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Curso 2009-2010 Coordinadores: Óscar J. Cordero, Ana Viñas, Jaime Gómez-Márquez Autores: Emilia Rebolledo, Rosa Ana Sueiro, Francisco de la Torre, María Teresa Herrera, Javier Sampedro, Fátima Adrio, Francisco Salgado, Jesús Aboal, Carmen Leirós, Carmen Bermejo

1. MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Y BIENESTAR ANIMAL…….......................... 1

2. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS................................. 19

3. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA........................... 37

4. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y MICROSCOPIA ............................................ 45

5. TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN Y ELECTROFORESIS .……………….............. 53

6. MEDIO FÍSICO Y TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA ........................................... 65

7. MÉTODO CIENTÍFICO Y TÉCNICAS DE MUESTREO.................................................. 69

8. CONTENIDOS DE BIBLIOTECA ................ 113

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1. MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Y BIENESTAR ANIMAL

(código calendario de prácticas: FA)

MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES,…

INSTRUMENTOS BÁSICOS DE MEDIDA

BALANZAS DE LABORATORIO Y PIPETAS

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas y manejo de una balanza de precisión de calibración

externa.

1.2 Consideraciones prácticas y manejo de pipetas. Pipetas automáticas, fijas y variables.

Pipetas repetitivas

2. Introducción

La fisiología y otras ramas de la biología son ciencias cuantitativas que requieren de un sistema

de medición estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medición precisa.

2.1 Balanzas de laboratorio

Uno de los instrumentos de medida más usados en el laboratorio es la balanza, utilizada para

medir cantidades pequeñas de masa.

La masa, propiedad característica de los cuerpos, es la cantidad de materia de una sustancia o

material. Concepto diferente al de peso: fuerza de la atracción gravitatoria que la Tierra ejerce sobre la

materia.

La balanza compara la masa desconocida de una sustancia con la masa de un patrón o patrones de

referencia (internos o externos), sometidas ambas a la misma aceleración debida a la gravedad. Al

proceso de comparar masas se denomina pesada.

El rasgo que define a las balanzas de laboratorio es el de la precisión junto al de alta resolución.

Una vez calibradas, tienen también un alto grado de exactitud.

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Exactitud: grado de concordancia entre el valor real y el valor medido.

Precisión: capacidad de dar el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas

condiciones. Grado de concordancia o repetitividad de un resultado.

Una balanza será precisa cuando diferentes medidas de una misma magnitud sean muy

parecidas. Una medida común de la variabilidad es la desviación estándar de las mediciones.

Resolución: incremento de peso más pequeño que permite diferenciar una medida de otra

Legibilidad: división más pequeña en la pantalla de la balanza

2.1.1 Tipos de balanzas

Las balanzas de laboratorio varían en su capacidad máxima de carga y en su legibilidad, y se clasifican

como

1. Microbalanzas: capacidad de 0,5-3 g; legibilidad de 0,001 mg

2. Balanzas semimicro: capacidad 30-150 g, según la casa comercial, y legibilidad de 0,01 mg

3. Balanzas analíticas: 60 -250 g y legibilidad de 0,1 mg

4. Balanzas de precisión: capacidad de carga de 80 - 600 g; legibilidad 0,001g- 0,1 g

Microbalanza Balanza analítica Balanzas de precisión

Algunas balanzas, del tipo 2-4, tienen capacidad y legibilidad dual: pueden aumentar su

capacidad disminuyendo su legibilidad o disminuir su capacidad y aumentar su legibilidad.

4


2.1.2 Consideraciones prácticas en medidas de masa

1. Localización de la balanza

a) En una sala con una entrada, el mínimo número de ventanas. Evitar la luz directa del sol y corrientes

de aire. Evitar choques y vibraciones.

Si las balanzas están ubicadas en lugares con alto grado de vibración, se recomienda

colocarlas sobre mesas antivibraciones (fabricadas en granito masivo, la amortiguación por aire evita

todo tipo de oscilaciones y vibraciones de una forma efectiva).

b) Mantener la temperatura de la sala constante. Humedad entre 45 - 60%.

c) Realizar las medidas lejos de fuentes de calor y de aparatos que utilicen ventiladores.

2. Cuidados básicos

a) Comprobar que la cámara de medida y el plato estén limpios

b) Verificar siempre la nivelación de la balanza

c) Conectar y esperar tiempo de calentamiento. Si se deja en el modo “stand by” se evita posteriores

esperas

d) Usar siempre un pesasustancias o frasco de la menor medida posible, limpios y secos

e) No usar frascos de plástico cuando la humedad esté por debajo del 30 - 40%

f) La temperatura del frasco y su contenido deben de estar a la misma temperatura del ambiente de la

cámara de medida. Las diferencias de temperatura causan corrientes de aire

g) Evitar el contacto directo de los dedos al poner o sacar los pesasustancias o frascos de la cámara de

medida

h) Poner el pesasustancias o frasco en el centro del plato de medida

i) Verificar si el mostrador indica cero al empezar la operación. Tarar la balanza si fuese necesario

j) Calibrar la balanza regularmente si los patrones de referencia son externos. Las balanzas analíticas de

precisión que utilizan patrones internos pueden calibrarse automáticamente

Ejercicio 1. Nivelación, calibración y precisión de una balanza Denver Maxx

Preparación de 100 mL de NaCl 1 M

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2.2 Pipetas

En el laboratorio, la medición precisa del volumen es tan importante como la medición precisa de

la masa. La medición fiable del volumen se realiza con una pipeta, una bureta o un matraz aforado.

Las pipetas permiten la transferencia de volúmenes medidos exactamente de un recipiente a otro.

2.2.1 Tipos de pipetas de uso común en el laboratorio

1. Aforadas: transfieren un sólo volumen fijo, las hay desde 0.5 a 200 mL

2. Graduadas: transferencia de 0.1 a 50 mL

Ambas se llenan hasta la marca de calibración. La superficie alta de un líquido contenido en un

tubo estrecho presenta una marcada curvatura o menisco. Es una práctica común usar la parte inferior

del menisco de los líquidos acuosos como el punto de referencia en la calibración y empleo de las

pipetas.

El llenado de las pipetas nunca se debe de hacer aspirando con la boca. Existen accesorios

auxiliares para macropipeteado que facilitan la operación de carga y descarga.

Aspiradores de seguridad Dentalab Pipeta graduada Pipeta aforada

Aspirador Macro de Brand

La transferencia se realiza apoyando la pipeta en el borde del recipiente recibidor y nunca se

sopla el líquido residual.

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Ejercicio 2. Manejo de aspiradores de seguridad de pipetas de la casa Dentalab.

1. Aspiración: Gire la rueda hacia arriba y aspire, sin producir burbujas, hasta situarse un poco

por encima de la marca de calibración. Desplace lentamente la rueda en sentido contrario para el ajuste

de la pipeta. Preste atención al menisco.

2. Vaciado: Presionar la palanca una vez que la pipeta esté dentro del tubo o recipiente

recibidor.

3. Pipetas automáticas: micropipetas y macropipetas

a) Micropipetas: transferencia de volúmenes de microlitros de líquido

- monocanal de volumen fijo: único volumen de transferencia, existen distintas pipetas que

cubren el intervalo entre 1 μL y 1000 μL

- monocanal de volumen variable: elección del volumen de transferencia mediante

desplazamiento de un micrómetro de ajuste localizado en la parte delantera o superior del

dispositivo. Poseen un indicador del volumen seleccionado

Con un número reducido de aparatos se cubre el intervalo entre 0,1 μL y 1000 μL

- multicanal: igual que la anterior pero dispensando 4, 8 ó 12 veces simultáneamente el mismo

volumen. Intervalo entre 0,5-300 μL

MicrómetroIndicador de volumen

Monocanal fija y variable Multicanal y variable

b) Macropipetas: transferencia de volúmenes de mililitros de líquido

- monocanal de volumen variable: hasta 2, hasta 5 o hasta 10 mL

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El uso adecuado de las pipetas automáticas está asociado a la elección de la punta de pipeta

correspondiente.

N: 0,1 – 20 μL A: 0,5 – 20 μL B: 2 – 200 μL C: 5 – 300 μL D: 50 – 1000 μL E: 0,5 – 5 mL * Las más comunes son la B y la D, puntas

amarillas y azules respectivamente

Ejercicio 3. Manejo de carga y descarga de pipetas automáticas.

1. Elija una pipeta de volumen variable de las disponibles en el laboratorio

2. Seleccione el volumen deseado girando con cuidado el micrómetro. Nunca supere la

capacidad máxima de la pipeta

3. Inserte la punta desechable adecuada a la pipeta elegida

4. Oprima el botón pulsador situado en la parte superior de la pipeta hasta un primer tope. Esta

operación desplaza un volumen de aire conocido en la punta desechable

5. Inserte la punta desechable dentro del líquido, agua destilada en nuestro caso, y libere la

presión sobre el botón pulsador. Este hecho aspira el líquido por la punta

6. Coloque la punta sobre la pared del recipiente recibidor y oprima el botón pulsador hasta el

primer tope. Después de un segundo, oprima el botón hasta un segundo tope para vaciar completamente

la punta.

7. Expulsar la punta desechable

8. Practique hasta conseguir el dominio de la pipeta

9. Cuando esté seguro pase al ejercicio siguiente

8


Ejercicio 4. Comprobación del pipeteo por medida gravimétrica (balanza Denver Maxx).

1. Utilice una pipeta de 1 mL fija o variable

2. Utilizar como líquido de transferencia agua destilada

3. Situar un vaso de precipitados de 25 mL sobre la balanza y ajustarla a cero

4. Pipetear en el vaso un mililitro

5. Anote su masa

6. Vuelva a tarar la balanza y añada 1 mL más

7. Anote su masa

8. Repita la operación hasta completar 5 muestras

9. Cambie la pipeta con un compañero e inicie el proceso desde el punto 3- 8

El uso de pipetas automáticas exige una comprobación regular de la exactitud y precisión de las

mismas

Exactitud: indicada por E = diferencia entre el valor medio y el valor nominal referida al valor nominal

en %

El control de la exactitud se realiza mediante control gravimétrico y aplicando un factor de

corrección Z

Z = 1,0032 μL/mg si el control se realiza a una temperatura de 21,5 ºC a una presión

atmosférica de 1013 mbar y con agua destilada

Precisión: indicada por el coeficiente de variación y definido éste como la desviación estandard en %,

referida al valor medio.

Ejercicio 5. Simulación del control de la exactitud de la pipeta automática de 1 mL, utilizando

los datos obtenidos en el ejercicio 4

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4. Pipetas automáticas repetitivas

En el laboratorio se dispone también de pipetas automáticas repetitivas para la dosificación en

serie o para situaciones que requieren transferencia repetida de un volumen particular

Permite dosificar repetitivamente un volumen

determinado con una sola carga

El número de repeticiones depende del volumen

seleccionado en el mando deslizante de ajuste y del

combitip corespondiente (ver tabla 1)

Mando selector de volumen Palanca de dosificación

Palanca de bloqueo y de llenado combinados

Tabla 1

Ejercicio 6: Manejo de una pipeta repetitiva

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INSTRUMENTO BÁSICO DE MEDIDA

PEACHÍMETRO O PHMETRO 1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas, calibración y manejo de un pHmetro 2. Introducción

El pHmetro, portátil o de sobremesa, es un instrumento utilizado en los laboratorios químicos y

biológicos para medir el pH de las disoluciones. El pH determina muchas de la características notables

de la estructura y actividad de las biomacromoléculas y, por tanto, el comportamiento de células y

organismos.

El pHmetro se utiliza también para determinar el pH de aguas, suelos, bebidas y alimentos. Los

instrumentos portátiles facilitan la medida en campo.

Al pHmetro, que mide la diferencia de potencial existente entre dos electrodos, se conecta un

electrodo combinado de pH: un electrodo de vidrio (indicador) y un electrodo de referencia montados

ambos en un solo cuerpo. Se constituye así el sistema necesario para la medida de pH, que debe ser

siempre precedida de una calibración del equipo con disoluciones tampón de pH conocido.

Si el pHmetro ha de ser informado de la temperatura de la muestra se conecta también un sensor

de temperatura, a no ser que el electrodo disponga del mismo. La medida del pH se ve afectada por la

temperatura.

Electrodo combinado de pH

En el dibujo se muestran los componentes y ubicación de las partes esenciales de un electrodo

combinado de pH, con el electrodo indicador en el centro y el de referencia en el exterior.

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Tipos de elementos de referencia

Conector

Cable

Cabezal De penetración

Para emulsiones

Orificio de relleno

De superficie

Tipos de electrodos Para micromuestras

Electrolito interno: HCl 0,1M saturado con AgCl

Membrana de vidrio: sensible a H3O+

Elemento de referencia: cristales de AgCl encapsulados y con barrera a iones Ag+

Electrolito de referencia: (KCl 3M) puente salino entre el electrodo y el exterior. Impide que los componentes de la disolución objeto de medida se mezclen con los del electrodo de referencia.

Diafragma: punto de unión entre electrolito y muestra. De cerámica porosa, que permite un pequeño flujo de electrolito hacia el exterior estableciendose el circuito eléctrico para medición

Electrodo con sensor de temperatura

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3. Consideraciones prácticas

1. Si el electrodo de pH es rellenable, verificar el nivel de electrolito de referencia. Éste debe

llegar cerca del orificio de llenado, asegurando un buen flujo de electrolito a través del

diafragma.

2. Verificar la ausencia de burbujas de aire en la zona de la membrana, si se observa alguna

sacudir el electrodo cuidadosamente

3. Limpiar el electrodo con agua destilada. No secar con un paño, utilizar un papel sin pelusa,

aplicándolo suavemente para evitar cargas electrostáticas, y retirar el exceso de agua

4. Si las mediciones se realizan a temperatura ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir como

mínimo el diafragma

5. Si las mediciones se realizan a temperatura distinta de la ambiente sumergir el electrodo

hasta cubrir el sensor de temperatura y el elemento de referencia.

4. Calibración

1. Se recomienda una calibración diaria antes de proceder a las mediciones. Si se realizan

muchas es aconsejable repetir la calibración cada 2 ó 3 horas, para compensar la posible

deriva del electrodo (potencial de asimetría) o una pérdida de sensibilidad del mismo

(pendiente)

2. Con el pHmetro conectado, y el electrodo sumergido en disolución tampón de pH conocido

(7.02 generalmente), esperar el tiempo indicado en las instrucciones del aparato antes de

proceder a la calibración

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3. Calibrar siempre con disoluciones tampón frescas. Estas se alteran con el paso del tiempo,

con el calor, la luz y, especialmente, con la contaminación

4. No devolver al frasco del tampón la disolución utilizada. Utilizar frascos pequeños para la

calibración

5. Entre medidas, lavar con agua destilada y utilizar un papel sin pelusa para retirar el exceso

de agua

6. Es recomendable para la calibración, así como para las mediciones, utilizar agitación. Un

imán y un agitador magnético proporcionan rapidez y repetibilidad en las lecturas.

Tipos de calibración

1. En un punto, cuando se miden valores de pH cercanos al valor del tampón utilizado

2. En dos puntos, la habitual. Se recomienda como primer tampón el de pH 7 y como segundo

tampón puede utilizarse el de pH 4 ó 9 dependiendo de si se trabaja en la zona ácida o alcalina.

Se corrige el potencial de asimetría y la pérdida de sensibilidad del electrodo

3. En tres puntos: si se mide en toda la escala de pH. Primer punto el tampón de pH 7, segundo y

tercer punto dos de los valores restantes (2, 4.01, 9.21, 10.9 a 25ºC). Se compensa el potencial

de asimetría y sensibilidad tanto en la zona ácida como en la alcalina

Ejercicio 1. Calibración en dos puntos de los equipos, marca CRISON, disponibles en el

laboratorio, y siguiendo el manual de instrucciones del equipo correspondiente.

DISOLUCIONES Y CONCENTRACIONES

DISOLUCIONES STOCK, DISOLUCIONES DE TRABAJO, DISOLUCIONES TAMPÓN

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas y preparación de disoluciones usadas en la experimentación

1.2 Preparación de una disolución tampón y medida del pH

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2. Introducción

La experimentación biológica utiliza técnicas de laboratorio que pueden ser de observación,

analíticas y /o bioensayo. El bioensayo puede realizarse in vivo, utilizando organismos intactos, o in

vitro, utilizando órganos, tejidos o suspensiones de células aisladas.

El bioensayo es una técnica muy utilizada en Fisiología Animal. Los estudios requieren

habitualmente el uso de disoluciones cuya concentración iónica y osmolaridad mantengan la integridad

y funcionalidad celular, y en los in vitro, además, que la disolución esté tamponada. Es decir, que

contenga un sistema tampón o buffer para amortiguar las variaciones de pH que pudieran producirse a

lo largo de un trabajo experimental, al igual que hace el plasma.

3. Disoluciones y concentraciones

En el laboratorio la concentración de las disoluciones se expresa de dos formas: concentración

molar o concentración porcentual.

Concentración molar, es el nº de moles de una especie contenida en un litro (1L) de disolución.

Unidad de concentración molar = molaridad (M), dimensiones mol.L-1 o mmoles.mL-1 de disolución.

1 mmol = 10-3 mol

Concentración porcentual (partes por cien): tres formas de expresarla

a) tanto por ciento en peso (p/p): peso del soluto . peso de la disolución -1. 100

b) tanto por ciento en volumen (v/v): volumen del soluto . volumen de disolución-1. 100

c) tanto por ciento en peso/volumen: peso del soluto (g) . volumen de la disolución (mL)-1.100

Ejercicio 1. - Preparar 100 mL de NaCl 154 mM

- Preparar una disolución de NaCl 0.9% (p/v)

¿Qué observación destacaría?.............................................................................

4. Disoluciones madre y disoluciones de trabajo

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En el laboratorio, es habitual preparar las disoluciones de trabajo a partir de disoluciones

concentradas, a las que se les llama disoluciones madre o disoluciones stock.

Las disoluciones stock, además de proporcionar rapidez, disminuyen los posibles errores que se

producirían durante continuas pesadas de los componentes de las disoluciones de trabajo.

Para preparar disoluciones diluidas a partir de las concentradas se utiliza la siguiente ecuación,

la cual se basa en que el nº de moles de soluto de la disolución diluida es igual al de moles en el

reactivo concentrado.

Vconcentrada . Moles/L concentrada = Vdiluida . Moles/Ldiluida, , es decir

V1.C1 = V2.C2 Volumen en litros y concentración molar en moles/L

O volumen en mL y concentración molar en mmoles/mL

Ejercicio 2. Tomando como disolución stock la de NaCl 1 M, calcular el volumen que habría

que tomar para preparar 10 mL de NaCl 150 mM

5. Disoluciones tampón

Sistemas tampón o buffers son aquellas disoluciones cuya H+ apenas varía al añadir ácidos o

bases fuertes. Suelen ser mezclas binarias de un ácido débil y una sal del mismo ácido con base fuerte, o

bien una base débil y la sal de esa base con un ácido fuerte.

La eficacia amortiguadora del sistema depende de la proporción relativa de las formas disociada y

sin disociar, siendo máxima cuando el cociente sal /ácido es próximo a la unidad. Esta proporción está

relacionada con el pH por la ecuación de Henderson-Hasselbach.

pH = pK + log sal / ácido

El Tris-HCl es un tampón para medios biológicos de uso habitual en el laboratorio. Está compuesto

de la base Tris-aminometano (Tris), y su sal cloruro de Tris. Sin embargo, no se suele comprar la sal,

sino sólo la base, que se disuelve y se lleva al pH requerido añadiendo HCl. La cantidad de HCl no se

suele medir con precisión, sino que es la necesaria para llevar la solución al pH deseado.

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Ejercicio 3. Preparar 100 mL de Tris-HCl 0.1M a pH = 8, midiendo en el pHmetro a temperatura

ambiente

6. Disolución isotónica

Una disolución en la que se pueden introducir las células sin que se vea alterado su volumen celular

se denomina isotónica. Son disoluciones isotónicas (moleculares, electrolíticas o mixtas) las que tienen

la misma osmolaridad que el plasma.

Osmolaridad /L = M . M = concentración molar del soluto

= nº de partículas en que se disocia el soluto cuando está en disolución

Osmolaridad/L de una disolución constituida por un conjunto de solutos = suma de osmolaridades parciales

Osmolaridad

El movimiento pasivo de agua a través de una membrana semipermeable, y a favor de su gradiente de concentración, se denomina ósmosis. El grado de presión necesario para interrumpir completamente la ósmosis recibe el nombre de presión osmótica.

La presión osmótica es proporcional al número de partículas disueltas / unidad de volumen líquido. La concentración de las disoluciones osmóticas en base al nº de partículas, se expresa en osmoles. Un osmol es la cantidad de soluto no disociado cuya presión osmótica corresponde a un mol.

Cuando los no electrolitos se disuelven en un litro de agua, las moléculas individuales entran en solución separadamente, y cada una constituye una partícula disuelta. Como un mol de soluto tiene el mismo número de moléculas (nº de Avogadro), una disolución de glucosa 0.1M tiene el mismo nº de partículas que una disolución de urea 0.1M. Y ambas la misma presión osmótica = 0.1 osmoles.

Cuando los electrolitos se disuelven en un litro de agua, las moléculas individuales se disocian en dos o más iones, cada uno de los cuales constituye una partícula disuelta. Así 0.1 mol de ClNa, que se disocia en Cl- y Na+, da lugar a dos partículas y, por lo tanto, ejerce una presión osmótica = 0.2 osmoles.

Una disolución que contiene 1 osmol de soluto disuelto por litro de agua se dice que tiene una osmolaridad de 1 osmol/L.

Ejercicio 4. Si la osmolaridad plasmática es de 0.3 Osmoles/L, ¿una disolución de NaCl 0.15M es

isotónica? ¿Y una de Na2PO4 1M?

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2. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

(código calendario de prácticas: MICRO)

TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

PRÁCTICA 1. Preparación de medios de cultivo y soluciones. Esterilización

Esterilización

La esterilización es la eliminación de todos los organismos presentes en un material, incluidas las

esporas y otros agentes infecciosos. La metodología utilizada depende de la naturaleza del material que

se va a esterilizar. Los principales métodos para destruir o eliminar microorganismos son los siguientes:

1. Calor húmedo. Esterilización por vapor

Es el método más común, eficaz y cómodo de esterilización. El vapor de agua a elevadas temperaturas

mata los microorganismos porque degrada los ácidos nucleicos y desnaturaliza las proteínas. El tiempo

y la temperatura necesarios para la esterilización de los medios de cultivo y del material dependen de

los microorganismos que se pretenden destruir, de la composición química de los medios, de la cantidad

de material y del volumen de medio que se esteriliza.

La esterilización por vapor se realiza en un autoclave, aparato similar a una olla a presión en la que el

aire presente inicialmente en la cámara se expulsa quedando completamente llena de vapor de agua. La

presión de vapor interna asciende hasta que se alcanzan 121º C de temperatura y 1,1 Kg/cm2 de presión.

En estas condiciones todas las formas vegetativas y endosporas se destruyen en 10-12 minutos, aunque

el tiempo estándar de esterilización es de 15 minutos. Por lo general, el autoclave se emplea para

esterilizar medios de cultivo y soluciones acuosas no termolábiles, material de vidrio, plástico y metal.

2. Calor seco

Es menos efectivo que el calor húmedo, necesitándose temperaturas más altas y tiempos más largos que

con el calor húmedo para matar a los microorganismos. La muerte celular se produce debido a la

oxidación de los componentes celulares y la desnaturalización de proteínas. Este tipo de esterilización

se realiza en hornos especiales de esterilización y requiere un tiempo de exposición largo del material

(por ejemplo, 2 horas a 160º C o 1 hora a 180º C). Se utiliza principalmente para la esterilización de

material de vidrio (placas de Petri no desechables, pipetas, etc.) y metal, y en algunos casos para

esterilizar productos en polvo, aceites y materiales similares.

Una alternativa de esterilización con calor seco es la incineración, que se utiliza para la destrucción de

material hospitalario contaminado, animales de experimentación, etc. En el laboratorio, la incineración

se emplea para la esterilización de las asas de siembra metálicas antes y después de ponerlas en contacto

con los cultivos.

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3. Filtración

Es el método alternativo a la esterilización por calor cuando se esterilizan líquidos termosensibles o

gases. La filtración no destruye los microorganismos, sino que los elimina mecánicamente, combinando

un proceso de retención y absorción. La técnica consiste en hacer pasar el líquido o gas a través de un

material poroso, el filtro, con tamaño de poro demasiado pequeño para que pasen los microorganismos,

pero suficientemente grandes para permitir el paso del líquido. Estos filtros retienen las bacterias, pero

dejan pasar los virus.

Los filtros que se utilizan normalmente en la “esterilización” de líquidos son el filtro de membrana de

acetato de celulosa o nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45 y 0,22 μm. Éstos últimos son

los que garantizan la eliminación de las bacterias, ya que las bacterias más pequeñas conocidas miden

alrededor de 0,3 μm. Para facilitar el paso de las soluciones a través de los filtros de membrana se aplica

presión o se hace vacío, teniendo presente que los recipientes de recogida de la solución filtrada deben

estar estériles. Hay un tipo de filtro, denominado filtros de alta eficacia de retención de partículas de

aire (HEPA, high-efficiency particulate air) que se utilizan en las cabinas de flujo laminar y de

seguridad biológica porque permiten eliminar el 99,9 % de las partículas mayores de 0,3 μm presentes

en el aire.

4. Radiaciones

4.1. Radiaciones no ionizantes. Luz UV. La radiación ultravioleta no produce ionización al incidir

sobre una molécula, pero sí excitación de sus electrones, haciendo que reaccione de forma anómala. La

acción bactericida más efectiva de la luz UV se produce a 260 nm, que es el máximo de absorción del

DNA. La capacidad de penetración de la luz UV es muy baja, no pudiendo atravesar el vidrio o

líquidos, por lo que sólo se utiliza para la esterilización de superficies (las cámaras de flujo laminar) o la

esterilización de aire en quirófanos o salas asépticas. En algunos casos específicos también puede usarse

para la esterilización de agua.

4.2. Radiaciones ionizantes. Rayos gamma y rayos X. Debido a su elevada energía, causan la

ionización de las moléculas y la aparición de radicales libres altamente reactivos que destruyen

componentes celulares como el DNA y las proteínas. Las radiaciones ionizantes, además de tener un

mayor poder microbicida que la radiación ultravioleta, presentan un mayor poder de penetración,

pudiendo esterilizar el interior de material empaquetado. Aunque son altamente efectivas contra formas

vegetativas y endosporas, no siempre lo son contra virus. Debido a la peligrosidad del equipo de

radiación, este tipo de esterilización se limita a las aplicaciones industriales a gran escala, empleándose

para esterilizar material plástico, material farmacéutico (antibióticos, hormonas), etc.

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5. Esterilización con agentes químicos

La mayor parte de los agentes químicos antimicrobianos se utilizan en la desinfección y no destruyen

las esporas, por lo tanto no son esterilizantes Sin embargo, en condiciones apropiadas, compuestos

como el óxido de etileno o el glutaraldehido eliminan formas vegetativas y esporas, por lo que deben

clasificarse dentro de los agentes esterilizantes. Estos compuestos se emplean en la esterilización de

instrumentos y material de plástico.

Medios de cultivo y soluciones

Los medios de cultivo son las soluciones nutritivas que se usan en el laboratorio para el crecimiento y

mantenimiento de los microorganismos. También se pueden emplear para demostrar una característica

fisiológica o bioquímica del microorganismo (utilización de una fuente de carbono, producción de

ácido, producción de gas, etc). Antes de su empleo, tanto los medios de cultivo como las soluciones y

todo el material utilizado para la manipulación de los microorganismos deben estar estériles para evitar

la entrada de microorganismos contaminantes.

Tipos de medios de cultivo

En función de su composición química se pueden dividir en:

Medios definidos: se conocen la composición química exacta del medio. Permite conocer los

compuestos que metaboliza el microorganismo estudiado.

Medios complejos o no definidos: contienen algunos componentes cuya composición química se

desconoce. En su preparación se suelen emplear peptonas (hidrolizados parciales de proteínas de la

leche, carne, soja, levaduras), extractos de carne, de levadura u otras sustancias muy nutritivas pero

no definidas químicamente. Resultan muy útiles y son los más utilizados porque un único medio

puede satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos.

Tanto si se trata de medios definidos como complejos, hablamos de medios de cultivo líquidos o

caldos y medios sólidos. Para pasar un medio líquido a medio sólido tan solo es necesario añadir un

agente gelificante que permita al medio líquido solidificar: la adición de agar al 1,5 % al medio líquido

es el procedimiento comúnmente empleado.

Existen una serie de medios de cultivo cuya composición ayuda a establecer o poner de manifiesto

determinadas propiedades de los microorganismos que pueden servir para su aislamiento y/o

clasificación. En este caso hablamos de:

Medios generales: permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos aerobios y

anaerobios facultativos (ej: Triptona Soja agar, Agar Nutritivo, etc).

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Medio de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en concreto

pero sin inhibir el crecimiento del resto de la flora acompañante. Se utilizan para favorecer el

crecimiento de microorganismos exigentes.

Medios selectivos: Incorporan en su composición compuestos químicos que inhiben el crecimiento

de determinados grupos de microorganismos mientras permite el crecimiento de otros, facilitando

así su aislamiento. Se utilizan para aislar grupos específicos de bacterias.

Medios diferenciales: permiten distinguir tipos diferentes de microorganismos que se encuentran

generalmente relacionadas bien morfológica o bioquímicamente. Incorporan compuestos químicos

que tras la inoculación e incubación producen un cambio característico en el aspecto del

crecimiento bacteriano y/o el medio que los rodea, lo que permite su diferenciación (ej. Agar

Citrato de Simons).

En numerosos casos, un mismo medio puede ser a la vez selectivo y diferencial (ej. Agar Eosina-Azul

de Metileno Levine, Agar Xilosa Lisina Desoxicolato, etc.), o de enriquecimiento y diferencial (ej. Agar

Sangre).

Es importante tener en cuenta que distintos microorganismos pueden tener requerimientos nutricionales

muy diferentes. Por tanto, para el cultivo correcto de un microorganismo determinado es necesario

conocer sus exigencias nutritivas y suministrarlas en los medios de cultivo con los nutrientes esenciales

en la forma y proporción adecuados.

Por otro lado, las soluciones salinas no son medios de cultivo, puesto que no permiten el crecimiento de

los microorganismos. Su función consiste en mantener los microorganismos en suspensión sin que se

vea afectada su viabilidad, debido a que son soluciones isotónicas.

Objetivo

Conocer las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo y soluciones empleadas en el

crecimiento, aislamiento e identificación de diversos microorganismos.

Material y Procedimientos

Numerosas casas comerciales suministran a los laboratorios los medios de cultivo deshidratados, que se

reconstituyen con la adición de agua destilada. Para su preparación, se siguen las indicaciones

realizadas por las propias casas comerciales sobre el medio de cultivo.

Los medios líquidos se hidratan con agua destilada, se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos

de ensayo, matraces, botellas, etc) y se tapan con un tapón metálico, de PVC o de algodón hidrófugo.

22


La mayoría de ellos se deben esterilizar y, una vez esterilizados, se mantienen a temperatura ambiente

para que enfríen. Cuando la temperatura del medio de cultivo es igual a la temperatura ambiental, ya se

pueden utilizar.

Los medios sólidos, una vez hidratados, se hierven para que el agar pueda formar un gel homogéneo

con el medio cuando se enfríe. La mayoría de los medios se esterilizan en autoclave. Si se van a

preparar tubos con medio sólido, el medio se distribuye en los tubos antes de esterilizarlo. Si la

finalidad es la preparación de placas, el medio se deja enfriar en un baño o a temperatura ambiente una

vez estéril. Cuando la temperatura del medio alcanza aproximadamente los 50º C se reparte

asépticamente en placas de Petri estériles a razón de 15-20 mL de medio por placa. El medio se debe

dejar solidificar antes de su empleo.

Algunos medios de cultivo contienen componentes altamente selectivos y no es necesario esterilizarlos.

Por lo general, los medios de cultivo que no se utilizan se mantienen a 4 º C hasta su empleo.

Para la preparación de las soluciones salinas, se disuelven las sales en el agua destilada, se distribuyen

en los recipientes adecuados y se esteriliza en el autoclave.

A continuación se indican los medios de cultivo y soluciones que se van a preparar así como el material

necesario y el procedimiento a seguir en su preparación. Para esta práctica, los alumnos formarán 4

grupos.

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GRUPO I

Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.

- Dispensador para pipetas de vidrio.

- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.


- Placas de Petri de 90 mm de diámetro vacías y estériles.

- Tubos de tapón de rosca de 5-10 mL de capacidad.

1. Triptona Soja Agar (TSA)

- Medio de cultivo para verter en placa.

- Cantidad a preparar: 250 mL.

- Repartir en 10-12 placas de Petri.

- Componentes/L:

- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)

- Agar 15 g

- Agua destilada 1.000 mL

Procedimiento: Disolver la Triptona Soja Agar en el agua destilada calentando hasta ebullición.

Esterilizar a 121°C/15 min. Verter en placas a razón de unos 20 mL por placa.

2. Agar Citrato de Simons (Agar Citrato)

- Medio de cultivo para preparar en tubos inclinados.


- Repartir en 10 tubos (5 mL/tubo).

- Componentes/L:

- Agar Citrato de Simons Cantidad fabricante (24,2 g/L)


Procedimiento: Disolver el Agar Citrato de Simons en el agua destilada calentando hasta

ebullición. Repartir en tubos y esterilizar a 121°C/15 min. Dejar solidificar en forma inclinada.

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GRUPO II

Material

- Rotulador.







1. Triptona Soja Agar (TSA)




- Componentes/L:

- Triptona Soja caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)

- Agar 15 g


Procedimiento: Disolver la Triptona Soja Agar en el agua destilada calentando hasta ebullición.


2. Agar semisólido

- Medio de cultivo para repartir en tubos.



- Componentes/L:

- Agar Nutritivo Cantidad fabricante (8 g/L)

- Agar 7,5 g


Procedimiento: Disolver los componentes en agua destilada calentando hasta ebullición. Repartir

en tubos y esterilizar a 121°C/15 min. Dejar solidificar los tubos en vertical.

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GRUPO III

Material

- Rotulador.







1. Medio Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD)




- Componentes/L:

- Medio XLD Cantidad fabricante (55 g/L)


Procedimiento: Disolver el medio XLD en el agua destilada calentando hasta ebullición. NO

ESTERILIZAR. Verter en placas a razón de unos 20 mL por placa.

2. Triptona Soja Caldo (TSB)

- Medio de cultivo para repartir en tubos.

- Cantidad a preparar: 50 ml.


- Componentes/L:

- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)


Procedimiento: Disolver el TSB en el agua destilada. Repartir en tubos. Esterilizar a 121°C/15 min.

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GRUPO IV

Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidrio de 10 mL de capacidad.





- Tubos de tapón de rosca de 10 mL de capacidad.

1. Agar Eosina-Azul de Metileno Levine (Agar EMB Levine)




- Componentes/L:

- EMB Levine Cantidad fabricante (37,4 g/L)


Procedimiento: Disolver el medio EMB Levine en el agua destilada calentando hasta ebullición.


2. Solución Salina

- Solución para repartir en tubos.



- Componentes/L:

- NaCl 8,5 g


Procedimiento: Disolver el NaCl en el agua destilada. Repartir en tubos y esterilizar a 121°C/15

min.

Cuestiones

A.- Indica los medios de cultivo asignados a tu grupo de trabajo y los cálculos realizados para la

preparación de la cantidad especificada.

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PRÁCTICA 2. Cultivo de microorganismos en el laboratorio. Recuento de

microorganismos viables

Primera parte. Cultivo de microorganismos en el laboratorio

Una vez preparado un medio de cultivo, se puede inocular (es decir, añadir los microorganismos) y a

continuación incubar en las condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. Para la adecuada

manipulación de los microorganismos es esencial el uso de la técnica aséptica. Esta técnica consiste en

una serie de procedimientos que evitan la entrada de organismos no deseados o contaminantes durante

la manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles (ver como ejemplo Figura 1). El

problema más común en el laboratorio de microbiología es la contaminación a través del aire. Así pues,

cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de modo que los contaminantes del aire no

penetren.

Figura 1. Transferencia aséptica. Procedimiento se toma de muestra a partir de un medio líquido. Imagen tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

28


En numerosas ocasiones, la finalidad del cultivo es obtener y mantener un único tipo de

microorganismo para poder estudiarlo en detalle. Cuando el cultivo contiene un único tipo de

microorganismo se denomina cultivo axénico o puro. Si, por el contrario, el cultivo contiene varios

tipos de microorganismos se denomina cultivo mixto. La pureza de los cultivos bacterianos se puede

verificar mediante la observación de las características de las colonias sobre una placa sembrada porque

las distintas especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico.

Objetivos

Conocer diferentes métodos de siembra empleados para el aislamiento, identificación y

mantenimiento de los microorganismos. Aprender a diferenciar entre cultivos puros y cultivos

mixtos.

Conocer y comprender las ventajas que supone la utilización de distintos tipos de medio de cultivo

para el aislamiento e identificación de los microorganismos.

En esta práctica se emplearán diferentes métodos de siembra para el cultivo de microorganismos:

1. Siembra en placa

1.1. Siembra en placa en estrías o por agotamiento

Es un método cualitativo de aislamiento de microorganismos procedentes de una muestra o de un

cultivo de laboratorio. Consiste en arrastrar con el asa de siembra un número cada vez más

pequeño de células sobre la superficie de un medio de cultivo sólido en placa de Petri. Las células

aisladas se multiplicarán formando colonias independientes. Una colonia es una formación o

agrupación macroscópicamente visible de microorganismos en un medio sólido. Es importante

indicar que cada colonia es un cultivo puro (población de células que procede de una única

célula).

Material y medios de cultivo

- Rotulador

- Asa de siembra curva o de bucle

- 2 placas de medio TSA

- 1 Placas de medio XLD

- 1 placas de Agar EMB Levine

Muestra

- Cultivos líquidos: Nº 1 y Nº 2

29


Procedimiento:

Se emplearán 2 cultivos líquidos:

- Cultivo Nº 1: se debe sembrar para aislamiento en estría en una placa de TSA y en una placa de

Agar EMB Levine

- Cultivo Nº 2: se debe sembrar en una placa de TSA y en una placa de XLD.

Para realizar la siembra se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular la base de las placas para poder identificarlas.

2. Esterilizar el asa de siembra en el mechero Bunsen y dejarla enfriar.

3. Tomar una alícuota del cultivo líquido con el asa de siembra y hacer estrías paralelas, pero no

superpuestas, en un extremo de la placa de Petri sobre una parte del medio de cultivo sólido.

4. Esterilizar el asa de siembra y dejarla enfriar.

5. Realizar una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores, de forma que se arrastren

parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior.

6. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso indicado en el punto 4 una vez más. Esta

tercera serie de estrías no debe superponerse a la primera.

7. Esterilizar el asa de siembra antes de depositarla en la mesa de trabajo.

8. Incubar las placas sembradas en estufa a 37º C durante 24 horas.

Cuestiones

B.- Observa y anota si en las placas de TSA, Agar EMB Levine y XLD sembradas para

aislamiento en estría a partir de los cultivos líquidos suministrados se obtienen cultivos puros o

mixtos.

C.- Considerando que el medio TSA es un medio general y los medios Agar EMB Levine y XLD

son medios selectivos y diferenciales ¿la obtención de cultivos puros o mixtos en estos medios de

cultivo a partir de los cultivos líquidos sembrados es coherente con lo que cabría esperar y por

qué?

1.2. Siembra en placa por inclusión o en profundidad

Se trata de un método cuantitativo empleado para el recuento y aislamiento de microorganismos,

por lo que se explicará en el apartado correspondiente a recuento de microorganismos.

2. Siembra en tubo con medio sólido

2.1. Siembra en tubo en estría

Método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros, así como para la determinación de

algunas características fisiológicas y bioquímicas de un cultivo puro de microorganismos.

30


Consiste en arrastrar la suspensión microbiana procedente de un cultivo puro sobre la superficie

inclinada del medio de cultivo, haciendo una estría en zig-zag desde la base a la parte alta.


- Rotulador

- Asa de siembra curva o de bucle

- 1 tubo de Agar Citrato de Simons (tubo con agar inclinado)

- 1 tubo de TSA (tubo con agar inclinado)

Muestra

1 cultivo puro en medio sólido

Procedimiento

El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en estría en los 2 tubos

con agar inclinado, tanto en el que contiene el medio TSA como el que contiene Agar Citrato.

Para ello, se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular los tubos para poder identificarlos.

2. Esterilizar el asa de siembra de bucle y dejarla enfriar.

3. Cargar el asa de siembra estéril con la porción del cultivo que se va a transferir.

4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estéril.

5. Flamear la boca del tubo e introducir el asa de siembra cargada con el inóculo bacteriano

dentro del tubo y realizar estrías en zig-zag sobre la superficie inclinada del medio de cultivo,

desde la base a la parte alta del tubo.

6. Flamear la boca del tubo y taparlo.

7. Esterilizar el asa de siembra.

8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas.

Cuestiones

D.- Observa y anota si en los dos medios de cultivo sólidos en tubo sembrados en estría hay

crecimiento continuo o se distinguen colonias aisladas. ¿Se observa cambio de coloración en

alguno de ellos?

2.2. Siembra en tubo en picadura

Método utilizado para la determinación de algunas características fisiológicas y bioquímicas de un

cultivo puro de microorganismos. En este caso se emplean asas de siembra de picadura. Se basa

31


en introducir un inóculo bacteriano procedente de un cultivo puro en un medio sólido o

semisólido.


- Rotulador

- Asa de siembra de picadura

- 1 tubo de agar semisólido

Muestra

1 cultivo puro en medio sólido

Procedimiento

El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en picadura en el tubo

con agar semisólido. Para ello, se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular los tubos para poder identificarlos.

2. Esterilizar el asa de picadura y dejarla enfriar.

3. Cargar la punta del asa con el cultivo puro que se va a transferir.

4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estéril y flamear la boca del tubo.

5. Introducir todo el filamento del asa de picadura dentro del medio de cultivo, en dirección

perpendicular a la base del tubo pero sin llegar a tocar el fondo.

6. Flamear la boca del tubo y taparlo.

7. Esterilizar el asa de picadura.

8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas.

En el medio de cultivo semisólido en tubo se debe observar crecimiento en la zona de inoculación,

zona por la que ha pasado el filamento del asa de picadura con el cultivo bacteriano.

Cuestiones

E.- ¿En el medio de cultivo semisólido en tubo sembrado en picadura se observa desplazamiento

en el crecimiento con respecto a la línea de siembra? ¿Qué indica el resultado obtenido?

Segunda parte. Recuento de microorganismos viables. Método de siembra en placa por

inclusión o en profundidad

En ocasiones, es necesario realizar recuentos de microorganismos en una muestra (por ejemplo, en

muestras de agua, alimentos suelo, orina, sangre, etc.) para estimar el número de células viables

presentes. Una célula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una

descendencia. El método habitual para realizar una determinación de células viables se basa en contar el

32


número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio de cultivo adecuado.

Por esta razón, el recuento de células viables también se llama recuento en placa o recuento de colonias.

En este procedimiento se supone que cada célula viable puede formar una colonia.

Hay dos métodos para realizar un recuento en placa de microorganismos viables: el método de siembra

por extensión, en el que un determinado volumen de la muestra diluida se extiende sobre la superficie

de una placa con medio sólido y el método de siembra por inclusión o en profundidad, en el que se

pipetea un volumen conocido (normalmente 1 mL) del cultivo en una placa Petri estéril sobre la que se

añade el medio con agar fundido (Figura 2).

Figura 2. Metodos de siembra para realizar un recuento de células viables en placa: siembra por extensión y siembra por inclusión o vertido en placa. Imagen tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

Antes de proceder a la siembra de la muestra hay una serie de consideraciones importantes. Por un lado,

el recuento se puede realizar tanto en muestras líquidas como en sólidas, pero en este último caso será

necesario preparar una suspensión o dilución inicial con la muestra empleando una solución isotónica

estéril. Adicionalmente, el número de colonias presentes en las placas no debe ser demasiado grande,

pues algunas colonias se podrían fusionar y las estimaciones obtenidas serían erróneas. También es

importante no obtener un número de colonias demasiado bajo, para que el cálculo sea más preciso y no

se arrastren errores asociados con la preparación de excesivas diluciones. En general, se considera que

el número de colonias por placa apropiado para el recuento oscila entre 30 y 300. Para conseguirlo, casi

siempre se diluye la muestra (Figura 3). Teniendo en cuenta que raramente se sabe de antemano el

número de células viables, se suelen hacer varias diluciones decimales sucesivas de la muestra. Tanto la

preparación de la suspensión inicial (muestras sólidas), como de las diluciones decimales sucesivas,

forman parte de la preparación de la muestra para el análisis.

En esta práctica se empleará una muestra líquida que contiene una concentración desconocida de

microorganismos. Por ello, antes de proceder a su siembra, se deben preparar una serie de diluciones

33


decimales sucesivas y posteriormente se sembrarán en placa. Se va a emplear un medio de cultivo

general para la siembra, por lo tanto se realizará un recuento de la totalidad de los microorganismos

viables presentes en la muestra líquida de partida.

Figura 3. Procedimiento para la determinación de células viables usando diluciones seriadas de la muestra y el método de siembra por inclusión o vertido en placa. Imagen tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

Objetivo

Realizar el recuento de microorganismos viables presentes en una muestra problema.

34


Material, soluciones, medios de cultivo y muestra a emplear

1. Preparación de diluciones decimales sucesivas

Material y soluciones

- Rotulador

- Pipeta automática con capacidad para 1 mL

- Puntas de pipeta estériles con capacidad para 1 mL

- 3 tubos con 9 mL de solución salina estéril

Muestra

- Cultivo bacteriano líquido

2. Siembra en placa por inclusión o en profundidad


- Rotulador

- Pipeta automática con capacidad para 1 mL

- Puntas de pipeta estériles

- 4 placas de Petri vacías y estériles

- 1 botella con 100 mL de TSA licuado y mantenido en un baño a 45º C

Muestras

- Las diluciones 1/100 y 1/1000 obtenidas a partir de la muestra de partida.

Procedimiento

1. Preparación de diluciones decimales sucesivas

A partir de la muestra líquida suministrada, se prepararán tres diluciones de la muestra: diluciones

1/10, 1/100 y 1/1000. Para ello, se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular los tubos con las distintas diluciones que se van a realizar

2. Preparación de dilución 1/10: usando una punta de pipeta estéril, se toma 1 mL de la

muestra y se transfiere a un tubo con 9 mL de solución salina estéril. A continuación, se

agita el tubo por rotación (nunca por inversión) para una homogenización completa del

inóculo incorporado con el diluyente.

3. Para hacer diluciones sucesivas (diluciones 1/100 y 1/1000), se usa una nueva punta de

pipeta estéril en cada paso de la dilución, se toma 1 mL de la dilución precedente y se lleva

a un tubo con 9 mL de solución salina estéril, recordando que se debe agitar siempre el tubo

una vez incorporado el inóculo.

35


36

2. Siembra en placa por inclusión o en profundidad

1. Coger las dos placas de Petri vacías y rotularlas en la base para poder identificarlas. Indicar

también la dilución que se va a sembrar.

2. Tomar una alícuota de 1 ml de la dilución 1/100, utilizar para ello una punta de pipeta estéril.

3. Depositar la alícuota sobre el fondo de las placas de Petri.

4. Verter sobre las placas inoculadas unos 20 ml de TSA fundido y mantenido a 45°C.

5. Agitar las placas suavemente mediante movimientos circulares y de traslación.

6. Dejar solidificar, invertir las placas e incubar en estufa a 37° C durante 24 horas.

7. Proceder de la misma forma para la dilución 1/1000 empleando una nueva punta de pipeta

estéril.

Cuenta las dos placas de la dilución que contengan entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias

(UFC) y calcula la media aritmética. El resultado obtenido se multiplicará por el inverso de la dilución

y se referirá como UFC/mL de muestra.

Cuestiones

F.- Indica los cálculos realizados para obtener el recuento de microorganismos viables presentes en la

muestra suministrada, especificando el recuento obtenido en placa y la dilución empleada. Anota

también el resultado final.

3. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA

(código calendario de prácticas: FV)

TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA y ESPECTROFOTOMETRÍA

TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS

Objetivos:

a) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo del pH.

b) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo de la

concentración.

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones

químicas y biológicas.

La mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la

cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o más componentes de la misma. Se pueden

plantear las siguientes cuestiones: una, de carácter cualitativo (¿de qué componente se trata?), y otra de

carácter cuantitativo (¿cuánto hay de ese componente?). Para ello, se puede utilizar el método

instrumental de análisis, como es la espectrofotometría para medir la absorción de radiación

ultravioleta y visible que interactúa con la materia (átomos y moléculas), la misma es considerada una

técnica cualitativa y cuantitativa basándose en la medición del color o de la longitud de onda de una

radiación e intensidad de la misma.

Fundamento de la espectrofotometría

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, incluso el vidrio que parece ser

transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible y el agua

que absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones ultravioletas,

visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas y es característica para cada sustancia

química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida y la energía radiante no

puede producir ningún efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben

ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo las longitudes de onda no

absorbidas pueden ser visualizadas.

Se denomina espectro electromagnético a la distribución energética del conjunto de ondas

electromagnéticas

39

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_%C3%B3ptico&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa

http://es.wikipedia.org/wiki/Vidrio

http://es.wikipedia.org/wiki/Agua

http://es.wikipedia.org/wiki/Infrarrojo

http://es.wikipedia.org/wiki/Ultravioletas


La espectrofotometría ultravioleta-visible usa haces de radiación del espectro electromagnético,

en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente el comprendido entre 200 y 400 nm y en el de la luz

visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región

ultravioleta y visible del espectro. Al campo de luz UV comprendido entre 200 y 400 nm se le conoce

también, como rango de UV cercano, la espectrofotometría visible solamente usa el rango del campo

electromagnético de la luz visible, de 400 a 800 nm.

El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o

transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una

cantidad conocida de la misma sustancia.

Las técnicas espectrofotométricas permiten determinar la identidad y la concentración de

componentes disueltos en una muestra incógnita. El espectro de absorción de un material muestra la

fracción de la radiación electromagnética incidente que un material absorbe dentro de un rango de

40

http://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metro

http://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Soluto


longitudes de onda, aportando información sobre la molécula, puesto que está relacionado con su

estructura molecular.

Practica 1. Efecto del pH sobre el espectro de absorción

Los cambios en las condiciones ambientales de una molécula pueden provocar cambios en su

estructura molecular. Así, un cambio en el pH puede provocar alteraciones en su espectro de absorción.

El compuesto que se usará en la práctica será el naranja de metilo, que es un colorante que se utiliza

como indicador de pH.

Se realizará el espectro de absorción entre 350 y 650 nm de distintas soluciones de naranja de

metilo a la misma concentración pero con distintos pHs en el medio.

Naranja de metilo

Procedimiento

En primer lugar se preparan las siguientes soluciones de trabajo, a partir de las cuales

prepararemos las soluciones a analizar:

1) Solución de naranja de metilo. Para ello se pesa en la balanza de precisión 1 mg de naranja de

metilo empleando para ello una espátula y un tubo de centrífuga. Posteriormente se disuelve en 5 mL de

H2O.

2) Solución de ácido cítrico 0.1 M. Se determinará la cantidad a pesar para preparar 30 mL de

solución.

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3) Solución de ortofosfato bisódico 0.2 M. Se determinará la cantidad a pesar para preparar 15 mL de

solución. Esta sal tarda más en disolverse que el ácido cítrico, es recomendable comenzar por ella y

ayudarse de agitación mecánica.

Una vez preparadas las tres soluciones madre, se procederá a mezclar las soluciones 2 y 3

siguiendo la tabla siguiente, para preparar las soluciones tampón:

pH aproximado Sol. Na2HPO4 (mL) Sol. Ácido cítrico (mL)

3.0 1.0 4.0

3.4 1.3 3.7

3.8 1.8 3.2

4.2 2.1 2.9

4.6 2.3 2.7

En este punto tendremos 5 tubos de ensayo que formarán un gradiente de pH. A continuación se

añaden con una micropipeta 0.1 mL de la solución stock de naranja de metilo a cada una de las

soluciones tampón y se agitan las soluciones. Una vez comprobado que se genera un gradiente de color,

se realizan los espectros de absorción entre 350 y 650 nm de las distintas muestras.

Cuestiones:

1. Comentar los resultados. Describir la gráfica obtenida, observando las variaciones en los

espectros de absorción y comentando como aumenta o disminuye la absorbancia en función de la

longitud de onda y el pH del medio.

2. Se observa un punto isosbéstico cuando en una solución coinciden dos especies absorbentes en

equilibrio. Observa la gráfica. ¿Puedes localizar algún punto isosbéstico? Existe algún punto en

el que la absorbancia no dependa del pH del medio?

3. En cada uno de los tubos el pH es distinto. ¿Por qué varía el espectro de absorción del naranja

de metilo al variar el pH?

42


Practica 2. Efecto de la concentración sobre el espectro de absorción.

Introducción:

La ley de Beer-Bougher-Lambert predice que para una molécula en disolución, un cambio en su

concentración provocará un cambio proporcional en la absorbancia.

El aumento en la concentración de los compuestos aumenta las interacciones entre sus

moléculas, cambiando su espectro de absorción. Aunque en la mayor parte de los casos este efecto

puede despreciarse, no ocurre así en el caso del azul de metileno.

43


44

Las condiciones en las que se encuentra una molécula pueden determinar cambios estructurales

que afecten a sus propiedades. En esta práctica observaremos como un aumento en la concentración de

una sustancia puede desencadenar un cambio estructural que cambie notablemente sus propiedades de

absorción de luz.

Procedimiento

Se preparan 10 mL de una solución stock de azul de metileno 1 mM (1x10-3 M) en agua

destilada. A partir de la solución stock se preparan 10 mL de las siguientes diluciones: 1x10-4, 1x10-5, y

1x10-6 M.

Se realiza un espectro de absorción entre 400 y 700 nm de las soluciones 1x10-4 y 1x10-6 M. A

continuación se mide la absorbancia de las tres soluciones a 610 y a 663 nm.

Cuestiones:

1. Representar gráficamente la absorbancia a las dos longitudes de onda frente a la concentración,

calculando el coeficiente de correlación lineal para cada una de las longitudes de onda.

2. Calcular la ratio entre la absorbancia a 610 y la absorbancia a 663 de las tres soluciones.

3. Comentar los resultados obtenidos tanto para los espectros de absorción realizados en el

laboratorio como para las gráficas del apartado 1. ¿Se observa alguna desviación de la Ley de

Beer-Bougher-Lambert? ¿Cuál podría ser la explicación de estos resultados?

4. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y MICROSCOPIA

(código calendario de prácticas: BC)

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y MICROSCOPIA

INTRODUCCIÓN

El procesado de una muestra histológica (animal o vegetal) para su estudio al microscopio

conlleva la realización de una serie de pasos y protocolos cuyo fin es poner de manifiesto las

estructuras tisulares de una forma lo más parecido posible a como se encuentran en estado vivo. Cada

uno de estos pasos puede presentar variaciones particulares dependiendo de las características de la

muestra biológica objeto de estudio, de las estructuras tisulares y celulares que se van a observar, y del

tipo de microscopio en el que se quieran observar (óptico (MO) o electrónico (ME)).

Los pasos generales que se siguen en este procesado son:

1.- Fijación. El objetivo de la fijación es preservar el tejido con las características estructurales

y de composición química que presentaba en el estado vivo. La fijación evita la alteración de la

morfología del tejido deteniendo los procesos de degradación que tienen lugar tras la muerte celular,

como la autolisis o la putrefacción. Además, endurece el material, confiriéndole protección frente al

daño que pudiera ocasionar la manipulación del tejido en los pasos siguientes a la fijación, y hace

insolubles los constituyentes celulares que se pretenden estudiar que, sin la fijación, se disolverían

durante el manejo posterior. No existe ningún fijador que haga insolubles todos los componentes

tisulares, por lo que la elección del fijador es importante dependiendo del, o de los componentes objeto

de estudio. Los lípidos son los componentes tisulares más difíciles de fijar, ya que la mayoría de los

fijadores los disuelven.

Normalmente se utilizan fijadores líquidos que pueden utilizarse solos (fijador simple) o

mezclados (mezcla fijadora). El fijador simple más utilizado es el formaldehído (o formol), pero otros

ejemplos son el etanol, ácido pícrico, ácido acético, paraformaldehído, glutaraldehído, tetróxido de

osmio, etc… La mezcla fijadora más utilizada es el líquido de Bouin [ácido pícrico, formol y ácido

acético], que es considerado como el fijador universal porque conserva muy bien la estructura tisular.

Para fijar el tejido se introduce la pieza en un bote con fijador durante un tiempo limitado (fijación por

inmersión) o se aprovecha el sistema circulatorio del animal para hacer pasar el fijador (fijación por

perfusión). En la fijación por inmersión hay que tener en cuenta el tiempo de fijación, ya que una

fijación excesiva puede provocar, además de un excesivo endurecimiento, la aparición de aspectos

citológicos que no existían “in vivo” observándose imágenes artificiales o artefactos debidos a

distorsiones, alteraciones morfológicas, cristalización de compuestos amorfos, desplazamientos de

sustancias, etc… El tiempo de fijación dependerá del tamaño de la pieza de tejido y del fijador

empleado.

Hay muchos tipos de fijadores y su elección depende de una serie de propiedades que poseen:

velocidad de penetración, velocidad de fijación, grado de endurecimiento y variaciones de volumen

que producen, etc… También hay que tener en cuenta las características químicas del tejido que

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vamos a estudiar, el método de seccionado que vamos a utilizar y la técnica que vamos a aplicar sobre

las secciones obtenidas.

Si la muestra se procesa para su observación al ME, se realiza una doble fijación, de forma que

primero se fija con paraformaldehído o glutaraldehído (o con una mezcla de ambos), y a continuación

con tetróxido de osmio.

2.- Inclusión. Permite darle consistencia a los tejidos y facilitar su seccionado con una cuchilla.

Consiste en rodear la pieza de un material, llamado medio de inclusión, que sea lo suficientemente

rígido que permita su seccionado Tras llevar a cabo la inclusión, obtendremos un bloque compacto de

la pieza de tejido rodeada por el medio de inclusión. En el procesado para la observación en el MO se

utilizan medios de inclusión hidrófobos (por ejemplo, la parafina), que requieren la deshidratación

previa del tejido, o medios de inclusión hidrófilos (por ejemplo, la gelatina), que son miscibles con el

agua. El uso de medios de inclusión hidrófilos permite un procesado más rápido y menos dañino para

el tejido. En ocasiones, la inclusión no es un paso imprescindible, ya que la consistencia se logra con

la fijación o con la congelación del tejido, sin necesidad de utilizar un medio de inclusión.

En la inclusión para la observación al ME se utilizan plásticos especiales (resinas) que

proporcionan una mayor dureza que los medios de inclusión para microscopía óptica, lo que permite la

obtención de secciones muy finas. En este caso la inclusión es imprescindible para lograr la

consistencia de la muestra.

3.- Seccionado. Para la mayoría de los procedimientos y estudios histológicos, se requieren

secciones de tejidos lo suficientemente delgados para que pase la luz y puedan observarse al MO, o

para que penetren los electrones y puedan observarse al ME. Los microtomos son instrumentos que

con la ayuda de una navaja o cuchilla permiten obtener cortes finos de los materiales a estudiar. Los

microtomos constan de un portabloques donde se coloca la muestra, una cuchilla y un sistema de

avance regulado del bloque (o de la cuchilla) que permite controlar el grosor de los cortes. En

microscopía óptica las cuchillas utilizadas son de acero y se obtienen secciones de varias micras (m)

de grosor, mientras que en microscopía electrónica las cuchillas son de vidrio o de diamante y se

obtienen secciones de varios nanómetros (nm) de grosor, es decir, mil veces más finos que para el

MO, debido a que el poder de penetración de los electrones es muy inferior al de los fotones. Hay

muchos tipos de microtomos y el uso de uno u otro tipo depende de si el material se ha incluido o no,

y, en su caso, del medio de inclusión que se haya utilizado. Los microtomos más utilizados hoy en día

son los siguientes:

* Microtomo de rotación o de tipo Minot. Se utiliza para seccionar piezas de tejido incluidas en

parafina y se obtienen secciones de entre 5 y 30m de grosor. En este microtomo la cuchilla

permanece fija y perpendicular al portabloques, en posición vertical. El movimiento rotatorio de una

manivela hace que el bloque con la muestra se desplace hacia la cuchilla una distancia fija que

determina el grosor del corte.

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* Criostato o criotomo. Requiere la congelación previa de la pieza de tejido. Se utiliza para

seccionar material no incluido, o incluido en un medio de inclusión especial para criostato (medio de

inclusión hidrófilo). Se obtienen secciones de entre 5 y 60m de grosor. El funcionamiento es similar

al microtomo de rotación pero en este caso el portabloques y la cuchilla se encuentran en una cámara

en la que podemos controlar la temperatura del bloque y de la cuchilla (suele estar entre -20 y -25ºC).

* Vibroslice o Vibratomo. Se utiliza para seccionar piezas de tejido fresco, de tejido fijado sin

incluir (la fijación ya proporciona la dureza necesaria para su seccionado), o de tejido incluido en un

medio blando como, por ejemplo, la gelatina. Ello conlleva la ventaja de que el procesado es más corto

y se evitan el proceso de inclusión en parafina (largo y dañino para el tejido) o la congelación (implica

que la pieza de tejido sufra cambios de temperatura), por lo que se conservan mejor las características

estructurales y funcionales del tejido. La desventaja es que no permite obtener secciones finas, ya que

el grosor mínimo obtenido es de 25m. El funcionamiento se basa en que la cuchilla vibra mientras

avanza sobre la pieza de tejido y eso facilita el seccionado del material.

* Ultramicrotomo. Es el microtomo que se utiliza en microscopía electrónica. Se pueden

realizar cortes semifinos (1m) que se usan para microscopía óptica, o para seleccionar la zona de la

que queremos obtener cortes ultrafinos (10-100nm) para su estudio al ME. El funcionamiento es

similar al microtomo de rotación pero en este caso las cuchillas son de vidrio o de diamante para poder

obtener secciones muy finas de material incluido en medios de inclusión muy duros (resinas).

4.- Procesado de las secciones. Sobre las secciones obtenidas podemos aplicar muchas técnicas

dependiendo de lo que se quiera estudiar (tinción, técnica histoquímica, técnica inmunohistoquímica,

hibridación in situ,…). Previamente a cualquier técnica que vayamos a realizar sobre las secciones de

un tejido que hemos incluido y seccionado debemos extraer el medio de inclusión, con el fin de que

dicho medio no interfiera con los reactivos utilizados en cada caso.

Como ejemplo de procesado de las secciones veremos cómo se lleva a cabo una tinción para la

observación de las secciones en un MO. Normalmente los tejidos son incoloros y, debido a que el

índice de refracción de la luz de los distintos componentes celulares es similar, es necesario

colorearlos para aumentar el contraste entre las distintas estructuras y poder así diferenciarlos al

observarlos en el MO. Los métodos de tinción son muy numerosos y reciben el nombre del, o de los

colorantes que se utilizan. Se utiliza uno u otro método dependiendo del tejido u orgánulo que se

quiera teñir, ya que, cada colorante tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a unas estructuras

del tejido y no a otras. Los colorantes se clasifican en colorantes básicos que tienen afinidad por los

componentes ácidos de la célula (núcleos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos), colorantes ácidos

que tienen afinidad por componentes básicos de la célula (citoplasma, colágeno); y colorantes neutros,

que suelen ser mezclas de varios colorantes.

En el caso del procesado del material para su observación en el ME no se realizan tinciones con

colorantes, sino que se llevan a cabo técnicas de contraste que agregan átomos de metales pesados

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(osmio, uranilo, plomo) que harán las estructuras celulares más o menos densas a los electrones

permitiendo así la obtención de una imagen. En el ME se obtienen imágenes en blanco y negro.

5.- Montaje. Consiste en colocar un cubreobjetos sobre las secciones para protegerlas durante la

observación en el MO. Cuando no queremos conservar la preparación podemos añadir, entre el

cubreobjetos y las secciones, una gota de agua, de tampón (agua con una mezcla de sales) o de

glicerina. En este caso, tras la observación se desecha la preparación. Cuando nos interesa conservar la

preparación, es necesario utilizar un medio entre las secciones y el cubreobjetos, llamado medio de

montaje, que debe ser transparente, asegurar lo máximo posible la conservación de las preparaciones y

asegurar la adherencia entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Hay medios de montaje hidrófilos y

medios de montaje hidrófobos. El montaje sólo se lleva a cabo en el procesado para el MO, ya que, en

el caso del procesado para el ME las secciones se sitúan sobre rejillas metálicas especiales y no

necesitan esa protección.

6.- Observación al microscopio óptico o electrónico. Las muestras biológicas o las células, en

general, son difíciles de observar a simple vista debido a su reducido tamaño y a su transparencia a la

luz visible, por lo que para su observación, necesitamos los microscopios, que son instrumentos de

óptica que nos permiten ver objetos muy pequeños o detalles estructurales imposibles de distinguir a

simple vista.

A) El microscopio óptico utiliza la luz común (luz blanca, emitida por una fuente de luz situada

en la base del microscopio) que atraviesa la muestra biológica e ilumina el campo de observación.

Cuenta con tres sistemas de lentes: a) el condensador, que concentra la luz emitida sobre la muestra;

b) los objetivos que aumentan la imagen X veces, normalmente en los microscopios utilizados en

prácticas hay cuatro objetivos de 4, 10, 40 y 100 aumentos; y c) los oculares que aumentan la imagen

10 veces (los hay de mayor aumento) y permiten la visualización directa de la muestra. Los aumentos

finales se obtienen multiplicando los aumentos del objetivo por los del ocular (por ejemplo, en un

microscopio de prácticas el mayor aumento que obtendríamos sería: [objetivo 100X] x [ocular de 10X]

= 1000 aumentos). Sin embargo, en un microscopio óptico lo importante no son los aumentos sino su

poder de resolución (PR), es decir, “la capacidad de distinguir como separados dos puntos que se

encuentran muy cercanos”. Y el PR depende del límite de resolución (LR, “distancia mínima a la cual

dos objetos pueden ser diferenciados”) y, de hecho, el PR es inversamente proporcional al límite de

resolución (PR =1/LR).

El límite de resolución de un microscopio se calcula mediante la fórmula de Abbe:

Limite de resolución (LR) = 0’61 x / n x sen

En esta fórmula: 0’61 es una constante, es la longitud de onda de la luz utilizada (luz blanca,

550nm), y n x sen es la apertura numérica (AN) de la lente objetivo. La AN depende del índice de

refracción del medio situado entre la muestra y el objetivo (n) y del ángulo de apertura del objetivo

utilizado (). Normalmente el medio situado entre la muestra y el objetivo es aire (n=1), aceite de

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inmersión (n=1,5) o agua (n=1,3). El uso del aceite de inmersión (impide la desviación de los rayos

más oblicuos) aumenta el PR porque aumenta la AN. El ángulo es la mitad del ángulo formado por

el cono de rayos recogidos por la lente objetivo sobre un punto de la muestra. Como la máxima

anchura es de 180º, el valor de sen (90º) es como máximo 1 (0.93 en los microscopios actuales).

Por tanto, el PR del microscopio depende de la de la luz utilizada y de la AN, de forma que,

cuanto menor sea y mayor sea la AN, más pequeño es el LR y mayor el PR. Los objetivos de mayor

aumento tienen mayor AN debido a que el ángulo aumenta al disminuir la distancia de la muestra a

la lente, por tanto, al subir el aumento aumentamos el PR.

El límite de resolución de un MO, en las condiciones más óptimas, es decir, utilizando el

objetivo de 100 aumentos con aceite de inmersión es LR = 0.61 x 550nm/1,5 x 0.93= 240nm = 0,24

m. Es decir, que en un MO podemos observar como separadas estructuras que tienen como mínimo

ese diámetro, o que están separadas como mínimo por esa distancia (bacterias, mitocondrias, núcleo,

plastos,...). Con el MO distinguiríamos la forma de estas estructuras pero no sus detalles internos.

Estructuras celulares de menor tamaño (ácidos nucleicos, ribosomas,…) tendríamos que observarlas al

ME, cuyo LR es mil veces menor que el del MO (LR=2-5A=0.2nm=0.0002m) debido a que la de

los electrones es muy pequeña (= 0.004nm). Por tanto, el PR de un ME es mil veces mayor que el del

MO y nos permite observar la ultraestructura celular. Teniendo en cuenta que el LR del ojo humano es

de 100-200m (0.1-0.2 mm), el MO ha aumentado unas mil veces el LR de nuestro ojo, y el ME lo ha

aumentado un millón de veces.

El diafragma del condensador (o de apertura) es otro dispositivo importante que se encuentra

situado debajo del condensador y con él podemos graduar la cantidad de luz que llega a la muestra.

Cuando cerramos el diafragma la muestra recibe menos luz, de forma que aumentamos el contraste y

la profundidad de campo pero disminuimos la resolución.

El MO que se usa habitualmente es el MO de campo claro o fotónico, utilizado para la

observación de preparaciones teñidas de células o de secciones de órganos o tejidos. Existen otros

tipos de MO, como el MO de campo oscuro, el MO de contraste de fases o el MO de contraste

diferencial de interferencia (DIC) o de Nomarski, que presentan dispositivos especiales

(condensadores, objetivos, prismas) que permiten la observación de secciones de tejidos sin teñir y de

células vivas y móviles (bacterias, espermatozoides, protozoos, cultivos celulares, células en mitosis o

en migración,…). El MO de fluorescencia y el MO de barrido confocal presentan dispositivos

especiales que permiten la observación de muestras fluorescentes.

El MO invertido se utiliza para la observación de muestras que se encuentran en frascos o placas

de fondo plano, como por ejemplo, los cultivos celulares o en la manipulación de gametos y embriones

vivos in vitro en técnicas de fecundación asistida. Su nombre se debe a que la fuente de luz está en la

parte superior del microscopio y los objetivos en la parte inferior, bajo la platina. El hecho de que esté

invertido permite acercar los objetivos a las células, ya que en un MO convencional la distancia entre

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los objetivos y el fondo de la placa sería muy grande. Independientemente de que el microscopio sea

convencional o invertido puede presentar los distintos dispositivos de las distintas ópticas.

B) El microscopio electrónico no utiliza la luz visible (fotones), sino electrones acelerados.

Hay dos tipos de ME:

B1.- El microscopio electrónico de transmisión (MET) consta de una columna hueca donde se

hace el vacío para que los electrones, emitidos por un cañón de electrones situado en lo alto de la

columna, no se dispersen. Consta, además, de distintas lentes electromagnéticas (condensadora,

objetivo y proyectora) y distintos diafragmas. La muestra se sitúa entre la lente condensadora y la

lente objetivo. Es importante destacar que en el MET las secciones ultrafinas no se colocan sobre

portaobjetos, ya que los electrones no son capaces de atravesar el vidrio, sino sobre rejillas de cobre o

níquel que no impiden el paso de los electrones.

Los electrones pasan por la lente condensadora, que concentra el haz de electrones procedente

del cañón sobre la muestra, llegan a la lente objetivo que origina y enfoca la imagen, y por último la

lente proyectora magnifica la imagen obtenida. La imagen se observa directamente en una pantalla

fluorescente, o indirectamente mediante la obtención de una imagen fotográfica o digitalizada. Para

visualizar la imagen debe tener lugar la dispersión de los electrones al atravesar la muestra y deben

producirse interacciones de esos electrones con los átomos de esa muestra. En la imagen final veremos

zonas claras (estructuras claras o transparentes a los electrones), por las que los electrones han

atravesado la muestra, y zonas oscuras (estructuras densas a los electrones o electrondensas) que

corresponden a las regiones donde los electrones han sido desviados.

B2.- El microscopio electrónico de barrido (MEB) se utiliza para observar la superficie de una

muestra que no ha sido seccionada (órganos o partes de órganos, pequeños organismos, granos de

polen, células enteras, orgánulos,…). En este caso el haz de electrones no está fijo, sino que se mueve

y va rastreando la superficie de la muestra, que está recubierta de una capa de un material metálico con

gran capacidad de transmisión de energía eléctrica (generalmente se utiliza oro). La presencia de ese

material hace que la superficie de la muestra, al ser barrida por el haz de electrones, emita a su vez

otros electrones que son recogidos por un detector y originan una imagen en relieve de la superficie de

la muestra que se observa en un monitor de televisión. Al igual que en el MET, en este microscopio

las imágenes se obtienen en blanco y negro.

OBJETIVO

Que el alumno se familiarice con la metodología que se lleva a cabo en el procesado de tejidos

para su observación en el microscopio óptico. Para ello, en estas prácticas haremos secciones de

tejidos animales, previamente fijados, utilizando dos tipos de microtomos: un vibroslice (o vibratomo)

para seccionar piezas de tejido sin incluir; y un microtomo de rotación para seccionar piezas de tejido

incluido en parafina. A continuación, teñiremos las secciones obtenidas, las montaremos, y las

observaremos al microscopio óptico de campo claro. Además, observaremos preparaciones sin teñir en

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otros tipos de microscopios ópticos (campo oscuro y contraste diferencial de interferencia (DIC) o de

Nomarski).

MATERIAL

Microtomo de rotación, bloques de tejidos incluidos en parafina, vibroslice, placas Petri,

pinceles, placas con pocillos, cristalizadores con puente, cubetas de vidrio verticales, portaobjetos y

cubreobjetos, colorantes, agua destilada, etanol (70º, 96º, 100º), líquido intermediario (histo-clear),

medio de montaje (Eukitt), microscopio óptico.

MÉTODOS:

Práctica 1: Seccionado, tinción y montaje.

A.- Seccionado (microtomía). Manejo de un vibroslice y obtención de cortes de tejido animal

previamente fijado y sin incluir. Manejo de un microtomo de rotación y obtención de cortes de tejido

animal previamente fijado e incluido en parafina.

B.- Tinción. B1.- Tras la obtención de secciones de un tejido animal en el vibroslice se procede

a realizar la tinción. Estas secciones flotantes (llamadas así porque debido a su grosor (50-80 m) no

se colocan en un portaobjetos para su procesado) se tiñen en placas con pocillos. Cada pocillo se llena

con un reactivo y las secciones flotantes se van cambiando cuidadosamente de pocillo en pocillo con

la ayuda de un pincel.

Con estas secciones llevaremos a cabo la tinción con Tionina de Laskey, que es un colorante que

tiñe de azul los componentes celulares que contienen ácido ribonucleico (ARN). El protocolo de esta

tinción es el siguiente:

1.- Lavar en agua destilada, 2 minutos.

2.- Etanol de 70º, 5 minutos.


4.- Teñir con tionina de Laskey durante 10 segundos. ¡¡CUIDADO!! hay que mantener con el

pincel las secciones para no perderlas de vista, ya que el colorante es muy oscuro y tiñe muy rápido.

5.- Paso rápido por agua destilada para eliminar el exceso de colorante.


7.- Etanol de 96º, tres baños de 1 minuto hasta que deje de eliminar colorante.

8.- Etanol 100º, 2 minutos.

9.- Histo-clear, 2 minutos.

10.- Montaje. Se colocan las secciones en un portaobjetos, se estiran bien con el pincel, se

cubren con una gota de medio de montaje (Eukitt) y se pone el cubreobjetos encima evitando que se

formen burbujas de aire.

Práctica 2: Tinción, montaje y observación

B.- Tinción. B.2.- Tras la obtención de secciones de un tejido animal en el microtomo de

rotación se procede a realizar la tinción. Previamente debemos proceder a la eliminación de la parafina

que impregna el tejido (desparafinado) e hidratar de nuevo el tejido (hidratación) que se había

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deshidratado en el proceso de inclusión. Para desparafinar e hidratar las secciones tenemos que

pasarlas por los siguientes líquidos: histo-clear (10 min); etanol 100º (5min); etanol 96º (5min); etanol

70º (5min) y agua destilada (5 min).

Una vez rehidratado el tejido procedemos a realizar la tinción, en este caso sobre el

cristalizador. Para ello, se colocan los portaobjetos sobre el puente y se van echando los diferentes

líquidos con una pipeta Pasteur de plástico (cada reactivo con su pipeta correspondiente) hasta cubrir

las secciones. Una vez transcurrido el tiempo de tinción se vacía cada líquido en el cristalizador y se

escurre cada porta sobre un papel de filtro antes de añadir el siguiente reactivo.

Con estas secciones llevaremos a cabo la tinción con hematoxilina-eosina que es una tinción

clásica y general muy utilizada en estudios de morfología tisular y en anatomía patológica. Se utilizan

dos colorantes: la hematoxilina de Mayer, que es un colorante básico y teñirá de azul los componentes

ácidos de las células (ácidos nucleicos: núcleo), y la eosina es un colorante ácido y teñirá de rojo o de

rosa los componentes básicos (proteínas: citoplasma, matriz extracelular). El protocolo de esta tinción

es el siguiente:

1.- Teñir con hematoxilina de Mayer, 10 minutos.

2.- Lavar con agua corriente (cubeta debajo del grifo), 4 minutos.

3.- Teñir con eosina, 35 segundos.

4.- Lavar con etanol de 96º hasta eliminar el exceso de colorante. Para ello, echaremos el etanol

sobre los cortes con una pipeta inclinando un poco el portaobjetos para que el etanol caiga al

cristalizador. A continuación, pasamos el portaobjetos con las secciones teñidas a la batería de

deshidratación.

5.- Cubeta de etanol 100º, 5 minutos.

6.- Cubeta de histo-clear, 3 minutos.

7.- Montaje. Se añaden unas gotas de medio de montaje (Eukitt) sobre las secciones y se pone el

cubreobjetos encima evitando que se formen burbujas de aire.

C.- Observación. Observación de las preparaciones obtenidas en el microscopio óptico de

campo claro. Observación de preparaciones sin teñir en el microscopio óptico de campo oscuro y en el

microscopio óptico de contraste diferencial de interferencia (DIC) o de Nomarski.

CUESTIONES

1.- En nuestro laboratorio de técnicas histológicas pretendemos estudiar la estructura del

músculo esquelético de ratón mediante la realización de una tinción hematoxilina-eosina sobre

secciones de 10 micras de grosor.

a.- Describe con detalle los diferentes pasos del proceso que va desde que extraemos el tejido

del animal hasta que lo observamos al microscopio óptico.

b.- Tras realizar la tinción sobre las secciones de músculo esquelético ¿qué componentes

celulares se teñirían y por qué?

c.- ¿En qué tipo de microscopio podríamos observar las preparaciones obtenidas?

5. TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN Y ELECTROFORESIS

(código calendario de prácticas: BQ)

TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN Y ELECTROFORESIS

Introducción

Centrifugación y fraccionamiento subcelular

La mayoría de los laboratorios de Biología disponen de centrífugas, de las cuales existen varios

tipos. Así, en función del de rotor tenemos centrífugas con rotores basculantes o con rotores de ángulo

fijo, y en base a la velocidad que alcanzan tendremos centrífugas (hasta ~3,000 xg), centrífugas de alta

velocidad (2,000-20,000 xg) y ultracentrífugas (15,000-600,000xg). Todas ellas se emplean para

separar sustancias de masas o densidades distintas, como por ejemplo partículas sólidas (células,

orgánulos, etc) de un líquido o bien líquidos con diferentes densidades. Los rotores basculantes

mantienen los tubos en posición vertical cuando el rotor está en reposo, pero dicha posición se vuelve

horizontal durante la centrifugación de modo que las partículas sedimentan uniformemente en el fondo

del tubo. En los rotores de ángulo fijo, en cambio, los tubos están situados en ángulo (25º-52º), y las

partículas van sedimentando tanto en el fondo como en los laterales de los tubos. Debido a su diseño

más aerodinámico, este último tipo de rotores alcanzan mayores velocidades. Las microcentrífugas que

vamos a emplear esta práctica tendrán rotores en ángulo fijo y nos permitirán operar a 11,000-15,000

revoluciones por minuto (rpm). Finalmente, las ultracentrífugas se caracterizan por ser capaces de

alcanzar altas velocidades (por ejemplo, 100,000 rpm), tanto con rotores de ángulo fijo como

basculantes.

Todas las centrífugas disponen de un motor eléctrico y de un rotor conectado a éste a través de

un eje. Tanto el eje como el rotor están colocados dentro de una cámara de seguridad; dicha cámara está

cerrada mediante una tapa. En el panel de control aparecen botones de encendido/apagado, de selección

de velocidad, de nivel de frenado, y en algunas de temperatura de trabajo (entre -15ºC y 25ºC). El

control de la temperatura evita incrementos debido a la fricción que podrían desnaturalizar las proteínas

o lisar las células. Las centrífugas disponen de tacómetros para conocer la velocidad (rpm) de

funcionamiento, y en el caso de las de alta capacidad y ultracentrífugas de alarmas de aviso de posibles

desequilibrios. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm) hace necesaria la

existencia de sistemas de vacío en la cámara para evitar el calentamiento de rotor y muestras.

Los tubos empleados en centrifugación pueden ser de vidrio o de plástico (poliestireno,

polipropileno), siendo más resistentes los últimos. Los tubos pueden tener formas (fondo cónico, fondo

redondo; sin tapa o con tapa, etc) y capacidades diversas. El equilibrado y colocación de los tubos en el

rotor es crucial, ya que si este proceso se realiza incorrectamente el proceso de centrifugación puede

pararse o generar sedimentos poco compactados.

Aparte de la velocidad de giro, expresada en rpm, también se emplea como unidad de medida la

fuerza de aceleración, fuerza centrífuga relativa (RCF) o número de veces que la fuerza de gravedad,

expresada en x g, se está aplicando a la muestra. Existe una relación directa entre RPM y RCF: RCF=

1.12 x10-5 x r x (rpm)2, en donde r es el radio del rotor (cm). Los valores en velocidad expresados en x g

son constantes entre las distintas centrífugas, pero no así los valores de rpm para un valor fijado de

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RCF, pues es dependiente del radio del rotor. No obstante, la mayoría de las centrífugas actuales

permiten especificar tanto RPM como RCF. Además, en los libros de instrucciones de las centrífugas

aparecen tablas o nomogramas para determinar las rpm que debemos seleccionar para un valor fijo de

RCF cuando rotor y radio son conocidos.

El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos que permiten obtener fracciones

enriquecidas en orgánulos (ej., mitocondrias, núcleos), fracciones de membrana (ej., membrana total,

membrana plasmática) o complejos multiproteicos (ej., citoesqueleto) mediante dos etapas. En la

primera tiene lugar la rotura celular (lisado) mediante procedimientos mecánicos suaves que pueden

emplear o no detergentes (sonicación, homogenizadores, etc). En esta práctica realizaremos una lisis

hipotónica sin detergentes, al emplear una solución con una osmolalidad muy inferior al citoplasma de

las células; esto genera la entrada de agua y la lisis celular. En la segunda etapa se separa la fracción

deseada mediante diversos criterios, como por ejemplo diferencias en densidad (ej., centrifugación

diferencial). La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la

suspensión que difieren, entre sí y con el medio, en cuanto a su densidad. Si se centrifuga en

condiciones suaves (poco tiempo, baja velocidad) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas.

Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones más

intensas sedimentarán las partículas más densas; el proceso se puede continuar indefinidamente.

En la práctica de hoy vamos a emplear un protocolo de centrifugación

diferencial con un modelo celular muy sencillo: el eritrocito humano. Los

eritrocitos han perdido su núcleo, membranas internas y mitocondrias, de modo

que pueden ser utilizados para la producción de fantasmas, vesículas obtenidas

después de liberar el contenido citoplasmático mediante hemolisis y que

constituyen un preparado casi puro de membrana plasmática. Dentro de esta

membrana plasmática existen tanto proteínas integrales como periféricas; las

primeras, embebidas en la membrana plasmática, y las segundas, unidas a su

cara interna formando un entramado de proteínas periféricas denominado

citoesqueleto. Dentro de las integrales tenemos la proteína transportadora de

aniones, el transportador de glucosa y las glicoforinas, y dentro de las

citoesqueléticas la espectrina, la actina y la proteína de la banda 4.1 (Figura 1).

FIGURA 1: Patrón electroforético de las proteínas presentes en los

fantasmas de membrana de eritrocitos (Tomado de B.W. Shen y cols,

1986): Bandas 1 y 2: Cadenas y de la Espectrina. Bandas 2.1, 2.2 y 2.3:

Ankirina. Banda 3: proteína transportadora de aniones. Banda 4.1: Proteína del

citoesqueleto. Banda 4.2: Paladina. Banda 4.9: Demantina. Banda 5: Actina.

Banda 6: Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa.

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Electroforesis

La electroforesis se basa en el movimiento que provoca el establecimiento de un campo

eléctrico sobre una molécula con carga y que permite la separación, por ejemplo, de proteínas, ADN o

ARN. Según la expresión v= Ez/f, la velocidad de migración (V) de estas moléculas dentro de un

campo eléctrico depende de la fuerza del campo (E), de la carga de la proteína (z) y del coeficiente de

fricción (f). Este último, a su vez, varía con la forma de la molécula, su tamaño y la viscosidad del

medio. Esto hace que una sustancia anfotérica como las proteínas, en un tampón de pH determinado

(que no se corresponda con el punto isoeléctrico de ésta), presente una carga eléctrica neta. De este

modo, diferentes proteínas con una relación carga/masa distinta y en estado nativo (no denaturalizado)

puedan ser separadas al establecerse un campo eléctrico mediante la electroforesis nativa.

Sin embargo, en las electroforesis desnaturalizantes como la de la práctica, la carga de la

proteína no va a ser la endógena, sino que viene dada por el dodecil sulfato sódico (SDS) del tampón de

muestra. El SDS es un detergente aniónico que se une con una estequiometría de aproximadamente un

molécula de SDS por cada dos aminoácidos. Esto le confiere a la proteína una carga negativa

proporcional a su masa; es decir, iguala la relación carga/masa de las proteínas. Además, la repulsión de

las cargas del SDS destruye las interacciones no covalentes lo que, junto con el calor, produce el

desplegamiento proteico. De este modo, al aplicar un campo eléctrico a la muestra, los complejos

proteína:SDS migrarán hacia el polo positivo y se separarán según el peso molecular (las proteínas más

pequeñas migrarán más rápidamente que las grandes). Aparte del SDS, el tampón de muestra también

contiene -ME o DTT, moléculas que rompen los puentes disulfuro, glicerol o sacarosa, para que la

muestra tenga una mayor densidad que el tampón de electroforesis y caiga dentro de los pocillos del

gel, y azul de bromofenol, un colorante con carga negativa con la movilidad electroforética de un

pequeño polipéptido y cuya función es la de ir por delante de las proteínas (frente de electroforesis).

Las separaciones electroforéticas se realizan habitualmente sobre distintos medios de soporte,

que evitan las corrientes de convección y sirven como tamices moleculares. Estos son habitualmente de

tipo continuos, como los geles de almidón, agarosa o los polímeros químicos (poliacrilamida). Los geles

de poliacrilamida son producidos mediante la polimerización de acrilamida y su derivado bifuncional,

la bisacrilamida. Esta última molécula establece los enlaces cruzados que permiten generar poros con

un tamaño controlado. Se emplean como catalizadores de la reacción persulfato de amonio y TEMED.

Los geles de poliacrilamida son descritos en función de dos parámetros, que son la concentración total

de monómero o %T [(gramos de acrilamida +gramos de bisacrilamida/volumen total en mL) x 100], y

el porcentaje en peso de crosslinker o %C [(gramos de bisacrilamida/gramos de acrilamida +gramos de

bisacrilamida) x 100]. Valores de %C del 2.6% (ratio 37.5:1), como en esta práctica, o 3.3% (ratio 29:1)

son apropiados para separaciones de proteínas, mientras que %C del 5% (ratio 19:1) son adecuados para

secuenciación de DNA.

57


La SDS-PAGE puede realizarse horizontalmente o verticalmente, y puede ser continua o

discontinua; la más empleada, y utilizada en la práctica, es la discontinua. En ésta se preparan 2 geles:

el gel separador (pH 8,8), donde se resuelven las proteínas y que tiene un %T elegido en función del

peso molecular de las proteínas a separar (menor cuanto mayor sea el peso de la proteína), y el gel

concentrador (%T = 4%, pH 6,8), situado sobre el primero. Bajo la acción del campo eléctrico

aplicado a la solución a través de dos electrodos con distinta carga (positiva/ánodo & negativa/cátodo),

los iones (en este caso, la mezcla proteica con carga negativa -y por tanto aniones- colocada sobre el gel

de concentrador) migran hacia el electrodo de carga opuesta (el ánodo). Cuando las proteínas llegan al

gel separador se concentran, de manera que todas inician la separación en el mismo momento; esto

mejora la resolución de la electroforesis.

En cualquier sistema eléctrico, la intensidad de la corriente producida es directamente

proporcional al voltaje aplicado e inversamente proporcional a la resistencia (Ley de Ohm, V=IR). La

electroforesis puede ser llevada a cabo fijando un valor de voltaje (por ejemplo, 100-200 V, como en

esta práctica) o de intensidad, pero en cualquier caso debe de realizarse lo más rápidamente posible para

evitar la difusión y maximizar la resolución. Si bien muchas electroforesis se realizan a RT, como la de

la práctica, en ocasiones los elevados voltajes implican mucha generación de calor, lo que hace

necesario el uso de geles muy delgados y sistemas de enfriamiento.

Una vez la electroforesis termina y las bandas de proteínas han sido resueltas en el gel

separador éstas deben de ser visualizadas. Para ello se emplean diversos métodos de tinción con

moléculas afines a las proteínas, tales como el azul de Coomassie (como el R-250, o el G-250 de la

práctica), con el que se pueden visualizar 0.1-0.5 μg de proteína/banda. Otro método de tinción son las

sales de plata, con elevada sensibilidad (hasta 0.1 ng proteína/banda) pero baja reproducibilidad.

Métodos de tinción con sensibilidades comparables a la plata, pero más reproducibles son los

compuestos fluorescentes, como el SYPRO Ruby, Flamingo Ruby, Deep Purple, Pro-Q Emerald.

Finalmente, varias son las aplicaciones de la SDS-PAGE, como por ejemplo analizar el grado

de pureza de una proteína, determinar su peso molecular (o cambios en este por proteolisis), o conocer

la concentración de una proteína en la muestra.

Objetivos:

Utilizar un protocolo sencillo de fraccionamiento diferencial para purificar membranas

plasmáticas de eritrocitos humanos para que los/as alumnos/as se familiaricen con las técnicas

de centrifugación.

Que el/la estudiante ponga en práctica los fundamentos teóricos adquiridos en el seminario

sobre electroforesis y que conozca una de sus aplicaciones: el análisis de mezclas de proteínas y

los datos que se pueden extraer de dicho análisis.

58


59

Instrumental:

Equipo de electroforesis MiniProtean de la casa comercial BioRad® (ver foto superior), que

trabaja con un sistema de mini geles que requiere poca muestra, es más rápido y mantiene una

alta resolución en la separación de las proteínas. Incluye un juego de cristales (pequeños y

grandes), separadores, peines de 10 pocillos, marcos para sujetar los cristales y “casting stands”

para generar 8 geles de SDS-PAGE. Tanque y tapa (ver foto superior).

Microfuga Bata y guantes (medianos y

pequeños) Fuente de alimentación (capacidad

200V, 500 mA) Contenedor de residuos biológicos

y químicos Agitador magnético con capacidad

para hervir muestras. Bandeja con cristal para la tinción

de los geles Microondas

8 kitasatos Micropipetas: p1000, p200 y p20

8 pipetas vidrio 10 mL +chupones

10 mL

Puntas azules y amarillas + cajas

Tubos eppendorf® de 1.5 mL,

blancos

Reactivos

Cloruro sódico Solución de tinción basada en azul

de coomassie G-250 Biosafe® Cloruro potásico

Marcadores de peso molecular Fosfato de sodio monobásico

Acrilamida Fosfato de sodio dibásico

Bisacrilamida


Tris

SDS (sodio dodecil sulfato)

TEMED

Persulfato de amonio

2-mercaptoetanol (�-ME)

Glicerol

Azul de bromofenol

Glicina

EDTA

Ácido clorhídrico (HCl)

Soluciones

Solución 1: Tris/HCl 1,5 M pH 8,8, 100 mL. Pesar 18,15 g de Tris. Disolver el Tris en

50 mL de agua destilada. Añadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a

8,8. Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL). Estable por meses a

4ºC.

Solución 2: Tris/HCl 1 M pH 6,8, 100 mL. Pesar 12,1 g de Tris. Disolver el Tris en 50

mL de agua destilada. Añadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a 6,8.

Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL). Estable por meses a

4ºC.

Solución 3: SDS 10% (w/v), 100 mL. Pesar 10 g de SDS. Añadir agua destilada hasta

completar el volumen de 100 mL. El SDS es un polvo fino neurotóxico, por lo tanto se

debe usar máscara, guantes y gafas de protección. Almacenar a RT.

Solución 4: Glicerol 50% (v/v), 100 mL. Mezclar un volumen de 50 mL de glicerol al

100% con 50 mL de agua destilada. Almacenar a RT.

Solución 5: Azul de Bromofenol 1% (w/v), 10 mL. Pesar 100 mg de azul de

bromofenol. Completar con agua destilada hasta 10 mL y mezclar hasta disolver. Filtrar

la solución en papel Whatman No 1 para eliminar el colorante no disuelto. Almacenar a

RT.

Solución 6: Acrilamida 30% (100 mL). La solución de acrilamida al 30% (w/v) es una

mezcla de acrilamida (29,2 g) y bisacrilamida (0,8 g). Pesar ambos reactivos y añadir

agua destilada hasta 100 mL. Filtrar en papel de filtro Whatman Nº1 La acrilamida en

polvo y en solución es neurotóxica, por lo tanto se debe usar máscara, guantes y lentes

de protección para su manipulación, o mejor comprarla ya preparada. Estable por meses

a 4ºC.

Solución 7: Persulfato de amonio al 10% (w/v), 5 mL. Pesar 0,5 g de persulfato de

amonio. Disolver en 5 mL de agua destilada. Almacenar a -20ºC.

Solución 8: Tampón de electroforesis 1X, 1 L. Pesar 3 g de Tris (25 mM), 14,4 g de

glicina (192 mM) y 1 g de SDS (0,1%). Añadir agua destilada hasta completar 1 L. El

pH debería ser de aproximadamente 8,3. Se puede preparar una solución 10 veces

60


concentrada y diluir el volumen necesario en el momento de la electroforesis. Esta

solución puede almacenarse indefinidamente a RT.

Solución 9: Tampón de muestra 5X, 10 mL. 0,6 mL de Tris/HCl 1M pH 6,8 (solución

2; 60 mM), 5 mL de Glicerol 50% (solución 4; 25%), 2 mL de SDS 10% (solución 3;

2%), 0,5 mL de 2-mercaptoetanol (14,4 mM), 1 mL de azul de bromofenol (solución 5;

0,1%), 0,9 mL de agua destilada. Almacenar a -20 ºC.

Solución 10: Tampón fosfato salino o PBS, 1L. Pesar 8 g de cloruro de sodio (NaCl),

0,2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,24 g de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) y

1,44 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4). Llevar hasta 1L con agua destilada. No

ajustar el pH. Almacenar a 4ºC.

Solución 11: 1 M tampón fosfato pH 7.0, 200 mL. Preparamos primero las soluciones

madre: solución A: 2 M fosfato de sodio monobásico (2,76 g NaH2PO4 H2O en 10 mL);

solución B: 2 M fosfato sodico dibásico (2,84 g de Na2HPO4 en 10 mL). Mezclar 3,9

mL de solución A y 6,1 mL de solución B. Diluir hasta 20 mL con agua para generar

una solución 1M.

Solución 12: 0.5M EDTA pH 8.0. Pesar 18,612 g de EDTA disódico 2 H2O y disolver

en 70 mL de agua destilada. Ajustar a pH 8.0 con 10 N NaOH (el EDTA no se

disolverá a menos que se alcance pH 8.0) y completar hasta 100 mL con agua destilada.

Guardar a 4ºC.

Solución 13: Tampón de lisis hipotónico, 100 mL. 5 mM fosfato sódico pH 7.0, 0.5

mM EDTA. Mezclar 0,5 mL de 1M tampón fosfato pH 7.0 (solución 11) con 0,1 mL de

0.5M EDTA pH 8.0 (solución 12). Completar con agua destilada hasta 100 mL.

Guardar a 4ºC.

Protocolo:

1er día, 2h 30 min

Obtención de los eritrocitos:

1. Coger 500 l sangre humana tratada con EDTA y la depositamos en un tubo eppendorf

de 1.5 mL. Centrifugar a 1000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).

2. Eliminar el plasma sanguíneo y la primera capa de leucocitos (que está sobre los

eritrocitos empaquetados). Lavar con 500 l de PBS pH 7.4, que es isotónico con el

citoplasma de las células rojas.

3. La suspensión se centrifuga a 1,000 xg durante 10 min a RT.

4. Descartar el sobrenadante y repetir el lavado con 500 l de PBS pH 7.4 dos veces más

para eliminar todas las proteínas del suero.

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Lisis hipotónica de los eritrocitos:

5. Utilizamos un protocolo de lisis hipotónica descrito por G. Fairbanks y colaboradores

en 1971. Las células se rompen tomando una fracción del volumen empaquetado (por

ejemplo, 150 l) y añadiendo aproximadamente 10 volúmenes (1,35 mL) del tampón

hipotónico frío (5 mM fosfato sódico pH 7.0, 0.5 mM EDTA).

6. Dejar lisar durante 15 minutos en hielo.

Fraccionamiento del lisado mediante centrifugación:

7. La suspensión se centrifuga a 12,000 xg durante 10 minutos. Cuidado con la colocación

de los tubos!!!!!

8. El sobrenadante se retira por aspiración y se guarda etiquetado como citosol.

9. El precipitado, que contiene los fantasmas de membrana, se resuspende en 5 mM

fosfato sódico pH 7.0 frío para la realización de varios lavados más (típicamente 3),

hasta que los fantasmas de membrana sean blancos (es decir, hasta que no contengan

hemoglobina).

10. Las proteínas de membrana se disuelven incubando los fantasmas con 25 l de tampón

de muestra de electroforesis 1X.

11. Del sobrenadante citosólico (paso 8) se toman 20 l y se le añaden 5 l de tampón de

muestra de electroforesis 5X.

12. Las tapas de los eppendorf que contienen los dos tipos de muestras son perforadas con

una aguja. Las muestras se hierven durante 15 minutos, se centrifugan a 12,000 xg

durante 5 minutos a RT para eliminar las proteínas precipitadas y los sobrenadantes se

guardan en tubos eppendorf nuevos etiquetados (tubo 1: citosol; tubo 2: proteína de

membrana) a -20 ºC hasta el día siguiente.

2º día. 2h 30 min. SDS-PAGE y tinción.

1. Ensamblar el molde formado por los soportes, vidrios y los separadores.

2. Preparación de los geles: Cada grupo va a preparar un minigel, aunque al final

solo dos serán los requeridos para cargar las muestras de todos los grupos.

3. Se prepara el gel separador con un porcentaje de acrilamida del 12% mezclando

en un kitasato y en este mismo orden 4 mL de agua, 2,5 mL de Tris HCL 1.5 M

pH 8,8, 100 l de 10% SDS y 2.5 mL de 30% acrilamida/0.8 % bisacrilamida.

Se añaden 100 l de persulfato amónico al 10% y 4 l de TEMED.

4. Utilizando una micropipeta p1000 se llena el sandwich formado por los cristales

y los separadores con dicha solución; no se deben formar burbujas. Dejar

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aproximadamente 1,5 cm entre la solución de acrilamida y el vidrio pequeño. Se

completa con agua con mucho cuidado para evitar que el borde del gel

polimerice de manera irregular y se deja polimerizar durante 30 minutos a RT.

5. Una vez polimerizado el gel separador, descartar el agua de la superficie del

mismo y preparar 4 mL de gel concentrador (4%) mezclando 2,7 mL de agua

destilada, 0,67 mL de solución 30%Acrilamida/0.8%bisacrilamida, 0,5 mL de

Tris/HCl 1 M pH 6,8, 40 μl de 10%SDS, 40 l de 10% persulfato amónico y 4

μl de TEMED. Utilizando una micropipeta p1000 se deposita sobre el gel

separador ya polimerizado y se inserta finalmente el peine con cuidado de no

formar burbujas. Dejar polimerizar durante 30 minutos a RT.

6. Durante el transcurso de esta última polimerización se descongelan las muestras

de proteína tanto del tubo 1 (citosol) como del tubo 2 (proteína de membrana)

para ser cargadas en el gel (20 l de cada una; 4 grupos por gel). Se preparan

también los marcadores de peso molecular.

7. Electroforesis: colocar dos de los geles (los que hayan quedado mejor) en el

tanque de electroforesis con aproximadamente 500 mL de tampón de

electroforesis 1X (solución 8). Quitar cuidadosamente el peine para que queden

libres los pocillos del gel. Los pocillos deben de ser limpiados con tampón de

electroforesis con micropipeta para eliminar el monómero de acrilamida no

polimerizado.

8. Las muestras de todos los grupos y los marcadores de peso molecular son

cargados en los dos geles. La unidad de electroforesis se conecta a la fuente de

alimentación y se aplica un voltaje constante de 100-200V.

9. Tinción: Finalizada la electroforesis se extraen los geles de la unidad de

electroforesis y se deposita en una cubeta de cristal. Los geles se fijan y lavan

dos veces con 50 mL por gel de 20% etanol en agua destilada en el microondas

(de 45 segundos a 1 minuto; 50-70ºC). Agitar 5 minutos.

10. Lavar una vez con 100 mL de agua destilada/gel a ~80ºC en el microondas,

agitar durante 2 minutos y repetir el lavado.

11. Teñir con 25 mL de solución de tinción Biosafe por gel, suficiente como para

cubrir los geles. Tapar con parafilm la cubeta y meter en el microondas.

Calentar a 70-80ºC a máxima potencia (dos pulsos de 20 segundos; parar si

empieza a hervir). Sacar y dejar en agitación suave durante 10 minutos.

12. Eliminar la solución de tinción. Lavar con 100 mL de 10% etanol en agua

destilada por gel en microondas a 50-70ºC. Sacar de microondas y poner papel

adsorbente. Agitar 15 minutos (o hasta que se destiña correctamente).

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EJERCICIOS DE LA PRÁCTICA DE CENTRIFUGACIÓN Y ELECTROFORESIS

Pregunta 1:

Representar el logaritmo del peso molecular de los marcadores en el eje Y frente a

la movilidad relativa de dichos marcadores (distancia migrada por el

marcador/distancia migrada por el frente de azul de bromofenol) en el eje X.

Calcular el peso molecular de las bandas 1, 2, 3, 4.1 y 4.2. Empleando el Atlas

Proteico Humano (http://www.proteinatlas.org) obtener los pesos moleculares de

dichas proteínas y comparar los resultados obtenidos en la práctica con los de la

base de datos.

Pregunta 2:

La proteína representada a continuación es la proteína transportadora de aniones

de eritrocitos (banda 3). Imagine que ha purificado dicha proteína en estado

oxidado y que las cisteínas 317 y 201 están implicadas en la formación de puentes

disulfuro intra- e intermoleculares (entre diferentes monómeros). Dibuje un

esquema del patrón de bandas, con sus pesos moleculares correspondientes, que

esperaría tras una SDS-PAGE de esta proteína en presencia y ausencia de -ME.

http://www.proteinatlas.org/

6. MEDIO FÍSICO Y TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA

(código calendario de prácticas: EDAFO)

MEDIO FÍSICO Y TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA

PRÁCTICA

Se realizará una salida a una zona próxima a la ciudad para hacer el estudio del medio físico de un

emplazamiento, mediante la caracterización de los distintos factores del medio y de sus interrelaciones

Para cubrir por el alumnado:

Fecha de la salida

Área de estudio

Cartografía utilizada

Datos do emplazamiento

‐ Posición fisiográfica

‐ Coordenadas geográficas

‐ Pendiente

‐ Altitud

Estudio del relieve. Corte topográfico

Materiales geológicos

Morfología de los suelos

Estudio del clima. Diagrama de Thornthwaite

Vegetación y uso del suelo

Interpretación conjunta de los factores del medio físico en ese emplazamiento

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MEDIO FÍSICO Y TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA

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7. MÉTODO CIENTÍFICO Y TÉCNICAS DE MUESTREO

(código calendario de prácticas: ECO)

MÉTODO CIENTÍFICO Y TÉCNICAS DE MUESTREO

1. INTRODUCCIÓN

1.1. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.

La práctica consistirá en tres fases bien diferenciadas que se realizarán en tres sesiones consecutivas.

En la primera sesión se realizará en el campo (en este caso en el Campus Sur de la USC). La sesión se

efectuará en parejas a las que a cada una les corresponderá su respectivo receptor GPS. El lugar en el

que se iniciará la práctica será la puerta principal de la Facultad de Biología. Es posible que durante las

horas de la práctica existan precipitaciones o condiciones atmosféricas adversas, que en principio no

supondrán suspensión de la práctica a no ser que sean extremas. Os recomendamos la lectura del

apartado “recomendaciones generales para el trabajo en el campo” para que acudáis convenientemente

preparados. Del mismo modo es necesario que previamente se haya leído el documento sobre los

“Sistemas Satelitales de Navegación Global”, que se podrá descargar de la página de la USC Virtual,

correspondiente a esta asignatura.

Durante, esta práctica primeramente se realizará una breve introducción a cerca de las recomendaciones

generales para el trabajo en el campo. Posteriormente se explicará el empleo de los diferentes modelos

de GPS que se van a utilizar durante el desarrollo de la misma, prosiguiendo con la asignación del GPS

correspondiente a cada pareja. A continuación se procederá a la captura de datos, tal y como se

especifica en el correspondiente apartado de esta memoria (Sección 2.2).

La segunda sesión se realizará en la sala de informática. Se comenzará con un tiempo para la aclaración

de dudas sobre el documento de “Sistemas Satelitales de Navegación Global”. A continuación se os

explicará como configurar un puerto USB como un puerto COM, y como importar los datos de un GPS

a un PC, a través de un software específico de la casa de los GPS empleados. Realizareis una

importación de datos desde el GPS que se os había asignado en la sesión anterior. A continuación

aprenderéis a exportar (a un archivo de texto sin formato) desde dicho software los archivos de datos

que previamente habéis importado. Estudiaremos el contenido del archivo exportado y lo

modificaremos para que pueda ser empleado en un Sistema de Información Geográfica (GIS). A

continuación desde un GIS (ArcMap 9.2 Esri©) se importará dicho archivo y aprenderemos unas

mínimas nociones de edición de datos que nos permitan crear archivos de puntos, líneas, polilíneas y

polígonos a partir de puntos, así como a modificar archivos de puntos. Por último aprenderemos a

diseñar muestreos desde un GIS mediante “Hawth's Analysis Tools for ArcGIS”, creando archivos de

puntos. Una vez creado estos archivos aprenderemos a exportarlos desde el ArcMap y a importarlos al

GPS.

La última sesión se realizará en el campo (de nuevo en el Campus Sur de la USC). La práctica se

efectuará en parejas a las que a cada una les corresponderá su respectivo receptor GPS. El lugar en el

que se iniciará la práctica será la puerta principal de la Facultad de Biología. Las recomendaciones

climatológicas de la primera sesión vuelven a ser aplicables. Se comenzará con la expiación del uso del

GPS en navegación, tras lo cual procederéis a buscar en este modo las coordenadas de los muestreos

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generados en la sesión anterior. Una vez lleguéis a estas coordenadas procederéis a la adquisición de

datos inmediatos (i.e. orientación, pendiente, altitud, pedregosidad, estima de la cobertura vegetal por

estratos), para proseguir a el muestreo de árboles en parcelas de radio de 20 metros.

72


1.2. RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL CAMPO

Aunque para la práctica que vamos a realizar no abandonaremos el Campus Sur de la USC, es

conveniente que conozcáis algunos aspectos y medidas de seguridad importantes a la hora de realizar el

trabajo de campo. No desdeñes estos consejos, si trabajas en el campo con el paso del tiempo acabarás,

desgraciadamente, conociendo a personas que lo han pasado muy mal por desatenderlos.

1.2.1. Recomendaciones generales

No salgáis nunca solos al campo. Por cuestiones de seguridad, es necesario salir como mínimo en

parejas. No te tomes esta recomendación a la ligera. Informad siempre a una persona cercana de

vuestras intenciones sobre la ruta que vais a seguir.

Cuando vayamos con personas con diferente forma física, el que tiene la peor forma marca el ritmo del

grupo al que nos adecuaremos con paciencia. Dosificad los esfuerzos y descansad cuando lo necesitéis.

Si sudáis, no olvidéis abrigaros al descansar.

No olvidéis nunca el teléfono móvil con la batería cargada (aunque en muchas zonas no tendréis

cobertura) ni el GPS (cuando lo tengáis). Si no conoces perfectamente la zona consulta antes cartografía

y lleva siempre un mapa.

No comáis frutos u hongos que no sepáis con seguridad que son comestibles. No bebáis agua que no sea

potable de forma verificada. Ojo con las aguas de alta montaña; en ocasiones las altas concentraciones

minerales pueden causar problemas gástricos.

1.2.2. Condiciones meteorológicas

Consultad siempre una predicción meteorológica fiable (i.e. http://meteogalicia.es) antes de salir al

campo. Si las condiciones son adversas o hay riesgo de las mismas, siempre que sea posible aplazad la

salida. De no ser así tomad las mayores precauciones posibles.

En los días calurosos, empezad la actividad con el tiempo necesario para acabarla antes de la hora de

más calor. Cuidado con la caída de la noche, consultad previamente la hora del ocaso y tened en cuenta

que dentro de cubiertas vegetales y/o en vaguadas y/o en pendientes con orientación este y/o con el

cielo encapotado la luz se extingue antes. Calculad con un amplio margen de seguridad - siempre puede

haber imprevistos - el tiempo del camino de retorno.

1.2.3. Recomendaciones sobre la ropa y calzado

Hay que llevar la ropa y el calzado adecuado y dependiendo de la época del año. Selecciona siempre

ropa cómoda. Para una salida sencilla (p.e. caminos, pistas, etc.) es suficiente un chándal y unos

deportivos. Si se trata de un trabajo en campo ya tendremos que llevar buena ropa y calzado.

La ropa debe de ser ligera, que permita el trabajo físico y que transpire. Que la ropa se pueda quitar por

capas es una buena opción cuando hace frío y vamos a realizar trabajo físico. En cuanto a la protección

de la lluvia en el mercado hay una gama muy amplia de tejidos impermeables. Si no vais a trabajar con

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http://meteogalicia.es/


asiduidad en el campo un impermeable y un pantalón plástico son una opción óptima (lo venden en

cualquier ferretería a un precio muy razonable). El problema del plástico es la falta de transpiración, por

ello si pensáis salir con frecuencia al campo o trabajar en allí en el futuro es posible que os compense

realizar una inversión en otras opciones. Como dijimos existe una gama amplísima de tejidos donde

elegir, además de las características previamente comentadas (ligeras, cómodas y que transpiren) tened

en cuenta la resistencia a la abrasión y a las posibles roturas ocasionadas por la vegetación. Tanto el

plástico como algunas prendas de alta montaña no están diseñadas para trabajar entre vegetación que

posea pinchos o espinas (lo que es habitual en nuestra geografía, p.e. Ulex sp. o Rubus, sp.), que se

rasgarán rápidamente perdiendo su impermeabilidad. Los cortavientos encerados reúnen todas estas

características y resultan muy difíciles de rasgar (pudiendo ser reparados cuando esto ocurre), en el

mercado existen multitud de marcas y precios tanto de chaquetas como de cubrepantalones. Es

interesante que las chaquetas tengan bolsillos externos de rápido acceso así como bolsillos carpeteros,

etc. Cuando hay lluvia o riesgo de la misma llevad siempre una muda completa.

En cuanto al calzado llevadlo resistente y cómodo. Comprad botas que se ajusten a vuestras

necesidades, prestando atención a los diferentes tipos de suelas, que son la parte más importante de la

bota, deben dar agarre al tiempo que ser duraderas. La selección de una bota de cualquier marca que

tenga suela “Vibram” es acertada. Si optáis por botas con membrana de Goretex, sed conscientes que si

se os llega a romper la membrana, al tener que impermeabilizar externamente la bota, los tejidos

interiores dan peores resultados que en botas sin membrana. Independientemente de la opción escogida,

las polainas de cordura son muy aconsejables cuando llueve, protegen tanto la bota como la parte baja

del pantalón, que en ocasiones queda al descubierto del cubrepantalón. No uses nunca calzado nuevo

para una salida al campo. Cuidaos los pies, prestad atención a que no tengáis arrugas en los calcetines

para evitar las ampollas. Los calcetines con teflón son una correcta solución al problema de las

ampollas. Lleva siempre unos calcetines de repuesto.

Una solución de emergencia, o para ahorrar inversiones, que sirve tanto para tejidos de algodón (p.e. un

pantalón vaquero) como para cualquier calzado de piel (p.e. unos deportivos) es el uso de sprays

impermeabilizantes que podréis encontrar en cualquier tienda de deportes o armería.

Aunque haga buen tiempo es siempre aconsejable llevar un chubasquero. En los días de sol no olvides

una gorra o sombrero y las gafas de sol. En los días de frío un cuello de tejido polar es un buen aliado, y

con frío extremo un pasamontañas.

1.2.4. Recomendaciones sobre el equipamiento

Llevad una pequeña mochila impermeable con una navaja, un cordón, una linterna o frontal, cerillas,

una bolsa de plástico y papel higiénico. Si tenéis cámara de fotos llevadla con vosotros.

Es conveniente llevar una botella de agua, frutos secos, galletas y fruta. Durante la jornada bebe agua y

toma algún alimento de vez en cuando.

74


Llevad con vosotros un pequeño botiquín con desinfectante, gasas, esparadrapo, apósitos adhesivos,

tijeras, pinzas, analgésicos, pomada antiestamínica, pomada para las quemaduras, vaselina, protección

solar y repelente de insectos.

1.2.5. Recomendaciones en caso de que nos perdamos

Procura no alejarte nunca del grupo o pareja. Si por cualquier razón debes apartarte, avisa al resto para

que te esperen. Si alguna vez te pierdes, espera, en cuanto alguien observe que faltas volverá a por ti. Es

más fácil encontrarte por donde ya se ha pasado, así que es mejor esperar y no empezar a andar sin

saber dónde ir. Cuando alguien se pierde los equipos de búsqueda suelen hacer señales con un silbato

(se oye más lejos que la voz), procura contestar gritando.

1.2.6. Recomendaciones en caso de accidente

El número de emergencias internacional es el 112. No obstante en ocasiones os encontrareis en zonas

sin cobertura o en las que la asistencia médica puede tardar mucho en llegar por ello es conveniente que

tengáis formación en primeros auxilios (atragantamiento, cuerpos extraños, esguinces, luxaciones,

fracturas, trasporte de accidentados, heridas, hemorragias, mareo, lipotimia, picaduras y mordeduras y

RCP básica). De no ser así busca donde hacer un curso (consultad en el Servicio de Vixilancia da Saúde

da USC).

1.2.7. Recomendaciones para como tomar notas en el campo

Es conveniente que llevéis siempre una carpeta o un portafolios duro (de plástico o metal) que os sirva

de soporte a la hora de escribir. Tomad notas siempre con lápiz y sobre papel de alto gramaje, ya que en

el caso de que la hoja se moje la impresión no se borra, a diferencia de la tinta de un bolígrafo o un

rotulador. Cuanto mayor sea el gramaje menor será la posibilidad de que se rompa o deshaga si se moja.

Para prevenir la lluvia en el mercado existen protectores plásticos para papel normal o papel

plastificado con calco.

1.2.8. Recomendaciones para los desplazamientos

Cumple siempre las recomendaciones generales sobre seguridad al volante. Al menos uno de los

acompañantes debe conducir. Los desplazamientos en el campo se realizan usualmente en todoterreno.

Adquirir conocimientos en conducción “off-road”, empleo de cabestrantes (i.e. “winch”) os será

necesario si pensáis trabajar en el campo en el futuro. Cuando empleéis un todoterreno no olvidéis

equiparlo con una pala, guantes, planchas y cabestrante manual, cuando el coche no lo tenga eléctrico.

75

http://www.totem4x4.es/CABESTRANTES%20GOLDEN.html

http://www.totem4x4.es/CABESTRANTES%20GOLDEN.html


2. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1. SESIÓN PRIMERA

El profesor te asignará una de las zonas del croquis adjunto para que comiences la práctica. Debes

dirigirte a esa zona y buscar en las páginas siguientes el código correspondiente a dicha zona para

realizar la captura de datos que se señala en la correspondiente tarea para esa zona. Posteriormente

dirígete a la siguiente zona (de la zona 1 a la 26 en bucle cerrado) y realiza la correspondiente tarea y

así sucesivamente hasta agotar el tiempo de la práctica. Los mapas individuales de cada zona no están

orientados ni tienen norte, así que utiliza el adjunto para orientar cada uno.

76


ZONA: 01 Facultade de Química

TAREA: Polígono de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 20 vértices (de forma ordenada y consecutiva) del edificio que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 01) seguido de un guión bajo y el número de cada vértice indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con cualquiera de las otras esquinas), p.e. 01_01.

NOTAS: Guíate para establecer los vértices por las esquinas del edificio

PROBLEMAS OBSERVADOS (pérdida de cobertura, baja disponibilidad de satélites, dudas, etc.)

01

10

11

1213

02 03

04

05

06 07

08

09

1415

Fuente de la cartografía: http//www.usc.es/flora/index.html

20 17

18

16

19

77


ZONA: 02 Entrada Principal Campus Sur

TAREA: Polígono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras para hacer un polígono que comprenda la masa de árboles compuesta principalmente por varias especies diferentes cedros, tullas, criptomerias, magnolios, adelfas, etc. (Cedrus deodara, Euonymus japonicus, Magnolia grandiflora, Prunus cerasifera var. Pisardii, Nerium oleander, Criptomeria japonica, Cedrus atlantica, Camellia japonica, Thuja orientalis y Salix babilonica) que está marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el código 02_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne el código por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio marcando el último punto introducido en el GPS como 02_F. Realiza el mismo tiempo un “track” o análogo.

NOTAS: Emplea la proyección ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No incluyas los árboles de la acera.



78


ZONA: 03 Facultade de Dereito

TAREA: Polígono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras para hacer un polígono que comprenda la masa de árboles compuesta por cedros, álamos y un ciprés (Cedrus deodara, Cedrus atlantica, Populus alba y Cupressus lusitanica) que está marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el código 03_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne el código por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio marcando el último punto introducido en el GPS como 03_F. Realiza el mismo tiempo un “track” o análogo.

NOTAS: Emplea la proyección ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No incluyas los tejos ni el pino.



79


ZONA: 04 CESGA, CSIC, Biblioteca C.A. y Guardería

TAREA: Línea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 10 nodos del camino marcado en el plano adjunto (de forma ordenada y consecutiva). Identifícalos con el código de la zona (i.e. 04) seguido de un guión bajo y el número de cada nodo indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 1 con el 10), p.e. 04_01.

Realiza el mismo tiempo un “track” o análogo.

NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera


01

10 02

04

05

06 07

08 09

03


80


ZONA: 05 Viviendas de funcionarios e antigas casas de catedráticos

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 16 platanos (Platanus orientalis) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 05) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 16), p.e. 05_01.

NOTAS: Elige una orientación del tronco del árbol para tomar la coordenada y mantenla en el resto de los árboles.


0806 16 02 04 1410 12

15 1305 07 110903 01


81


ZONA: 06 Pistas de deportes

TAREA: Polígono de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 18 vértices (de forma ordenada y consecutiva) del estanque que están marcados en el plano adjunto (todos los vértices y 3 puntos por cada circunferencia). Identifícalos con el código de la zona (i.e. 06) seguido de un guión bajo y el número de cada vértice indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con cualquiera de las otras esquinas), p.e. 06_01.

Para los 5 primeros vértices (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Sólo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada vértice, y posteriormente pulsa 9 veces seguida la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne un código por defecto.

NOTAS: Camina y toma las coordenadas por el borde de piedra del estanque.



15

01

10

1112

13

0203

0407

08

18

1617

14

09

05

06

82


ZONA: 07 Facultad de Políticas

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada una de las 12 camelias (Camellia japonica) que están marcadas en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 07) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 12), p.e. 07_01.

NOTAS: Toma la coordenada en el centro de los pies de cada una de las cepas de camelia.


01 02 04

03

05

10

06 08

11

07 09

12


83


ZONA: 08 Xardín entre Fac. de Farmacia e Fac. Políticas


Para los 5 primeros nodos (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Sólo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada nodo, y posteriormente pulsa 9 veces seguida la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne el código por defecto.


NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.



01 10 11

12 13

02 03

04

05

06

07

08

14 15

16

17

18

19

09

84


ZONA: 09 Facultad de Farmacia

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 9 robles americanos (Quercus rubra) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 09) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 09), p.e. 09_01.



09

08

07

06

05

04 Fuente de la cartografía: http//www.usc.es/flora/index.html

03

02

01

85


ZONA: 10 Auditorio y Observatorio Astronómico

TAREA: Polígonos múltiples de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 28 vértices (de forma ordenada y consecutiva) del seto de aligustre (Ligustrum ovalifolium) que están marcados en en la ampliación del plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 10) seguido de un guión bajo y el número de cada vértice indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con cualquiera de las otras esquinas), p.e. 10_01.


NOTAS: Toma las coordenadas sobre los setos en su punto medio.



252826

27

24

22

21 20

18 17

1615

14

09

0807

06

05 04

0302

13 23

1219 11

10

01

86


ZONA: 11 Colexios Maiores


Para los 7 primeros nodos (i.e. 01-07) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Sólo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada nodo, y posteriormente pulsa 9 veces seguida la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne el código por defecto.




01

10

1112

13

02

0304

0506

07

08

0914

15

17

16


18

19

87


ZONA: 12 Capela Universitaria e campo de hockey herba

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 14 castaños de indias (Aesculus hippocastanum) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 12) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 14), p.e. 14_01.




01

02

03 04

05 06

07 08

09 10

11 12

13 14

88


ZONA: 13 Piscina

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 8 robles (Quercus robur) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 13) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 08), p.e. 13_01.

Para los 8 árboles (i.e. 01-08) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Sólo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada árbol, y posteriormente pulsa 9 veces seguida la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne un código por defecto.

NOTAS: Elige una orientación del tronco del árbol para tomar la coordenada y mantenla en el resto de los árboles. En el plano se representan tres árboles que ya no existen.


08 0102

03

04

05


07

06

89


ZONA: 14 Campo de fútbol e CIBUS

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 15 abedules (Betula alba) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 14) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 13), p.e. 14_01.

Para los 5 primeros árboles (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Sólo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada árbol, y posteriormente pulsa 9 veces seguida la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne un código por defecto.



09 15 11 13 0703 0501

10 1202 04 08 14 06


90


ZONA: 15 Pavillón Estidiantil, Facultades de Bioloxía e de Matemáticas


NOTAS: Guíate para establecer los vértices por la proyección de las terrazas más salientes.



01

10 11

12 13

02 03

04 05

06

07

09

1415

16

08

91


ZONA: 16 Casa Gradín e Pavillón de Servicios


NOTAS: Guíate para establecer los vértices por las esquinas del edificio.


13 15 12

01

10 11

02

03

0405

06

07

0809

14 17

16 1918

Fuente de la cartografía: http//www.usc.es/flora/index.html 20

92


ZONA: 17 Estadio de atletismo

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 14 perales chinos (Pyrus callery var. Cumbre nevada) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 17) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 14), p.e. 17_01.

NOTAS: Elige una orientación del tronco del árbol para tomar la coordenada y mantenla en el resto de los árboles. En el plano se representa un árbol que ya no existe.


01 02

03

04 05

06

10 11

12 13


08 09

14

93


ZONA: 18 FEUGA

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 13 plátanos (Platanus orientalis) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 18) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 13), p.e. 18_01.

NOTAS: Cuidado con los coches, trabaja siempre sobre la isleta. Elige una orientación del tronco del árbol para tomar la coordenada y mantenla en el resto de los árboles.


01

02 03

04

05

06 07

08

0910

11

12 13


94


ZONA: 19 Fac. de Enxeñería Química e Informática



NOTAS: Guíate para establecer los vértices por la proyección de las terrazas.


01

10

11

0203

04

0506

07 08

09


95


ZONA: 20 Invernadoiros, CACTUS e Institutos de Investigacións

TAREA: Polígono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras para hacer un polígono que comprenda la masa de árboles compuesta principalmente por arces, plátanos y robles americanos (Acer saccharinum, Acer platinoides y Quercus rubra) que está marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el código 20_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne el código por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio marcando el último punto introducido en el GPS como 20_F. Realiza el mismo tiempo un “track” o análogo.

NOTAS: Emplea la proyección ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No incluyas los árboles de la acera.



96


ZONA: 21 Animalario de Bioloxía e Ampliación de Psicoloxía

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 25 camelias (Camellia japonica) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 21) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 1 con el 25), p.e. 21_01.

Para los 5 primeros árboles (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Sólo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada árbol, y posteriormente pulsa 9 veces seguida la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne un código por defecto.

NOTAS: Al registrar las coordenadas, localiza el GPS sobre el centro de la parte superior de cada una de las camelias


ZONA: 22 Residencia “Monte da Condesa”


01 10

1112

1302

03 04

05 06

0708

09

14 15

16 18 17

20 222521

2419 23

97


TAREA: Polilíneas. Registra las coordenadas de cada uno de los 15 nodos que están marcados en la ampliación del plano adjunto que corresponden a una escultura. La escultura tiene tres partes, le corresponden 5 a cada parte (dos extremos, el centro y dos intermedio). Identifícalos con el código de la zona (i.e. 22) seguido de un guión bajo y el número de cada nodo indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 1 con el 5), p.e. 22_01.

Para los 5 primeros nodos (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Sólo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada árbol, y posteriormente pulsa 9 veces seguida la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne un código por defecto.

NOTAS:


ZONA: 23 Pavillón Polideportivo e Monte da Condesa

TAREA: Línea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 16 nodos del camino marcado en el plano adjunto(de forma ordenada y consecutiva). Identifícalos con el código de la zona (i.e. 23) seguido de un guión bajo y el número de cada nodo indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 1 con el 23), p.e. 23_01.


15

03 02 0414

01

10

11 06

07

130812 05

09


98




01

11

15

13

03 04

0708

09

14 16 12

10

02

06


99


ZONA: 23B Pavillón Polideportivo e Monte da Condesa

TAREA: Polígono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras para hacer un polígono que comprenda la masa de árboles compuesta por acacias (Acacia melanoxylon) que está marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el código 23B_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne el código por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio marcando el último punto introducido en el GPS como 23B_F. Realiza el mismo tiempo un “track” o análogo.

NOTAS: Emplea la proyección ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa.



100


ZONA: 24 Facultade de Físicas

TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 15 madroños (Arbutus unedo) que están marcados en el plano adjunto. Identifícalos con el código de la zona (i.e. 24) seguido de un guión bajo y el número de cada árbol indicado en el plano (sitúate con atención para no confundir el 01 con el 15), p.e. 24_01.

NOTAS: Elige una orientación del tronco del árbol para tomar la coordenada y mantenla en el resto de los árboles. En el plano se representan dos árboles que ya no existen. No confundas los madroños con los tejos.


01

1011

1213

02 03

0405

0607

08

09

1415


101


ZONA: 25 Facultades de Filosofía, Psicoloxía e CC. Da Educación

TAREA: Línea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 10 nodos del camino marcado en el plano adjunto(de forma ordenada y consecutiva). Identifícalos con el código de la zona (i.e. 25) seguido de un guión bajo y el número de cada nodo indicado en el plano, p.e. 25_01.





1001

0203

04 05 08

06 07

09

102


ZONA: 26 Almacén, Servicios e Animalario

TAREA: Polígono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras para hacer un polígono que comprenda la masa de árboles compuesta por acacias, pinos y robles (Acacia melanoxylon, Pinus pinaster y Quercus robur) que está marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el código 26_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites la tecla “mark” o análoga, sin incluir ningún código de forma que se le asigne el código por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio marcando el último punto introducido en el GPS como 26_F. Realiza el mismo tiempo un “track” o análogo.

NOTAS: Emplea la proyección ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa.



103


2.2. SESIÓN SEGUNDA:

Sigue las indicaciones del profesor en el aula de informática.

2.3. SESIÓN TERCERA:

Dirígete mediante el empleo del GPS en navegación a cada una de las coordenadas del archivo que se

habrá cargado previamente. Dicha coordenada será el centro de una circunferencia de radio 20m en la

que se establecerá como parcela de trabajo. Señala la localización de dicha coordenada en el plano del

apartado 3.3. Si la coordenada coincide con un edificio o zona no practicable únicamente localízala en

el mapa de la sección 3.3 y busca la siguiente coordenada.

Cuando sea posible, en las parcela procederás a tomas los datos inmediatos, y contarás el número de

árboles con un DBH (diámetro del tronco del árbol a la altura del pecho, i.e. 130cm) mayor de 7 cm (22

cm de diámetro). Cuando una cepa se bifurque a una altura inferior a la del DBH se contarán todos los

pies superiores a 7 cm de DBH.

104


3. RESULTADOS

3.1. SESIÓN PRIMERA:

Los resultados de la primera parte de la práctica serán los archivos obtenidos al descargar el GPS tras

realizar las tareas señaladas en la sección 2.1.

3.2. SESIÓN SEGUNDA:

Los resultados de la segunda parte de la práctica serán los archivos requeridos tras editar los archivos

obtenidos con el GPS en la primera parte de la práctica. Dichos archivos se enviarán como un tranajo a

la USC Virtual, y consistirán en temas de ArcGis (.shp) correspondientes los diferentes tipos de

elementos empleados: polígono de lados regulares, polígonos de lados irregulares, polígonos múltiples,

líneas, polilíneas y puntos. Del mismo modo se creará un archivo de puntos que será utilizado en la

última sesión de la práctica.

Además en la página de la USC Virtual se colgarán dos trabajos referidos a los errores de los GPS, que

serán explicados durante esta sesión. Para ello el alumno deberá de consultar la información que se le

proporcione en dicha página.

3.3. SESIÓN TERCERA:

Cuando sea posible, de acuerdo con lo especificado en el material y métodos, rellena uno de los

estadillos adjuntos para cada parcela.

Además en la página de la USC Virtual se colgará un trabajos referido a la estima del número de

árboles del campus, calculado de acuerdo al muestreo realizado (para ello en la segunda sesión

necesitarás calcular la extensión del campus).

105


106


ID Parcela: Tamaño parcela:

Fecha:

Coordenada X: Coordenada Y:

Pendiente: Orientación:

Altitud: Est.Pedregos. (%):

Est.Cob.arbórea (%): Est.Cob.arbust. (%):

Est. Cob.herbac. (%):

Nº de árboles: Nº de pies ha-1:


Fecha:




Est.Cob.arbórea (%): Est.Cob.arbust (%):

Est. Cob.herbac (%):



Fecha:







107



Fecha:








Fecha:








Fecha:







108



Fecha:








Fecha:








Fecha:







109



Fecha:








Fecha:








Fecha:







110



Fecha:








Fecha:








Fecha:







111


112


Fecha:








Fecha:








Fecha:







8. CONTENIDOS DE BIBLIOTECA

(código calendario de prácticas: BIB)

CONTENIDOS DE BIBLIOTECA

PRÁCTICAS

CATÁLOGO DE LA BUSC

1. Haz una búsqueda en el Catálogo de la BUSC de libros de Botánica general.

1. Nº de registros:

2. Limita por ubicación “Biología” y lengua “castellano.


3. Selecciona y guarda los registros que respondan a libros de botánica general publicados después del año

2000


4. Busca un artículo de revista sobre líquenes de Portugal escrito por Graciela Paz Bermúdez y Regina

Carballal Durán y publicado en la revista “ Nova Hedwigia”

1. Selecciónalo y guárdalo.

2. Exporta los registros guardados a tu correo electrónico.

3. ¿Tenemos el artículo en papel, dónde?

4. Busca en SFX si tenemos acceso al texto completo del artículo

5. Elabora una bibliografía con los documentos previamente seleccionados –libros y artículos- empleando el

formato de cita bibliográfica “Harvard” o “Vancouver” y lo envías a la USC – Virtual

6. Busca en el Catálogo cuántas ediciones tenemos de esta obra en la BUSC

Hickman, Cleveland P. Principios integrales de zoología

115

CONTENIDOS DE BIBLIOTECA

116

BASES DE DATOS

7. Entra en la base de datos del CSIC ICYT, y expón los pasos que diste para entrar.

8. Busca artículos sobre algas de agua dulce relacionados con Galicia a partir del año 1998


2. ¿tienen enlace al texto completo? ¿Cuántos?

3. ¿Tenemos las revistas en la Biblioteca Universitaria, dónde?

4. Si queremos consultar los artículos en papel ¿cómo tenemos que hacer?

Nota:

memoria de prácticas - usc€¦ · - monocanal de volumen variable: elección del volumen de...

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