MARKER AFLP (AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM)

Oleh Amrullah M, S.PdNIM. 8136173002

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI KELAS APROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

OUTLINE1. Pengertian marka molekuler2. Apa itu marka Amplified Fragment Length

Polymorphism (AFLP)3. Manfaat dan Kegunaan marka Amplified

Fragment Length Polymorphism (AFLP)4. Kelebihan dan kekurangan marka Amplified

Fragment Length Polymorphism (AFLP)5. Mekanisme Kerja marka Amplified Fragment

Length Polymorphism (AFLP)

PENDAHULUAN

• Penanda genetik, juga disebut dengan penanda, marker, marka, atau markah di berbagai kepustakaan, merupakan penciri individu yang terdeteksi dengan alat tertentu yang menunjukkan genotipe suatu individu. Penanda genetik menggambarkan perbedaan genetik diantara individu dalam suatu organisme atau spesies.

• Bentuknya dapat berupa penampilan fenotipe/morfologi tertentu, kandungan senyawa (protein atau produk biokimia tertentu), berkas (band) pada suatu lembar hasil elektroforesis gel atau kromatogram, atau hasil pembacaan sekuensing.

MARKER

• Marka Molekuler/ Marka DNA/ Marka Genetik :Potongan/fragmen DNA pada lokasi tertentu dalam genom.

• Penggunaan marka molekuler utamanya untuk memonitor variasi susunan DNA di dalam dan pada sejumlah spesies serta merekayasa sumber baru variasi genetic dengan mengintroduksi karakter-katakter baik yang baru dari landraces dan spesies-spesies liar.

• Level analisis marka molekuler : sekuen DNATidak terlihat dibuat suatu metode atau teknik untuk memunculkan perbedaan marka tersebut berdasarkan pita-pita yang muncul pada gel agarose hasil elektroforesis.

• Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) merupakan teknik yang bekerja atas dasar selektif PCR amplifikasi dari DNA fragmen yang degenerate dengan enzim retriksi. Pada dasarnya AFLP merupakan gabungan dari teknik RLFP dan teknik PCR.

• Prinsip dasar teknik AFLP adalah mendeteksi perbedaan letak marka DNA di seluruh genom

yang berupa urutan basa tertentu.

Manfaat dan kegunaan marka AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

• Metode AFLP biasanya digunakan untuk meneliti variasi genetik diantara individu dalam suatu spesies, mengevaluasi variasi genetik untuk koleksi plasma nutfah dan skrining biodiversitas.

• Metode AFLP juga sering digunakan untuk membuat peta genetik dan percobaan untuk menemukan gen-gen yang bertanggung jawab terhadap karakter tertentu.

• Keunggulan teknik AFLP adalah dapat men-deteksi variasi genetik tanpa memerlukan informasi urutan basa genom. Selain itu, teknik AFLP memiliki tingkat reproduksi yang tinggi berdasarkan ampli-fikasi selektif fragmen hasil digesti genom (Mueller dan Wolfenbarger, 1999).

• Teknik AFLP mampu menganalisis genom secara menyeluruh sehingga dihasilkan informasi yang memadai untuk mengana-lisis variasi genetik (Mba dan Tohme, 2005)

Kelebihan dan kekurangan marka AFLP

• Kelebihan metode ini yaitu tidak memerlukan informasi sekuen dari genom, hasil amplifikasinya stabil, tingkat pengulangan dan variabilitasnya sangat tinggi, dan dapat mendeteksi variasi genetik diantara spesies, varietas, atau kultivar yang berkerabat dekat.

• Kekurangan metode ini yaitu pengerjaan yang rumit dan intensif dibandingkan metode lainnya, pengadaan alat dan bahan sangat mahal, serta dibutuhkannya kits yang berbeda-beda yang dapat beradaptasi dengan ukuran genom selama analisis.

Mekanisme kerja marka AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

• Langkah awal pelaksanaan marka molekuler adalah mengambil bagian tanaman, biasanya berasal dari daun muda. Kemudian diisolasi DNA-nya, kemudian dicari mana bagian yang bertanggung jawab terhadap karakter unggul pada tanaman.

• Biasanya DNA yang diisolasi kemudian akan dihubungkan dengan bank data genetika, untuk mengidentifikasi gen dan menduga karakter yang diekspresikan.

MEKANISME MARKA MOLEKULER AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism)

dalam menganalisis VARIASI GENETIK JAMBU METE (Anacardium occidentale L.) (Richael Syam, et all, 2012).

• Pengambilan sampel dilakukan secara acak dengan mengambil daun yang masih muda atau pada pucuk pertama. Sampel daun yang telah dipilih kemudian dimasukkan dalam termos es untuk sementara waktu sebelum dimasukkan dalam freezer. DNA jambu mete diekstraksi dari bagian daunnya dengan menggunakan metode CTAB (cetyltrimetyl ammonium bromide).

• Sampel yang akan diekstraksi di timbang (0,15 mg), lalu dipotong kecil-kecil, digerus menggunakan lumpang dengan ban-tuan nitrogen cair, dimasukkan dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 1,5 ml buffer ekstraksi divortex dan dipanaskan pada waterbath selama 30 menit pada suhu 65 ⁰C (setiap 5 menit sekali di-keluarkan dan dibolak-balik) lalu disentrifuse pada 10.000 rpm selama 10 menit, suhu 4 ⁰C, mengambil supernatan lalu dimasukkan dalam eppendorf baru dan ditambahkan 1 x volume kloroform isoamil untuk melarutkan senyawa-senyawa organik.

• Selanjutnya disentrifuse lagi pada 10.000 rpm selama 10 menit, suhu 4 ⁰C, kemudian super-natan diambil dan ditambahkan 1 x volume sodium asetat dan 2 x volume etanol absolut dingin lalu diendapkan selama 2 jam dalam freezer.

• Setelah pengendapan kemudian disentrifuse lagi pada 10.000 rpm selama 20 menit, suhu 4 ⁰C, kemudian supernatan dibuang dan mengambil endapannya yang berada pada bagian bawah

• Selanjutnya endapan tersebut ditambahkan dengan 500 μl ethanol 70% untuk membersihkan dari sodium asetat, dikocok sebentar lalu disentrifuse lagi pada 10.000 rpm selama 10 menit, suhu 4 ⁰C lalu endapannya diambil dengan membuang cairan bagian atasnya kemudian dikeringkan pada suhu 37 oC di oven selama 20 menit hingga kering kemudian ditambahkan 20-30 μl H₂O, kocok hingga larut.

• selanjutnya larutan DNA disimpan pada di freezer pada suhu -20 ⁰C. Selanjutnya larutan DNA ditambahkan enzim RNase hingga konsentrasi 100 μg/ml lalu diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 1 jam. Selanjutnya larutan ditambahkan dengan 500 μl buffer TE, dikocok lalu ditambahkan kloroform isoamil alkohol (24 : 1).

• Larutan dihomogenkan dengan vorteks, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas kemudian dipindahkan pada tabung baru. Sempel kemudian ditambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M, pH 5,2 dan 2 volume etanol absolut. Tabung dibolak balik perlahan lahan kemudian diinkubasi pada suhu -20 ⁰C selama 30 menit. Pelet dikeringkan dengan vakum selama 15 menit. Setelah pelet kering kemudian ditambahkan buffer TE sebanyak 20-30 µl, tabung dipanaskan pada suhu 50 ⁰C dengan heatblock sampai pelet larut.

Hasil isolasi DNA diuji dengan elektroforesis gel agarosa 0,8 %

menurut Sambrook dan Russell (2001).

• Hasil positif gel agarosa adalah munculnya pita yang berpendar jika gel dilihat di bawah sinar ultraviolet.

• Hasil negatif elektroforesis gel agarosa adalah tidak adanya pita yang berpendar jika gel agarosa dilihat di bawah sinar UV.

• Hasil isolasi DNA jambu mete yang didapatkan disimpan pada suhu 4 oC, dan dapat digu-nakan untuk aplikasi selanjutnya.

Digesti genom dilakukan menurut invitro-gen (2003), digesti genom dilakukan dengan menggunakan enzim

restriksi EcoRI/MseI• Sampel genom (500 ng dalam 5 µl), enzim EcoRI/MseI (0,5

µl), 5 x RL-buffer (10 µl), dan milliqH 2O (30 µl) sampai volume 50 µl dicampurkan di dalam tabung eppendorf 1,5 ml.

• Campuran kemudian dicampur secara perlahan dan disentrifugasi singkat untuk menurunkan seluruh cairan dalam tabung

• Sampel diinkubasi dalam inkubator selama 2 jam dengan suhu 37 ⁰C. Inkubasi sampel selama 15 menit pada suhu 70 ⁰C dilakukan untuk menginaktivasi enzim. Tabung diletakkan dalam kotak es sampai tahap selanjutnya.

Ligasi adapter dilakukan menurut invitro gen (2003).

• Sampel yang telah didigesti ditambah-kan larutan ligase adapter (2 µl), enzim T4 DNA ligase (1 µl), 10 mM ATP, sampel dicampurkan perlahan, disentrifugasi, kemudian diinkubasi pada suhu 20 ⁰C ± 2 ⁰C selama 2 jam.

• Sampel diencerkan 10 kali dengan mengambil 10 µl sampel kemudian dipindahkan ke tabung eppendorf 1,5 ml dan dila-rutkan dengan 90 µl buffer TE. Sisa sampel disimpan pada suhu -20 ⁰C.

Preamplifikasi dilakukan menurut invitrogen (2003) dengan modifikasi yaitu penambahan 5 mM dNTP.

• Preamplifikasi dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA (5 µl), pre-amp primer mix (26 µl), 10 x super buffer (2 µl), 5 mM dNTP sebanyak 0,8 µl, dan enzim Taq-polymerase (5 unit/µl) sebanyak 0,08 µl didalam tabung eppendorf 200 µl. Larutan dicampur secara perlahan.

• Sampel dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan 24 siklus seperti 94 ⁰C selama 30 detik, 56 ⁰C selama 30 detik, dan 72 ⁰C selama 60 detik dengan temperatur akhir 4 ⁰C

• Hasil preamplifikasi disimpan pada suhu 20 ⁰C di freezer. • Sebelum digunakan sebagai cetakan pada amplifikasi

selektif, hasil preamplifikasi diencerkan dengan milliqH₂O.

Amplifikasi selektif dilakukan menurut invitrogen (2003).

• membuat campuran dengan komposisi primer EcoRI sebanyak 0,5 µl dan primer MseI sebanyak 0,3 µl, 5 mM dNTPs (0,4 µl), 10 x super buffer (1,0 µl), milliq H₂O sebanyak 2,8 µl, dan enzim Taq polymerase 5 unit/µl sebanyak 0,04 µl.

• Reaksi amplifikasi dilaku-kan pada tabung mikrosentrifugasi 200 µl dengan komposisi DNA sampel hasil preamplifikasi yang telah diencerkan dan komposisi campuran. Larutan dicampur perlahan.

• Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR. Program yang digunakan adalah sebagai berikut:

Satu siklus 94 ⁰C selama 30 detik, 65 ⁰C selama 30 detik (penurunan 0,7 ⁰C setiap

siklus hingga mencapai 560 C) dan 72 ⁰C selama 60 detik untuk 12 siklus dan sisa 24 siklus dilakukan dengan suhu 94 ⁰C

selama 30 detik, suhu 56 ⁰C selama 30 detik, dan suhu 72 ⁰C selama 60 detik dan diakhiri dengan suhu 10 ⁰C.

Hasil amplifikasi selektif kemudian dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid menurut

Sambrook dan Russell (2001).

• Langkah pertama adalah menyiapkan alat pencetak gel.• Alat–alat pencetak gel terdiri atas dua buah lempeng

kaca, dua buah pemisah, dan dua buah penjepit kaca.• Gel poliakrilamid 6% dapat dibuat dengan cara

mencampurkan 13,3 ml polyacrilamide gel 45% (29 : 1), 41,4 ml H₂O, 10 x TBE 10 ml, dan urea 40 g. Larutan diinkubasi pada suhu 55 ⁰C sampai seluruh urea larut. Ammonium persulfate 1,6% sebanyak 3,3 ml dan TEMED sebanyak 50 µl ditambahkan pada larutan gel dan diaduk selama 5 menit.

• Pencetak gel disiapkan dengan cara, kaca panjang diberi campuran larutan bind silane, etanol absolut, asam asetat glasial sebanyak 1 ml dan disebar merata pada permukaan kaca dengan menggunakan tisu

• Setelah 5 menit kaca diberi etanol absolut sebanyak 2 ml dan dilap dengan tisu. Pencucian dengan etanol dilakukan sebanyak 3 kali. Kaca pendek yang terhubung dengan tangki buffer diberi repel silane sebanyak 2 ml dan disebar merata pada seluruh permukaan kaca dengan tisu. Setelah 10 menit, kaca diberi H₂O dan dilap dengan tisu.

• Pencetak gel dirancang dengan cara, meletakkan pemisah setebal 0,4 mm diletakkan diatas kaca pendek.

• Kaca panjang diletakkan diatas kaca pendek dan pemisah. Kedua lempeng kaca kemu-dian dijepit dengan penjepit pada kedua sisi, kemudian bagian bawah kaca ditahan dengan menggunakan karet silikon.

• Pencetak gel diletakka secara horizontal.• Campuran gel dimasukkan ke pencetak gel dengan

menggunakan syringe 60 ml. Gel kemudian didiamkan selama 30-60 menit.

• Sharktooth comb diangkat secara perlahan ketika gel sudah mengeras dan bagian comb yang tajam dimasukkan ke dalam gel 1 mm, sehingga terbentuk well yang rata.

• Gel diletakkan pada tangki elektroforesis. Penampungan buffer atas diisi dengan 500 ml buffer 1 x TBE, sedangkan penampungan buffer bawah diisi dengan 350 ml buffer 1 x TBE. Sampel DNA dicampur dengan loading buffer formamide (20 µl).

• Sampel didenaturasi pada suhu 94 ⁰C selama lima menit kemudian langsung diletakkan.

• Sampel dimasukkan ke dalam well dengan tips dan mikro-pipet sebanyak 3µl. Elektroforesis dilakukan selama 3 jam 40 menit dengan daya 40 W.

• Setelah elektroforesis selesai, buffer dipindahkan dari tempat penampungan. Pemisah dan kedua kaca dilepaskan lalu gel menempel pada kaca panjang.

• Analisis pita AFLP dilakukan dengan memberikan angka 1 untuk keberadaan pita dan angka 0 untuk tidak adanya pita pada tabel data biner. Jumlah seluruh pita dan baris yang mengandung pita polimorfisme dihitung, kemudian persentase polimorfisme dihitung berdasarkan rumus (Chen et al., 2004)

• Pita polimorfis adalah pita yang tidak terdapat pada seluruh sampel sedangkan pita umum adalah pita yang terdapat pada seluruh sampel.

• Interpretasi pita dilakukan untuk mempermudah dalam melihat lokasi pita-pita spesifik.

• Data binar seluruh primer yang mengandung pita polimorfis dimasukkan ke dalam program SPSS (Statistical Package for Social Science) versi 15.0 metode Complete Linkage fungsi Phi (1,0).

• Analisis data biner menghasilkan gambar dendogram.

DAFTAR PUSTAKA• Richael Syam, Gusti Ray Sadimantara, dan Muzuni. Analisis Variasi Genetik Jambu

Mete (Anacardium occidentale l.) Asal Sulawesi Tenggara Menggunakan Marka Molekuler AFLP. Jurnal Penelitian Agronomi Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo Vol. 1 No. 2 Hal. 164-173

• Azrai, M. 2005. Sinergi Teknologi Marka Molekuler Dalam Pemuliaan Tanaman Jagung. Jurnal Litbang Pertanian 25: 81-89.

• Mba, C. dan J. Tohme, 2005. Use of AFLP markers in surveys of plant diversity. Methods in enzy-mology. 395: 177–201

• Saunders, J.A., S. Mischke, dan A.A. Hemeida, 2001. The use of AFLP techniques for DNA finger-printing in plants. Beckman Coulter, Inc., Fullerton. 9 hlm

• Garcia, A.A.F., L. Luciana, Benchimol, A.M.M. Barbosa, I.O. Geraldi, C.L. Souza Jr. And A.P. de Souza. 2004. Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR Markers for Diversity Studies in Tropical Maize Inbred Lines, Genetics and Molecular Biology 27: 579-588.

• Gagakijo, http://gagakijo.blogspot.com/2012/05/metode-teknik-marka-molekular-dilakukan.html diakses, 05 Maret 2013