ngs (neste generasjons sekvensering) i diagnostikk, erfaringer … · 2017. 6. 9. · ngs (neste...
TRANSCRIPT
NGS (Neste Generasjons Sekvensering) i
diagnostikk, erfaringer og resultater
Emiel Janssen
Seksjonsleder for Kvantitativ og Molekylær Patologi
Daglig leder for laboratoriet for molekylær biologi
Avdeling for Patologi
Stavanger Universitetssjukehus
Professor II, Biomedisin, UiS
Organisering på avdeling for patologi
Avdelingsoverlege
Seksjonsoverlege/ Seksjonsleder
Seksjon for obduksjon
Seksjonsoverlege/
Seksjonsbioingeniør
Seksjon for histologi
Stedfortred.
sek.bioingeniør/ Fagbioingeniør
Generell histlab.
Fagbioingeniør makro
Fagbioingeniør fersk frys/ biobank
Fagbioingeniør farge
Seksjonsoverlege/ Seksjonsbioingeniør
Seksjon for cytologi
Stedfortred. sek.bioingeniør/ Fagbioingeniør
lab.
Fagbioingeniør klinisk
Fagbioingeniør gyn.
Seksjonsoverlege/
Seksjonsbioingeniør
Seksjon for immunhistokjemi
Seksjonsoverlege/
Seksjonsbioingeniør
Seksjon for kvantitativ og molekylærpat.
5,3 personer både
diagnostikk og forskning
Adm. koordinator
Merkantil seksjon
Fagbioingeniør
system
Stedfortredende avdelingsoverlege
Leger
Sjefbioingeniør
Lunge kreft I Norge 2015
•3035 nye tilfeller I 2015
• Økende andel kvinner
• 5-års overlevelse ca 15-20%
• Bare 17% kan behandles med kirurgi
•Anbefaling er EGFR og ALK testing ifm terapi utvalg
•Sensitiv eller resistens
•Primair svulst/liquid biopsy/metastase??
Kreft –en genetisk sykdom
IHC
FISH
GENETISKE
ANALYSER EGFR
BRAF
NRAS
KRAS
Sequist et al: annals of oncology 22, 2616-2624, 2011
Sharma et al. Nature Reviews Cancer 7, 169–181 (March 2007)
Kuiper et al, BJC, 2016
Molekylær biologiske analyser ved
avd. for patologi, SUS
2007 2015
Antall genetiske tester 2 8
Antall analyser 103 537
Antall personer som
utfører disse testene 1 1
+ HPV screening, 10 649 analyser i 2015
Prosent tall fra Stavanger 2012-2015
Antall testet Antall positiv Positiv Uegnet
FISH-ALK 42 6 15% 2%
KRAS * 228 69 30% 0.5%
NRAS * 228 4 2% 0
EGFR 387 31 7% 0
BRAF * 144 59 40% 2%
* Flere organer inkludert i disse tallene
KRAS 59- G12 9- G13 1- K 117
NRAS 2- G12 1- Q61 1- K 117
Lungekreft biopsi
Mutasjonsanalyer
• Å teste hver gen for seg:
– En pasient som skal testes for KRAS/NRAS/BRAF
mha qPCR krever 200 ng DNA
– På grunn av økt forespørsel, økt antall mutasjoner for
hvert gen og økt antall gener trenges de flere 96-bunns
plater med analyser hver dag
– Mye pipettering
– Kostnader øker pga arbeidstid og reagenser
EGFR+KRAS+NRAS+BRAF=
1000+462+462+257=2181 NOK
Kan NGS være en løsning??
NGS= neste generasjons sekvensering
• Panel med gener eller hel genom/eksom
• Egne paneler eller kommersielle
• Massiv parallel sekvensering
• Mange millioner sekvenseringsreaksjoner samtidig
Illumina: measurement by imaging/sequecing by synthesis
Life: measurement by pH-difference/sequencing by
Qiagen: sequencing by ligation
NGS= next generation sequencing
• Spesifikke paneler eller hel genom
• minst 10 ng FFPE DNA
• Sekvensering via pH måling
• Ca. 115 bp per sekvens
• 11 million brønner per chip
https://www.thermofisher.com/no/en/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development/oncomine-
oncology/oncomine-focus-assay.html
https://www.thermofisher.com/no/en/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development/oncomine-
oncology/oncomine-focus-assay.html
https://www.thermofisher.com/no/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-
sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-run-sequence/ion-pgm-system-for-next-generation-
sequencing.html
Muligheter
https://www.thermofisher.com/no/en/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development.html
IVD godkjent siden mars 2015
Oncomine fokus : • Har blitt validert i 300 prøver (100 lunge, 100
prostata, 100 blandet)
• 100% sensitivitet and spesifisitet for EGFR, BRAF,
KRAS in lunge
• >95 % sensitivitet and spesifisitet totalt
Ion Torrent, NGS
Hovelson et al, Neoplasia 2015 Apr; 17(4): 385–399.
Logistikk
• Manuell DNA-isolering – torsdag + fredag
• DNA-måling, kvantitet + kvalitet – fredag
• Bibliotek laging – mandag
• Bibliotek måling, kvantitet + kvalitet – mandag
• Ion Chef – tirsdag
• PGM – tirsdag/onsdag
• Ion torrent server - onsdag
Lokal validering
• Total antall 50 FFPE + 3 kommersielle kontroller
• 4 Celle linjer med multiple mutasjoner (BRAF, KRAS,
NRAS, EGFR)
• 100 % overenstemmelse
• Her2 CNV mha NGS: n=8 ikke-amplifisert, 7 amplifisert
• Her2 FISH 1.8 – 2.0 : Ikke amplifisert mha NGS n=4
PIK3CA BRAF KRAS NRAS EGFR 1 21 14 3 14
NGS resultater
NGS analysering
• Trenger minst 3.5 million reads av DNA og minst 250.000
per prøve
• Trenger minst 5000 reads av RNA per prøve
• Trenger helst minst 50% tumor celler for kopi antall
beregningen
• Noen ikke affiserte områder i de forskjellige gener blir
analysert også
• Kopi tall er en in silico beregning ift 500 analyserte
normale og tumor prøver.
• ALK, ROS, RET og NRTK1 bestemmes i begge lese
retninger (dette ifm mulige delesjoner) pluss en måling av
normal ekspresjon (i andre regioner av genene)
Kvalitetsrunder
• ESP kolorektal (KRAS/NRAS/BRAF)
– 100% Korrekt
– Ikke godkjent rapport
• ESP lunge (ALK, EGFR)
– ongoing
NGS utfordringer • CNVs og tumorprosent på>50%
• RNA kvalitet og positive kontroller
• Hva skal man rapportere (forskjellig for hver organ, eller
alt eller…??)
• Taksten?
• Hva skal man oppbevare, DNA/rådata filen, rapport
filen
• Hvilket system skal man bruke, standard for alle eller..?
• Fortsatt en del pipettering
• Trening/utdanning. Spesialister i molekylær patologi,
molekylære onkologi, molekylære kirurgi?
Forslag fra SUS, standardsvar på «lunge pakke» primærutredning:
Mutasjons informasjon
• EGFR
• KRAS
• NRAS
• BRAF
Ved re-biopsi grunnet behandlingssvikt på EGFR-hemmer
Mutasjons informasjon Translokasjon
• EGFR -ALK
• KRAS -ROS1
• NRAS -RET
• BRAF
• ALK
• ROS1
• RET
Amplifikasjons informasjon
• MET
• HER2
• PIK3CA
Lungekreft
Resistens mot EGFR TKI
Camidge et al. Nature Reviews Clinical Oncology Volume: 11, Pages:473–481:(2014)
Videre utviklinger
• Flere biopsier vil bli testet
• Tester man primaer svulsten eller metastaser (eller
begge to)?
• Liquid biopsier:
– Testing for mutasjoner i cell free DNA (plasma) hos
pasienter hvor annet prøvematerialet er for vanskelig
– Testing for bestemte, kjente mutasjoner under
behandlingen
• Digital PCR eller NGS
Norsk forening for Molekylær Patologi
NFMP
• Organisert under patologi foreningen
• Åpent for alle som jobber er interessert i molekylær
patologi
• Arbeidsgruppen startet med registrering og mandat
osv
• Patologi foreningen har gitt støtte
• Ideer for en logo er velkommen
• Første møte 16-17 november 2017 i Oslo
Takk for oppmerksomheten!!