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Microarreglos de expresión RNA Equipo 3

María Fernanda Cervantes Díaz A00343597Karina Vargas Barón A01215233

Silvia Juliet Gallegos Bueno A00368306 Rosa Jarumy López Rivera A01224241

+Introducción

De acuerdo con el proyecto Genoma Humano, se sabe que nuestra secuencia genética es 99.9% idéntica en todos los humanos.

Un mismo gen puede trabajar de manera correcta para una persona o puede verse afectado por mutaciones o influencias ambientales las cuales hacen que los genes se expresen de manera diferente o no lo hagan.

Los estudios de la expresión de los genes se realizan midiendo la cantidad de mRNA producidas por un gen. Para poder llevar a cabo esto, se utiliza como herramienta los microarrays de expresión.

+ Al comparar la expresión de un gen con el de una

persona sana, los microarrays ayudan a encontrar que genes son los que están fabricando poco o demasiado RNA en la persona enferma. Es así como se puede asociar una enfermedad con un gen o un grupo de genes para después desarrollar tratamiento o pruebas para detectar la enfermedad.

+Historia 1990 Protocolos de marcaje flourescente.

Instrumentación sofisticada. Permitía comparar dos muestras diferentes en el mismo array

1995 Patrick Brown, MD, PhD, profesor de bioquímica (co-inventor Dari Shalon, PhD, investor in Shalon Ventures) Laboratorios de Stanford.

1995 Schena et al. desarrolló un sistema de alta capacidad para controlar la expresión de 45 genes de Arabidopsis en paraleleo mediante la detección de cDNA en portaobjetos por impresión robótica de alta velocidad.El formato miniaturizado de alta densidad permite el uso de volúmenes más pequeños de hibridación lo que mejoró la sensibilidad del ensayo y habilitó la detección de trascritos raros derivados de 3ug de mRNA

+1996 Schena et al. Mejora la sensibilidad a través de los filtros de colonias y métodos de sondas marcadas radiactivamente que podrían cuantificar los niveles de expresión de transcripciones presentes en abundancia 0,005% de la muestra

Comercialización de arrays por Affymetrix.

2003 prácticas clínicas

2004 todo el genoma humano en un microarreglo

Mark Schena

+Microarreglos de mRNA

Usan la propiedad de atracción de los pares de bases (Hibridación) para identificar cuales secuencias de RNA se encuentran presentes en una muestra y su medida de expresión.

+Sondas

Los chips de Affymetrix: toman 11 cadenas cortas pertenecientes al mismo gen. Esto para asegurar que se mide el gen correcto.

El primer paso es fijar las sondas (probes), cadenas cortas de cDNA, en la superficie de cristal del microarray. Estas sondas son de 25 pb y se comprueban que no estén presentes en otro gen.

+Sondas Buscan un alineamiento perfecto con el RNA que se trata

detectar. Por cada una de las sondas, se coloca una modificada (mismatch), en la cual la base central se modifica para que no haya un alineamiento total con el gen objetivo.

Esto se hace con el objetivo de que si el RNA se adhiere al la sonda modificada, es posible que la medida no sea fiable. Solamente si se adhiere a la sonda objetivo se puede decir que el gen se está expresando realmente.

Para cada gen, en total hay 22 sondas diferentes para así asegurarse que se detecta el RNA correcto.

+ Cada uno de los cuadros del microarray contiene un

único tipo de sonda.

+Extracción de RNA y su preparación Después de diseñas las sondas, se extrae el RNA de

una muestra (saliva, sangre). Luego se generan miles de copias de este RNA, para que sea más fácil su detección sobre el array.

Se le unen moléculas de biotina a cada cadena. Éstas actúan como pegamento molecular para las moléculas fluorescentes que luego se lavarán sobre el array.

Cuando se pase un scanner láser sobre el array, las moléculas brillarán, es así como se muestra donde se fijaron las muestras de RNA sobre las sondas de DNA.

+Lavado de la muestra Las muestras del RNA se lavan sobre el array por

periodo de 14 – 16 horas. Algunas de las moléculas de RNA encontrarán a su

complementaria y habrá un alineamiento perfecto, la muestra se pegará a la sonda.

+ Después de que el RNA se una a

las sondas, se debe de eliminar el RNA que no lo hizo.

Para poder saber la cantidad de RNA que se unió a las sondas, se utiliza un tinte fluorescente que se pega a la biotina para así poderlo ver en la obscuridad.

+Gen Expresado Si el gen es altamente

expresado, muchas moléculas de RNA se pegarán a las sondas y brillarán de manera intensa.

Si se expresa en un nivel inferior, se pegarán en menor cantidad a la sonda y por lo consiguiente serán menos brillantes.

+Ejemplo de expresión simultánea de genes

+Microarrays de un color Expresión absoluta

*Afymetrix (fotolitografía)-Probe/25 bases-Probe cell/40*107-Probe pairs-Probe set/11-20 probes pairs

+Microarrays de dos colores Expresión relativa

+Comparación de expresión Dos muestras (Enfermos y sanos) Mapas de color Rojo : El gen esta más expresado en el tejido patógeno

que en el sano Verde: El gen esta expresado en el tejido más sano. Amarillo: El gen esta expresado en la misma proporción

en ambos tejidos

+Video

http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM

+Equipo

+Aplicaciones Perfiles de expresión

Actividad transcripcional Comparación de niveles de ARNm en distintas condiciones Cambios ambientales

Respuesta transcripcional

GlobalFenotipo

molecular

+ Estudios de patogenicidad

Interacciones entre rutas metabólicas.

Fases de desarrollo Rutas de regulación de

infección.

Farmacogenómica Modo de acción de

fármacos, inhibidores o compuestos tóxicos

Cambios en el perfil de expresión celular

Nuevas dianas terapéuticas

Terapias individualizadas Éxito de los tratamientos

según el perfil del paciente

Clasificación de tumores en “clases”

“clustering” ≠ comportamientos

clínicos ≠ terapias

+Bibliografía Villardón, José Luis. Medida de la expresión de genes mediante

microarreglos. Universidad de salamanca. Descubrimiento y selección de herbicidas. (n.d.). Plant and Soil

Sciences eLibrary. Retrieved April 18, 2013, from http://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=1130447135&topic

Universidad de Salamanca. (n.d.).Grupo de Estadística Aplicada. Retrieved April 18, 2013, from http://biplot.usal.es/ALUMNOS/BIOLOGI

Aguado, Mónica. Microarrays en microbiología. Facultad de veterinaria UCM

Microarrays y Biochips de ADN. Informe de vigilancia Tecnológica. Genoma España. Obtenido el 17 de Abril del 2013 de http://www.cecalc.ula.ve/bioinformatica/BIOTUTOR /Microarrays.pdf