folosirea unui alt mediu în locul gelozei M-H nu este recomandată. În lipsa

oricărei alte alternative, utilizarea gelozei nutritive este condiţionată de suplimentarea cu

5-8% sânge lacat de cal ; rezultatele vor fi valorificate numai în cazul în care controlul de

calitate efectuat pe acelaşi mediu cu tulpinile de referinţă corespunde criteriilor din

tabelul 12V şi 12VI. Mediul de cultură trebuie să-ndeplinească unele caracteristici

tehnice şi anume:

Să aibă compoziţia standard şi o consistenţă corespunzătoare cu cea dată de agarul

pulbere în concentraţie de 1,5-1,7%;

PH-ul mediului M-H trebuie să fie cuprins între 7,2-7,4; este indicat ca pH-ul să

fie testat înainte de turnare în plăci (50° C) sau mai bine după gelificare în plăci,

în această situaţie determinarea pH-ului se face în funcţie de posibilităţile

laboratorului, fie macerând o mică cantitate de geloză, fie lăsând să se solidifice o

mică cantitate de agar în jurul unui electrod de suprafaţă;

Grosimea stratului de geloză turnată în plăci cu fundul perfect plan trebuie să fie

de 4mm; în acest scop se recomandă plăcile din material plastic. Pentru realizarea

acestui strat sunt necesare aproximativ 25ml mediu pentru o placă de 10 cm

diametru şi50 ml mediu pentru o placă cu diametru de 15cm.

48

Geloza M-H se foloseşte ca atare pentru cultivarea majorităţii speciilor bacteriene,

cu următoarele excepţii:

Pentru testarea sensibilităţii Streptococilor grup A, B, C, D şi viridans,

Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, se suplimentează cu sânge de

oaie, de cal sau altă specie (sânge lipsit de activitate antimicrobiană);

Pentru testarea chmiosensibilităţii Haemopliylus influenzae este necesară

prepararea unei geloze M-H şocolat cu adaos de autolizat proaspăt de drojdie sau

de preferinţă factor X şi V în stare pură. Pentru Neisseria gonorrheae testarea se

va face pe geloză M-H sau geloză specială pentru acest scop suplimentată cu

sânge şi soluţie de vitamine, spre exemplu, izovitalex;

În cazul notării unei rezistenţe la cotrimoxazol este indicată retestarea pe mediul

M-H cu sănge lacat de cal.

Cu toate avantajele oferite mediului M-H nu constituie formula optimă, în special

din cauza concentraţiei variate de cationi bivalenţi ce pot influenţa diametrul zonelor de

inhibiţie pentru amino-glicozide, antibiotice polipeptidice, şi tetraciclină. Standardizarea

unui mediu definit chimic este însă un deziderat greu realizabil. Ca mediu lichid pentru

prepararea inoculului este indicat bulionul M-H sau în lipsa acestuia bulion cord-creer.

Germenul de testat

Este absolut necesar ca agentul etiologic să fie izolat în cultură pură; este total

contraindicată efectuarea antibiogramei din floră bacteriană mixtă dezvoltată pe medii

solide sau lichide. De asemenea antibiograma este inutilă sau constituie chiar o gravă

sursă de eroare clinică dacă germenul de cercetat nu este confirmat ca agentul etiologic

cert al infecţiei ce trebuie tratată.

În scop clinic efectuarea antibiogramei este indicată numai pentru acele specii

bacteriene a căror CMI nu este o constantă dinainte previzibilă. Din această categorie de

germeni se pot testa prin antibiograma difuzimetrică numai bacteriile cu dezvoltare

rapidă şi uniformă şi îndeosebi acelea care au tendiinţa de a câştiga rapid rezistenţă fată

de medicaementele de uz clinic.

Antibiograma de rutină pentru Streptococcus pyogenes, Streptococcus

pneumoniae, Neisseria meningitidis şi Neisseria gonorrheae este practic inutilă,

exceptând unele situaţii când:

49

Se înregistrează un eşec terapeutic în cazul utilizării antibioticului de elecţie cum

ar fi arrele tzlpini de Streptococcus pnezumoniae, Neisseria gonorrheae devenite

rezistente la Betalactamine;

Bolnavul este sensibilizat faţă de antibioticul de elecţie;

Nu se pot testa prin metoda difuzimetrică germeni cu dezvoltare lentă, spre

exemplu Nochardia, Actinomyces, etc.

Asigurarea unei dezvoltări rapide pentru germeni tip Haemophylus şi Neisseria se

face prin suplimentarea mediului cu diferiţi factori aşa cum s-a specificat anterior.

Constituie o eroare efectuarea antibiogramei direct din produs; fac excepţie de la această

regulă numai cazurile urgente în care produsul respectiv conţine un singur germen şi în

cantitate suficientă pentru un inocul adecvat.

În această situaţie se pot găsi unele lichide cefalo-rahidiene, bulionul de

hemocultură, lichidul pleural şi chiar urini, dacă au fost corect recoltate, transportate şi

examinate în timp util. Rezultatul obţinut este considerat ca provizoriu urmând a se

efectua antibiograma din cultura ca atare. Prezintă o contraindicaţie absolută efectuarea

antibiogramei din produse pluricontaminate (exudat faringian, spută, materii fecale,

secreţie vaginală). Antibiograma trebuie efectuată imediat după izolare chiar dacă

germenul este în curs de identificare; testarea germenilor sălbatici după stocarea

îndelungată este total contraindicată dată fiind posibilitatea segregării determinanţilor de

rezistenţă.

Inoculul

Este absolut necesar ca inoculul să fie reprezentativ, adică să cuprindă toate

categoriile populaţiei microbiene uneori heterogenă din punct de vedere al rezistenţei. În

acest scop pentru prepararea inoculului se va pleca în mod obligatoriu de la 4-6 colonii

identice dezvoltate pe un mediu neselectiv (sau din cultura de bulion). Mărimea

inoculului trebuie să fie riguros standardizată. Aceasta se realizează pe bază

nefelometrică şi trebuie să corespundă opacităţii din tubul cu sulfat de bariu obţinut

printr-un amestec de BaCl2 cu SO4H2 după tehnica menţionată; aceasta corespunde la un

conţinut de aproximativ 5x107-108 germeni/ml (Enterobacteriaceae şi Stafilococi) şi

aproximativ 108-5x 108germeni/ml pentru Pseudomonas aeruginosa.

50

Prepararea inoculului din cultura de testat se efectuează după una din modalităţile

mai jos notate:

Se suspendă 4-6 colonii separate, identice, dezvoltate pe mediu neselectiv din

culturi 16-20 h în mediu lichid sau în soluţie salină pH 7,2 şi se ajustează la

turbiditate standard;

Se repică 4-6 colonii în 5ml bulion nr.1 (sau bulion M-H), se incubează 4-8h la

37° şi se ajustează la nevoie la turbiditate standard.

Însămânţarea inoculului pe plăci se va efectua în cel mult 15 min. de la data

preparării.

Depunerea inoculului se poate face după următoarele modalităţi:

Cu ajutorul unui tampon de vată netoxic şi steril care se îmbibă cu suspensie

bacteriană; se elimină cu grijă excesul prin presarea şi rotarea completă de mai

multe ori a tamponului pe peretele tubului. Se şterge tamponul pe suprafaţa

mediului în trei direcţii până la acoperirea uniformă a întregii suprafeţe, efectuând

în final un striu marginal circular. Presupunând că conţinutul unui tampon

reprezintă aproximativ 1/10 ml rezultă că pe suprafaţa plăcii s-au depus 5-106 -107

celule bacteriene.

Prin inundarea plăcii cu 3-5 ml inocul îndepărtând excesul cu o pipetă Pasteur;

Prin depunerea a 0,1 ml inocul în 3-4 picături şi întindere cu tamponul uscat.

Plăcile îsămânţate - indiferent de procedeul folosit - se lasă maximum 5- 10 min.

la temperatura camerei pentru uscare până la depunerea microcomprimatelor. Dacă

inoculul şi însămânţarea plăcilor s-au efectuat corect se obţine o cultură bacteriană

uniform confluentă sau semiconfluentă.

Substanţe antimicrobiene

Substanţele antimicrobiene pentru antibiogramă sunt condiţionate în ţara

noastră sub forma de microcomprimate (substanţa activă este incorporată în poliezilenă

cu un adaos de Na2S04 şi amestecul este supus comprimării directe). Fiecare

microcomprimat are un diametru de 6 mm şi are notat pe o faţă simbolul respectiv.

Pentru medicamentele de uz curent faţă de care nu există microcomprimate

corespunzătoare se pot folosi - în condiţiile menţionate la capitolul Control de Calitate -

discuri preparate de alte case farmaceutice sau discuri preparate de laborator.

51

Conservarea microcomprimatelor se face prin menţinerea la adăpost de căldură, lumină şi

umiditate. Experienţa confirmă că microcomprimatele B lactaminice (peniciline şi

cefalosporine) îşi pierd eficacitatea înainte de limită dacă nu se păstrează la +4°C.

Flacoanele cu microromprimate o dată desfăcute ca şi antibioticele condiţionate

sub formă de discuri impregnate vor fi păstrate numai la 4°C. Înainte de utilizare se

menţin la temperatura camerei timp de 30-60min. pentru echilibrarea termică.

Microcomprimatele şi discurile cu valabilitate depăşită sau acelea care dau zone de

inhibiţie pentru germeni de referinţă în afara valorilor standard, nu pot fi utilizate.

Este indicat a se folosi un singur preparat reprezentativ pentru un grzup de agenţi

antimicrobieni strâns înrudiţi ca activitate "in vitro" şi anume:

Benzil penicilina sau penicilina G este utilizată pentru testarea sensibilităţii faţă

de toate penicilinele sensibile la penicilinază (fenoximetilpenicilin sau penicilina

V şi feneticilină );

Oxacilina, reprezintă de fapt toate penicilinele rezistente la penicilinază

(meticilina, nafcilina, cloxacilina şi flucloxacilina); de menţionat că rezistenţa

stafilococului la oxacilină şi la medicamentele înrudite este de tip heterogen:

astfel majoritatea celulelor pot fi perfect sensibile producând o zonă mare de

inhibiţie în timp ce altele pot apărea sub formă de colonii rezistente minuscule şi

discrete în interiorul zonei de inhibiţie; acest tip de rezistenţă este potenţat prin

incubare prelungită la 35°C.

Ampicilina este utilizată pentru testarea faţă de penicilinele cu spectru larg active

pe germeni Gram-negativi cum ar fi: amoxicilina, pivampicilina, talampicilina,

etc.; spectrul de acţiune nu este însă superpozabil cu cel al carbenicilinei care

trebuie să reprezinte a doua penicilină activă pe Gram-negativ; de menţionat

proliferarea deosebită în ultimul timp al acestor tipuri de B lactamine;

Cefalotinul reprezintă toate cefalosporinele comercializate de prima generaţie

(cefalexin, cefrodin, cefaloridin, cefozolin şi cefapirin); consecutiv proliferării

cefalotinelor din generaţia a II-a şi a III-a este indicat a se folosi câte un disc

pentru unele din aceste medicamente cum ar fi cefoxidin, cefamandol, cefuroxin,

moxalactan, cefotoxin şi cefsulodin şi ureid penicilinele;

52

Între aminoglicozide, kanamicina poate reprezenta şi neomocina şi

paromomicina; restul aminoglicozidclor cum ar fi streptomicina, gentamicina,

tobramicina, sisomicina şi amikacina se include în funcţie de indicaţiile clinice.

Discurile de cloramfenicol pot fi aplicate şi înlocui tiamfenicolului;

Tetraciclină este singurul agent pentru oxitetraciclină, clortetraciclină şi alţi

membrii ai acestui grup (metaciclina, dimetil-clor-tetraciclina, etc.). Unii germeni

Gram-pozitivi şi Gram-negativi pot arăta o comportare deosebită faţă de

doxiciclină (vibramicină) şi minociclină care ar trebui să completeze grupa

tetraciclinelor;

Eritromicina poate suplini unele din antibioticele din grupul macrolidelor ca

oleandomicina, spiramicina şi virginomicina; nu poate înlocui însă lincocina şi

clindamicina care au spectru mai larg;

Colistinul şi polimixina B sunt medicamente polipeptidice strâns înrudite şi este

suficient a folosi unul din ele;

Sulfamidele pot fi reprezentate de un singur preparat - sulfizosazol sau

sulfafurazol;

Dintre nitrofurani se va folosi nitrofurantoin pentru germenii izolaţi din urină şi

alte produse şi furazolidonul pentru germenii din conţinutul intestinal;

Acidul nalidixic reprezintă grupul quinolonelor de primă generaţie;

Cotrimoxazolul, combinaţie din trimetoprim şi sulafametoxazol, este singurul disc

conţinând combinaţii de medicamente; având o acţiune net diferită de

medicamentele componente, este considerat ca un preparat unic.

Concentraţia în substanţă activă a microcomprimatelor şi discurilor trebuie să fie

astfel aleasă încât atunci când sunt utilizate după tehnica standard să ducă la obţinerea de

zone de inhibiţie nete faţă de germeni pentru care concentraţiile minime inhibante sunt

cuprinse între limitele nivelelor maxim şi minim ce se pot obţine în sânge şi ţesuturi cu o

terapie uzuală şi invers, să nu arate nici o zonă de inhibiţie faţă de germeni a căror

concentraţie minimă inhibantă este superioară nivelelor ce se pot obţine în organism.

Selecţionarea setului de microcomprimate pentru antibiogramă se face în funcţie

de obiectivul sau scopul urmărit care poate fi de ordin strict clinico-terapeutic, de ordin

taxonomic, epidemiologie sau în scop de cercetare. Pentru a face faţă oricărui criteriu din

53

cele menţionate, se sugerează întocmirea a 2 (eventual a 3) seturi mari din combinarea

truselor de microcomprimate distribuite ( şi care nu corespund cerinţelor reale), respectiv

unul pentru Gram- pozitiv şi altul pentru Gram-negativ precum şi unul pentru infecţii

urinare; din acestea se vor selecţiona microcomprimatele în funcţie de obiectivul urmărit

(clinic, epidemiologie, de cercetare).

Dintre microcomprimateîe existente în diferite truse unele pot fi excluse cum ar fi

pristinamicina, novobiocina, foarte rar utilizate. Mai pot fi eliminate microcomprimatele

cu concentraţia inadecvată în substanţă activă, cum ar fi microfurantoin- doza mică (10

mcg), sulfafurazol - doza mică (30mcg), colistin- doza mare ( 300 mcg) şi care nu

prezintă o utilitate practică. În schimb trebuie introduse microcomprimate sau rondele

corespunzătoare medicamentelor utilizate în clinică ca: gentamicina, cotrimoxazol,

cefalotin, carbenicilina, etc.

Pe baza acestor criterii, propunem următoarele două seturi pentru Gram-pozitiv

şi Gram-negativ. Tabel

13.1

GRAM-POZITIVI GRAM-NEGATIVI

Penicilina G (benzil penicilina) Ampicilina

Meticilina (oxacilina) Carbenicilina

Ampicilina Cefalotin

Cefalotin Streptomicina

Streptomicina Kanamicina (neomicină)

Kanamicina (neomicină) Gentamicină

Gentamicină Cloramfenicol

Cloramfenicol Tetraciclină

Tetraciclină Polimixina (colictin)

Eritromicina Nitrofurantoin 200 mcg

Lincomicina Furazolidon

Rifampicină Eritromicina

Cotrimoxazol Acid nalidixic 40 mcg

Sulfafurazol 300 mcg

Cotrimoxazol 1000 mcg

54

Pentru laboratoarele de spital şi în scop strict terapeutic se vor folosi din seturile

menţionate mimai microcomprimatele strict necesare, în funcţie de felul germenilor şi

localizarea infecţiei.

Tabel 13.2

PENTRU COCI GRAM POZITIVI

(STAFILOCOCI)

PENTRU COCI GRAM NEGATIVI

(ENTEROCOCI)

Penicilina G Penicilina G

Meticilina (oxacilina) Ampicilina

Cefalotin Cefalotin

Kanamicina (a) Gentamicina (x)

Gentamicina (a) Cloramfenicol

Cloramfenicol (a) Tetraciclină

Tetraciclină (a) Eritromicina

Eritromicina

Lincomicina

a = numai ca medicament de rezervă rar aplicat x = numai în asociaţie cu B lactamine Tabel 13.3

PENTRU BACILI GRAM-NEGATIVI (INFECŢII

SISTEMICE)

PENTRU BACILI GRAM-NEGATIVI

(INFECŢII URINARE)

Ampicilina Ampicilnă (a)

Carbenicilina (x) Carbenicilină (x)

Cefalotin (a) Cefalotin (a)

Kanamicină (a) Kanamicină (a)

Gentamicină Gentamicină

Cloramfenicol Tetraciclină (a)

Tetraciclină Colistin (polimixin) (a)

Colistin (a) Acid nalidixic 300 mcg

Cotrimoxazol Nitrofurantoin

Sulfafurazol

Cotrimoxazol

Tabel 13.4

PENTRU BACILI GRAM-NEGATIVI

( INFECŢII DIGESTIVE )

PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Ampicilină (a) Carbenicilină

Kanamicină ( neomicină) Gentamicină

Cloramfenicol Polimixină ( colistin)

55

Tetraciclină

Colistin

Furazolidon

Cotrimoxazol

Tabel 13.5

ALTE SPECII DE SPEUDOMONAS ŞI GRAM NEGATIVI NEFERMENTATIVI

Ampicilină Cloramfenicol

Streptomicină Tetraciclină

Kanamicină Sulfaforazol

Cotrimoxazol

Faţă de unii germeni, testarea va putea fi limitată la numai 2-3 preparate incluzând

medicamentul de elecţie şi 1-2 medicamente de rezervă, spre exemplu penicilină,

tetraciclină, şi eritromicină pentru Streptococcus pneumoniae. Streptococi grup B,

Streptococcus pyogenes sau penicilină şi sulfafurazol pentru Neisseria maningitidis.

Depunerea microcomprimatelor se face după uscarea plăcilor şi nu mai târziu de

15 min. de la însămânţare. Aşezarea spaţială a microcomprimatelor este la libera alegere

a fiecărui laborator dar este recomandabilă o dispoziţie în funcţie de grupele de agenţi

antimicrobieni, spre exemplu:

B lactamine (peniciline şi cefalosporine);

Aminoglicozide;

Antibiotice cu spectru larg (cloramfenicol, tetraciclină);

Macrolide şi substanţe înrudite;

Polipeptide;

Substanţe chimioterapice.

În acest fel, spectrul de rezistenţă se poate aprecia şi reţine mai uşor. Înainte de

depunerea inoculului se scriu pe fundul plăcii simbolul sau numărul de ordine al

microcomprimatului respectiv. Depunerea microcomprimatelor se face cu pensa - de

preferat pensă oftalmologică tip Iris - presând uşor fiecare comprimat pentru a ajunge pe

toată suprafaţa sa în contact cu cultura. Se va respecta o distanţă 15 mm de la marginea

plăcii şi aproximativ 24 mm între comprimate. Se poate deasemenea folosi un dispozitiv

mecanic sau semiautomat de aşezare simultană a mai multor discuri.

56

Pe o placă de 150 mm diametru, se pot depune aproximativ 12 microcomprimate

iar pe una de 100 mm diametru 8 microcomprimate. După depunerea

microcomprimatelor se realizează o periadă de predifuziune nu mai mare de 15 min.

Incubarea

Se face la 37°C (de preferinţă la 35°C) în poziţie răsturnată în condiţii de

aerobioză. Incubarea în atmosferă de CO2: nu este recomandată din cauza modificărilor

de pH pe care le cauzează. Durata incubării este de 16-18 h; numai în cazuri de extremă

urgenţă se va putea face o citire cu caracter preliminar după 4-8h cu obligaţia de a

reincuba plăcile şi de a reefectua o citire definitivă la sfârşitul perioadei de incubare.

Citirea, exprimarea şi interpretarea rezultatelor

Se supun citirii numai plăcile care prezintă o cultură corespunzătoare din punct de

vedere al purităţii şi densităţii. Citirea se efectuează cu ochiul liber, măsurând diametrul

zonei de inhibiţie în mm (inclusiv diametrul microcomprimatului) de 2-3 ori în diferite

direcţii cu ajutorul unei rigle sau unui abac. Pe mediile fară sânge măsurarea diametrului

se poate efectua direct pe fundul plăcii în lumina reflectată sau transmisă, dacă s-a

adăugat sânge, zona de inhibiţie se determină prin măsurare la suprafaţă în lumina

reflectată după îndepărtarea capacului plăcii Petri.

Se apreciază inhibiţia completă a creşterii aşa cum se observă cu ochiul liber cu

următoarele precizări:

Nu se iau în considerare:

Cultura foarte fină ce poate apărea în zona microcomprimatului cu sulfamide

şi cotrimoxazol din cauza diferenţei de timp între apariţia culturii (sunt

necesare câteva generaţii de creştere) şi începutul procesului de inhibiţie;

Colonii foarte mici, punctiforme, vizibile numai cu lupa la marginea zonei de

inhibiţie;

Zona de creştere foarte fină pe aria de inhibiţie (mai ales la cloramfenicol)

cauzată de roirea Proteusului, în prezenţa unei zone circulare de inhibiţie

foarte net vizibilă (situaţie provocată de obicei de un inocul prea bogat).

Se iau în considerare:

Colonii mari, bine dezvoltate, apărate în interiorul zonei de inhibiţie: acestea

reprezintă mutante rezistente în cadrul unei populaţii predominant sensibile;

57

astfel de colonii se vor repica, reidentifica şi retesta pentru sensibilitate,

notându-se totodată şi numărul lor;

Cultura net vizibilă, chiar dacă prezintă o opacitate mai redusă; în cazul în

care aceasta este dispusă circular şi există o zonă de inhibiţie completă, se va

nota numai diametral interior al inhibiţiei totale; dacă cultura rezistentă cu

opacitate mai redusă este prezentă pe toată aria se va nota diametrul zonei de

inhibiţie parţiale cu specificarea prezenţei culturii rezistente.

Situaţiile de mai sus sunt generate de mutante rezistente precum şi în cazul unor

bacterii cu viteze de multiplicare diferite în cadrul unei populaţii bacteriene heterogene.

Exprimarea rezultatelor

În buletin se face fie direct prin transcrierea diametrului zonei de inhibiţie în mm

cu indicarea limitelor valorilor exprimând sensibilitate sau rezistenţă fie prin traducerea

acestei valori în atribute calitative de tulpini rezistente, intermediare sau sensibile

conform criteriilor menţionate în tabelul 13.6

* - discuri impregnate în laborator în lipsa microcomprimatelor respective Tabel 13.6

Nr.

Crt

Agent antimicrobian Conţinut pe

microcomprimat

Zona de inhibiţie în mm

Rezistent Intermediar Sensibil

1. Penicilina G

- Testare Stafilococ

- Testare alţi germeni

10 u

10 u

≤20

≤11

21-27

12-19

≥28

≥20

2. Oxacilină 5 meg ≤10 11-13 ≥14

3. Ampicilină

- Testare Haemophil

-Testare bacili Gram-negativi şi enterococi

-Testare stafiloeoci şi germeni sensibili la

penicilină

10 mcg

10 mcg

10 mcg

≤19

≤9

≤16

-

10-12

17-24

≥20

≥13

≥25

4. Carbenicilină*

- Testare Proteus. E. coli

- Testare Pseudomonas

100 mcg

100 mcg

≤15

≤12

16-18

13-14

≥19

≥15

5. Cefalotin* 30 mcg ≤12 13-15 ≥16

6. Streptomicină 50 mcg ≤12 13-16 ≥17

7. Neomicina 30 mcg ≤12 13-16 ≥17

8. Kanamicină 30 mcg ≤12 13-17 ≥18

58

9. Gentamieină*

- Testare Stafilococ. Pseudomonas

-TestareE.coli,Klebsiella

10 mcg

10 mcg

≤12

≤12

-

13-16

≥13

≥17

10. Cloramfenicol 50 mcg ≤11 12-17 ≥18

11. Tetraciclină 50 mcg ≤15 16-19 ≥20

12. Eritromicină 27 mcg ≤12 13-18 ≥19

13. Novobiocină 10 mcg ≤12 13-17 ≥18

14. Lincomicină 12 mcg ≤12 13-17 ≥18

15. Rifampicină 6 mcg ≤12 13-16 ≥17

16. Polimixină 30 mcg ≤8 9-11 ≥12

17. Colistin 30 mcg ≤9 10-12 ≥13

18. Furazolidon 30 mcg ≤11 12-15 ≥16

19. Nitrofurantoin 200 mcg ≤12 13-15 ≥16

20. Acid nalidixic

Acid nalidixic

40 mcg

300 mcg

≤12

≤14

13-15

15-17

≥16

≥18

21. Sulfamidă 1000 mcg ≤12 13-16 ≥17

22. Cotrimoxazol 1,25+23,75 ≤10 11-15 ≥16

59

Interpretarea rezultatelor

Semnificaţia clinică a atributului de tulpină sensibilă intermediară sau rezistentă a

fost specificată la capitolul Introducere.

În interpretarea rezultatelor pe baza diametrelor critice trebuie avute în vedere

următoarele limite sau precauţii:

Rezistenţa la polimixină şi colimicină este uneori inexactă, eroarea fiind cauzată

de un inocul prea bogat asociat cu un coeficient redus de difuziune a acestor

antibiotice; astfel de situaţii se controlează prin metoda diluţiilor;

Unele tulpini de stafilococ pot apărea ca fals sensibile la meticilină în condiţiile

incubării la 37°C; rezistenţa la meticilină poate fi mai uşor decelabilă prin

incubare la 37°C sau prin adăugare la mediu a 5% NaCl, cu condiţia folosirii unui

inocul bogat;

Tulpinile de stafîlococ meticilină-rezistente se arată uneori sensibile la

cefalosporin; aceasta poate fi datorată diferenţei de concentraţie a celor două

discuri (microcomprimate) de 5 şi respectiv 30 mcg. În general astfel de rezultate

nu se confirmă în clinică, motiv pentru care sensibilitatea la cefalotin a tulpinilor

meticilino-rezistente trebuie privite cu rezervă; practic se poate considera

rezistent;

Tulpinile de Pseudomonas găsite rezistente la aminoglicozide şi într-o oarecare

măsură la polipeptide vor fi retestate întrucât falsa rezistenţă ar putea fi datorată

unei concentraţii mai mari de ioni de Mg şi Ca decât concentraţia fiziologică; se

poate înregistra şi o situaţie inversă şi anume o falsă sensibilitate în condiţiile unei

concentraţii subfiziologice de cationi bivalenţi respectivi;

Unele tulpini de stafilococ şi Pseudomonas cu un grad redus de rezistenţă la

Gentamicină (CM! = 8-6 mcg/ml) vor fi greu de diferenţiat de tulpinile sensibile

din cauza lipsei unei zone intermediare; astfel de tulpini care dau o zonă de

inhibiţie cu 3-6 mm mai redusă decât a tulpinei de Pseudomonas aeruginosa de

referinţă, vor trebui să fie retestaţi.

60

Procedeul de lucru

Rezultă din capitolele anterioare.

Se scot plăcile din frigider şi se lasă să se usuce la temperatura laboratorului; se

controlează pentru sterilitate şi grad de consistenţă; se notează pe fundul plăcii

numărul probei şi locul de aplicare al microcomprimatelor;

Se prepară inoculul după tehnica menţionată şi se ajustează turbiditatca la etalonul

standard prin compararea vizuală pe fondul unei hârtii albe cu dungi negre de

contrast;

Se inoculează plăcile în cel mult 15 min. de la prepararea inoculului după unul din

procedeele menţionate. După însămânţare se lasă să se usuce cu capacul deschis

5-15 min;

Se depun microcomprimatele (discurile) pe suprafaţa gelozei însămânţate; întrucât

eliberarea antibioticului se face aproape instantaneu, discurile odată depuse nu vor

mai fi mişcate în altă poziţie;

După cel mult 15 min. de la depunerea microcomprimatelor (perioada de

predifuziune) plăcile se incubează în termostat în poziţie răsturnată;

După 16-18 h de incubare se citesc zonele de inhibiţie şi se interpretează conform

indicaţiilor de la capitolul "mod de exprimare al rezultatelor".

Surse de erori

Acestea pot fi cauzate de o serie de situaţii ca cele mai jos menţionate:

Folosirea unui alt mediu decât geloza M-H fără determinarea parametrilor daţi de

curbele de concordanţă, sau folosirea, mediului M-H necontrolat din punct de

vedere al pH-ului, consistenţei, al concentraţiei de ioni de Ca şi Mg;

Folosirea de microcomprimate (discuri) degradate având depăşită limita reală de

eficacitate;

Însămânţarea unui inocul nestandardizat;

Depăşirea intervalelor de timp între prepararea inoculului şi însămânţare, între

însămânţare şi aplicarea microcomprimatelor şi între aplicarea

microcomprimatelor şi incubare (prelungirea periopadei de predifuziune);

Incubarea în CO2 sau incubare aerobă pe o perioadă prea scurtă fără recitire;

Testare de culturi niixre;

61

Produse pluricontaminate sau pe germeni cu dezvoltare lentă;

Citirea inexactă a diametrelor zonelor de inhibiţie sau transcrierea eronată a

diametrelor critice;

Lipsa controlului de calitate.

Controlul de calitate

Rezultatele obţinute cu tehnica difuzimetrică pot fi influenţate - aşa cum s-a arătat

în capitolul precedent - de fiecare din componentele implicate în efectuarea antibiogramei

(mediu, inocul, microcomprimate, condiţii tehnice de lucru).

Tulpini de referinţă

Întrucât nu este posibil a se controla fiecare variabilă a metodei în parte se recurge

la verificarea rezultatului final, exprimat de diametrul zonei de inhibiţie observat la

tulpinile de referinţă (testate în aceleaşi condiţii ca şi germenii de cercetat) raportat la

valori standard de referinţă.

Pentru antibiograma difuzimetrică sunt recomandate următoarele tulpini de

referinţă internaţionale:

Echerichia coli, ATCC 25922 (NCTC 10418)

Stafilococ aureus ATCC 25923 (NCTC 6571)

Pseudomonas aeraginosa ATCC 27853 (NCTC 10662)

Tulpinile menţionate pot fi obţinute de la Institutul Cantacuzino, colecţia de

culturi microbiene sau laboratorul de microbiologie clinică.

Fiecare laborator va păstra aceste tulpini în triplu exemplar şi în următoarele

modalităţi:

Tulpină de rezervă sub formă liofilizată;

Tulpină stock - pe geloză dreaptă M-H la +4°C;

Tulpină de lucru, obţinută din tulpina stoc prin subculturi la interval de două

săptămâni.

Folosirea zilnică pe o perioadă îndelungată a tulpinei de lucru poate duce la

rezultate eronate. Acestea pot fi cauzate fie de o contaminare, fie de schimbarea

spectrului de sensibilitate a gemenului de referinţă consecutiv a prea multe pasaje. În

consecinţă ori de câte ori se observă modificări ale diametrului zonelor de inhibiţie peste

62

limitele admise, modificări ce nu pot fi atribuite unor comprimate ale tehnicii, se va face

apel la subculturi din tulpina stoc.

Pentru fiecare din tulpinile de referinţă au fost determinate valorile diametrelor

zonelor de inhibiţie faţă de fiecare microcomprimat. Pe baza a numeroase măsurători s-a

ajuns la definirea provizorie a unor parametrii de valoare internă utili în efectuarea

controlului de calitate al antibiogramei şi anume:

Media diametrului zonei de inhibiţie;

Rangul sau diferenţa între observaţia cea mai mare şi cea mai mică; aceasta

reprezintă limita de toleranţă în interiorul căreia trebuie să fie incluse cel puţin

75% din determinările singulare la nivelul diferitelor laboratoare.

Diametrul zonelor de inhibiţie (mm) al tulpinilor de referinţă E. coli şi

Stafilococ faţă de microcomprimatele R.S.R.

Tabel 13.7

Nr.

Crt. Agentul antimicrobianConcentraţie în mcg

Stafilococ

25923

Echerichia coli

25922

Media Rangul Media Rangul

1. Benzil penicilină

(penicilina G)

10 u 30 28-35 — —

2. Oxacilină 5 u 21 18-23 — —

3. Ampicilină 10 u 26 24-28 13 11-15

4. Carbenicilină 100 u — — 25 23-29

5. Cefalotin 30 u 30 28-32 16 13-20

6. Streptomicină 50 u 20 17-23 18 16-20

7. Kanamicină 30 u 20 18-22 18 16-20

8. Neomicină 30 u 21 18-23 18 17-19

9. Gentamicină 10 u 22 18-25 19 17-21

10. Coramfenicol 50 u 20 18-22 19 18-21

11. Tetraciclină 50 u 24 20-28 20 19-23

63

12. Eritromicină 15 u 23 21-26 — —

13. Lincomicină 12 u 23 20-27 — —

14. Rifampicină 6 u 25 23-28 — —

15. Poiimixină 30 u — — 16 14-17

16. Colistin 30 u — — 16 15-19

17. Colistin + 300 u — — 19 18-22

18. Furazolidon 30u — — 18 16-20

19. Nitrofurantoin 10u — — 11 10-12

20. Nitrofurantoin + 200 u — — 18 16-20

21. Acid nalidixic 40 u — — 19 18-22

22. Acid nalidixic + 300 u — — 22 21-25

23. Sulfafurazol 30 u — — 12 10-15

24. Sulfafurazol + 1000 u — — 22 21-24

25. Cotrimoxazol 1,25+23,75 26 24-30 25 23-26

Aceste date sunt prezentate în tabelul de mai jos, pentru stafilococ ATCC25923 şi

pentru Echerichia coli ATCC25922. Pentru Pseudomonas sunt trecute valorile

interanaţionale pentru gentamicină, carbenicilină şi tobramicină - fără corespondenţe în

microcomprimate româneşti şi valoarea internă pentru coilistin.

Tabel 13.8

Agentul antimicrobian Conţinutul pe disc

în mcg

Media diametrului

zonei de inhibiţie

Rangul

Carbenicilină (a) 100 22 19-25

Gentamieină (a) 10 19 16-22

Tobramicină (a) 10 22 19-25

Colistin (a) 10 13 11-15

Colistin (b) 30 17 14-19

a= valori internaţionale pentru rondele standard;

b= valori pentru microcomprimate româneşti.

64

Modul de efectuare al controlului

Fiecare laborator va testa în aceleaşi condiţii de tehnică o dată cu tulpinile de

examinat şi tulpinile de referinţă. Înainte de înregistrarea şi interpretarea rezultatelor

antibiogramelor se va trece la citirea şi scrierea diametrelor zonelor de inhibiţie pentru

tulpinile de referinţă; se verifică dacă diametrul găsit pentru aceste tulpini se înregistrează

în limitele variaţiei admise de rang. Cu cât diametrul zonei de inhibiţie pentru tulpinile de

referinţă sunt în mod repetat mai aproape de valoarea medie şi în orice caz în interiorul

variaţiei admise, cu atât rezultatele sunt mai exacte şi reproductibile.

În această situaţie se poate trece la citirea antibiogramelor şi la interpretarea

rezultatelor în rezistent, sensibil, intermediar . Dacă mărimea diametrelor zonelor de

inhibiţie la tulpinile de referinţă pentru unul sau mai multe comprimate se situează în

afara valorilor rangului, rezultatele pentru respectivele microcomprimate nu sunt valabile

şi nu se raportează pe buletin. Într-o astfel de situaţie se trece la cercetarea cauzei prin

verificarea fiecărei componente a tehnicii în parte.

În cazul în care variaţia în afara limitelor admise este dată pentru mai multe

microcomprimate, sunt implicate foarte probabil deficienţe ale mediului (compoziţie,

consistenţă, pH) sau ale inoculului (prea bogat sau prea sărac). Dacă variaţia nepermisă

interesează în mod constant unul sau un număr redus de comprimate este foarte probabil

ca eroarea să fie consecinţa unei deteriorări a microcomprimatelor printr-o incorectă

conservare sau inexactă dozare. În astfel de situatii se va trece la verificarea concentraţiei

în substanţă activă a microcomprimatelor (rondelelor).

Controlul concentraţiei în substanţa activă a microcomprimatelor

Pentru efectuarea acestui control se folosesc aceleaşi tehnici de lucru şi una din

tulpinile de referinţă menţionate. Este necesară deasemenea prepararea unor soluţii etalon

proaspete din antibioticul respectiv, în cazul în care nu există un etalon naţional de

referinţă. Se folosesc trei concentraţii etalon din care una corespunde conţinutului în

substanţă microbiană activă a microcomprimatului respectiv, o concentraţie superioară şi

una inferioară distanţate pe scara logaritmică; spre exemplu, dacă microcomprimatui

conţine 30 mcg, în afară de soluţia de 30 mcg se vor prepara concentraţiile de 15 şi

respectiv 60 mcg pentru o scară logaritmică 2 sau 20 şi respectiv 45 mcg pentru scara

logaritmică 1,5.

65

Pentru depunerea antibioticelor se folosesc fie cilindrii fixaţi în geloză în care se

depun 0,05ml, fie discuri îmbibate cu 0,02 ml din soluţii de concentraţii corespunzătoare:

discul trebuie să fie de acelaşi diametru cu cel al discului standard şi de o porozitate care

să permită absorbţia unei cantităţi de apă disilată egală cu 2,5-3 ori din greutatea sa.

Pentru efectuarea propriu-zisă a titrării se depun la întâmplare cel puţin 5 discuri sau

cilindrii din fiecare concentraţie şi discurile sau microcomprimatele de titrat.

Se face media diametrelor pentru fiecare din cele trei concentraţii etalon şi cu

ajutorul acestora se întocmeşte o curbă de concordanţă notându-se pe abscisă zonele de

inhibiţie în mm şi pe ordonată logaritmul concentraţiei în mcg. Concentraţia în antibiotic

a unei doze sau a unui comprimat de titrat se poate determina prin proiectarea pe

ordonată a punctului de intersecţie de pe curba de concordanţă cu verticala ridicată de pe

abscisă din dreptul valorii diametrului de inhibiţie dat de microcomprimatul respectiv.

Un microcomprimat sau un disc este considerat corespunzător dacă coţinutul în

substanţă antimicrobiană se situează între 75-125% în raport cu concentraţia notată.

Discurile sau microcomprimatele uniform impregnate nu trebuie să arate (în aceleaşi

condiţii de testare) o diferenţă mai mare de 2,5 mm. Menţionăm că nu există în ţară

microcomprimate sau discuri etalon de referinţă naţională sau internaţională; în lipsa

acestora se pot folosi etaloanele naţionale pentru agenţii antimicrobieni uzuali existenţi la

Institutul Pentru Controlul Medicamentelor.

Fig. 1. Aparat mini API pentru identificarea microorganismelor si a sensibilitatilor la antibiotice

66

Fig. 2. Cultura de Steptococcus pyogenes β- hemolitic pe geloză cu saâge de berbec (streptococ de grup A

sensibil la bacitracină, streptococ non grup A rezistent la bacitracină)

67

Fig. 3. Cultură de Staphylococcus aureus pe geloză cu sânge de berbec

68

69

CAPITOLUL 6REZULTATE ŞI CONCLUZII

LUNA

SPECIA

SH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF∕SN

I 1 4 4 6 1 2 18 99/9II 10 9 3 1 1 3 1 28 153/2III 10 12 5 5 4 6 42 201/14I 7 8 2 5 2 4 1 2 31 187/4V 5 8 1 3 3 1 21 155/6VI 7 5 1 5 1 19 144/2VII 2 3 1 3 9 76/5VIII 8 4 3 5 3 23 85/6IX 8 5 1 1 3 2 20 114X 5 9 3 1 2 20 96XI 4 1 3 1 9 35/1XII 2 2 22/1Total pozitivi

67 68 20 35 2 1 27 19 1 2 242 1350/50

2007 STAŢIONAR

70

71

2007 AMBULATOR

LUNA

SPECIA

SH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF∕SN

I 31 32 9 6 2 2 4 5 1 92 552/15II 29 25 6 8 1 1 5 3 1 79 521/15III 52 50 12 16 6 2 13 15 1 167 805/23I 46 57 6 7 2 1 6 6 131 790/37V 32 32 12 4 1 5 5 1 1 1 94 654/24VI 47 22 4 2 4 16 10 1 1 1 108 562/21VII 16 12 12 7 1 1 9 10 1 1 70 380/17VIII 41 42 30 31 5 4 8 8 169 560/23IX 45 60 13 12 2 5 11 1 1 150 749/16X 54 62 8 7 2 2 3 2 1 141 610/23XI 57 64 12 6 3 3 5 12 1 1 164 720/29XII 63 40 17 8 7 2 5 2 1 145 605/17Total pozitivi

513 498 141 114 32 21 84 89 3 4 3 1 3 1 1 1 1510 7508/260

72

73

Recoltarea de probe pe anul 2007- AMBULATOR + STAŢIONAR

ANUL2007

SPECIASH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSIELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF/SNStaţionar 67 68 20 35 2 1 27 19 1 - - 2 - - - - 242 1350/50Ambulator 513 498 141 114 32 21 84 89 3 4 3 1 3 1 1 1 1510 7508/260Totalpozitivi

580 566 161 149 34 22 111 108 4 4 3 3 3 1 1 1 1752 8858/310

exudatul faringian (EF):8858-dintre care – 1350 - staţionar - 7508 - ambulatorNumărul total de probe recoltate 9171 din: secreţie nazală (SN):310 – dintre care – 50 - staţionar

- 260 – ambulator

Numărul total de probe recoltate masculine şi feminine pozitive: 1752 dintre care – 242 staţionar- 1510 ambulator

Numărul total de indivizi cu: SH M=580 SAH M=161 Pneumococi M=34 Candida M=111F=566 F=149 F=22 F=108

Haemophilus M=4 Pseudomonas M=3 Klebsiella M=3 Moraxella M=1F=4 F=3 F=1 F=1

74

75

SAH – Anul 2007

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de stafilococ isolate în anul 2007

Nr.TotalSAH241 Luna

ANTIBIOTICILEP Ox A Aug CXM Ge AK E Bi Cl Cedax Neth Rocifir Clofron Nf. Norfe T Oflox

S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S RI 3 24 13 15 4 24 27 25 3 25 3 14 2 15 11 20 7 6 1

II 3 27 17 13 4 26 27 3 26 4 25 5 27 3 18 12 17 13 6 1 2 1 2

III 10 27 18 21 10 29 40 31 8 29 9 33 5 21 15 27 12 3 1 1 1 1

IV 2 18 14 6 3 17 20 19 1 16 4 18 1 13 8 15 5 3

V 2 28 19 11 4 25 27 1 24 4 22 6 23 5 21 9 19 11 8 1 1 3 1 1 3 1

VI 1 8 5 4 2 7 7 1 5 1 8 5 6 3 5 4 3 3 1 1 1

VII 1 30 17 5 2 19 22 20 21 1 21 15 7 19 3 6 1 3 1

VIII 2 51 43 9 3 46 42 8 40 8 47 6 44 3 31 21 43 11 1 2 2 1

IX 2 21 22 1 1 16 18 18 24 17 1 18 5 20 3 9

X 2 11 10 2 3 10 10 3 12 1 11 2 12 1 5 8 11 2 4

XI 5 21 14 12 7 19 9 17 20 1 23 2 18 3 14 11 16 7 9 1 2 1 3 1 3

XII 4 19 1 22 4 19 3 20 14 3 23 10 1 10 13 11 11 6 1 2 1 2 2 2 3 4 1 6 2 4 3

Total: 37 285 193 121 47 257 252 53 254 34 274 38 242 25 166 123 223 100 64 4 3 2 5 1 5 4 3 5 17 3 12 4 3 7 3

76

77

2008 Staţionar

LUNA

SPECIA

SH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF∕SN

I 24 27 27 23 5 9 2 3 6 3 1 2 132 301/54II 17 20 20 24 2 4 7 4 108 268/56III 23 16 7 8 4 7 2 14 8 89 259/57I 9 8 9 14 3 1 3 2 49 228/47V 10 9 14 10 2 2 2 1 2 52 2755VI 7 5 7 8 1 1 3 32 206/56VII 10 4 11 19 1 1 2 2 1 50 259/50VIII 6 12 14 1 1 34 276/45IX 13 11 19 10 7 10 1 3 1 1 76 237/64X 10 13 26 9 14 7 1 14 11 1 1 1 2 110 320/76XI 10 15 17 8 14 5 1 1 14 9 1 1 2 98 263/81XII 14 4 9 14 2 2 1 19 9 2 4 80 207/32Total pozitivi

147 142 178 161 54 48 13 20 76 45 1 1 4 3 10 2 910 3094/673

78

79

2008 Ambulator

LUNA

SPECIA

SH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF∕SN

I 47 71 26 21 5 1 8 8 1 188 760/28II 71 57 79 74 6 8 11 19 325 1087/56III 80 92 46 43 6 6 15 22 3 1 299 1224/63I 47 42 41 30 12 3 12 13 2 4 206 784/49V 46 53 26 40 9 6 4 6 2 2 3 2 199 862/56VI 27 33 23 30 11 11 8 9 3 4 1 3 163 685/347VII 13 17 33 23 8 7 16 12 2 3 1 2 137 537/52VIII 13 9 23 16 3 2 11 7 4 4 1 93 573/25IX 37 30 6 13 3 1 4 4 1 1 1 1 1 99 665/21X 69 60 22 26 13 6 16 17 6 2 1 1 4 6 249 1025/76XI 55 64 39 36 9 7 6 8 7 4 1 4 8 249 893/68XII 31 17 16 11 11 4 3 5 5 3 2 108 440/63Total pozitivi

536 545 380 363 96 62 114 125 32 25 6 5 5 21 18 2315 9535/904

80

81

Recoltarea de probe pe anul 2008- AMBULATOR + STAŢIONAR

ANUL2008

SPECIASH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSIELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF/SNStaţionar 147 142 178 161 54 48 13 20 76 45 1 1 4 3 10 2 910 3094/673Ambulator 536 545 380 363 96 62 114 125 32 25 6 5 5 21 18 2315 9535/604Totalpozitivi

683 687 558 524 150 110 127 145 108 70 7 6 4 8 31 20 3225 12629/1277

exudatul faringian (EF):12629-dintre care – 3094 - staţionar - 9535 - ambulatorNumărul total de probe recoltate 13906 din: secreţie nazală (SN):1277 – dintre care – 673 - staţionar

– 604 - ambulator

Numărul total de probe recoltate masculine şi feminine pozitive: 3225 dintre care – 910 staţionar- 2315 ambulator

Numărul total de indivizi cu: SH M=683 SAH M=558 Pneumococi M=150 Candida M=127F=687 F=524 F=110 F=145

Haemophilus M=108 Pseudomonas M=7 Klebsiella M=4 Moraxella M=31 F=70 F=6 F=8 F=20

82

83

SAH – Anul 2008

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de stafilococ isolate în anul 2008

Nr.TotalSAH413 Luna

ANTIBIOTICILEP Ox A Aug CXM Ge AK E Bi Cl Cedax Neth Rocifir Clofron Nf. Norfe T Oflox

S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S RI 2 21 13 15 3 21 5 24 13 4 22 2 1 17 10 26 3 13 3 1 1 2 2 3 2 1 1II 6 31 43 13 6 30 47 9 40 3 36 3 14 1 39 18 42 14 24 2 3 1 1 1 2 1 2 6 2 2 1 3III 3 19 28 12 11 11 34 6 36 1 20 3 15 5 25 14 24 15 16 3 2 1 3 1 4 1 1 2 4 1 1 3 3 2IV 9 15 44 9 13 10 50 3 51 1 19 3 17 3 38 16 43 10 16 1 1 1 1 1 4 1 4 1 1 4V 7 18 31 19 14 11 48 2 43 1 27 3 22 2 33 17 37 11 13 3 3 3 1 2 5 1 3 3 1 5VI 3 15 18 9 17 11 20 7 22 2 20 6 15 2 15 12 18 9 11 2 2 1 1 2 2 3 3 1 2VII 7 24 30 12 12 18 39 2 33 1 40 2 21 25 17 36 6 15 2 3 1 1 4 1 3 3 5 5VIII 1 24 22 9 10 14 29 1 28 2 28 3 24 20 11 16 7 19 1 1 1 1 1 2 2IX 6 29 22 12 28 6 33 1 33 1 30 4 31 3 25 9 26 8 24 4 2 2 2 1 1 1 2 1 3X 5 26 10 46 5 26 53 3 54 1 51 5 26 3 38 18 46 9 26 3 1 2 1 1 3 1 3XI 3 17 35 8 5 15 40 3 38 2 37 6 15 2 29 15 34 9 16 1 1 3 1 1 3XII 5 7 12 10 7 5 18 3 13 4 18 5 5 3 11 11 11 10 7 1 1 1 1 2 2 4 1 4 1 5Total: 57 246 308 174 121 178 416 64 404 23 348 42 207 25 314 168 359 111 200 26 11 7 12 5 17 8 11 10 38 11 22 19 17 35

84

85

2009 Staţionar

LUNA

SPECIA

SH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF∕SN

I 6 12 15 18 2 2 1 5 5 66 291/104II 4 2 15 8 5 3 2 1 21 16 2 79 105/67III 1 1 1 2 6 41/12TotalPozitivi

10 14 31 27 8 3 4 2 28 31 2 151 437/183

86

87

2009 Ambulator

LUNA

SPECIA

SH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF∕SN

I 18 11 13 10 2 3 1 1 59 502/43II 27 20 22 11 4 3 5 6 5 2 3 2 110 190/63III 1 3 4 107/5Totalpozitivi

45 31 36 21 6 3 8 10 6 2 3 2 173 1299/111

88

89

Recoltarea de probe pe anul 2009- AMBULATOR + STAŢIONAR

ANUL2009

SPECIASH SAH PNEUMOCOCI CANDIDA HAEMOPHILUS PSEUDOMONAS KLEBSIELLA MORAXELLA TOTAL

M F M F M F M F M F M F M F M F EF/SNStaţionar 10 14 31 27 8 3 4 2 28 31 2 151 437/183Ambulator 45 31 36 21 6 3 8 10 6 2 3 2 173 1299/111Totalpozitivi

55 45 67 48 14 6 12 12 34 33 5 2 324 1736/294

exudatul faringian (EF):1736-dintre care – 437 - staţionar - 1299 - ambulatorNumărul total de probe recoltate 13906 din: secreţie nazală (SN):294 – dintre care – 183 - staţionar

– 111 - ambulator

Numărul total de probe recoltate masculine şi feminine pozitive: 324 dintre care – 151 staţionar- 173 ambulator

Numărul total de indivizi cu: SH M=55 SAH M=67 Pneumococi M=14 Candida M=12F=45 F=48 F=6 F=12

Haemophilus M=34 Pseudomonas M=5 Klebsiella M=0 Moraxella M=0F=33 F=2 F=0 F=0

90

91

SAH – Anul 2009

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de stafilococ izolate în anul 2009

Nr. TotalSAH56 Luna

ANTIBIOTICELEP Ox A Aug CXM Ge AK E Bi Cl Cedax Neth Rocifir Clofron Nf. Norfe T Oflox

S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R S R

I 5 18 18 15 6 17 26 6 23 6 23 10 17 3 14 18 10 23 12 5 3 3 5 3II 4 10 10 10 5 9 20 18 1 20 12 1 12 7 15 5 12 2 1 1 1 1III 2 2 6 5 2 2 10 1 9 2 11 5 4 7 17 3 2 1 1 1 2 2 1 2Total 11 30 34 30 13 28 56 7 50 9 54 10 34 4 30 32 32 31 26 8 1 1 1 6 3 3 6 3 3

92

93

ConcluziiÎntre diferitele specii de microorganisme se stabilesc în timp şi spaţiu numeroase

feluri de relaţii, tocmai datorită amestecului lor permanent. Aceste relaţii constituie

sistemul ecologic al cavităţii bucale. Orice noţiune de ecologie, de la nivelul cavităţilor

naturale ale omului şi deci şi de la nivelul cavităţii bucale, trebuie înţeleasă în dublu sens:

pe de o parte, relaţiile interspeciale, adică cele dintre numeroasele specii de

microorganisme prezentate, pe de altă parte relaţiile fiecăreia şi în ansamblul cu mediul

lor de viaţă, în acest caz cavitatea bucală.

Între microorganismele din cavitatea bucală se stabilesc tot felul de relaţii, potrivit

metabolismuiui fiecăruia în parte, şi al tuturor, ca ansamblu. În linii mari, aceste relaţii

pot fi de stimulare a dezvoltării unei specii sau de indiferenţă şi de inhibare. Cele de

stimulare pot fi unilaterale, privind beneficiul unei specii pe seama alteia, când o

denumim "toleranţă" şi "dependenţă", cum este cazul bacteriilor-doică.

Pentru ca o bacterie să devină parte integrantă din microflora bucală, ea trebuie să

fie reţinută, să poată persista la nivelul acestei cavităţi. Altfel există riscul de a fi repede

spălată de salivă şi îndepărtată prin deglutiţie. De aceea ea trebuie să aibă o serie de

calităţi morfologice, sau enzimatice, sau de altă natura, care să-i confere un anumit fel de

a rezista la influenţa celorlalte microorganisme şi la condiţiile din ecosistem. Implantarea

unui agent microbian nou venit este un fapt simplu şi uşor, fiindcă el nu vine pe un loc

"gol".

Identificarea agentului etiologic este scopul final al examinării oricărui produs

patologic. În unele situaţii acest act poate fi realizat pe baza datelor de ordin morfologic

şi cultural prezentate în capitolele anterioare. În cele mai multe cazuri este nevoie de

completarea cu informaţii privind caracterele metabolice, de structură antigenică şi de

patogenitate ale germenului în cauză.

Sensibilitatea germenilor la un agent antimicrobian se exprimă prin concentraţia

cea mai mică de medicament care în condiţii standardizate de lucru inhibă "in vitro"

creşterea bacteriană. Din motive de ordin clinic, adeseori este mai utilă determinarea

concentraţiei minime de medicament în stare - în aceleaşi condiţii standard - să omoare

germenul în cauză.

94

Consecutiv administrării agenţilor antimicrobieni se obţine în organism, între

două administrări, concentraţii sau nivele variind de la maxim la minim ceea ce constituie

zona nivelelor critice. Felul relaţiei dintre concentraţia m in imă inhibantă sau

concentraţia minimă bactericidă, nivelul de antibiotic în sânge sau în focarul infecţios,

precum şi criteriul clinic, permit clasificarea germenilor în sensibili, intermediari şi

rezistenţi.

Fiecare laborator va testa în aceleaşi condiţii de tehnică o dată cu tulpinile de

examinat şi tulpinile de referinţă. Înainte de înregistrarea şi interpretarea rezultatelor

antibiogramelor se va trece la citirea şi scrierea diametrelor zonelor de inhibiţie pentru

tulpinile de referinţă; se verifică dacă diametrul găsit pentru aceste tulpini se înregistrează

în limitele variaţiei admise de rang. Cu cât diametrul zonei de inhibiţie pentru tulpinile de

referinţă sunt în mod repetat mai aproape de valoarea medie şi în orice caz în interiorul

variaţiei admise, cu atât rezultatele sunt mai exacte şi reproductibile.

În această situaţie se poate trece la citirea antibiogramelor şi la interpretarea

rezultatelor în rezistent, sensibil, intermediar . Dacă mărimea diametrelor zonelor de

inhibiţie la tulpinile de referinţă pentru unul sau mai multe comprimate se situează în

afara valorilor rangului, rezultatele pentru respectivele microcomprimate nu sunt valabile

şi nu se raportează pe buletin.

95

BibliografieOprean L., Microbiologie generală, Ed. Univ. “Lucian Blaga”, Sibiu,2000.

Oprean L., Gaspar E., Curs de biologie celulară şi moleculară, Ed. Univ. „Lucian

Blaga”, Sibiu, 2009.

Oprean L., Gaspar E., Lengyel E.,Biologie celulară şi moleculară, Îndrumător de

laborator, Ed. Univ. „Lucian Blaga”, Sibiu, 2009.

Zara Margareta, Microbiologie generală, Editura EuroPlus, 2006.

SR ISO 6887-1 / 2002 Pregatirea probei pentru analiză a suspensiei iniţiale şi a

diluţiilor decimale pentru examen Microbiologic.

SR ISO 4833-2003 Enumerarea microorganismelor .Tehnica de numărare a

coloniilor la 300C.

STAS ISO 6888 –1 /2003 Metoda orizontală pentru enumararea Stafilococilor

coagulază pozitivi.Tehnica pe mediu de agar Baird-Parker.

SR EN ISO 21871/ 2006 Metoda orizontală pentru determinarea celui mai mic

număr de Bacillus cereus prezumtiv.

SR EN ISO 7937 /2005- Metoda orizontală pentru numărarea Clostridium

perfringens.

Felicia TOMA, Bacteriologie generală, Editura Universităţii de Medicină şi

Farmacie Tg. Mureş, 2005.

Borucki, M.K.; Krug, M.J.; Muraoka, W.T.; D.R. Discrimination among Listeria

monocytogenes isolates using a mixed genome DNA microarray. Veterinary

Microbiology,2003.

Call, D.R.; Brockman F.J.; Chandler D.P. Detecting and genotypin Escherichia

coli O157:H7 using multiplexed PCP and nucleic acid microarray. International Journal

of Food Microbiology. 2001.

Liébana, S.; Lermo, A.; Campoy, S.; Cortés, M.P.; Alegret, S.; Pividori, M.I.

Rapid detection of Salmonella in milk by electrochemical magneto-immunosensing.

Biosensors and Bioelectronics. 2009.

Lisa, M.; Chouhan, R.S.; Vinayaka, A.C.; Manonmani, H.K.; Thakur. M.S. Gold

nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of

96

dichlorodiphenyltrichloroethane:An organochlorine pesticide. Biosensors and

Bioelectronics. 2009.

Liu, T. The comparisons of zymotechnics and the fluorescence method in food

coliforms .Chinese Journal of Health Laboratory Technology. 2004.

McGuinness, S.; McCabe, E.; O’Regan, E.; Dolan, A.; Duffy, G.; Burgess, C.;

Fanning, S.; Barry, T.; O’Grady, J. Development and validation of a rapid real-time PCR

based method for the specific detection of Salmonella on fresh meat. Meat Science. 2009.

Pranoto, Y.; Rakshit, S.K.; ; Salokhe, V.M. Enhancing antimicrobial activity of

chitosan films by incorporating garlic oil, potassium sorbate and nisin. LWT-Food

Science and Technology, 2005.

Qiu, Y. Examination of B gene of golden color staphylococcus enterotoxin in

food by PCR. Chinese Journal of Microbiology. 2004.

Shan,C.Several examination methods of food safety in our country. China

Condiment.2004.

Wilson, W.J.; Strout, C. L.; Desantis, T. Z.; Stilwell, J. L.; Carrano, A.V.;

Aanersen, G.L. Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using

microarray technology. Molecular and Cellular Probes. 2002.

Yu, J.; Liu, Z.; Liu, Q.; Yuen, K. T.; Mak, A.F.T.; Yang, M.; Leung. P. A

polyethylene glycol (PEG) microfluidic chip with nanostructures for bacteria rapid

patterning and detection. Sensors and Actuators A: Physical. 2009.

97