manual shigella 2007

5/11/2018 Manual Shigella 2007 - slidepdf.com

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Manual de Procedimientos

Diagnóstico y caracterización

de Shigella spp.

2007



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AUTORES

Raquel TerragnoMaría Inés Caffer

Norma Binsztein

Departamento Bacteriología

Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas

A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”

Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv

para América del Sur



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INDICE

CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN 5

CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp. 7

1.-ESPECÍMENES 7

2.-PROCESAMIENTO 7

2.1.-AISLAMIENTO 7Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica de Shigella spp

a partir de heces. 9

2.2.-IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SHIGELLA spp.10

2.2.1.- Pruebas Bioquímicas Diferenciales 12

2.2.2.-Pruebas bioquímicas 13 Agar Hierro Tres Azúcares y Agar Kligler 13

Agar Lisina Hierro

Prueba del Indol 17

Prueba de la Beta Galactosidasa 19

Test de Utilización de Azúcares 21

Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa 23

Prueba del Acetato 25

Prueba del Mucato 26

Citrato de Christensen 27

2.3.-SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp. 28Flujograma para Serotipificación de Shigella spp. 31

CAPÍTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD 33

1.- NIVEL DE LABORATORIOS 33

2.-ELEMENTOS DE PROTECCIÓN. 34 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO. 35

4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 35

5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA 36

6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS 36



4

CAPÍTULO IV-MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS 38

Agar McConkey 38

Agar EMB 38

Agar SS 39

Agar XLD 39

Agar Hektoen 40

CAPÍTULO V - PLANILLAS DE RESULTADOS 42



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CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN

Las bacterias del género Shigella, de la familia Enterobacteriaceae, son bastones Gram

negativos, de 0.3 a 1 µm de diámetro y de 1 a 6 µm de longitud, que pueden estar solos, en

cadenas o de a pares. Son no móviles, no esporulados, anaerobios facultativos, oxidasa

negativo, fermentan la glucosa y otros azúcares sin producción de gas, Voges-Proskauer

negativo y rojo de metilo positivo. No utilizan citrato de Simmons, no producen SH2 y son

lisina descarboxilasa, arginina dehidrolasa y ureasa negativos (Tabla 1). La temperatura de

crecimiento óptima es 37º C.

El género está formado por Shigella dysenteriae (serogrupo A); Shigella flexneri (serogrupo

B); Shigella boydii (serogrupo C); Shigella sonnei (serogrupo D).

La shigellosis, infección causada por Shigella spp., está distribuida en todo el mundo, pero es

endémica en países tropicales y de clima templado con mayor incidencia en verano. Es causa

de infección intestinal aguda en niños pequeños. Las 2/3 partes de los casos y la mayoría de

las defunciones ocurren en niños de 6 meses a 10 años. Representan también un riesgo para

viajeros que se trasladan hacia áreas endémicas y son frecuentes los brotes en condiciones de

hacinamiento y falta de saneamiento como cárceles, hospitales psiquiátricos, geriátricos,

campamentos y a bordo de embarcaciones.

Shigella tiene como únicos huéspedes al ser humano y a los primates. La enfermedad se

transmite de persona a persona por la vía fecal-oral, por alimentos contaminados donde el

vector de transmisión son las moscas, o por el uso de aguas contaminadas para la preparación

de los mismos.

La bacteria es altamente infecciosa por la ruta oral, la ingestión de tan sólo 10 a 100

organismos produce infección en voluntarios. La gravedad y la letalidad de la infeccióndependen de la edad de la persona, del estado nutricional, de la magnitud de la dosis

infectante y del serotipo del microorganismo.

Shigella dysenteriae produce la forma más severa de la enfermedad, con una tasa de letalidad

del 20%. En cambio las infecciones por otras especies de Shigella se autolimitan y rara vez

son fatales, excepto en huéspedes inmunocomprometidos, ancianos y niños pequeños.

Shigella flexneri también puede producir disentería. Shigella sonnei puede producir brotes



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esporádicos por alimentos semi-cocidos o mal cocidos y aguas contaminadas. Shigella boydii

se aísla con menor frecuencia que las otras tres.

TABLA 1. Propiedades Bioquímicas de Shigella spp.

Ensayo o Sustrato Resultado Sulfuro de hidrógeno -

Glucosa (gas) -

Glucosa (ácido) +

Movilidad -

Citrato de Simmons -

Adonitol -

Mucato -

Rojo de metilo +

Voges-Proskauer -

Arginina dihidrolasa -

Lisine decarboxilasa -

Ornitina decarboxilasa Sh. sonnei +; otras Shigella –

Urea (hidrólisis) -

Fenilalanina deaminasa -

Salicina -

Lactosa -

Sacarosa -Xilosa -

Bioseguridad

Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones

establecidas en “Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 4 th. CDC/NIH

(Ver Capítulo III - Precauciones de Bioseguridad)



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CAPÍTULO II – AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SHIGELLA spp.

1.-. ESPECÍMENES

Las muestras se deben obtener en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el

tratamiento con antimicrobianos. Para muestras humanas se puede utilizar un hisopo dealgodón para recoger material mucoso o sanguinolento de la materia fecal. Las muestras que

no se van a procesar en dos horas se deben mantener en medio de transporte Cary-Blair con

tioglicolato que reduce la tensión de oxígeno. Este medio tiene la ventaja de ser estable hasta

18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas

y las muestras se pueden conservar hasta 5 días, siempre en refrigeración.

2.- PROCESAMIENTO

2.1.- AISLAMIENTO

Materiales y equipamiento

• Ansas descartables (10µl)

• Placas de Petri (9 cm diámetro) estériles

• Balanza

• Estufa de incubación a 37ºC

• Mechero Bunsen

• Pipetas para 0.1 ml (pipetas de 1 ml)

• Hisopos de algodón

Medios

• TSA agar (estrías)

• TSI agar (estrías)

• LIA agar (estrías)

• MacConkey agar (placas)

• EMB agar (placas)

• SS agar (placas)

• XLD agar (placas)

• Hektoen agar (placas)



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Procedimiento Comentarios

No hay un medio de enriquecimientoespecífico para el cultivo y aislamientode Shigella spp. de materia fecal. Si sedispone de caldo GN se lo puede usar

para el enriquecimiento. Otraposibilidad es resuspender el hisopo conmateria fecal en un caldo tioglicolato yluego sembrar una placa de agar XLD.

Día 1• Realizar la siembra en losmedios SS, XLD, McConkey, Hektoen,EMB, con heces frescas suspendidas ensolución salina o directamente a partirdel hisopo.• Incubar las placas por 18-24horas a 37º C

Día 2• Seleccionar colonias convexasde 2 a 4 mm de diámetro.Leer placas de SS: coloniastranslúcidas, ligeramente rosadas, aveces con un centro más oscuro.Leer placas de XLD: coloniastranslúcidas con un tono rojizo.Leer placas de McConkey: coloniastranslúcidas, ligeramente rosadas.Leer placas de Hektoen: coloniasverdes, elevadas y húmedas.Leer placas de EMB: coloniastranslúcidas de color ambar.• Sembrar las coloniassospechosas en agar TSI, agar LIA yagar TSA. A partir de la estría en TSAse realiza la confirmación bioquímica y

la serotipificación (ver día 3).

• Seleccionar uno o dos de losmedios de aislamiento.



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FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓNBIOQUÍMICA DE SHIGELLA spp. A PARTIR DE HECES

Camino II Camino I

(1) Caldo de enriquecimiento: Ver 2.1.- Aislamiento

(2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar eosina azulde metileno.

(3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias.(4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Shigella, se siembran pruebas bioquímicas

complementarias y se realiza la serotipificación somática O (Serotipo O)(5) Pruebas bioquímicas complementarias: acetato de sodio, mucato de sodio, citrato de Christensen,

manita.

MATERIA FECAL (HISOPO)

Suspensión en

solución fisiológica

Caldo de enriquecimiento (1) Aislamiento en mediosselectivos y diferenciales (2)

18-24 hs, 37ºC

Aislamiento en mediosselectivos y diferenciales (2)

Colonias típicas (3)

TSI LIAEstría

18-24 hs, 37ºC

Lectura (4)Colonias típicas (3)

TSI LIA Estría

P. Bioq. (5)

Serotip. O

Lectura (4)

P. Bioq. (5)

Serotip. O

18-24 hs, 37ºC

Lectura

1er. día

2do. día

3er. día

4to. día



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2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SHIGELLA spp.


• Ansas descartables

• Mechero Bunsen• Estufa a 37ºC

Medios

• Medio base para azúcares

• Solución madre de Manitol 10%

• Solución madre de Glucosa 10%

• Solución madre de Sacarosa 10%• Solución madre de Salicina 10%

• Medio base con arginina, lisina y ornitina y medio base sin agregados para control

• Vaselina estéril

• Discos de ONPG para ensayo de ß- galactosidasa

• SIM

• Mucato de sodio

• Acetato de sodio• Citrato de Christensen

Cepas bacterianas

• Cepas de referencia para el control de calidad de los medios.


Día 3• Leer los tubos de agar TSI y LIAde acuerdo a la Tabla 2 y realizar laprueba de ONPG a partir del TSI.• Del cultivo en agar TSA inocular:medio SIM; medios con arginina, lisina yornitina y control; medios base conmanita, sacarosa, xilosa y dulcita; agaracetato de sodio, agar Christensen, caldomucato.• Incubar todas las pruebas por 18 a

• Colocar una capa de vaselinalíquida sobre los medios con aminoácidos yel tubo control.



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24 horas a 37ºC.• Realizar la serotipificación apartir del agar TSA (ver 2.3Serotipificación)

Dia 4• Leer los resultados de las pruebasbioquímicas de acuerdo a la Tabla 2 yanotar los mismos en la Planilla deResultados.

• Realizar la prueba de ONPGutilizando discos de ONPG según loindicado por el fabricante.• Realizar la prueba de indolagregando 1 ml de reactivo de Erlich almedio.

• La confirmación bioquímica y laserotipificación se pueden realizar almismo tiempo.

TABLA 2. Pruebas Bioquímicas para identificación de Shigella spp.

Interpretación de Resultados

ResultadosMedio Reacciones

Negativo PositivoTSI Producción de ácido (si la base

es amarilla y la estría roja, la

producción de ácido se debe ala glucosa)

Base roja Base amarilla

TSI Producción de ácido de lactosay/o sacarosa

Estría roja Estría amarilla

TSI Producción de gas No hay burbujasde gas en la base

Burbujas de gas enla base

TSI Producción de H2S Sin color negro Color negroLIA Producción de H2S Sin color negro Color negroLIA Reacción alcalina, color violeta

a través del medio. Organismosque no descarboxilan la lisinaproducen una estría alcalina yun fondo ácido

Botón púrpura –Superficie amarilla

Botón púrpura –Superficie púrpura

Ensayo deAminoácidos

Lisina/ornitina decarboxilasa,arginina dehidrolasa

Color amarillo Color púrpura

ONPG Β-galactosidasa Sin color amarilloMedio base conazúcares

Fermentación Azul Rosa

Indol Producción de indol Anillo amarillo Anillo rojo-rosado

Las siguientes características pueden ayudar en la identificación de Shigella spp.:

a) Los aislamientos son siempre inmóviles y lisina negativo.



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b) La producción de gas es rara aunque se puede observar ocasionalmente en cepas de

Sh.flexneri, Sh. boydii y Sh. dysenteriae.

2.2.1.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIALES

a) Entre especies de Shigella

En la diferenciación de los cuatro miembros del género se deben tener en cuenta algunas

propiedades bioquímicas:

- Shigella dysenteriae: la mayoría de las cepas no fermentan el manitol, son ornitina

descarboxilasa negativa y tienen propiedades bioquímicas diferenciales entre los serotipos.

Particularmente, Sh dysenteriae 1 es arabinosa e indol negativo y ONPG positivo muy rápido.

- Shigella flexneri: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol y son ornitina

descarboxilasa negativo.

- Shigella boydii: la gran mayoría de las cepas fermentan manitol, son ornitina descarboxilasa

negativo y tienen propiedades bioquímicas diferenciales entre los serotipos.

- Shigella sonnei: indol negativo, ornitina descarboxilasa positivo, ONPG positivo y manitol

positivo.

Los caracteres diferenciales se resumen en la TABLA 3.1

TABLA 3.1. Reacciones Bioquímicas de Shigella spp.

EspecieD-Manitol ONPG Ornitina

decarboxilasa

Sh. dysenteriae - - -

Sh. flexneri + - -

Sh. sonnei + + +

Sh. boydii + - -

Tabla 3.2. Reacciones Bioquímicas de Serotipos de Shigella.

Ver página 45



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b) Entre Shigella spp. y Escherichia coli

La diferenciación de Shigella spp respecto a E. coli es uno de los problemas con que se

enfrenta el laboratorio de microbiología y refleja el hecho que E. coli y las cuatro especies de

Shigella están estrechamente relacionadas sobre la base de estudios de hibridación DNA-DNA.

La mejor aproximación es realizar un conjunto de pruebas bioquímicas. En “Edwards and

Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae”, 4th Ed., se sugiere realizar los ensayos que se

indican en la TABLA 4.

TABLA 4. Diferenciación de Shigella spp. y E. coli.

Ensayo Shigella E. coli

Mucato - +

Acetato - + o (+)

Cit. Christensen - +, (+), -

Indol (producción) - o + +

Lisina decarboxilasa - +, (+), -

Ornitina decarboxilasa - o + +, (+),-

Arginina dehidrolasa +, (+), - +, (+), -

Glucosa (gas) - +Sacarosa +, (+), - +, (+), -

Salicina - +, (+), -

Movilidad - + ó -

+ 90% o más positivo en 1-2 días; (+) positivo tardío; - 90% o más negativo.

Las pruebas citrato de Christensen, acetato de sodio y mucato de sodio son de valor en la

diferenciación de los miembros del género Shigella y Escherichia, particularmente de biotipos

anaerogénicos, no móviles, porque los aislamientos que fermentan mucato o son alcalinos en

agar acetato o citrato de Christensen es muy probable que sean E.coli.

2.2.2.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler

I. Principio

El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de

carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y



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10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso

pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la

punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o

sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve

alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH delmedio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de

SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.

El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede

reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos

bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios.

II. Materiales

El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volúmenes

de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar inclinado

dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha

de preparación y de expiración.

Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar.

III. Procedimiento

A. Con un ansa estéril tomar material.

B. Punzar el fondo en el centro.

C. Retirar el ansa y estriar sobre la superficie del agar.

D. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire.

E. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas.

IV. Resultados

A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o

lactosa (E. coli).

B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente

(Shigella spp.).

C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa).

D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp).

E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.).



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V. Control de Calidad

Bacteria Estría Punción SH2

Salmonella Typhi K A + (*)

Salmonella Paratyphi A K Ac/g -

Salmonella spp. K A +Shigella spp. K A -

Enterobacter aerogenes A Ac/g -

Enterobacter cloacae A Ac/g -

Escherichia coli A Ac/g -

Citrobacter A Ac/g +

Klebsiella A Ac/g -

Proteus vulgaris A A oAc/g +(sucio)

Proteus mirabilis K Ac/g o A + (sucio)

Klebsiella pneumoniae A Ac/g o A -

(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo.

A:ácido; K:alcalino; c/g: cn gas

VI. Consideraciones

A. Cuando se agrupan los miembros de la familia Enterobacteriaceae, las reacciones del

TSI y KIA pueden variar ligeramente. Algunos no fermentadores de lactosa pueden fermentarsacarosa.

B. El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos

resultados ácido/ácido, mientras que lecturas tardías pueden dar falsos resultados

alcalino/alcalino.

C. Una gran producción de SH2 enmascara la reacción de la glucosa. Sin embargo la

glucosa fue fermentada aunque no se vea el cambio de color. Observar si hay producción de

gas.

D. En el TSI, la utilización de sacarosa puede suprimir el mecanismo enzimático que

resulta en la producción de SH2. Por esta razón, algunos organismos pueden demostrar

producción de SH2 en KIA pero no en TSI.



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Agar Lisina Hierro (LIA)

I. Principio

La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje

al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido,

es necesaria la fermentación previa de la glucosa.

Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un

viraje al amarillo en todo el medio.

La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.

Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii,desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio

de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.

II. Materiales

El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en

volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121º C por 15 minutos. Enfriar de

manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera.

III. Procedimiento

A. Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar. Incubar a 37º C por 18 a

24 horas (a veces pueden ser necesarias 48 horas).

IV. Resultados

Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta.

Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje

al amarillo.

La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra.



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Bacteria Estría Punción SH2

Salmonella sp. K K +

Proteus mirabilis R A +

Proteus vulgaris R A +

Morganella morganii K A -

Prov. rettgeri R A -

Providencia spp. R A -

Citrobacter spp. K A +

Escherichia coli K A -

Shigella spp. K A -

Klebsiella spp. K A -

A.ácido; K.alcalino; R: desaminación de la lisina

Este medio no es un sustituto del método estándar de Moeller.

VI. Consideraciones

Dado que decarboxilación de la lisina ocurre únicamente a pH ácido, este medio sólo puede

utilizarse para diferenciar cultivos que fermenten glucosa.

Prueba Del Indol

I. Principio

El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio

rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos

aldehídos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para

detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa

el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli,

y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).



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II. Materiales

A. Caldo triptofano

• Peptona 20.0 g

• Cloruro de sodio 5.0 g

• Agua destilada 1000 ml

A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a

121º C durante 15 minutos. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10ºC para su

conservación.

B. Reactivo de Erlich

• p-dimetilaminobenzaldehido 1.0 g

• alcohol etílico, 95% 95.0 ml

• ácido clorhidríco, concentrado 20.0 ml

Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega

lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo

con una etiqueta y guardar refrigerado en botellas color caramelo.

III. Procedimiento

A. Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene

triptofano.

B. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas.

C. Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo.

D. Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.

E. Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo.

F. Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

IV. Resultados

Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos

después de agregar el reactivo.

Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.



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Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos,

antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y

que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas.

Escherichia coli +; Enterobacter aerogenes -; Klebsiella pneumoniae –

VI. Consideraciones

A. El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La

disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción

falsamente negativa o débilmente positiva.

B. Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubadosaeróbicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de indol.

C. No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada

acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa.

El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

Prueba de la β-Galactosidasa

I. Principio

La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras que la permeasa facilita la

penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa

hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa

carecen de ambas enzimas; sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no

permeasa. El o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro

estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en

galactosa y o-nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se

agrupa de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de

fermentadores de lactosa.



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II.Materiales

A. Solución de ONPG

Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer

fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses.

Rotular la solución y guardar refrigerada (4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o

envueltos en papel de aluminio.

B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0)

Disolver 6,9 g de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solución

de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada

y guardar a 4º C.

III. Procedimiento

A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en

0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba

basada en la observación de un cambio de color.

B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG.

C. Incubar la mezcla a 37º C y examinar cambio de color hasta 24 horas.

IV. Resultados

Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo.

Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.

V. Control de calidad

Escherichia coli +

Salmonella (-)

VI. Consideraciones

A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de

TSI.

B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo.

C. A veces se puede favorecer la liberación de la enzima agregando una gota de tolueno,

se deja reposar unos minutos a 37º C y se agrega luego el ONPG.



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Test de Utilización de Azúcares

I. Principio

Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de

carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en

la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares

se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de

color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del

organismo y de la claridad visual del cambio de pH.

II. Materiales

A. Medio base

• Peptona 10.0 g

• Extracto de carne 1.0 g

• Cloruro de sodio 5.0 g

• Azul de bromotimol 10.0 ml

• Indicador de Andrade 5.0 ml

• Agua destilada 1000 ml

Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar

el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50º C.

Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en

concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azúcares. Dispensar en

volúmenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es

estable por 3 meses.

Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antesde autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar estérilmente

después de enfriar a 50º C.

B. Indicador de Andrade

Disolver 0.5 g de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N

(4%); mezclar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando



22

frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una

decoloración suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%).

C. Solución de azul de bromotimol

Mezclar 47.5 ml de agua destilada con 2.5 ml de NaOH 0,1N y luego agregar 0.1 g deindicador.

III. Procedimiento

A. Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido.

B. Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono.

Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad de

flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a

tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería grande (15 a 20) de

azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el ansa antes de tomar nueva

muestra.

C. Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos

puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados día

por día.

D. En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días.

IV. Resultados

Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio.

Ensayo negativo: no hay cambio de color.


Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo:Escherichia coli: glucosa +

Klebsiella: lactosa +

Yersinia enterocolitica: sacarosa +



23

VI. Consideraciones

A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo.

B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa.

C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción

de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular.D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el

microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No obstante, si

se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar

campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas las enterobacterias son

fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone campanita al medio con

glucosa.

Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa

I. Principio

La decarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de

los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en

la identificación de enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina

y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acciónde una dehidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base

sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio

con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la

glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La

acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a

la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color

violeta.

La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de

Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter

agglomerans (-)

La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus

vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+)

de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).



24

II. Materiales

El medio base más comúnmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio

está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la

forma L y 2% para la forma D, porque los microorganismos son activos sólo frente a la formaL. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3

porciones del medio. El pH se debe ajustar después de agregar el aminoácido y antes de

esterilizar a 6 – 6,2. Fraccionar en volúmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y

autoclavar a 121º C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos y

guardar en heladera.

III. Procedimiento

A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos.B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.

C. Incubar a 37ºC

D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados

Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento.

Ensayo negativo: color amarillo

Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un

fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).


Bacteria Arginina Lisina Ornitina

Proteus vulgaris- - -

Morganella morganii

- - +

Enterobacter cloacae+ - +

Enterobacter aerogenes- + +

Salmonella Typhimurium + + +

Klebsiella spp.- + -



25

VI. Consideraciones

A. Inocular siempre un tubo control.

B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido.

C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de

interpretar la reacción.

D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede

indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar

más indicador antes de interpretar el resultado

E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular.

Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado positivo.

F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de

interpretar los resultados.G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas.

H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso.

Prueba del Acetato

I. Principio

El medio permite determinar la capacidad de las bacterias de utilizar acetato como únicafuente de carbono y de energía. Sirve para diferenciar E. coli de Shigella.

II. Materiales

El medio es igual al agar citrato de Simmons, con la diferencia que lleva 0.25 gr de acetato de

sodio en lugar de citrato. Disolver en agua destilada, dispensar en volúmenes de 3 ml y

autoclavar a 121º C por 15 minutos. Enfriar en forma de estría y guardar en heladera.

III. Procedimiento

A. Tomar material con un ansa estéril e inocular el agar por punción.

B. Incubar a 37º C durante 7 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados

Ensayo positivo: viraje del medio al azul.

Ensayo negativo: no hay cambio de color.



26


E. coli +

Shigella –

VI. Consideraciones

No hay.

Prueba del Mucato

I.Principio

Se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar el ácidomúcico. Es útil para diferenciar Escherichia coli de Shigella.

II. Materiales

Bactopeptona 1.0 g

Acido múcico 1.0 g

Azul de bromotimol 1/500 1.8 ml

NaOH 4N 1.2 ml

Pesar el ácido múcico y disolver en 80 ml de agua destilada Colocar el recipiente sobre un

agitador magnético y agregar 1.2 ml de NaOH 4N aproximadamente (para 100 ml de solución

se debe agregar 2.0-2.5 ml de NaOH 4N gota a gota), hasta virar el color amarillo de la

solución al azul-verdoso; este color debe persistir durante 5 minutos de agitación. El agregado

del álcali es para transformar el ácido múcico poco soluble en la sal soluble, mucato de sodio.

A continuación agregar 1.0 g de bactopeptona, 1.8 ml de azul de bromotimol. y 15.0 ml de

agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 por medio de NaOH 0.1N o HCl 0.1N, si se ha pasado el

pH. Esterilizar por filtración y fraccionar en forma estéril en volúmenes de 3 ml por tubo.

Guardar en heladera.

III. Procedimiento

Tomar material con un ansa estéril e inocular un tubo con mucato. Incubar a 37º C durante 48

horas, realizando lecturas a las 24 horas.



27

IV. Resultados

Ensayo positivo: viraje del color al amarillo o amarillo verdoso.

Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece azul verdoso.

V. Control de Calidad Cepas mucato (+): E. coli, Salmonella Paratyphi B

Cepas mucato (-): Proteus vulgaris, Shigella sp., Salmonella Paratyphi A

VI. Consideraciones

No hay.

Citrato de Christensen

I. Principio

Este medio pone en evidencia la utilización del citrato en presencia de nitrógeno orgánico

(monoclorhidrato de cisteína). Es igual al de citrato de Simmons con la única diferencia que la

fuente de nitrógeno es orgánica. Es útil en la diferenciación entre Escherichia coli y Shigella.

II. Materiales

El medio está disponible comercialmente. Se disuelve el polvo con agua destilada, se caliente

suavemente y se fracciona en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Se esteriliza a

121º C durante 15 minutos y se enfría en pico de flauta. El medio se guarda en heladera.

III. Procedimiento

Se repite todo exactamente igual que lo indicado para el citrato de Simmons, pero las lecturas

se realizan durante 7 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados

Ensayo positivo: color rojo rosado en el pico de flauta.

Ensayo negativo: no se observa cambio de color.


Enterobacter aerogenes +

Escherichia coli +



28

Shigella –

VI. Consideraciones

No hay.

2.3.- SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp.

El uso de métodos de serotipificación con propósitos de vigilancia epidemiológica se basa en

el hecho que los microorganismos muestran variaciones en su composición antigénica. Los

microorganismos producen una variedad de antígenos: componentes estructurales de la célula

(constituyentes de la pared celular, cápsulas, flagelos, fimbrias); productos de secreción de las

células (toxinas, enzimas extracelulares) o antígenos contenidos en el interior de las células.

Químicamente, los antígenos usados con este propósito pueden ser proteínas, carbohidratos, omezclas de ambos componentes.

Debido a la característica del género Shigella de ser inmóviles, solamente se ponen en

evidencia los antígenos (denominados somáticos) compuestos por cadenas polisacarídicas del

lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa, integrante de la pared celular. Cuando un

antisuero específico se mezcla con una suspensión de un cultivo puro de Shigella se observa

una reacción de aglutinación.

Luego del aislamiento e identificación, se realiza la aglutinación en lámina: los anticuerpos en

el suero aglutinarán con la bacteria cuando los antígenos correspondientes estén presentes.


• Ansas descartables

• Láminas de vidrio

Reactivos

• Solución salina 2%

• Antisueros polivalentes y monovalentes de Shigella para la serotipificación de

miembros del género Shigella. Se necesita el siguiente conjunto de antisueros:

a) Tres antisueros de Shigella dysenteriae.



29

- A(I -) que aglutina los serotipos indol negativos (1,3,4,5,6,9 y 10)

- A(I +) que aglutina los serotipos indol positivos (2,7 y 8)

- Un antisuero monovalente anti Sh. dysenteriae 1.

b) Antisueros polivalentes de Shigella flexneri para aglutinar los 6 serogrupos y antisueros

monovalentes para diferenciar los serotipos dentro de cada serogrupo..

c) Un antisuero de Shigella sonnei.

d) Dos antisueros de Shigella boydii

- C(I-) para aglutinar serotipos indol negativo (1,2,3,4,6,8,10,12 y 14).

- C(I+) para aglutinar serotipos indol positivo (5,7,9,11,13 y 15).

La nomenclatura de los antisueros mencionados corresponde a los nombres dados por el

Instituto Nacional de Producción de Biológicos - ANLIS “Carlos G. Malbrán”, Argentina.


• Mezclar cuidadosamente, con un

palillo sobre una lámina de vidrio, un ansadel cultivo en TSA y una gota de soluciónsalina 2% (control de autoaglutinación).

• Mezclar cuidadosamente, con unpalillo sobre una lámina de vidrio, un ansadel cultivo en TSA y una gota de antisueropolivalente. Mover la lámina suavemente por2 minutos.

• La aglutinación positiva con losantisueros polivalentes continúa con laaglutinación con algunos de los antisuerosmonovalentes correspondientes, paradeterminar el serotipo del cultivo.

• Si no hay aglutinación el cultivo

no está rugoso y se procede al segundopaso.

• La selección de los antisuerospolivalentes se debe hacer en base a lahistoria de la región o país y a laspruebas bioquímicas diferencialesindicadoras de especie• Una suspensión homogéneaindica una reacción negativa. Unaaglutinación indica una reacción positiva.

• Cuando un cultivo que presentacaracterísticas bioquímicas de Shigella aglutina pobremente o no aglutina, sepuede estar en presencia de unaislamiento capsulado. Estos cultivos sedeben calentar en un baño de agua a100ºC por 15 a 30 minutos y luego serepite el ensayo de aglutinación.



30

Comentarios

Situaciones atípicas que se pueden presentar:

a) TSI alcalino/ácido sin gas, SIM (-v-), acetato de sodio negativo, ureasa negativa y

aglutinación con el antisuero específico pobre o negativa: estos cultivos se deben calentar a

100º C.

b) TSI alcalino/ácido con gas, SIM (---), acetato de sodio negativo, ureasa negativa: a

estos cultivos se les debe probar aglutinación porque algunos serotipos de Sh. dysenteriae, Sh.

flexneri y Sh. boydii fermentan glucosa con producción de gas.



31

Cepa rugosa

FLUJOGRAMA PARA SEROTIPIFICACIÓN DE SHIGELLA spp.

Cultivo con propiedades bioquímicas de Shigella

Aglutinación con solución salina 2%

Negativo

Positivo Sh. flexneri (probar serotipos 1a 6)

Aglutinación con OShB

Negativo

Aglutinación con OShD

Positivo Sh. sonnei

Negativo

Aglutinación con OShC

Positivo Sh. boydii (probar serotipos indol + y -)

Negativo

Aglutinación con OShA

Positivo Sh. dysenteriae (probar serotipos indol + y -, y serotipo 1)

Negativo

Calentar y repetirel procedimiento

Positivo



32

Referencias

Bopp, Ch., Brenner, F., Wells, J., Strockbine N. 1999. Escherichia, Salmonella, Shigella,. In

Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. (Ed.). Cap. 28, pp. 459-474.

Ewing, W. 1986. Edwards and Ewing´s Identification of Enterobacteriaceae. 4 th edition.

Elsevier Science Publishers.

Le Minor, L., Richard, C. 1993. Méthodes de Laboratoire pour l´Identification des

Entérobactéries. Institut Pasteur.



33

CAPÍTULO III –– PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD

Los laboratorios de microbiología son ambientes de trabajo que pueden presentar riesgos de adquirir

enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en ellos. Los accidentes en el laboratorio

ocurren por ausencia de entrenamiento, desconocimiento, experiencia escasa, cansancio, trabajar muy

rápido, no seguir prácticas seguras y subestimar la peligrosidad del trabajo.

Frente a estas situaciones se introdujo el concepto de bioseguridad que es el “conjunto de métodos

tendientes a minimizar el riesgo asociado al manejo de microorganismos, mediante la protección de

los operadores, personas del entorno, productos y medio ambiente”. Define las condiciones de

contención provistas por el uso de equipos de seguridad.

Los microorganismos se han clasificado en grupos de riesgo en función de su patogenicidad, forma y

facilidad de transmisión, la dosis infecciosa, y la existencia de tratamiento.

Los microorganismos con los cuales se trabajará Salmonella, Shigella y otros miembros de la Familia

Enterobacteriaceae, pertenecen al Grupo de Riesgo II, donde el riesgo individual es moderado y e

riesgo comunitario limitado. Estos microorganismos pueden provocar enfermedades en humanos y

animales, pero con pocas probabilidades de riesgo grave para el personal de laboratorio, animales omedio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección pero se dispone de

medidas de tratamiento y de prevención y el riesgo de propagación es limitado.

1.- NIVEL DE LABORATORIO

El laboratorio donde se trabaja con estos microorganismos es de Nivel de Bioseguridad 2. En

este nivel el personal debe contar con una capacitación específica para el manejo de los

agentes patógenos y el director es un profesional competente. El acceso al laboratorio está

restringido cuando se están desarrollando actividades y la puerta de entrada debe tener el

símbolo indicador. Se toman precauciones especiales cuando se manejan elementos corto-

punzantes y se utilizan elementos de protección (ambos, delantales, guantes, máscaras

faciales) con los procedimientos que pueden representar un riesgo para el operador. Las

mesadas de trabajo tienen que ser impermeables al agua, resistentes al calor moderado y a los

productos químicos empleados en la desinfección.



34

El laboratorio debe disponer de un lavatorio para el lavado de manos y de adecuados sistemas

de decontaminación del material.

En los laboratorios está prohibido comer, beber, fumar, manipular de lentes de contacto,

maquillarse.

2.- ELEMENTOS DE PROTECCION

a) Ambos, delantales o uniformes de laboratorio durante la permanencia en el mismo; esta

vestimenta no debe salir del laboratorio y el personal no puede llevarla a su casa para el

lavado.

b) Guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales infecciosos o

superficies contaminadas. Los guantes se descartan luego de su uso, no se lavan ni se reusan y

no se deben usar fuera del laboratorio.

c) Protección Facial se requiere su uso cuando existe la posibilidad que algún procedimiento

genere gotas o aerosoles La protección facial esta dada por anteojos, máscaras faciales,

barbijos.

d) Gabinete de seguridad biológica, cuando existe la posibilidad de generación de gotas o

aerosoles. El gabinete que se utiliza es Clase II que protege al operador, los productos y el

medio ambiente. El aire externo no entra directamente a la mesa de trabajo sino que

previamente pasa por un filtro HEPA para luego ingresar al área de trabajo, y también sale al

ambiente a través de otro filtro, (Fig. 1).

Es obligatorio que los gabinetes se evalúen y certifiquen en el momento de la instalación en el

laboratorio, cuando se trasladan y por lo menos una vez por año a partir de ese momento.

FIGURA 1



35

Dentro del gabinete debe ingresar solamente el material indispensable para trabajar para

perturbar lo menos posible la circulación del aire dentro del gabinete.

3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO

1. Leer cuidadosamente todas las instrucciones antes de comenzar con los protocolos detrabajo.

2. Considerar POTENCIALMENTE CONTAMINADO a todo material de vidrio,

plástico, pipetas, espátulas, que esté en contacto con las supensiones bacterianas.

3. Todo material contaminado potencialmente infeccioso se tratará en autoclave. No

efectuar ninguna limpieza del mismo en el laboratorio.

4. Descartar los residuos plásticos potencialmente infecciosos en recipientes resistentes a

la perforación, que contienen hipoclorito de sodio al 1%. Estos recipientes NO SEDEBEN LLENAR COMPLETAMENTE.

5. Descartar los materiales con cultivos microbianos en recipientes con bolsas plásticas

de color rojo, para su posterior eliminación.

6. Descartar material de vidrio en recipientes de acero inoxidable con tapa de seguridad

para su posterior descontaminación en autoclave.

7. Cada mesada debe tener propipetas, guantes, alcohol 70% y una solución de

hipoclorito de sodio al 10%.

8. Notificar a las personas responsables del área o instructores de trabajos prácticos

cuando se produzcan derrames, quienes tomarán las medidas adecuadas según el caso.

9. Descartar el material de vidrio roto envolviendo los trozos en papel, colocarlo en bolsa

plástica y finalmente en un recipiente resistente y rotulado con claridad “vidrios

rotos”.

4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO

1. Mantener la calma y avisar al resto de las personas.

2. Dar aviso al Departamento de Seguridad e Higiene.

3. Si el fuego es pequeño y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de

consideración no se arriesgue y evacue el laboratorio.

4. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas.

5. No lleve objetos ya que pueden entorpecer su salida.



36

6. Si pudo salir del laboratorio, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos

especializados se encarguen.

5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA

Se deben tener disponibles los números telefónicos correspondientes.

6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS

El acondicionamiento seguro de muestras para diagnóstico bacteriológico es responsabilidad

de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el responsable del laboratorio y el

personal de la empresa de transporte. El embalaje de los materiales infecciosos debe evitar lafuga de los mismos por rotura o mal empaque del envío.

Los materiales para diagnóstico se deben enviar en el “sistema de triple envase” de acuerdo a

las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3. (Fig. 2)

El sistema consiste de:

a) Recipiente primario, a prueba de pérdidas, con cierre hermético (tubo pequeño o vial),

en el cual se coloca la muestra.

b) Recipiente secundario, resistente, a prueba de fugas, impermeable, donde se incluye el

recipiente primario.

c) Envoltorio externo, para proteger el envase secundario de influencias externas, como

daño físico o agua.

El espacio entre los recipientes primario y secundario se debe llenar con material absorbente,

para retener el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una pérdida durante el

transporte.

Los formularios con datos de la muestra, notas y todo otro tipo de información que

identifiquen o describan a la muestra, al remitente y al destinatario, se deben colocar

alrededor del recipiente secundario.



37

FIGURA 2

REFERENCIAS

Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed., World Health Organization Geneva, 2004 www.who.int

Biological Safety. Principles and Practices, 3rd ed. Fleming, D.O., Hunt, D.L. Ed.

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed., Richmond J., McKinney

Ed. CDC/NIH, 2001. www.cdc.gov.

Safety in Health-Care Laboratories. World Health Organization Geneva, 1997. www.who.int/ .



38

CAPÍTULO IV - MEDIOS DE CULTIVO

Agar MacConkey

Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no

fermentadores de lactosa.

Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas

residuales. Es un medio de baja selectividad para usar con inóculos pequeños.

Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de

lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador

debido a la producción de ácido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia

y un halo turbio por la precipitación de las sales biliares por la acidez del medio. Las

bacterias no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran

el medio, dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio

MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito.

El medio contiene: peptona, sales biliares, rojo neutro, cristal violeta, sales y lactosa.

Interpretación

Salmonella, Shigella: incoloras, medio amarillo

Escherichia: rojas, halo turbio

Enterobacter, Klebsiella: grandes, rosadas a rojo, mucosas

Proteus: incoloras

Agar EMB

Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patógenas intestinales Gram

(-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciación de Salmonella y Shigella lac/sac (-), de la flora acompañante lac (-)/lac(+) (Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas

hydrophila). La combinación de colorantes es la que permite diferenciar entre los fermentadores

y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos coliformes la fermentan

más rápido que a la lactosa.

El desarrollo de las bacterias Gram (+) está inhibido por los colorantes del medio (eosina

amarilla y azul de metileno).



39

Agar EMB Levine contiene solamente lactosa.

El medio contiene: peptona, sales biliares, tiosulfato, carbonato de calcio, lactosa y sacarosa.

Interpretación

Salmonella, Shigella: transparentes, ámbar rosado

Escherichia: violáceas con brillo metálico y centro negro azulado

Enterobacter, Klebsiella: colonias grandes, mucosas sin brillo metálico y centro oscuro.

Bacterias lac (+): negras o centro oscuro, halo transparente.

Bacterias lac (+) o sac (-): incoloras.

Agar SS

Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y

animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve también para Yersinia

enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores.

La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentración de tiosulfato y el citrato

inhiben la flora acompañante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación

de sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo

neutro a rojo.

El medio contiene: extracto de carne, peptona, lactosa, citrato de hierro amoniacal, tiosulfato,

verde brillante, rojo neutro.

Interpretación

Salmonella: incoloras, transparentes, centro negro

Shigella: incoloras, transparentes, medio amarillo

Proteus: transparentes, centro rojo, medio amarillo

Escherichia coli: rosadas a rojo, medio rojo

Enterobacter aerogenes: rosadas a crema, opacas, mucosas

Bacterias lac +: rojizas, mucoides, centro negro

Agar XLD

Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella.

La degradación de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al



40

amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de sulfhídrico. La

decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura

por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+).

La diferenciación de Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones:fermentación de xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfhídrico. La xilosa

diferencia Shigella de Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina

diferencia Salmonella de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa

en exceso evitan que los coliformes lis + reviertan la condición alcalina de los

microorganismos consumidores rápidos de xilosa/lisina. La producción de sulfhídrico ocurre

en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en condiciones ácidas la

precipitación negra se inhibe.

El medio contiene: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato,

tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, rojo fenol, sales.

El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede

eliminarse por filtración.

Interpretación

E. coli, Enterobacter: amarilla, opacas, c/precipitado Aeromonas: amarilla, opacas, c/precipitado

Klebsiella: amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado

Citrobacter: amarilla, opacas, centro negro

Serrati, Hafnia: amarilla, opacas

P. vulgaris, P. mirabilis: amarilla, translúcidas, centro negro

Salmonella: igual color del medio, centro negro

Shigella, Providencia:igual color del medio, translúcidas

Salmonella Typhi: amarilla, ligeramente opacas

Agar Hektoen

Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluidas algunas shigellas.

No tiene efecto inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompañante. Debido a

los dos indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac + tienen una diferencia



41

cromática con las colonias lac -; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y

salicina. El tiosulfato con el hierro dan coloración negra a las colonias sulfhídrico+. Las sales

biliares inhiben a la flora acompañante.

Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y Proteus.

El medio contiene: peptona, extracto de levadura, sacarosa, lactosa, salicina, tiosulfato, citrato de

hierro amoniacal, sales biliares, azul de bromotimol, fucsina.

Interpretación

Shigella, Providencia: verdes, planas, transparentes

Salmonella, Proteus: verde-azuladas, c/s centro negro

Pseudomonas: verde-azuladas, planas, borde irregularColiformes: salmón, halo de precipitación



42

CAPITULO V - PLANILLA DE RESULTADOS

Aislamiento de Shigella de heces – Morfología en agar selectivo

Fecha:____________________

Nombre:__________________Muestra:__________________

Color Resultados ComentariosMorfología enMacConkey

Morfología en EMB

Morfología en SS

Morfología en XLD

Morfología en Hektoen



43

PLANILLA DE RESULTADOS

Aislamiento de Shigella de heces – Pruebas Bioquímicas

Fecha:____________________Nombre:__________________Muestra:__________________

Color Resultados ComentariosTSI profundidadTSI estríaTSI gasTSI H2SLIA profundidadLIA estríaArginine dihidrolasaLisine decarboxilasaOrnithine decarboxilasa

Mucate (fermentación)Acetate (utilización)Cit. ChristensenIndole (reacción)Sucrose (fermentación)Manitol (fermentación)Xylose (fermentación)Dulcita (fermentación)Β-galactosidasa



44

PLANILLA DE RESULTADOS

Aislamiento de Shigella de heces – Serotipificación

Fecha:____________________Nombre:__________________Muestra:__________________

A) Antisueros polivalentes

OSh A OSh B OSh C OSh D

B) Antisueros de serotipos

Antisueros polivalentes Antisueros de serotiposOSh AOSh BOSh COSh D



45

Tabla 3.2. Reacciones Bioquímicas de Serotipos de Shigella spp.

+ 90% o >; - 90% o >; +/- >> +; -/+ >>-; d diferentes reacciones

Subgrupo/Serotipo Man. % Dul. % Xil. % Ram. % Raf. % Glic. % Indol % Orn. Decarb. %

Sh. dysenteriae 1 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0

2 - 0 - 0 - 0 + 98 - 0 "(+)/+" 98 + 100 - 0

3 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "(+)/+" 100 - 0 - 0

4 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "(+)/+" 100 - 0 - 0

5 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0

6 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "-/(+)" 38 - 0 - 0

7 - 0 - 0 - 0 "(+)/+" 90 - 0 - 0 + 100 - 0

8 - 0 - 0 "+/(+)" 96 - 0 - 0 "+/(+)" 100 + 100 - 0

9 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 "+/(+)" 100 - 0 - 0

10 - 0 - 0 + 100 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0

Sh. flexneri 1 + 95 - 0 - 0 - d 89 - 0 "-/+" 35 - 0

2 + 99 - 0 - 0 - d 77 - 0 "-/+" 44 - 03 + 98 - 0 - 0 d 12 d 88 - 0 "+/-" 88 - 0

4 + 99 - 0 - 0 d 23 d 82 - 0 "+/-" 55 - 0

4 - 0 - 0 d 71 "-/+" 48 - 3 - 0 + 98 - 0

5 + 99 - 0 - 0 - 5 d 72 - 0 + 95 - 0

6 + 99 d 80 - 4 - 6 - - d 98 - 0 - 0

Sh. boydii 1 + 100 - 1 "+/(+)" 97 - 0 - - "(+)/+ 96 - 0 - 0

2 + 100 - 1 - 0 - 0 - - "+/(+)" 100 - 0 - 0

3 + 100 d 75 d 86 - 0 - - "+/(+)" 91 - 0 - 0

4 + 99 "-/(+)" 28 - 0 - 0 - - "+/(+)" 100 - 0 - 0

5 + 100 - 0 (+) 94 - 0 - - d 61 + 100 - 0

6 "+/(+)" 100 "(+)/+" 100 + 100 - 0 - - "(+)/+" 100 - 0 - 0

7 + 100 - 0 + 98 - 0 - - "(+)/+" 98 + 100 - 0

8 + 100 - 0 + 94 - 0 - - "(+)/+" 100 - 0 - 0

9 + 95 - 0 - 0 d 80 - - "(+)/-" 82 + 100 - 0

10 + 94 + 100 d 84 - 0 - - "(+)/+" 100 - 0 - 0

11 + 100 "-/(+)" 34 "+/(+)" 100 - 0 - - "(+)/+" 100 + 100 - 0

12 + 100 "-/(+)" 14 - 0 - 0 - - "-/+" 14 - 0 - 0

13 + 100 - 0 - 0 - 0 - - "(+)/-" 63 + 100 + 100

14 "-/+" 29 - 0 "(+)/+" 100 - 0 - - "+/(+)" 100 - 0 - 0

15 + 90 - 0 - 0 - 0 - - "(+)/+" 64 + 100 - 0

Sh. sonnei + 99 - 1 - 1 "+/(+)" 98 d 84 d 46 - 0 + 99

manual shigella 2007

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