METODOLOGI PENELITIAN

4.1 DesainPenelitian

Jenis penelitian adalah experimental. akar mambung diperoleh dari Kabupaten

Murung Raya. Akar mambung dibuat menjadi ekstrak dengan pelarut etanol

dengan cara maserasi. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan

menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur kamar. Maserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut

setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Lalu dilakukan uji

aktivitas antioksidan dengan metode DPPH.

4.2 Waktu dan Lokasi Penelitian

4.2.1 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Desember sampai Januari tahun 2014

4.2.2 Tempat penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas

Palangkaraya.

4.3 Estimasi Besar Sampel

Besar sampel pada penelitian ini dihitung dengan menggunakan rumus Federer:

(n−1 ) ( t−1 ) ≥ 15

dengann merupakan jumlah pengulangan dan t merupakan jumlah perlakuan. dalam

penelitian ini akan dilakukan tujuh perlakuan dengan dua perlakuan merupakan

kontrol positif dan negatif sehingga estimasi besar sampel dihitung sebagai berikut :

Diketahui t adalah 7, maka

(n−1 ) (t−1 ) ≥ 15

(n−1 ) (7−1 ) ≥15

6 (n−1 )≥ 15

6n-6≥15

26

6n=15+6

Jadi n = 21/6=3,5 ≈ 4

sehingga masing-masing perlakuan dilakukan empat kali pengulangan.22

4.4 Kriteria Pemilihan

4.4.1 Kriteria Inklusi

Akar tumbuhan mambung yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua

pada cabang ke -4 sampai ke -6.

4.4.2 Kriteria Ekslusi

Akur tumbuhan mambungyang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua pada

cabang ke -4 sampai ke -6 yang kemudian dikeringkan namun membusuk.

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Variabel Bebas

Variabel bebas penelitian ini adalah ekstrak etanol akar tumbuhan mambung

(Blumea balsamifera.

4.5.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung penelitian ini adalah aktivitas antioksidan ekstrak etanol

akar tumbuhan mambung (Blumea balsamifera).

4.6 Definisi Operasional

Tabel 4.1 Definisi Operasional

Variabel Definisi Operasional Hasil Ukur Alat Ukur Skala

Ekstrak

etanol akar

tumbuhan

mambung

Akar mambung yang telah

dilumatkan halus kemudian

dimaserasi dengan etanol

dalam erlenmeyer selama 24

jam dengan perbandingan 50

Konsentrasi

(ppm)

Tabung

Reaksi

Numerik

gram dengan pelarut etanol

96% kemudian dimaserasi

selama 24 jam dengan 3 kali

pengulangan kemudian

disaring dengan kertas saring

untuk memisahkan ampas dan

filtratnya, filtratnya kemudian

dievaporasi untuk menguapkan

pelarutnya. Sehingga diperoleh

ekstrak kental dari filtrat

rendaman daun mambung.

Aktivitas

Antioksida

n

Antioksidan merupakan

senyawa pemberi elektron

(donor elektron) atau reduktan

dan merupakan senyawa

penghambat radikal bebas.

Persen

Inhibisi

(%)

Spektofot

ometer

UV vis

Numerik

4.7 Pertimbangan Etika Penelitian

Penelitian ini menggunakan sampel berupa akar tumbuhan mambung

(Blumea balsamifera) dengan pertimbangan :

a. Tumbuhan ini bukan merupakan tumbuhan langka dan dilindungi.

b. Penggunaan tumbuhan ini sebagai sampel tidak akan mengganggu populasi

tumbuhan itu sendiri.

c. Determinasi penamaan dan klasifikasi tumbuhan ini dilakukan di

laboratorium LIPI.

d. Tumbuhan ini bukan merupakan tumbuhan yang berbahaya seperti halnya

beracun.

e. Metode, alat dan bahan dalam penelitian ini bukan merupakan zat yang

bersifat toxic.

f. Limbah sisa penelitian akan didekontaminasi dengan pembagian antara

bahan yang dapat dibakar dan tidak dapat dibakar, untuk bahan yang tidak

dapat dan atau berbahaya untuk dibakar maka akan dilakukan penguburan.

4.8 Alat dan Bahan

a. Pembuatan ekstrak Etanol

Pada tahan ini diperlukan alat dan bahan berupa :

1. Tabung reaksi

2. Mortir

3. Stamper

4. Timbangan

5. Laruta Etanol

6. Larutan Metanol analisis

7. Alumunium Foil

8. Erlenmeyer

9. Vakum

10. Kertas saring

11. Evaporator

12. Timbangan

13. Termometer ruangan

b. Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH

Pada tahan ini diperlukan alat dan bahan berupa :

Tabung reaksi

Vortex

Stopwatch

Spektrofotometer

Ektrak Etanol

Larutan DPPH

Larutan vitamin C (kontrol)

4.9 Prosedur Kerja

4.9.1. DeterminasiTumbuhan

Tumbuhan mambung yang diteliti dideterminasi di Laboratorium Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia di Bogor.

4.9.2 Pengambilan Sampel

Akar yang diambil dari tumbuhan mambung yang tidak terlalu tua namun tidak

terlalu muda, setelah dicuci daun akan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan

dengan tanpa terkena sinar matahari langsung, kemudian akar akan dihaluskan

menjadi serbuk dan disimpan di wadah kering.

4.9.3. Pembuatan Ekstrak Tumbuhan Mambung

Akar tumbuhan Mambung (Blumea balsamifera) yang telah dikeringkan

kemudian ditimbang sebanyak 50 gram kemudian diekstraksi dengan cara dimaserasi

dengan menggunakan pelarut etanol 96% sampai akar terendam semuanya selama 24

jam dengan tiga kali pengulangan, setiap 24 jam filtrat etanol dipisahkan dengan

menggunakan kertas saring kemudian dipekatkan dengan vakum evaporator.

Kemudian ekstrak ditimbang bobotnya.

4.9.4. Penentuan Aktivitas Antioksidan

a. Pembuatan larutan DPPH 0,4 mM

Sebanyak 7,9 mg DPPH ditimbang, kemudian dilarutkan dengan methanol

analisis hingga 50 mL. kemudian ditempatkan kedalam botol gelap yang telah

dibungkus dengan alumunium foil. Untuk setiap pengujian, larutan dibuat

baru.

b. Pembuatan larutan blanko

Sebanyak 1 mL larutan DPPH 1mM dipipetkan ke dalam tabung reaksi yang

telah ditandai di strip 5 mL kemudian ditambahkan methanol pro analisis

hingga tanda yang telah dibuat dan dihomogenkan. Mulut tabung ditutup

dengan alumunium foil.

c. Pembuatan larutan uji

Sebanyak 5 mg ekstrak ditimbang, kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL

metanol pro analisis, larutan ini merupakan larutan induk. Sebanyak

50,100,250,500 dan 1000 uL larutan induk dipipetkan kedalam tabung reaksi

yang telah ditandai pada strip 5 mL untuk mendapatkan konsentrasi

5,10,25,50 dan 100 ug/mL. kedalammasing-masing tabung ditambahkan 1 mL

larutan DPPH 1mM dan ditambahkan dengan methanol pro analisisampai 5

mL kemudian dihomogenkan. Mulut tabung ditutup dengan alumunium foil.

d. Pembuatan larutan vitamin C sebagai kontrol positif

Sebanyak 3 mg vitamin C ditimbang kemudian dilarutkan dengan methanol

pro analisis hingga 5 mL. pipet 250,200,150 dan 50 uL dimasukkan masing-

masing kedalam labu yang telah diukur 5 mL dengan ditambahkan larutan

DPPH 1mM, kemudian tambahkan methanol pro analisis hingga tanda

sehingga diperoleh konsentrasi 3,6,9,12 dan 15 ug/mL.

e. Pengukuran serapan radikal bebas DPPH

Larutan uji dengan beberapa konsentrasi yang telah dibuat d inkubasi dalam

penangas air 37o C selama 30 menit. Serapan larutan diukur pada panjang

gelombang serapan maksimum 515 nm menggunakan spektrofotometer

cahaya tampak.

f. Cara perhitungan

Aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai presentase berkurangnya

warna DPPH dengan menggunakan persamaan % Aktivitas ant ioksidan=¿

1−absorbansi sampel+absorbansi kontrolabsorbansi kontrol

×100 %

Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, kemudian dibuat

kurva antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan

uji. Dari persamaan regresi linear tersebut dapat ditentukan nilai IC50, yaitu

konsentrasi inhibisi larutan uji yang mampu menangkal 50% radikal

bebas.23,24,25

4.10 AlurPenelitian

Identifikasi sampel

Pembuatan ekstraksi

Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak

Etanol daun mambung dengan metode

DPPH

Pengambilan sampel

Penentuan aktivitas antioksidan Vitamin C

(kontrol) dengan metode DPPH

Analisis data

Gambar 4.1 Alur Penelitian.

4.11 Cara Pengolahan dan Analisis Data

Proses manajemen data dimulai dari verifikasi dan editing data (untuk

mengecek kelengkapan dan konsistensi data yang dikumpulkan), entri data,

pembersihan data (data cleaning) sampai data siap untuk diolah dan dianalisis

menggunakan sistem komputerisasi dengan menjaga keutuhan data tersebut.26,27

Data akan diolah menggunakan komputer dengan perangkat lunak SPSS 17.

Dengan teknik analisis regresi linear sederhana untuk menentukan nilai IC50

yaitu nilai inhibisi yang dapat menangkal 50% radikal bebas dibandingkan

kontrol vitamin C, apabila data tidak memenuhi persyaratan untuk dilakukan

teknik analisis regresi linear sederhana, maka data akan di analisis dengan

teknik analisis probit.24,25,30,31

BAB V

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

1. PROSES EKSTRAKSI

Cara kerja :

Ditimbang masing-masing +/- 300 gram contoh kemudian di ekstraksi dengan cara

maserasi (tanpa panas) dengan menggunakan pelarut etanol 96% selama 24 jam dengan 3

kali ulangan (3 x 24 jam). Setiap 24 jam filtrat etanol dipisahkan kemudian dipekatkan

dengan vakum evaporator. Ekstrak pekat etanol kemudian di timbang bobotnya.

Hasil :

Jenis contoh Bobot Ekstrak (gram) Rendemen (%)

Akar 9,06 3,02

2. UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH

Cara kerja :

1. Pembuatan larutan DPPH 0,4 mM

Sebanyak 7,9 mg DPPH (BM 394,32) ditimbang, kemudian dilarutkan dengan metanol pro

analisis hingga 50,0 mL. ditempatkan dalam botol gelap. Untuk setiap pengujian larutan

dibuat baru.

2. Pembuatan larutan blanko

Sebanyak 1 mL larutan DPPH 0,4 mM dipipet ke dalam tabung reaksi yang telah ditara 5 mL,

kemudian ditambahkan metanol pro analisis hingga tanda dan dihomogenkan. Mulut tabung

ditutup dengan aluminium foil.

3. Pembuatan larutan uji

Sebanyak 5 mg ekstrak ditimbang kemudian dilarutkan ke dalam 10,0 mL metanol pro

analisis (500 bpj), larutan ini merupakan larutan induk. Sebanyak 50, 100, 250, 500, dan

1000μL larutan induk dipipet ke dalam tabung reaksi yang telah ditara 5,0 mL untuk

mendapatkan konsentrasi 5, 10, 25, 50, dan 100 μg/mL.

Ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH 1mM dan tambahkan

dengan metanol pro analisis sampai 5,0 ml kemudian dihomogenkan. Mulut tabung ditutup

dengan aluminium foil.

4. Pembuatan larutan vitamin C sebagai kontrol positif

Sebanyak 3 mg vitamin C ditimbang kemudian dilarutkan dengan metanol pro analisis hingga

5,0 mL. Pipet 250, 200, 150, 100, dan 50 μL masukkan masing-masing ke dalam labu

tentukur 5-mL dengan ditambahkan 1 mL larutan DPPH 1mM kemudian tambahkan metanol

pro analisis hingga tanda sehingga diperoleh konsentrasi 3, 6, 9, 12, 15 μg/mL.

5. Pengukuran serapan peredaman radikal bebas DPPH

Larutan uji dengan beberapa konsentrasi diinkubasi dalam penangas air 37oC selama 30

menit. Serapan larutan diukur pada panjang gelombang serapan maksimum 515 nm

menggunakan Spektrofotometer cahaya tampak.

6. Cara perhitungan

Persentase inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut :

Hambatan (inhibisi) = Serapan blanko – Serapan sampel X 100%

Serapan blanko

Nilai IC50 (Inhibition Concetration 50) adalah konsentrasi antioksidan (μg/mL) yang mampu

menghambat 50 % radikal bebas. Nilai IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara 50%

daya hambatan dengan sumbu konsentrasi, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan

Y=a+bX dimana Y=50 dan nilai X menunjukkan IC50. Ekstrak yang dinyatakan aktif bila

nilai IC50 kurang dari 100 μg/mL.

Hasil :

Nama

Sampel

K A1 A2 Ā A Inhibisi

(%)

IC50

(ppm) Blanko (ppm)

Akar 5 0.775 0.735 0.755 0.819 7.814 44.001

10 0.687 0.685 0.686 0.819 16.239

25 0.493 0.495 0.494 0.819 39.683

50 0.267 0.267 0.267 0.819 67.399

100 0.060 0.064 0.062 0.819 92.430

Vitamin

C

3 0.487 0.487 0.487 0.819 40.537 3.053

6 0.285 0.295 0.290 0.819 64.591

9 0.040 0.050 0.045 0.819 94.505

14 0.030 0.030 0.030 0.819 96.337

15 0.027 0.029 0.028 0.819 96.581

Keterangan :

K (ppm) : konsentrasi (ppm)

A1 : absorbansi simplo

A2 : absorbansi duplo

Ā : absorbansi rata-rata

IC50 : Inhibition concentration 50

Grafik 5.1 Garis Linear Ekstrak Akar Mambung terhadap Persen Inhibisi

Grafik 5.2 Garis Linear Vitamin C terhadap Persen Inhibisi

5.2 Pembahasan

Penangkapan radikal bebas merupakan salah satu metode uji untuk menentukan

aktivitas antioksidan 28. Kemampuan suatu senyawa atau sampel uji untuk menangkap radikal

DPPH merupakan suatu indikasi bahwa senyawa/sampel uji tersebut memiliki beraktivitas

antioksidan. Penggunaan DPPH untuk metode penangkapan radikal mempunyai keuntungan,

yaitu mudah digunakan, mempunyai tingkat sensitivitas yang tinggi dan dapat menganalisis

sejumlah besar sampel dalam jangka waktu singkat.29

Parameter yang digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH ini adalah nilai IC50,

yaitu konsentrasi ekstrak/ fraksi uji yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebesar

50%. Nilai ini diperoleh dari suatu persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan

antara konsentrasi ekstrak/ fraksi uji dan persen penangkapan radikal bebas. Semakin kecil

nilai IC50maka semakin efektif ektrak/fraksi tersebut sebagai penangkap radikal bebas.

DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu

kamar dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau

ekstrak bahan alam. DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)menerima elektron atau radikal

hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan

DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil) baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada

DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH

(1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)dan membentuk DPPH (1,1-diphenil-2-

pikrylhydrazil)tereduksi. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH (1,1-diphenil-2-

pikrylhydrazil) menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi

kuning terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Perubahan ini

dapat diukur secara stoikiometri sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen yang

ditangkap oleh molekul DPPH (1,1-diphenil-2-pikrylhydrazil)akibat adanya zat antioksidan.

Pada penelitian ini digunakan methanol sebagai pelarut DPPH. Hal ini dikarenakan

methanol dapat melarutkan Kristal DPPH dan memiliki sifat yang dapat melarutkan senyawa

yang non polar, mengingat DPPH sendiri merupakan senyawa yang non polar.

Aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai presentase berkurangnya warna

DPPH dengan menggunakan persamaan % Aktivitas antioksidan=¿

1−absorbansi sampel+absorbansi kontrolabsorbansi kontrol

×100 %

Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, kemudian dibuat kurva

antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan uji. Dari persamaan

regresi linear tersebut dapat ditentukan nilai IC50

Dari grafik 5.1 dan grafik 5.2 dapat dilihat perbedaan nilai konsentrasi minimal antara

ekstrak daun mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) dan Vitamin C dalam menghambat

50% radikal bebas. Suatu ekstrak/fraksi dinyatakan aktiv untuk menyerap radikal bebas

apabila memiliki nilai IC50kurang dari 100 ppm. Sangat jelas terlihat bahwa daun tanaman

mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) memiliki aktivitas yang aktiv terhadap penyerapan

radikal bebas.

Apabila dilihat dari Grafik 5.2, dimana vitamin C memiliki konsentrasi yang lebih

rendah untuk mencapai IC50, ada pertimbangan lain, dimana ekstrak etanol tumbuhan

mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) merupakan ektrak kotor yang mana senyawa

fitokimi murni belum dipisahkan. Hal ini dapat menjadi pertimbangan terhadap hasil

penelitian ini.

5.3 Keterbatasan Penelitian

Berbagai keterbatasan selama penelitian ini diataranya adalah keterbatasan dalam

pengumpulan sampel dikarenakan akses yang sangat jauh untuk mengumpulkan sampel,

selain itu keterbatasan penyediaan peralatan dan bahan reagen penelitian juga dirasakan

peneliti sangat mempengaruhi penyusunan penelitian ini.

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

1. Akar tumbuhan mambung (Blumea balsamifera) terbukti memiliki aktivitas

antioksidan .

2. Kemampuan penangkapan terhadap radikal bebas oleh akar Mambung (Blumea

balsamifera) masih lebih lemah dibandingkan vitamin C.

6.2 Saran

1. Setelah dilakukannya penelitian Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Akar

Mambung (Blumea Balsamifera) Dengan Metode DPPH ( 1,1 –Diphenil-2-

Pikrylhydrazin) peneliti menyarankan adanya penelitian yang lebih lanjut untuk

mengetahui apakah tumbuhan ini memiliki manfaat sebagai anti malaria.

2. Perlunya sosialisasi lebih terbuka kepada masyarakat tentang manfaat tumbuhan ini.

3. Perlunya budidaya tumbuhan ini agar dapat menjadi sumber tanaman obat herbal.

BAB III

LANDASAN TEORI DAN HIPOTESIS

Mengakibatkan terbentuknya

Memiliki

3.1 LandasanTeori

Pada kondisi terstetu seperti stress, hiperkolesterolemia peningkatan exercise dan

infeksi malaria, memberikan respon, dimana terjadi peningkatan radikal bebas endogen

akibat proses autooksidasi, reaksi enzimatik, fagositosis, transport electron dan oksidasi ion-

ion logam transisi, kodisi ini akan mengakibatkan reaksi berantai. Radikal bebas yang

kekurangan electron akan mengambil pasangan electron disekitarnya sehingga proses ini

mengakibatkan injuri yang terus-menerus. Dalam kondisi ini diperlukan donor electron baik

dari endogen maupun eksogen yang disebut dengan antioksidan, pada kondisi normal tubuh

akan memproduksi antioksidan endogen seperti bilirubin,melatonin, glutation dan koenzim

Q, namun apabila terjadi peningkatan yang massive, antioksidan tubuh tidak lagi dapat

mengimbangi peningkatan radikal bebas ini sehingga dibutuhkanlah antioksidan eksogen

yang dapat berasal dari Vitamin C, Vitamin E dan flavonoid yang berasal dari tumbuhan.

- Stress- Malaria- Hiperkolesterolemia- exercise

Akar Tumbuhan Mambung

Senyawa fenol

Mencari kekurangan elektron

Meningkatkan terbentukya

Berefek pada

Gambar 3.1 Kerangka Teori

3.2 KerangkaKonsep

Efek dari fagositosis parasite malaria dalah peningkatan radikal bebas yang dapat

mengakibatkan kerusakan sel, keberadaan radikal bebas ini akan dihambat oleh hadirnya

Radikal Bebas EksogenEndogen

- Autoksidasi- Oksidasi- Enzimatik- Fagositosis- Transport elektron

dimitokondria dan- Oksidasiion-ion

logam transisi

- Sinar UV- Radiasi- Rokok- Pestisida

Kerusakan Sel

Peningkatan metabolisme

Antioksidan

Eksogen

- Vitamin C- Vitamin E- Flavonoid

Endogen

- Bilirubin- Melatonin- Glutathion- KoenzimQ

Memberikan donor elektron

antioksidan eksogen seperti halnya flavonoid, dalam penelitian ini ekstrak etanol dari daun

mambung akan memberikan donor electron atau bersifat antioksidan sehingga dapat

menghambat kerusakan sel akibat reaksi berantai oleh radikal bebas.

Gambar 3.2. Kerangka Konsep Penelitian

Keterangan

= Variabel yang diteliti

= Variabel yang tidak diteliti

3.3 Hipotesis

Akar tumbuhan mambung (Blumea balsamifera [L.] DC) memiliki aktivitas

antioksidan .

Tumbuhan Mambung (Blumea balsamifera

[L.] DC)

AntioksidanRadikal bebas

Batang

Ekstrak Etanol

Senyawa fenol

Malaria

Fagositosis

AkarDaun