nukleov é kyseliny
DESCRIPTION
Nukleov é kyseliny. Význam genetické informace, její replikace a exprese pro živý organismus DNA – struktura, vlastnosti a funkce v organismu RNA – dtto Virus ( = parazitující soubor genů) Možné využití syntetických oligonukleotidů - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Význam genetické informace, její replikace
a exprese pro živý organismus
DNA – struktura, vlastnosti a funkce v organismu
RNA – dtto
Virus ( = parazitující soubor genů)
Možné využití syntetických oligonukleotidů
Technické použití nukleových kyselin: aptamerové senzory, DNA nanomateriály
Nukleové kyseliny
Znaky živého organismu
získávání energie z živin pro své životní potřeby
možnost růstu, diferenciace a reprodukce
aktivní udržování vnitřní uspořádanosti
aktivní reakce na změny vnějších podmínek
Všechny tyto životní projevy se realizují primárně na úrovni buněk
Jednotná molekulární strategie buněk
Polysacharidy a lipidy … stavební a zásobní
Bílkoviny (proteiny) … univerzální, mohou mít funkci: stavební, zásobní, biochemickou (enzymy), transportní, pohybovou,
kontrolní, signální,..
Specifický vztah mezi strukturou a funkcí:
posloupnost aminokyselin struktura funkce
Kritická podmínka pro zachování životních pochodů buňky: mít možnost podle potřeby vytvořit protein pro zabezpečení dané funkce
To zajišťují Nukleové kyseliny: v DNA je informace uložená, RNA je prostředníkem její realizace (exprese)
Centrální dogma molekulární biologie
Přenos genetické informace v živých organismech vždyDNA RNA protein
Chemické složení DNA
Asymetrický řetězec s jasně rozlišeným 5’ a 3’ koncem.
DNA je polymerní řetězec, vzniklý
polymerací nukleotidů.
Nukleotid = báze + deoxyribóza + + fosfátová skupina
Uspořádání DNA
DNA je v buňkách ve formě dimeru tvořeného antiparalelně uspořádanými řetězci s komplementárním bázovým složením.
Rozsah buněčné genetické informace
Kompletní genetická informace organismu = genom.
Prokaryota: Genom obsahuje typicky jednotky tisíc genů. Existují však i primitivní bakterie s méně než 100 geny.
________________________________________________Eukaryota: Desetitisíce až statisíce genů v genomu. Primitivní eukaryota nemají o mnoho více genů než nejlépe geneticky vybavená prokaryota (kvasinka Saccharomycescerevisiae má 6 tisíc genů).
Příklad genu
Uložení DNA v buňce
Genom prokaryot je uložen v jediné molekule DNA, která je cyklická.__________________________________________________V případě eukaryot je genom představován sadou molekul DNA, které jsou základem jednotlivých chromosomů. Například somatické (nepohlavní) lidské buňky obsahují dvě sady po 23 chromosomech. V každém chromosomu je DNA o délce kolem 10 cm.
Délka a počet DNA molekul v jádře vylučuje jejich volné uložení. Proto dochází k několikastupňové organizaci. Ta je maximální při přípravě pro buněčné dělení, kdy jsou zformovány chromosomy. Při ostatních životních fázích buňky dochází k částečnému rozvolnění:struktura DNA + podpůrné proteiny = chromatin
Vyšší stupně uspořádání Nukleosomy jsou vázány na další vláknový histon a tvoří „30 nm vlákno“. To je dále zprohýbáno a organizováno.
Díky uspořádání je délka chromosomu 10.000x menší než délka rozvinuté DNA.
Při ostatních životních fázích buňky dochází k rozvolnění. Málo rozvolněný chromatin (heterochromatin) je nedostupný pro expresi genetické informace.
I v nejvíce rozvolněném chromatinu zůstává struktura nukleosomů. Základní pochody na DNA, tj. replikace, transkripce nebo opravy mohou probíhat přes nukleosomy.
Uspořádání v jádře
V jádře se chromosomy (= molekula DNA + histony) uspořádávají do více a méně rozvinutých oblastí.
Předávání a rekombinace genetické informace
Genetická informace při diferenciaci buněk nemizí
Replikace DNA
Přesnost replikace:
prostá syntéza DNA vlákna: pravděpodobnost chyby 1:100000
bezprostřední kontrola a oprava: pravd. chyby 1:100
další kontrola a oprava na novém vláknu: pravd. chyby 1:100
Celková pravděpodobnost chyby při replikaci: 1 : 1 miliarda
Důležitost předávání genetické informace
Je to především pojistka proti současnému poškození životně důležitých genů u celého společenství jednotlivců
U bakterií je možné předání malého množství DNA přímo mezi jedinci, nebo i z okolí buňky.
Dobře se uplatňují plasmidy, malé kruhové DNA
U eukaryot se děje předávání genetické informace při pohlavním rozmnožování
Somatické buňky jsou diploidní – mají vždy 2 páry chromosomů, jeden od otce a jeden od matky, které se spojily při oplození, kdy se do jednoho jádra dostaly chromosomy z samční i samičí podhlavní buňky.
Přenos genetické informace podle principu KOMPLEMENTARITY
pouze bázové páry A:T, G:C
Zápis genetické informace
U všech organismů se zápis genetické informace realizuje
v molekule DNA = deoxyribonukleová kyselina
a to pořadím čtyř bází:
Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin
Co je příčinou principu komplementarity ?
Pouze při zachování principu komplementarity lze při libovolném řazení čtyř bází na jednom řetězci vytvořit pravidelnou strukturu dvojšroubovice
Stabilita dvojšroubovice DNA
Relativně velká citlivost na vnější podmínky: teplota, tlak, pH, koncentrace kationtů, koncentrace jednotlivých vícemocných iontů
Zvláštní struktury DNA podmíněné speciálním bázovým složením:- alternující G a C ………………………….levotočivá šroubovice- pouze A a G v jednom vlákně … ……….trojšroubovice- pouze G …………………………. ……….kvadruplex- úsek pouze s A a T s alternacemi ………ohyb
Závislost stability na stavbě DNA - délce řetězce - bázovém složení: stabilita roste s podílem G:C párů
RNA - chemické složení
Chemické složení RNA se od DNA liší pouze ve dvou detailech
Místo báze Thymin je Uracil (Uracil nemá methylovou skupinu)
Místo deoxyribózy je ribóza (má OH skupinu v pozici 2’)
DNA RNA
Role RNA
RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolíchmRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselinrRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů)tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách
Centrální dogma molekulární biologie:Přenos genetické informace v živých organismech vždy
DNA RNA protein
Eukaryota Prokaryota
Postup exprese genetické informace
RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolíchmRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselinrRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů)tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách
Strukturní rysy RNA RNA se zásadně vyskytuje jako jednovláknová, může ale vytvářet lokální interní dvojšroubovice a stabilizovat se ve složité prostorové struktuře. Základními strukturními motivy jsou vlásenka (hairpin, hairpin loop) - obsahuje vlastní smyčku a stonek (stem), výduť (bulge), vnitřní smyčka, křížení (junction)
Struktura 5´konce viru HIV-1 • TAR – vlásenka, na kterou se vážou proteiny virový Tat a
buněčný CyclinT1• DIS (SL1) – vlásenka, která je zodpovědná za držení obou
homologních vláken viru při sobě
Viry• Samostatně existující skupiny genů. Mohou se replikovat pouze pokud infikují vhodnou hostitelskou buňku. Nebuněčné částice, nepovažují se za živý organismus.
• Mimo hostitelskou buňku nevykazují životní projevy: nemají látkový ani energetický metabolismus, nerostou, nejsou dráždivé, nemají aktivní pohyb, nerozmnožují se. Žádný z virů neobsahuje geny klíčové pro jeho replikaci, především pro stavbu ribosomu nebo syntézu ATP. • V procesu své reprodukce představují vnitrobuněčné parazity, kteří jsou zpravidla patogenní pro hostitelskou buňku.
• Obsahují 3 až stovky genů a jejich velikosti se pohybují od 15 do cca 400 nm.
Životní cyklus DNA viru
Lytický cyklus – s využitím buněčného aparátu (permisivita buňky) se replikuje nukleová kyselina i virové proteiny. Kapsidové proteiny se v procesu tzv. maturace samovolně skládají a vytvářejí kapsid, sestavují se nové viriony. Konkrétní mechanismus závisí především na tom, jak je realizován zápis virových genů:
DNA viry - přímá transkripce a translace virové DNA
Životní cyklus retroviru RNA je virovou reverzní transkriptázou přepsána do DNA a ta je virovou integrázou včleněna do buněčné DNA v jádře
Použití oligonukleotidu k „uspání“ genu
oligonukleotid = krátký úsek nukleové kyseliny
Motivace:
1. Chemoterapie:
Selektivní likvidace nežádoucích organismů
Potlačení reprodukce virů, především retrovirů
Potlačení růstu vlastních buněk s patogenním chováním
2. Molekulární biologie:
Efektivní zkoumání funkcí řízených jednotlivými geny
Možné mechanismy
• Antigenní – oligonukleotid se váže na dvojšroubovici DNA a vytváří triplex; blokuje transkripci (vznik mRNA)
• Antisensní – oligonukleotid se váže na mRNA a vytváří duplex; blokuje translaci (syntézu proteinů) nebo dokonce vede ke štěpení mRNA pomocí RNasy H
• Aptamerní – oligonukleotid zabraňuje funkci proteinu zajišťujícímu nezbytný krok v realizaci genetické informace (reverzní transkriptáza, integráza, apod.)
• siRNA – krátká dvojšroubovice RNA obsahující nežádoucí sekvenci
• Ribozymy – speciální RNA sekvence katalyzující štěpení mRNA
Chemicky modifikovaná analoga nukleových kyselin
Krátké úseky přírozených nukleových kyselin nejsou v buněčném prostředí stabilní – působení štěpících enzymů (nukleázy)
První generace antisense léků: Založené na fosforothioátechAktivují RNázu HDesítky přípravků ve stadiu klinickýchtestů, jeden lék povolen pro lékařské použití Problémem je nespecifická vazba na nukleové kyseliny a proteiny
Druhá a třetí generace antisense léků: Založené na ochranných O-methyl nebo O-methoxy-ethyl skupinách, někdy v kombinaci s fosforothioáty (2.generace) nebo jiné typy modifikací (3.generace)Neaktivují RNázu H, řeší se to tvorbou „chimerických“ oligonukleotidů Více než desítka ve stadiu klinických testů
Výběr z přehledu testovaných přípravků
To je motivace pro hledání nových, vhodnějších modifikací
- dostatečná stabilita vůči enzymům v buňce štěpícím nukleové kyseliny
- specifická afinita k cílovému úseku přirozené nukleové kyseliny
s komplementární bázovou sekvencí
- pro antisense aplikaci schopnost aktivovat enzym RNáza H
- úspěšné pronikání do buněk a správná distribuce
ve vnitrobuněčném prostředí
- netoxičnost a to ani metabolických produktů
Žádná z dosud používaných modifikací nemá bohužel optimální vlastnosti, aby se mohl plně využít potenciál antisensní strategie
Požadavky na syntetická analoga nukleových kyselin pro terapeutické použití
Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i
modifikovaných nukleových kyselin
Studované problémy
tvorba a rozpad duplexů, triplexů a kvadruplexů
vliv vnějších podmínek : pH, jednotlivé kationty, speciální molekuly
stabilita a dynamika duplexů s neúplnou komplementaritou
struktura, dynamika a interakce s enzymy regulačních úseků DNA
interakce s enzymy (HIV integráza, RNasa H) významné pro terapii
interakce vazebných strukturních motivů s aptamery (TAR smyčka)
pronikání oligonukleotidů do buněk a jejich vnitrobuněčný osud
Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i
modifikovaných nukleových kyselin
Používané metody
UV absorpce
Ramanova spektroskopie
senzory na bázi rezonance povrchových plasmonů
mikrokalorimetrie
strukturní a dynamická NMR měření
cikulární dichroismus (v UV absorpci)
gelová elektroforéza
mikrofluorescenční techniky
počítačové modelování
Testování syntetických oligonukleotidů
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
O
PO T
HO
OO
OCH3
d[T15
]d[(X)14
T]
dT15
50 nM buffer
buffer
O
PO T
HO
OO
CH3OCH2CH2O
d[(X)14
T]
O
PO
THO
OOH
(S)-
d[T(TX)7] (S)
O TO
PHO
O
O
d[(X)14
T]
Sen
sor
resp
on
se [
nm
]
O
PO T
HO
OO
CH3O
d[(XTTT)3XXT]
O
PO T
HO
OO
OCH3
d[T(XT)7]
Time [min]
O
P
OTHO
O
O
d[(X)14
T]
Testování vazby na přirozený řetězec – SPR biosenzor
Specificita vazby(výsledky UV absorpce)
stabilita komplexu s přirozeným vláknem, strukturní podobnost (UV absorpce, počítačové simulace, Ramanův rozptyl)
biochemický test: aktivace RNasy H