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Méthodes de dosage de l’HbA1c Surveillance du sujet diabétique
IXème Congrès Maghrébin d'Endocrinologie et Diabétologie, 23-25 Novembre 2012- Alger
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Dr Edith Bigot-Corbel MCU-PH Biochimie- Nantes
Complications du diabète et protéines
glyquées
• Gravité du diabète: complications dégénératives
• Objectif majeur de la prise en charge:
– Empêcher et/ou retarder l’apparition des complications dégénératives
(qualité de vie, coûts des traitements)
• Mode d’intervention: contrôle métabolique optimal (lien entre contrôle
glycémique et apparition des complications)
• Nécessité de marqueurs biologiques fiables:
– Marqueurs de glycation des protéines : HbA1c
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Leçons de l’UKPDS: moins de complications avec un meilleur contrôle glycémique
Reduction de 1% d’HbA1c
Réduction
du risque*
1%
Mortalité liée au diabète
IDM
Complications Microvasculaires
AOMI
UKPDS 35. BMJ 2000;321:405–12 *p<0.0001 IXème Congrès Maghrébin d'Endocrinologie et Diabétologie, 23-25 Novembre 2012- Alger
Définition de l’hémoglobine glyquée
• Ensemble des molécules d’Hb modifiées par fixation non
enzymatique d’oses (glc) sur des fonctions amines des chaînes ß
de globine
• Formation en 2 étapes:
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Facteurs influençant la glycation
• La glycation est un phénomène naturel qui dépend:
– De la moyenne des concentrations en glucose
– De la vitesse de la réaction de glycation
– Du turn-over de la protéine
• Facteurs conditionnant les réactions de glycation in vivo:
– Physico-chimiques: température, pH
– Facteurs liés aux protéines: concentration ½ vie, accessibilité
– Facteurs liés aux oses: concentration, nature
• Effets de la glycation:
– Remaniements moléculaires
– Altérations structurales et fonctionnelles des protéines
– Mécanismes de maturation/vieillissement impliqués en pathologie
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Hétérogénéité de l’hémoglobine glyquée
HbA Tétramère 2ß2
Hb Glyquée
Caractérise toute fixation non enzymatique de glucose ou d’autres oses sur l’ Hb.
HbAo
Composant majeur de l’ HbA; comprend des formes non glyquées et des formes glyquées ailleurs que sur l’extrémité N-terminale des chaînes ß.
HbA1 Hb rapides;Hb A glyquée sur l’extrémité N-term. des chaînes ß quelque soit l’ose.
HbA1c HbA glyquée,par le glucose,sur l’extrémité N-term.,d’au moins une chaîne ß. Modification de la charge des molécules d’Hb
PréHbA1c Forme labile d’HbA1c.
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HbA1a1
HbA1a2
HbA1b
HbA1c
Hb préA1c
Prélèvement et facteurs pré-analytiques
• Prélèvement:
- sur héparine,EDTA,ou fluorure
-Volume de sang nécessaire:5 µL à 2 mL
-Prétraitement de l’échantillon:
réalisation de l’hémolyse
élimination de la fraction labile
• Facteurs pouvant modifier la valeur d’ HbA1c:
-causes hématologiques
-insuffisance rénale
-dyslipoprotéinémies
-prise de médicaments
-
HbA1c en biologie clinique
• Années 1970-80: Utilisation clinique
• Années 1990-2000: Validation méthodologique
• Années 2000-2010: Standardisation
• En 2012
– Paramètre éprouvé
– Apparente simplicité
– Réelle complexité
• Deux problèmes
– Standardisation et performances des techniques
– Standardisation de l’expression des résultats
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Méthodes de dosage
• Dosage de l’Hb glyquée totale
• Dosages spécifiques de l’HbA1c
– Immunologiques
– Chromatographiques:
• affinité
• échange d’ions: HPLC
– Electrophorétiques
– Enzymatique
En France: Les seules utilisables sont celles répondant au cahier des charges
relatif aux notices des réactifs dosant l’HbA1c, (AFSSAPS 30/09/05)
Objectif répétabilité : CV HbA1c < 3%
Objectif reproductibilité : CV HbA1c < 4%
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Dosage de l’Hb glyquée totale
• Technique autmatisée de Chromatographie d’affinité:
IMX
– Les résultats sont corrigés par rapport à une courbe
d’étalonnage mémorisée qui a été titrée en HbA1c par HPLC
– Résultats corrigés exprimés en % d’HbA1c
• Avantages:
– Pas d’interférence
• de la fraction labile
• De la température
• De l’Hb carbamylée
• De l’Hb acétylée
• Inconvénients:
-pas de détection des hémoglobines anormales
-résultats corrigés
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Dosages spécifiques de l’HbA1c
• Immunologiques:
• Ac mono ou polyclonaux spécifiques de la liaison glucose –extrémité N-terminale
de la valine
– Immunoturbidimétriques en phase homogène
– Immunoinhibition sur latex
– ELISA: microplaques, AC monoclonaux
– Inconvénients:
– Les limites de l’utilisation dépendent de l’épitope reconnu
– Pas d’identification des Hbs anormales
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Dosage immunologiques:
- méthode turbidimétrique en phase homogène:
automates labo Roche, Beckmann, Abbott…..
-Dosage par réaction d’inhibition d’agglutination: DCA
2000 Siemens
• Principe général:
-sang prélevé sur EDTA puis hémolysé
-détermination du taux d’ Hb totale par une méthode colorimétrique
-puis détermination du taux d’ HbA1c par 1 Ac monoclonal
% HbA1c=(HbA1c / Hb )x 100
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Dosages spécifiques de l’HbA1c
• Méthodes électrophorétiques:
– En gel d’agarose: ne répond pas aux exigences
– IEF: ne répond pas aux exigences
– Capillaire: développé par Sebia
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Dosages spécifiques de l’HbA1c
• Techniques chromatographiques
– Manuelle: microcolonnes Biorad
– Automatisée HPLC
• Chromatographie par échange d’ions
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• Biorad / Tosoh
-sang hémolysé automatiquement puis injecté à
travers la colonne
-colonne constituée d’une résine non poreuse
d’échange de cations
-séparation des fractions par 3 tampons de
concentrations salines différentes
-détection des fractions par lecture
spectrophotométrique à 415 nm
Dosages spécifiques de l’HbA1c: HPLC
• Sang normal:6 fractions identifiées et
quantifiées (HbA1a, HbA1b, HbF, HbA1c
labile, HbA1c stable, HbAo)
• Rapport entre les différentes fractions
effectué par calcul de l’aire des pics
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Dosages spécifiques de l’HbA1c: HPLC
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Avantage HPLC: détection des variants de l’Hb
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Dosages spécifiques de l’HbA1c
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Dosages spécifiques de l’HbA1c
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l’HbA1c
Dosages spécifiques de l’HbA1c
• Technique immunologique
– techniques d'immunodosage: microparticules bleues conjuguées aux anticorps anti-
A1C migrent sur la tigette réactive. pour mesurer l'A1C et analyse chimique pour
mesurer l'hémoglobine totale
– résultat quantitatif très rapide : 5 minutes
– cartouches à usage unique.
– 5 µL de sang total (une grosse goutte) prélevés au bout du doigt
– le prélèvement du sang, la dilution et le transfert de l'échantillon se font
désormais en une seule étape
– aucun étalonnage et aucun entretien ne sont nécessaires
– Précision de laboratoire à 99 %
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Interprétation des résultats d’HbA1c
• Les normes d’HbA1c (selon étude DCCT) ont été
définies pour :
– Une durée de vie normale des hématies: 120 jours
(absence d’hémolyse, de transfusion, …)
– Une synthèse normale d’hémoglobine
– Une population de patients homozygotes A/A
(HbA0 > 95%)
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Difficultés d’interprétation des résultats d’HbA1c
• Métabolisme anormal de l’Hb ou des GR
• Traitement stimulant l’hématopoïèse
• Hémorragies
• Transfusions
• Traitement antirétroviral
• Splénectomie
• Présence de variants d’Hb
• Conséquences physiopathologiques
– Diminution de la ddv des GR + hémolyse
– Cinétique de glycation différentes
• Conséquences analytiques (dépendent de la méthode)
– Détection du variant
– Interprétation et rendu des résultats ou non
• Présence d’autres Hb modifiées
– La fixation sur l’Hb de substances non glucidiques qui modifient ses pptés physico-chimiques et peut augmenter
les valeurs d’HbA1c
• Acétylation avec aspirine ou au cours de l’éthylisme chronique ou l’Hb acétylée peur représenter 2à 3%
• Carbamylation de l’Hb lors de l’IR: fixation d’isocyanate provenant de la décomposition de l’urée
• fructosamines
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Interprétation des résultats d’HbA1c
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Interprétation des résultats d’HbA1c
• Étude des interférences
– http:// www.ngsp.org
• HbS, C, E, D
– Interférences variables selon les méthodes
• Immunodosages: spécificité de l’antigène
– Possibilités de rendre le résultat si:
• Validation analytique (corrélation à méthode
de référence ou de comparaison)
• Absence d’hémolyse
• Suivi individualisé (le patient est son propre
témoin si % constant HbA0)
– Non utilisable pour les homozygotes SS, CC
ou hétérozygotes SC
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Interprétation des résultats d’HbA1c
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Interprétation des résultats d’HbA1c
Impact de différents facteurs sur la glycémie moyenne estimée: ADAG = glycémie moyenne dérivée de l’HbA1c
Glycémie (g/L) = [(35.6x % HbA1c) – 77.3] x 0.01 •Glycémie à jeun et post-prandiale
•Période
•Âge
•Ethnie
•Variations interindividuelles
•…..
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HbA1c et Contrôle de qualité: CQI, CQE, CQN
Les méthodes demeurent inégales (précision et exactitude….)
Valeur basse
Valeur élevée
Affinité 10.4 10.6
CLBP 3 2.6
CLHP 2.9 2.8
Immunochimie 3.6 3.9 CV (%) interlaboratoire moyen des différentes méthodes disponibles
éléctrophorèse 0.1%
Mini-colonnes Échanges ions
<0.1%
Chromato affinité 3.6%
Chromatographie échange ions CLBP
2.9%
CLHP 52%
Immunologiques 40.6%
Méthodes utilisées en France Données CQN 2007
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Standardisation
• 2007: standardisation du dosage et de l’expression des résultats
• Etudes DCCT et UKPDS : recommandations objectifs thérapeutiques
basés sur HbA1c unités NGSP/DCCT
• La méthode NGSP/DCCT initialement prise comme référence ne peut
pas être considérée comme méthode de référence (pas spécifique
HbA1c et stabilité analytique à long terme insuffisante)
• 1995 mise en place d’un groupe de travail IFCC, aboutissant en 2002 à la
description d’une méthode de référence et production de matériau de
référence (15 labos dans le monde)
– Méthode IFCC non destinée à être utilisée en routine
– Sert à établir la traçabilité des méthodes commercialisées par les fabricants
– Fournit des valeurs plus basses que NGSP/DCCT (plus spécifique)
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Standardisation
• NGSP: National Glycohemoglobin Standardization Program
– Système de référence:
• CLHP (ech cations)
• étalon: HbA1c purifiée
– S’appuie sur les travaux menés depuis plusieurs années par le DCCT (Diabetes
Control and Complication Trial)
• IFCC: plus récent International Federation of Clinical Chemistry
– Système de référence:
• Définition plus restrictive de l’HbA1c : structure de référence: hexapeptide N-terminal glyqué des
chaînes b de globine
• CLHP phase inverse avec détection par spectrométrie de masse, électrotrospray ou électrophorèse
capillaire après digestion enzymatique de l’Hb
– Sur le plan scientifique apparaît plus satisfaisant mais les travaux du DCCT
semblent difficilement transposables aux résultats obtenus (valeurs plus basses)
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Standardisation
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Standardisation
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Valeur de la certification NGSP- IFCC
• la certification aux normes internationales est reconnue par
l’Afssaps comme étant un gage de qualité
Extrait de l’analyse des résultats du
dernier Contrôle National Qualité
publié en Novembre 2010
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Recommandations SFBC
• Rendre les résultats d’Hb glyquée sous forme d’HbA1c exprimée en % de l’Hb
totale (NGSP/DCCT) et en mmol d’HbA1c/mol Hb (IFCC)
• Ne pas convertir les résultats en glycémie moyenne calculée : ADAG (un tableau
de correspondance peut être fourni avec les résultats)
• Les méthodes doivent doser directement l’HbA1c ou pouvoir être reliées à une
méthode de référence (IFCC) dosant l’HbA1c pour corriger les valeurs brutes
• Les techniques utilisées par les labos doivent faire la preuve de leur traçabilité à
une méthode de référence recommandée par les sociétés scientifiques: IFCC
(NGSP)
• Les fabricants doivent fournir les documents de certification relatifs à la
standardisation
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Recommandations 2011 ADA et American Association for
Clinical Chemistry
• L’HbA1c doit être mesurée régulièrement chez les patients diabétiques afin d ’évaluer
l’équilibre glycémique
• Les laboratoires doivent utiliser une méthode certifiée NGSP et corrélée à la référence
DCCT. Les fournisseurs doivent également fournir la corrélation avec la méthode IFCC
• Les laboratoires mesurant l’HbA1c doivent participer à un programme de CQ utilisant du
sang frais
• Mise en garde sur les interférences potentielles (hémoglobinopathies et modification de
la ddv des GR)
• CV intralaboratoire < 2% et CV interlaboratoire < 3.5% sur 2 niveaux différents de
contrôles
• Tout résultat d’HbA1c en dessous de la limite inférieure (4%) ou supérieur à 15% doit
être vérifié sur un nouveau prélèvement
• Tout résultat d’HbA1c discordant avec la clinique doit être complété par des explorations
complémentaires
• Les POCT pour la mesure de l’HbA1c ne sont pas assez précis pour pouvoir être utilisé
dans le diagnostic de diabète
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Intérêt de l’HbA1c dans le diagnostic du diabète
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Historique des méthodes diagnostiques:
ADA Expert Committee 1997, WHO Consultation 1999 :
• Glycémie à jeun : > 125 mg/ml (7.0 mmol/L)
• Glycémie HGPO à 2h. > 200 mg/dL (11.1 mmol/L) pour une charge à 75 g de glucose
• IFG (impaired Fasting Glucose) : 110 – 125 mg/dL Glucose HGPO 2h. : IGT (impaired Glucose Tolerance) : 140 – 200 mg/dL
HbA1c pas recommandé en tant que critère diagnostique Raison : absence de standardisation !
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2012 – Qu’est-ce qui a changé ?
• Standardisation de l’HbA1c
• Facteurs interférents pour le dosage de l’HbA1c connus
et minimisés
• Nouvelles données disponibles sur la relation entre
glycémie et complications cliniques
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Diabetes Care 2009 ; 32 : 1327-1334
Attributs techniques : glycémie vs. HbA1c
Préanalytique: HbA1c Glucose stabilité in vivo + - stabilité in vitro + - Variabilité analytique: + + Variabilité biologique: intra-individuelle faible plus élevée inter-individuelle faible plus élevée Clinique: pas de timing avec timing sans préparation > 8 h. jeûne pas affecté par stress affecté par tout
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Pour en savoir plus…
1. Sacks D et al. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnostic and management of diabetes mellitus. Clin.
Chem. 2011, 57:6 e1-e47
2. Sacks D et al. Gaps in the glycation Gap hypothesis. Clin. Chem. 2011, 57: 2, 150-152
3. Little R. et al. Status of hemoglobin A1c measurement and goals for improvement: from chaos to order for improving diabetes
care. Clin. Chem. 2011, 57, 2: 205-214
4. Corbé-Guillard E et al. Labile Hemoglobin A1c : unexpected indicator of preanalytical contraindications. Clin.Chem 2011, 57, 2: 340-
346
5. Weykamp C. et al. The analytical goals for hémoglobin A1c measurement in IFCC units and National Glygohemoglobin
Standardization Program Units are different. Clin. Chem 2011, 57, 8: 1204-1205
6. Lenters-Westra E et al. Six of eight HbA1c POC instruments de not meet the general accepted analytical performance criteria.
Clin. Chem 2010, 56, 1: 44-52
7. Hanas R et al. 2010 consensus statement on the worldwide standardization of the hemoglobin A1c measurement. Diabetes research
and clinical practice 2010, 90: 228-230
8. Nathan D et al. Translating the A1c assay into estimated average glucose values. Diabetes Care 2008, 31: 1473-1478
9. Gillery et al. Propositions pour l’expression standardisée des résultats d’HbA1c. Ann. Biol. Clin. 2009, 67: 669-671
10. Rodriguez-Segade S et al. Progression of nephropathy in type 2 diabetes: the glyccation gap is a significant predictor after
adjustment for glycohemoglobin (HbA1c). Clin. Chem. 2011, 57-2: 264-271
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