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.,.\:\'Gl'l .vnnocor.

République de Côte d'Ivoire Union-Disc.iprïne-Travail

Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche

Scientifique

Numéro d'ordre

Soutenu publiquement

Le 04 /Octobre/ 2016

Mémoire

Présenté pour l'obtention de l'UE de stage de Master 2

Option : Microbiologie et Biologie moléculaire

Par

p

BLEDOUMOU KOFFI NICAISE

RI PH

( Wistar otbino

Commission d'examen

Dr Fau let Betty Epse Ahonzo (Présidente du jury)

Dr Soro Anastasie Yao (Membre)

Dr Aké Moussan Désirée Francine (Membre)

Dr Yapi Assoi Yapi Désiré (Membre)

Dr Dadie Adjêhi Thomas, Co-Directeur, UNA

Dr Adon Monsan Arsène, Co-Directeur, IPCI

DEDICACE

À ma/ami/le À ceux qui y ont cru depuis le début ...

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire ii

REMERCIEMENTS

Ce document est le résultat de plusieurs mois d'effort. Sa réalisation a été possible grâce au

concours de plusieurs personnes à qui nous voudrions exprimer notre profonde gratitude.

Le présent travail a été réalisé avec le soutien de l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire (IPCI). Mes

remerciement vont à l'endroit de:

}> Docteur. Arsène Monsan ADON pour nous avoir acceptés dans son laboratoire de

Biologie cellulaire et pour nous avoir guidés durant nos manipulations.

}> Monsieur DIABY V andjiguiba, Ingénieur contrôle qualité pour sa parfaite collaboration

durant ce stage sans oublier tout le personnel dudit laboratoire.

Mes vifs remerciements vont également à l'endroit de :

}> Professeur BOHOUA Guichard, Doyen de l'Unité de Formation et de Recherche des

Sciences et Technologie des Aliments (UFR-STA) de l'Université Nangui Abrogoua pour

nous avoir acceptés dans son Unité de Formation et de Recherche.

}> Professeur DJE Koffi Marcellin, Directeur du Laboratoire de Biotechnologie et de

Microbiologie des Aliments.

Je témoigne toute ma reconnaissance et mes remerciements sincères à mon encadreur :

}> Professeur. DADIE Adjéhi Thomas, Maître de Conférences à l'UFR/STA pour la

confiance qu'il a placé en moi en acceptant de diriger ce travail. Sa présence permanente,

sa disponibiJité, son soutien moral et spirituel, ses conseils ainsi que son accueil familial

ont été des éléments très importants dans l'élaboration de ce travail.

Mes remerciements vont également à l'endroit de tous les enseignants de l'UFR-STA en

particulier ceux de la filière Microbiologie pour la formation solide qu'ils nous ont donnée et

aussi pour Jes conseils.

Tous mes remerciements à ma famille en particulier mon père BLEDOUMOU Kouakou Lucien,

ma maman AMANI Yah Epse BLEDOUMOU, à Docteur KOFFI Ahua René de l'équipe de

Recherche « Veille Sanitaire et Sécurité Microbiologique » dirigée par Professeur DADIE, à

l'université Nangui Abrogoua, à Monsieur Blegui Ingénieur à LANEMA, Monsieur Zoro Bi

enseignant au Lycée Technique de Y opougon, mes amis Monsieur TRAORE Souleymane et Mlle

Anastasie KONAN, mon Pasteur KOUADIO Justin, mes frères et sœurs ainsi qu'à mes cousins et

cousines pour leur confiance, leurs suggestions, leurs aides spirituelles et financières.

Enfin, j'adresse mes sincères remerciements à toutes mes connaissances pour la parfaite et

cordiale entente et à tous ceux qui ont participé de près ou de Join à l'élaboration de ce travail.

RESUME

Le « koutoukou » est une eau-de-vie dont la production et la commercialisation ont été

interdites en Côte d'Ivoire en 1964, avant d'être autorisées en 1999. Les données sur les

caractéristiques physico-chimiques, microbiologiques et toxicologiques sont rares. L'objectif de

l'étude était de déterminer les caractéristiques physico-chimiques, microbiologiques et

toxicologiques du moût de production du « koatoukou » et d'évaluer le potentiel toxique de

l'alcool. L'étude a consisté en une caractérisation physico-chimique, microbiologique et

toxicologique du moût et une évaluation toxicologique du koutoukou par 1 'enregistrement de la

masse corporel de rats Wistar. L'étude a révélé qu'au cours de la fermentation du moût, les

levures sont les microorganismes fermentaires les plus abondants. Leur charge qui etait de 5-

5,65 log (UFC/ml), ne varie pas dans le temps (48h) et selon les sites de production.

La charge en bactéries lactiques, 4,8 log (UFC/ml) ne varie pas significativement

après 48h. Quant aux entérobactéries, leur charge qui était de 2,4-4,1 log (UFC/ml) a

révélé un manque de bonnes pratiques d'hygiène. L'activité de ces microorganismes a

influencé le pH et le taux d'alcool du koutoukou. Le gavage des rats au koutoukou, induisait

une perte de masse corporelle de 10,5 à 17% chez les animaux. Le pouvoir toxique du

koutoukou à base de levure était plus élevé que celui à base de vin de palme. La maîtrise de

la technique de production du koutoukou pourrait contribuer à améliorer la sécurité sanitaire

du produit.

Mots clés : koutoukou, propriétés physico-chimique, qualité microbiologique, boisson alcoolisée ( Wistar albinos)

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie-et Biologie- Moléculaire iv

SIGLES ET ABREVIATIONS

ADN

AFNOR

AVBSP

CA

DMO

HA

ISO

KTK

MAF

L-S-E

OMS

PNF

: Acide désoxyribonucléique

: Agence Française de Normalisation

: Année de Vie de Bonne Santé Perdue

: cirrhose alcoolique

: Densité minérale osseuse

: hépatite alcoolique

: International Organization for Standardization

: Koutoukou

: maladies alcooliques du foie.

: Levure sucre eau

: Organisation mondiale de la santé

: Procédure normalisée de fonctionnement

1

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire v

1

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Condition de culture selon les germes recherchés 27

Tableau 2 : Constitution des lots des rats 31

Tableau 3 : Charge moyenne en entérobactéries des échantillons collectés 37

Tableau 4 : Paramètres physico-chimiques da koutoukou en fonction du substrat.. 38

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire vii

TABLE DES MATIÈRES RE.MERCIE.MENTS iii

RESlJME iv

SIGLES ET ABREVIATIONS ······················································································································· V

LISTE DES FIGURES vi

LlSTE DES TABLEAUX vii

1NTR0DUCT10N 1

PARTIB J: REVUEBIBLJOGRAPHlQUE 3

!-GENERALITES SURL'ALCOOL 4

1.1-Définition 4

1.2-Consommation d'alcool 4

1.3-Place de l'alcool dans la société 5

l .4-Alcool et le poids S

1.5-Elimination de l'alcool par l'organisme S

1.6-Maladies alcooliques du foie 6

2-GENERALITES SUR LE« KOUTOUKOU » 7

2.} -Définition de l'eau de vie « koutoukou » 7

2.2-Production et consommation 7

2.3-Composition chimique 8

2.4-Importance du « koutoukou » dans la société ivoirienne 8

3-GENERALITE SUR LA FERMENTATION 11

3.1-Définition de la fermentation 11

3.2-Fermentation du vin de palme 11

3 .3- Interactions levures-bactéries 13

4-GENERALITES SUR LA FLORE MJCROBIBNNE RECHERCHEE 13

4.1- Levures 13

4.2- Bactéries Lactiques 14

4.3-Entérobactéries 14

5-DESCRIPTION DU RAT BLANC 15

PARTIE TI:MATERIEL ET METHODES 16

1-MA TERIEL 17

1 .1- Matériel biologique 17

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire viii

2- Méthodes 18

2.1-Analyses microbiologiques 18

2.1.1-Échantillonnage et suivi du stockage 18

2.1.2- Dénombrement de la flore microbienne 18

2.1.2.1- Préparation des dilutions décimales 18

2 .1.2.2- Recherche et dénombrement... 19

2.1.2.3- Recherche et dénombrement des levures 19

2.1.2.4-Recherche et dénombrement des bactéries lactiques 19

2.2- Analyses physico-chimiques du koutoukou 21

2.2.1- Détermination du pH 22

2.2.2-Dosage de l'alcool dukoutoukou 22

2.3-Evaluation du pouvoir toxique du koutoukou sur des rats 22

2.3.1- Choix de l'animal. 22

2.3.2- Entretien des animaux 22

2.3.3- Constitution des lots des rats 23

2.3.4- Pesée 23

2.3.5- Principes internationaux de la bioéthique 23

2.3.6- Evaluation de la toxicité du koutoukou 23

2.4- Analyses statistiques des données 24

PARTIE ffi:RESULTATS ET DISCUSSION 25

1- RESULTATS 26

1.1- Charge microbienne du moût 26

1.1.1- Evolution de la charge en levures 27

1.1.2- Evolution de charge en bactéries lactiques 28

1.1.3- Charge moyenne en entérobactéries du moût 29

1.2- Caractères physico-chimiques du koutoukou 28

1.3- Pouvoir toxique du koutoukou sur des rats 29

1.3.1- Evaluation du poids corporel... 30

1.3 .2- Effet comparé du koutoukou à base de vin de palme et de koutoukou à base

de levure-sucre eau 30

2- Discussion 32

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 35

REFERENCES BIBLIOGRAPHlQU.ES 36

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire ix

INTRODUCTION

À l'échelle mondiale, l'alcoolisme représente l'un des risques sanitaires les plus importants.

Selon le rapport 2006 de }'OMS sur la santé dans le monde, l'usage nocif de l'alcool est

responsable de 4 % du taux de morbidité et de 3,2 % des décès prématurés enregistrés dans le

monde (Hamon et al., 2000). La même source d'information indique qu'il s'agit de la

principale cause de décès et d'incapacité dans les pays en développement à faible mortalité, du

troisième facteur de risque de décès dans les pays développés après le tabac et 1 'hypertension, et

du onzième dans les pays en développement à fort taux de mortalité.

En Afrique de l'Ouest, notamment en Côte d'Ivoire, l'introduction des boissons fortement

alcoolisées remonte à la traite des esclaves et au début de la période coloniale où l'alcool était

utilisé pour conclure des aJliances et des accords territoriaux avec les chefs coutumiers (Amany,

1990). Avant cette époque, les populations ne disposaient que de boissons fermentées faiblement

alcoolisées, dont les plus courantes étaient les vins de palmiers et les bières de maïs, de mil et de

sorgho. La consommation de ces alcools était ritualisée et elle répondait à des coutumes et /ou à

des exigences sociales. Quant aux eaux-de-vie locales, dénommées « Koutoukou », ce n'est que

tardivement qu'elles ont été produites en Côte d'Ivoire. Cette boisson artisanale est produite avec

l'introduction de l'alambic depuis le Ghana voisin, à partir de 1940 (Amany, 1990). EUe est

produite à partir du jus de canne à sucre ou d'un mélange eau-sucre-levure ou encore par le vin de

palme (Yao, 2009). Ainsi, l'usage des eaux-de-vie artisanales obtenues à partir du vin de palme,

du jus de canne à sucre et de l'eau sucrée additionnée de levure, s'est depuis pérennisé à

l'occasion des cérémonies de cultes aux ancêtres, de funérailles et de mariages. Les travaux

réalisés par Camara (1998) révèlent que la consommation de l'alcool fait partie intégrante de la

culture de nombreux peuples africains.

En Côte d'Ivoire, selon les données de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), de

1970 à 1980, les vins étaient plus consommés que les bières et les liqueurs. Depuis 1986, les

bières sont les produits alcoolisés les plus consommés (Anonyme, 1999). La même source

indique qu'avec les crises économiques qui se sont succédées, les alcools de production

artisanale sont de plus en plus consommés. Ainsi, les travaux de Camara (1998) ont révélé

l'entrée remarquable du koutoukou dans les habitudes de consommation des populations

ivoiriennes, en particulier les jeunes.

En effet, chez ces jeunes, on assiste de plus en plus à une augmentation de la consommation de

boissons alcoolisées de production traditionnelle de type « Bangui », « Dolo » et « Koutoukou ».

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire 1

La prolifération des plantations de palmier à huile encouragée par l'Etat (Cheyns et al, 2001 ) et

le vieillissement de ces plantations ont contribué à l'utilisation préférentielle du vin de palme pour

la production du Koutoukou, L'Etat de Côte d'Ivoire a donc adopté une loi pour la levée de

l'interdiction du« koutoukou » en 1999 (loi 0°99-437 du 6 juillet 1999).

Depuis la levée de cette interdiction, la production et consommation du koutoukou ne

cesse d'augmenter. La filière de production de cette boisson est entièrement artisanale ; ce qui ne

garantit pas toujours une qualité sanitaire du produit. Les données relatives à l'étude du

koutoukou, surtout celles concernant son degré de toxicité, sont très peu nombreuses en Côte

d'Ivoire. Parmi les travaux précédemment réalisés, il y a les études menées par Hamon et

Camara (2000) qui ont porté essentiellement sur la proportion de consommation de cette

boisson. Par ailleurs, Camara (1998) a déterminé la place qu'occupe le « koutoukou » dans la

consommation d'alcool en Côte d'Ivoire, également a identifié les principaux alcools qui

entrent dans la composition chimique du « koutoukou » et a montré chez l'homme, les effets

de cette boisson (l'alcool) sur le fonctionnement cérébral.

L'objectif de cette étude est d'identifier au cours du processus de fabrication de cette

boisson, la microflore intervenant dans la fermentation du moût, et de déterminer l'effet du

koutoukou sur l'état du rat Wistar.


PARTIE I :REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1-GENERALITES SUR L'ALCOOL

1.1-Définition

L'alcool est une substance chimique de base contenue dans toutes les boissons alcoolisées. Il est

obtenu par la fermentation de fruits, de légumes ou de céréales (riches en sucre) ou par

distillation. Les boissons fermentées (vin, bière, cidre) contiennent au maximum 15% d'alcool

pure tandis que les boissons distillées ( spiritueux, apéritifs, eaux de vie) peuvent en contenir

jusqu'à 45%. L'alcool passe en quelques minutes dans le sang, avant d'être véhiculé dans tous

les organes dont le cerveau et le foie. Sa durée d'élimination est dépendante de l'activité

physique fournie ou de la température ambiante ou de l'habitude de boire.

1.2-Consommation d'alcool L'Union Européenne est la région du monde où le pourcentage de consommation d'alcool par

habitant est le plus élevé. L'alcool est le troisième facteur de risque le plus important après le

tabagisme et l'hypertension et devant l'hypercholestérolémie et le surpoids entraînant des

pathologies et des décès prématurés. En plus d'entraîner une dépendance et d' être la cause d'une

soixantaine de pathologies et de traumatismes, l'alcool est responsable de dommages sociaux,

mentaux et affectifs très répandus qui induisent des coûts très élevés pour la société. La

consommation d'alcool peut être préjudiciable pour le consommateur, l'enfant à naître et les

membres de la famille. Elle entraine également des délits, de violence et d'accidents de la route

ou autres accidents dont ceux du travail.

La mesure de la consommation alcoolique est exprimée en boisson ou verre standard qtn

correspond à une quantité de boisson alcoolisée contenant 13-16 grammes d'éthanol. La

consommation abusive ou nocive de l'alcool correspond chez la femme à une consommation

journalière de 4 verres standards tandis que chez l'homme elle est de 5 verres standards.

Au niveau mondial, la consommation nocive de l'alcool provoque 3,2% des décès (1,8 milJions)

et 4,0% d' A VBSP (58,3 millions). Cette proportion est plus élevée chez les hommes (5~6% de

décès et 6,5% d' A VBSP) que chez les femmes (0,6% décès et 1,3% AVBSP).

En Côte d'Ivoire, l'enquête STEPS de 2005 a montré que 71.1% de la population ont consommé

de la boisson alcoolisée tandis que 28.9% s'abstenaient. En milieu urbain, 70.9% ont consommé

de l'alcool contre 73.4% en milieu rural. La région des lagunes était à une moyenne de 9 verres

standards d'alcool consommés en 1 semaine par personne.


La moyenne journalière de consommation standard d'alcool dans l'ensemble de la population

enquêtée est de 5 verres standards avec une moyenne de 4 verres en milieu rural et 5 verres en

milieu urbain. Les hommes consomment en moyenne 6 verres standards de boissons alcoolisées

par jour en milieu urbain contre 5 en zone rurale. Quant aux femmes, leur consommation

journalière moyenne est de 4 verres standards de boissons alcoolisées en milieu urbain contre 2.2

en milieu rural. La fréquence de consommation alcoolique est plus élevée en milieu urbain qu'en

milieu rural.

1.3-Place de l'alcool dans la société La place de l'alcool dans la société a évolué au cours du temps. Les appellations utilisées

autrefois témoignent de ce changement puisque l'alcool était jadis considéré comme un

«Aliment», un «fortifiant» ou un «remède». Or, il n'a jamais. été un aliment ou un remède au sens

que nous donnons aujourd'hui à ces termes - il fournit certes des calories mais ne contient pas

d'éléments nutritifs. Par ailleurs, il n'a d'effets positifs sur la santé (maladies cardiovasculaires)

qu'à condition d'être consommé modérément (un verre standard parjour) et à partir d'un certain

âge seulement ( dès 40 ans. environ).

1.4-AJcool et le poids

L'alcool contient 7,1 kilocalories par gramme. Il favorise la prise de poids mais les kilocalories

consommés sont considérées comme des « calories vides », car elle ne contient que de très petites

quantités de nutriments. L'alcool est la seule drogue ayant une valeur énergétique calorique (7,1

kcal/g), mais sa relation avec le poids est complexe. Une méta-analyse révèle que la relation

alcool-poids est négative dans. 15 % des cas et positive dans. 50 % des. cas chez l'homme, alors

qu'elle est négative dans 4 7 % et positive dans 12 % des cas chez la femme. Ceci rappelle que les

calories alcooliques ne se retrouvent pas intégralement in vivo et que la valeur calorique in vivo

est sûrement inférieure à 7, 1 (Pirola et Lieber, 1976).

1.5-Elimination de l'aJcool par l'organisme

Le catabolisme de l'alcool ingéré en quantité modérée contribue à la couverture des besoins

énergétiques en fournissant 7,1 kcal/g qui ne sont, toutefois, pas totalement utilisables in vivo.

La voie principale est l'oxydation hépatique de l'alcool en acétaldéhyde par l'alcool

déshydrogénase. Elle a pour cofacteur le NAD+- et libère de l'énergie qui peut être stockée sous

forme d'ATP.

BLE DOUM OU Koffi Nicaise Master 2 {Microbiologie et Biologie Moléculaire 5

Ingérée en plus grande quantité, l'alcool entre dans la voie du système microsomial

d'oxydation (MEOS), ce qui permet d'accélérer son oxydation, mais l'énergie ainsi produite ne

peut être stockée et est perdue · sous forme de chaleur. L'oxydation par la voie de la catalase est

une solution accessoire. L'acétaldéhyde produit par ces réactions est un composé toxique métabolisé

en acétate par un acétaldéhyde déshydrogénase qui est introduit dans le métabolisme

intermédiaire (cycle de Krebs). Le facteur limitant est la disponibilité de NAD+.

-------- 1 Vole du MEOS

----- ---~-------

/

{

Figure 1: Métabolisme de l'éthanol

Source: Jaspard, 2009

1.6-Maladies alcooliques du foie

Les maladies hépatiques provoquées par une consommation excessive d'alcool comportent des

atteintes de trois types :

stéatose : accumulation, à un degré varié, de triglycérides sous forme de macro vésicules,

préférentiellement dans les hépatocytes de la zone centrale du lobule hépatique ;

Hépatite Alcoolique (HA) : association de nécrose hépatocytaire, d'inflammation à

polynucléaires et de fibrose initialement périsinusoïdale. L'hépatite alcoolique est habituellement

qualifiée d'aiguë car le tableau clinique, au moment du diagnostic, correspond le plus souvent à

une forme sévère, ictérique qui s'atténue avec le sevrage d'alcool et le traitement. On ne dispose

pas d'éléments permettant d'exclure formellement l'existence d'une hépatite alcoolique


chronique, forme qui pourrait exister, ne serait-ce qu'à bas bruit, en cas d'alcoolisation excessive

chronique;

Cirrhose Alcoolique (CA): nodules de régénération de petite taille (micronodules) entourés par

de la fibrose.

Aux lésions histologiques de base, stéatose, nécrose, inflammation, fibrose, peuvent être associées

d'autres lésions élémentaires : corps de Mallory (agrégats de filaments d'actine, fréquents au

cours de l'HA, non spécifiques mais évocateurs de l'étiologie) ; mitochondries géantes

(volumineuses mitochondries visibles au microscope optique) ; fibrose périveinulaire (fibrose

autour de la veine centrolobulaire) ; ballonisation cellulaire (hépatocytes de grande taille,

considérés comme en voie de destruction).

D'un point de vue clinique, la stéatose peut exister seule ou en association avec une HA ou une

cirrhose. La cirrhose peut être associée à une HA, et les HA sévères sont habituellement observés

chez les patients cirrhotiques.

Pour les anatomopathologistes, l'HA peut être classée en trois degrés de sévérité histologique :

mineure, modérée, majeure (Anonyme, 1981). En pratique clinique, et surtout aux États-Unis,

seule la forme sévère, ictérique, est qualifié d'hépatite alcoolique, sans doute en raison des

insuffisances diagnostiques qui seront évoquées plus bas. L'abréviation MAF utilisée ici désigne

l'ensemble des maladies alcooliques du foie.

2-GENERALITES SUR LE « KOUTOUKOU »

2.1-Définition de l'eau de vie« koutoukou »

Le « Koutoukou » est une eau de vie traditionnelle obtenue au départ par distillation de la sève du palmier à huile fermenté (Kouadio et al., 1986; Dano et al., 1988).

Ce produit alcoolique est distillé pratiquement dans toutes les régions du pays, à partir de la

fermentation d'extraits de matières végétales dont le vin de palme, de rhonier et d'un mélange

de sucre-eau-levure (Saccharomyces cerevisiae).

2.2-Production et consommation

Le « koutoukou » est alcoolisé et est obtenu après fermentation puis distillation. Cet alcool a également divers noms : « Koutoukou » en Côte d'Ivoire, « Sodébi » au Cameroun, « kill me

quiet » au Congo etc. La production de cette boisson est faite par les hommes qui la proposent

aux femmes qui, à leur tour, assurent sa vente sur les marchés et espaces dédiés. Des bistros

traditionnels, appelés "gbelèdromesneo Cote d'Ivoire, sont aménagés et tenus par des femmes ou

des coopératives de femmes pour la commercialisation de cette boisson.


Dans une étude réalisée par Cama ra et al. (2008), il a été montré qu'en raison de son coût peu

élevé, le « Koutoukou », faisait partie des boissons alcoolisées les plus consommées en Côte

d'Ivoire, surtout, après la dévaluation du francs CF A en janvier 1994.

Depuis lors, la paupérisation des couches sociales favorise la prolifération de cette liqueur

artisanale et sa substitution aux boissons alcooliques industrielles dont le prix de vente ne cesse

d'augmenter (Y ao, 2009).

2.3-Composition chimique

Les travaux réalisés par Camara (1998) révèlent que la toxicité du « koutoukou » est due à la forte teneur en méthanol et non à l'éthanol qui lui, est observé à l'état de trace. Aussi, les études

chromatographiques en phase gazeuse montrent que cette liqueur artisanale contiendrait en

moyenne 19,55 mg/1 de méthanol, 47 mg/1 de propanol et de nombreux alcools supérieurs non

identifiés à ce jour (Cama ra et al, 2004).

On peut aussi le fabriquer en ajoutant à l'alcool éthylique ou aux distillats, des arômes, des

sucres, certains produits édulcorants ou d'autres produits agricoles.

2.4-Importance du « koutoukou » dans la société ivoirienne

En Cote d'Ivoire, les résultats de l'enquête de Camara et al (2008) indiquent que les boissons

alcoolisées artisanales sont moins préférées que consommées; inversement. les boissons

alcoolisées industrielles sont plus préférées que consommées. La bière reste la boisson alcoolique

la plus prisée et la plus consommée. Un résultat important est que la consommation d'alcool est

plus élevée chez l'homme que chez la femme; cependant, ces dernières ont une

consommation d'alcool relativement élevée. Aussi, les ruraux ont le plus grand taux de

consommation d'alcool (essentiellement le« bandji »). Les citadins et les étudiants ont les mêmes

tendances à préférer et consommer plus la bière. En ce qui concerne le cas particulier du

koutoukou, selon un constat, sa consommation a baissé, certainement à cause des nouveaux

conditionnements de liqueurs industriel1es moins coûteuses sur le marché. Cependant, le

koutoukou reste la boisson alcoolisée la plus consommée par les alcooliques chroniques.

Les figures 2 et 3 présentent le diagramme de fabrication du koutoukou


FORMULATION

EAU (185L) ,sucre (SOkr ,Barrique de 200L

1 ère HOMOGENEISATION

Perle en 1is,lmin

FERMENT A TION 4----------ll

(Anaérobiose) pendant 7 jours

Ajout de 50kg

De levure

2ème HOMOGENEISATION

DISTILLATION

Sur feu vif durant lh 34 MIN

1 ALCOOL

60L de klntoukou

CONDITIONNEMENT

A froid dans différents bidons 30L

1 STOCKAGE

Figure 2: Diagramme de production de « Koutoukou » à base de Levure-sucre-eau

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie- et Biologie Moléculaire 9

EXTRACTION DU VIN DE PALME 230L , vin de palme

MISE EN FERMENTEUR Barrique 200L + bidon 30L

! FERMENTATION

(Anaérobie) durant 4-5 jours

! HOMOGENEISATION

Perle en bois pendant 1 min

+ lème DISTILLATION

200L de jus de fermentation sur feu vif pendant lb 21 min 60L de soda

• 2ème DISTILLATION

60L «soda»+ 30L de jus de fermentation sur feu vif pendant lh 15min

• ALCOOL koutoukou • CONDITIONNEMENT

A froid dans les bidons de 30L +

STOCKAGE

Figure 3 : Diagramme de production de « Koutoukou » à base de Vin de palme


3-GENERALITE SUR LA FERMENTATION

La fermentation alcoolique est une étape clé dans l'élaboration du Koutoukou. Au cours de ce

processus, les sucres sont, pour l'essentiel, convertis en éthanol et dioxyde de carbone. Mais de

très nombreux autres produits sont aussi synthétisés parmi lesquels certains jouent un rôle

important sur les propriétés sensorielles de l'alcool final. La souche de levure joue un rôle

majeur mais la composition du moût et le mode de conduite de la fermentation est aussi

très important.

En effet, le déroulement de la fermentation est le résultat des interactions entre la souche de

levure, la disponibilité des éléments nutritifs dans le moût et le mode de contrôle de la

fermentation.

3.1- Définition de la fermentation

La fermentation a été utilisée depuis longtemps pour répondre aux préoccupations de

conservation de denrées alimentaires. Elle consiste en une transformation provoquée, orientée ou

non de matières organiques en des produits de caractéristiques physicochimiques, nutritionnelles

et organoleptiques améliorées sous l'action des micro-organismes.

Au plan biochimique, la fermentation est un processus d'oxydoréduction au cours duquel des

composés organiques, source d'énergie et de carbone servent de donneurs et d'accepteurs

d'électrons et de protons (Guiraud, 1998).

Des techniques ont permis d'optimiser et de mieux maîtriser les différentes étapes de la

fermentation qui aboutiront au développement de véritables industries modernes.

3.2-Fermentation du vin de palme

En général, il existe huit types de fermentations dont trois interviennent simultanément dans la

fermentation du vin de palme à savoir la fermentation alcoolique, la fermentation lactique et la

fermentation acétique.


3.2.1- Fermentation alcoolique

Les matières pouvant servir de base à la transformation alcoolique sont nombreuses et variées.

Les levures transforment les sucres en alcool avec dégagement de gaz carbonique (produits

principaux) et en plusieurs autres produits bien que présents en faible quantité (Scriban,

1988). Ce principe est à la base de la production de vin alcoolique à partir des fruits sucrés. La

réaction à lieu selon l'équation de Gay Lussac:

C6H1202+ 2 ADP

Glucose + 2 ADP

2 C02 +2 C2H50H+2 ATP

éthanol+2 ATP (source d'énergie)

3.2.2- Fermentation lactique Les agents responsables sont les bactéries lactiques. Les sucres utilisés par ces bactéries sont

fermentés essentiellement en acide lactique. Lorsque la fermentation est homolactique, la

production de lactate passe par la voie d'Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). Les bactéries

intervenant dans cette phase sont les genres Streptococcus, Pediococcus et les espèces du genre

Lactobacillus (Lactobacil/us leichmanii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckiîy

Lorsque la fermentation est hétérolactique, la voie employée est celle des pentoses phosphates

et aboutit à la production de lactate, d'éthanol et éventuellement d'acétate. Cette fermentation

est réalisée par les genres Leuconostoc et Lactobacillus (Leveau, 1993). La production d'acide

lactique se fait par la voie homolactique selon !"équation suivante :

----- CH3CHOHCOOH + 2 ATP Glucose acide lactique

3.2.3-Fermentation acétique Elle est assurée essentiellement par les genres Gluconobacter et Acetobacter. Cette

fermentation est à la base de la production du vinaigre. Par ailleurs, le genre Bifidobacterium dont

la plupart des espèces produisent plus d'acide acétique que d'acide lactique intervient dans

ce type de fermentation (Leveau, 1993). La production d'acide acétique nécessite des

bactéries ayant la capacité de transformer l'éthanol en acide acétique. Par deux oxydations

successives, ces bactéries tirent l'énergie nécessaire à leur métabolisme. La réaction a lieu selon

l'équation:

C2H50H + 02 ---------•CH3COOH + H20+ 494 KJ

Ethanol acide acétique

BLE DOUM OU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire 12

3.3- Interactions levures-bactéries

Les interactions entre levure (Saccharomyces cerevisiae) et bactérie lactique peuvent poser des

problèmes de réalisation de FML. En effet, Saccharomyces cerevisiae produit de l'éthanol,

du dioxyde de soufre (S02) et des acides gras à courte et moyenne chaîne qui peuvent

inhiber les bactéries lactique. De plus, l'utilisation des acides aminés par la levure comme

source d'azote pendant les premières étapes de la fermentation alcoolique peut compliquer la

croissance ultérieure des bactéries lactiques (Costello et al, 1983). L'inhibition des

bactéries lactiques décroît fortement en fin de fermentation alcoolique, vraisemblablement du

fait de la mortalité levurienne. Toutefois, il peut être intéressant d'inoculer les bactéries

lactiques avant la fin de la fermentation alcoolique de façon à profiter d'un environnement

plus favorable car moins riche en éthanol, et contenant plus de nutriments.

4-GENERALITES SUR LA FLORE MICROBIENNE RECHERCHEE

Tenant compte de la littérature, le mout est une suspension de micro-organismes en particulier

levures et bactéries provenant de son environnement immédiat. Il serait préjudiciable de ne pas

mentionner les micro-organismes qui témoignent de la mauvaise qualité hygiénique du mout

notamment les entérobactéries.

4.1-Levures Les levures interviennent dans la fermentation alcoolique, elles peuvent influençer ainsi les

caractères et la flaveur des boisson alcoolisées (Ostergaard et al., 2000). En effet, les

Brettanomyces sont décrits comme des agents de contamination de nombreux produits de

fermentation incluant le vin, le cidre, la bière, le kombucha, le kefyr, la téquila, etc. (Morrissey et

al., 2004 ; Silva et al, 2004 ; Teoh et al., 2004. Diverses études ont été menées sur la microflore

du vin de palme et ont permis de révéler une diversité de genres et d'espèces de microorganismes.

En effet, la sève fraîchement extraite du vin de palme est fortement contaminée par divers

microorganismes. Cette sève est un milieu riche en source de carbone et en minéraux qui favorisent

la croissance d'une flore microbienne diversifiée.

Les levures dont l'espèce dominante est Saccharomyces cerevisiae (Ukwuru et Awah, 2013) initient

la fermentation. Elles dégradent les sucres pour la production d'alcool (réaction 1) qui atteint des

concentrations évoluant jusqu'à 5 % au 8ème jour de fermentation.

BLE DOUM OU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire 13

4.2- Bactéries lactiques

Bien que participant à la fabrication de certains types de boissons alcoolisées, les bactéries

lactiques peuvent cependant faire partie de la flore d'altération de ces produits. Dans les vins, les

phénomènes de "piqûre lactique" (augmentation de l'acidité en fin de fermentation),

d'augmentation de la viscosité (due à la production de polysaccharides) et de production de

saveurs indésirables ont été reliées à la présence de bactéries des genres Oenococcus,

Leuconostoc, Pediococcus et Lactobacillus (Lonvaud-Fnnel, 1999). Dans la bière, les genres

Lactobacillus (principalement représenté par les espèces Lb. brevis et Lb. lindneri) et

Pediococcus peuvent être à l'origine d'accidents de fermentation (Sakamoto et Konings, 2003).

Ces microorganismes notamment les Lactobacillus peuvent entrainer une odeur de « souris » due à la synthèse de molécules te11es que l'acétylhydropyridine (Vaugban et al., 2005) et une flaveur

de « buffet » due à la production de diacétyl par Lactobacillus casei, Pediococcus damnosus, et Pediococcus claussenii (Kallmeyer, 2003).

Par ailleurs, certains métabolites synthétisés par des bactéries lactiques et pouvant avoir des effets

délétères, peuvent être présents dans ces boissons alcoolisées sans être pour autant détectables au

niveau sensoriel, comme par exemple les amines biogènes (tyramine et histamine, putrescine,

cadavérine, etc.) (Lasekan et Lasekan, 2000). Ce sont des composés azotés, dérivés de la

décarboxylation de certains acides aminés. Lorsqu'elles sont absorbées en trop grandes quantités,

elles peuvent être responsables de maux de tête, hypotension, crampes abdominales, diarrhées et

vomissements (Silla, 1996). Si certaines levures Saccharomyces peuvent produire des amines

biogènes, tout comme la levure d'altération Brettanomycesbruxellensis (Caruso et al., 2002), les

bactéries lactiques sont les principaux microorganismes responsables de la production d' amines

biogènes dans les aliments (ten Brink et al, 1990 ; Lonvaud-Funel, 2001). Les plus importants

producteurs sont les lactobacilles, les pédiocoques mais aussi de nombreux Oenococcus oeni

(Lonvaud-Funel et Joyeux, 1994).

4.3-Entérobactéries La famille des Entérobactéries comprend 100 espèces actuellement (Denis et al., 1998). Les

genres les plus souvent rencontrés sont Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia,

Klebsiel/a, Morganel/a, Proteus, Serratia, Shigel/a, Yersinia, Providencia, Salmonella. Ce sont

des bacilles à Gram négatif, immobiles ou mobiles grâce à une ciliature péritriche. Ils sont aéro

anaérobies facultatifs et se développent sur milieux nutritifs (ordinaire). Ils sont dépourvus

d'oxydase et ont la faculté de fermenter le glucose, mais aussi de réduire les nitrates en nitrites.

Les différences entre les nombreux genres et espèces viennent de critères plus précis, comme la


fermentation des différents sucres, la production ou non de sulfure, la présence ou l'absence

d'enzymes du métabolisme (désaminases, décarboxylases). Les Entérobactéries sont des hôtes du

tube digestif de l'homme et de nombreux animaux où ils sont retrouvés soit à l'état de pathogène,

soit à l'état de commensaux (Denis et al., 1998). Cependant cette localisation digestive n'est

pas exclusive. On les retrouve également dans l'environnement (sols, eau) où ils participent à

la dégradation des matières organiques, à l'altération des plantes suite à des nécroses, à

une dégénérescence ou à un ramollissement (Denis et al., 1998).

Le dénombrement des entérobactéries dans l'aliment témoigne du non-respect des Bonnes

Pratiques d'Hygiène, Bonnes Pratiques Fabrication (problème de respect des règles d'hygiène,

témoins de contamination fécales compte tenu de leur écologie, indicateurs de défaillance

technologique).On distingue trois genres et une espèce considéré comme potentiellement

pathogène avec pour chef de fil Salmonella impliqué dans près de 82% de TIAC (Anonyme 3,

2004), Shigella, Yersinia et des sérotypes d' Escherichia coli) . Quant aux autres espèces elles sont

considérées comme des pathogènes opportunistes (Denis et al., 1998). Certains genres tels

que Salmonella et quelques sérovarts d' Escherichia coli ont un pouvoir entéro- invasif et

pénètrent dans les cellules de la muqueuse intestinale créant ainsi des diarrhées sanguinolentes

tandis que d'autres produisent des toxines telles que la shiga-toxine (Shigella dysentériae)

responsable de diarrhée, de colite hémorragique qui peut se compliquer en atteinte nerveuse en

modifiant la formule sanguine (Denis et al., 1998).

5-DESCRIPTION DU RAT BLANC

Le rat blanc Wistar albinos, qui est une espèce génétiquement sélectionnée est issue par

croisement, de race albinos. C'est un rongeur nocturne, omnivore et coprophage. Le pelage du

jeune rat blanc est soyeux mais devient progressivement rugueux et décoloré avec l'âge. Il

possède une large tête, de petites oreilles des yeux rouges globuleux et une petite queue. Il se

reproduit pendant toute l'année et la gestation dure 21 jours. Sa durée de vie est de 2 à 3 ans

(Omari et al 2011). Le rat à la naissance pèse à peu près 5 grammes, mais est très actif, il

atteint rapidement 35-50 grammes en trois semaines. Le mâle adulte pèsera 400-500 grammes

alors que la femelle adulte pèsera environ 100 grammes de moins. Après la souris

d'expérimentation, le rat est le rongeur d'expérimentation le plus utilisé comptant pour à peu

près 20 % du nombre total de rongeur utilisés en recherche. Depuis les années 1934, le rat a

été utilisé dans presque tous les aspects de la recherche biomédicale et comportementale et de la

toxicologie (Omari et al 2011).


PARTIE II: MATERIEL ET

METHODES

1-MATERIEL

1.1- Matériel biologique

1.1.1-Le Koutoukou

Le matériel biologique est constitué de koutoukou, une eau de vie de production locale, obtenue

soit par fermentation de vin de palme (Elaeis guineensis], soit par fermentation de sucre

commerciale. La figure 4 présente un aspect de cette boisson, au cours d'un processus de

conditionnement.

1.1.2- Le moût. Le moût est le mélange eau-sucre-levure boulangère (SAF-Levure), dont la fermentation conduit

à l'obtention de koutoukou. Le vin de palme utilisé pour la production de koutoukou, peut être

également considéré comme moût

Figure 4: Conditionnement de Koutoukou en bouteille

Figure 5: Moût de vin de palme pour la production de koutoukou

1.1.2- Le rat blanc L'étude a été réalisée sur des rats blancs Wistar albinos mâles, produits localement au niveau de

l'animalerie du département de biologie animale de la faculté des sciences de la nature et de

l'Ecole Normal Supérieure (ENS).

Figure 6: Le rat blanc (Wistar albinos


2-Métbodes

2.1-AnaJyses microbiologiques

2.1.1-Échantillonnage et suivi du stockage

Des échantillons de 50 ml de moût issu de vin de palme et de mélange levure-sucre-eau

ont été prélevés à l'aide des flacons stériles juste avant la production chez deux

producteurs-vendeurs dans deux localités respectivement la commune d' Abobo et celle de

Tiassalé. Les échantillons sont conservés dans une glacière contenant de la glace et transportés

au laboratoire dans un temps n'excédant pas 2h, pour analyse. Une fois au laboratoire, un volume

de 15 ml de chaque échantillon est prélevé dans un erlenmeyer et stocké à la température

ambiante (25-30°C) pour servir au dénombrement de la flore de contamination.

Deux autres échantillons d'un litre de vin de palme chacun sont prélevés dans les mêmes

conditions et stockés. Toutes les 24 heures des prélèvements de cette boisson stockée sont

effectuées pour suivre l'évolution de la flore de fermentation pendant 72 heures.

2.1.2- Dénombrement de la flore microbienne

2.1.2.1-Préparation des dilutions décimaJes

Après ouverture de manière aseptique et homogénéisation des échantillons conservés à la température ambiante et au réfrigérateur, 5 ml de chaque échantillon sont introduits dans un tube à

essai et une série de dilutions décimales de 10-1 à 1 O""° est réalisée en utilisant de l'eau peptonée stérile (Bio-Rad, France). Ainsi 1 ml d'échantillon est introduit à la pipette dans un tube contenant

9 ml d'eau peptonée stérile. Le tube est mis en agitation pendant 20 secondes au moyen d'un

agitateur vortex. A partir de la première dilution (décimale). 1 ml est transféré dans le tube

suivant contenant 9 ml d'eau peptonée stérile, ce qui constitue la dilution 10-2. Après 20 secondes

d'agitation, l'opération est répétée autant de fois jusqu'à la dilution 10-6.

BLEDOUMOU Keffi Nicaise Master 2 /Microbiologie et Biologie Moléculaire- 18

2.1.2.2- Recherche et dénombrement des bactéries lactiques

Le milieu MRS (Man Rogosa and Sharp ; Biokar Diagnostics, France) a été utilisé pour la

recherche et le dénombrement des bactéries lactiques. Un volume de 0, 1 ml de la suspension mère

ou des dilutions décimales est utilisé pour ensemencer par étalement, le milieu gélosé coulé en

boîtes de Pétri. L'incubation a été réalisée à 30°C pendant 48 h. Au terme de la durée

d'incubation, les colonies blanchâtres et naines sont comptées et les boîtes contenant entre 15 et

150 colonies sont considérées.

2.1.2.3- Recherche et dénombrement des levures

Les levures ont été isolées sur le milieu gélosé Sabouraud au chloramphénicol (Biorad, France)

préalablement préparé suivant les consignes du fabricant et coulé dans des boites de Pétri. Les

échantillons dilués sont ensemencés en double sur la surface de la gélose, par étalement de 0,1ml

de l'inoculum. Les boîtes sont ensuite incubées à 30°C pendant 48 h. Les colonies

caractéristiques sont bombées, lisses, laiteuses, de diamètre 0,5 à 2 mm et de bords réguliers, avec

une odeur de pain. L'observation microscopique montre des cellules de forme ovoïde ou

sphérique et ayant pour certaines, des bourgeons. Les colonies sont comptées pour les boîtes

contenant 15 à 150 colonies.

2.1.2.4-Recherche et dénombrement des entérobactéries La gélose glucosée biliée lactosée au cristal violet (VRBLG) a été utilisée pour le dénombrement

des entérobactéries selon la Norme AFNOR NF ISO 21528-2:2004. L'ensemencement a été

effectué par introduction de 1 ml de suspension mère ou de dilution décimale dans une boîte de

Pétri vide, auquel sont additionnés 12 à 15 ml de la gélose en surfusion à 45°C. Le mélange est

homogénéisé par agitation circulaire et alternative horizontales. Après solidification de la gélose

dans la boite de pétri, une deuxième couche d'environ 4 à 5 ml du même milieu y a été coulée.

Deux boites ont été coulées par dilution retenue. L'incubation s'est faite à 37°C pendant 24

heures et les boites de pétri contenant 15 à 150 colonies rouge de diamètre 0,5 à 2 millimètres ont

été retenues et la numération de ces clonies a été effectuée.


Tableau 1 : Conditions de culture selon les germes recherchés

Micro-organismes Température Durée d'incubation Milieu de culture

recherchés d'incubation

Levures 30°c 48h Sabouraud

Bactéries lactiques 30°c 48h M.RS

Entérobactéries 31°c 24h VRBLB

2.1.2.6- Expression des résultats

Le nombre N de micro-organismes présents dans l'échantillon d'essai et exprimé en UFC/ml est

calculé sous forme de moyenne pondérée de deux dilutions décimales successives en utilisant

l'équation suivante :

N = d X (nl rc '2)

où:

L C est la somme des colonies comptées sur les boîtes conservées après deux dilutions décimales

successives, dont une au moins contient au minimum 10 colonies ;

V est le volume d'inoculum placé dans chaque boîte, en millilitres ;

d est la dilution correspondant à la première dilution retenue ;

nl est le nombre de boîtes de Pétri à la première dilution considérée ;

n2 est le nombre de boîtes de Pétri à la deuxième dilution considérée.

Les résultats ont été arrondis au deuxième chiffre significatif seulement au moment de la

conversion en UFC/ml et rapportés sous la forme d'un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multipliés

par la puissance 10 appropriée.


2.2- Analyses physico-chimiques du koutoukou

2.2.1- Détermination du pH

Le pH a été mesuré directement sur 10 ml de chaque échantillon à l'aide d'un pH-mètre.

L'étalonnage de l'appareil est fait systématiquement avant les mesures du pH à l'aide de deux

solutions tampon à pH=7 et pH=4. La mesure s'effectue en plongeant l'électrode dans 10 ml

d'échantillon. La valeur du pH s'affiche sur l'écran digital du pH-mètre. Pour chaque échantillon,

l'opération est répétée trois fois et la moyenne des valeurs est retenue.

2.2.2-Dosage de l'alcool du koutoukou Le dosage de l'alcool du koutoukou a été réalisé par la méthode d'oxydation Nitro-chromique

(Richer et al., 1973). Dans un erlenmeyer (bouchant émeri) de 150 ml. sont mis 20 ml de distillat

(koutoukou) et 20 ml de solution nitro-chromique de 0,05 N. et attendre 30 mn pour que

l'oxydation de l'alcool soit complète. Ensuite, 10 ml de solution de KI à lOOg/1 ont été ajoutés.

Après 1 mn, l'iode formé est dosé par une solution de thiosulfate à 0,05 N.

Pour Je témoin, 20 ml de distillat sont remplacés par 20 mJ d'eau distillée et le dosage ne doit pas

se faire en présence de lumière vive qui provoque l'oxydation de l'iodure en iode, donc une

libération de composé supplémentaire.

2.3-Evaluation du pouvoir toxique du koutoukou sur des rats

2.3. 1-Cboix de l'animal

Le rat blanc Wistar albinos a été utilisé pour la réalisation de l'étude toxicologique. Le choix de

ce modèle animal a été fait pour plusieurs raisons : il 'agit d'animaux dociles et faciles à

manipuler, peu agressifs, facile d'entretien, résistants vis-à-vis de diverses contaminations et

mode! animal le mieux adapté et le plus utilisé pour des études similaires citées par la littérature

Aneh et al .(1999).

2.3. 2- Entretien des animaux

Dès leur réception, les rats sont placés aléatoirement en 3 groupes dans des cages en matière

plastique ayant un couvercle en acier inoxydable de dimensions (36cm x25cm).Une épaisse

couche de copeaux est déposée au fond des cages, renouvelée tous les 2 à 3 jours et plus souvent


pour les animaux en cours d'expérimentation. Les animaux ont libre accès à l'eau et à la

nourriture qui se compose de croquettes fournies par une société Agroalimentaire. Avant leur

utilisation les rats subissent une période d'adaptation de 2 semaines au niveau de l'animalerie à

température constante (25 ± 2) °C et soumis à un cycle de lumière/obscurité de 12/12h pour le

respect de leur horloge biologique.

Figure 7: Condition d'élevage des rats

2.3.3- Constitution des lots des rats

L'échantillon se compose de 15 rats mâles pesant entre 50-230g (au début de

l'expérimentation), divisé en 3 lots selon le tableau

Tableau 2 : Constitution des lots des rats

Lotl Lot2 Lot3 n=5 n=5 n=5

15,2 ml/kg Eau distillée Ktk de levure Ktk vin palme

Les rats ont été marqués à l'oreille et ont été acclimatés une semaine avant de commencer l'étude.

2.3.4- Pesée

Les animaux sont pesés à l'aide d'une balance de précision (Denver SI-602) à des moments

fixes avant le gavage (début de la manipulation) et le lendemain après le gavage jusqu'au jour de

dissection des rats.


2.3.5- Principes internationaux de la bioéthique

Les principes directeurs internationaux pour la recherche biomédicale sur animaux, adoptés en 1985,

ont été établis par le conseil pour l'organisation internationale des sciences médicales (Council for

International Organization of Médical Sciences C.I.O.M.S.) .Elles résultent de la collaboration

d'experts de l'organisation mondiale de 1a santé avec la communauté biomédicale. Ces principes ont

ensuite été à la base des réglementations américaine et européenne .

De plus, les tests de toxicité doivent être effectués conformément aux lignes directrices de la

"International Conference on Harmonization of technical requirement for registration of

pharmaceuticals for human use" (ICH Conférence internationale sur l'harmonisation des critères

techniques relatifs à l'enregistrement des médicaments pour l'utilisation humaine)

2.3.5.1-Réglementation européenne

Les pays de l'union européenne sont obligés d'intégrer dans leurs réglementations, les

dispositions de la directive 86/609/CEE. Ce règlement stipule que les animaux devant faire l'objet

d'expérimentations doivent être sélectionnés selon des critères quantitatifs bien établis ; ils doivent

être bien soignés et toute souffrance inutile doit leur être évitée, chaque fois que cela est possible.

23.6- Exposition des rats au Koutoukou

L'expérience a été effectuée sur 15 rats de sexe mâle de souche Wistar albinos, de

masse corporelle comprise entre 137 et 131 g. Les rats sont regroupés par lots de trois. dans

l'animalerie de l'unité de biologie cellulaire de l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire

(IPCI), dans un environnement hygrométrique stabilisé par un hygromètre.

Les animaux sont répartis en trois (3) lots de cinq (5) animaux chacun, dont un lot témoin (lotl)

recevant de l'eau distillée et deux lots d'essai (Iot2, lot3). traité l'un avec du koutoukou obtenu

par fermentation de vin de palme et l'autre obtenu par fermentation de sucre commercial. Le

poids de chaque animal est évalué après le traitement. Le lot témoin (de référence) reçoit de

l'eau distillée pendant que les lots traités (lotl) et (lot2) reçoivent 15,2 ml d'alcool par kg

de rat (I5,2ml/kg) et respectivement de concentrations de 33% de koutoukou de vin de palme

et 41 % de koutoukou de levure-sucre-eau. La dose choisie est extraite des travaux de Wei-wei

Xing (2011). Tous les traitements sont faits par gavage pendant sept (7) jours. Chaque animal a

accès ad libitum à la nourriture et est pesé chaque jour avant le gavage.

2.4.- Analyses statistiques des données

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne

± SD. Les comparaisons intergroupes témoins et traités sont réalisés par un Test t

Student. Une valeur de p= 5% est considérée comme significative.

~

~ ~

t:, ~

8 ~ 00 ~

•• ~

~ 00 00 00 ~

~ 0 ~ z ~ > ~ 00 ~

~

1-RESULTATS

1.lCbarge microbienne du moût

1.1.1-Evolution de la charge en levures

Les charges en levures du vin de palme varient au cours du stockage à la température ambiante

(Figure 8). Ainsi, pour le vin de palme du site d' Abobo la charge en levures croit pendant 48

heures de stockage pour atteindre 6, 79 log (UFC/ml) et diminue légèrement pendant le dernier 24

heures pour atteindre 6,68 log (UFC/ml). Pour le vin de palme issu de Tiassalé, la charge en levure

varie plus que celui d'Abobo. Elle passe de 5,65 Iog (UFC/ml) à l'état frais à 7,51 log (UFC/ml)

durant les 48 heures et on obtient une légère baisse à 72h pour atteindre 7, 17

8

7

6 - :::s ,:::- 5 ;> E - 4

1

-+-SITE A 3

---SITE B ]

1

0 0 24~ 48 72

Figure 8: Évolution de la charge en levures au cours du stockage du moût

Site A : Abobo

Site B : Tiassalé


1.1.2-Evolution de la charge en bactéries lactiques

Les charges en bactéries lactiques dans le vin de palme frais sont de 4,79 log (UFC/ml) pour le

vin de palme issu d' Abobo et 4,69 log (UFC/ml) pour le vin de palme de Tiassalé. Les charges

en bactéries lactiques diminuent pendant les 24 premières heures de stockage pour atteindre 4,49

log (UFC/mI) puis amorce une phase de croissance après 48b pour atteindre 5, 17 log (UFC/ml) et

chute brusquement pendant Jes dernières heures pour atteindre une charge de 1,11 Jog (UFC/.mJ).

Dans les échantillons prélevés à Tiassalé la charge varie de 4,69 log (UFC/ml) à 5,43 log

(UFC/ml) après 24h puis diminue progressivement entre 48h et 72h pour atteindre 2,46 log

(UFC/ml). La baisse est plus marquée entre 48 heures et 72 heures pour les deux échantillons.

fi

i- G 1 .r:. r

0 l.8

Temps (heures)

-+-SITT /\

-SITTR

Figure 9: Évolution de la charge en bactéries lactiques au cours du stockage du mout prélevé auprès des distillateurs traditionnelles

Site A : Abobo

Site B : Tiassalé


1.1.3- Charges moyennes en entérobactéries du moût

Les entérobactéries ont été dénombrées dans le moût avec une charge spécifique élevée. Cette

charge est plus importante dans le moût de levure-sucre-eau avec une moyenne de 4,37

log(UFC/ml) par rapport à celui de vin de palme dont la moyenne est de 4,33 log (UFC/ml). Ces

valeurs ont été consignées dans le tableau 5 et ne sont pas significatives.

Tableau 3: Charge moyenne en entérobactéries des échantillons collectées

Moût Abobo

Charge en Levure-sucre-eau 4,43

entérobactéries ( Abobo)

Vin de palme 3,64

log(UFC/ml) (Tiassalé)

Tiassalé Moyenne

4,30 4,37±0,5

4.60 4,32±0,3

1.1.4- Qualité microbiologjque du moût

Le moût de distillation du koutoukou est un produit indigène qui provient de la fermentation.

C'est un produit non industrialisé, par conséquent, aucune réglementation microbiologique

n'existe. Ainsi, une charge élevée en entérobactéries obtenu après analyse indique une qualité

microbiologique non satisfaisante du moût par rapport à la norme.

1.2-Caractères physico-chimiques du koutoukou Les différents échantillons prélevés dans les villes d' Abobo et de Tiassalé ont été soumis à

quelques analyses physico-chimiques dont la mesure du pH et le taux d'alcool. Les valeurs de ces

paramètres sont présentées dans le tableau 4. La mesure du pH a révélé que le koutoukou de

levure-sucre-eau extrait à Abobo est plus acide que celui de Tiassalé. Elle est de 2,92 à Abobo

contre 3,06 à Tiassalé. Quant au taux d'alcool, les valeurs sont de 41 ° pour le koutoukou à base

de levure-sucre-eau pour l'échantillon d'Abobo et 33° pour le koutoukou à base de vin de palme

obtenu à Tiassalé.


Tableau 4: Paramètres physico-chimiques du koutonkoo en fonction du substrat

Koutoukou Taux d'alcool LepH

-- A base de levure-sucre-eau 41° 2,92 (Abobo) A base de vin de palme 33° 3,06 (Tiassalé)

1.3- Evaluation de la toxicité

1.3.1- Évolution du poids corporel

La variation du poids corporel moyen des rats des 3 lots est représentée par la figure 10

( chaque valeur correspond à la moyenne).

Les résultats obtenus montre un gain régulier du poids corporel des rats normaux témoins, les

valeurs moyennes du poids corporel passent de 136,85g en début d'expérimentation à 156,89g

en fin de cette étude. Avant Je gavage, il ya eu une augmentation du poids corporel chez les rats.

Les résultats obtenus dans notre étude ont montré que le gavage induisait une perte

considérable du poids corporel chez le lot (3) traité au koutoukou de levure de l'ordre de

130,94 à 108, 71 g. Egalement, le lot (2) qui recevait du koutoukou à base de vin de palme a

subit pendant les sept (7) jours d'expérimentation une diminution du poids corporel de

l'ordre de 124,06g à 110,28g. Toutes ces observations restent statistiquement très hautement

significatives (plu value< 0,001).

L'état pbysico-émotionnel était aussi affecté. En effet, les rats gavés au koutoukou étaient plus

calme, moins agitées, maigres, semblaient toujours endormies, donnaient le sentiment de vouloir

s'enfuir de la cage, ne mangeaient presque plus et avaient tous le hoquet à la fin de

l'expérience. Ce qui était le contraire des rats abreuvés avec de l'eau distillée. Ils étaient plus

mobiles, mangeaient abondamment et étaient déstressés.

BLEDOUMOU Koffi Nicaise Master 2 /Microbiologie-et Biologie Moléculaire 29

Variation clJ poids corporel (g) des trois Jas de rat en fonction clJ 1ml)S (.b.rs)

100

100

140

12) ë; r: 1 00

40

ai 0 0 1 2 3 4 5 6 7

Figure 10: Variation du poids corporel moyen (g) des 3 lots de rats en fonction du temps.

1.3.2-Effet comparé du koutoukou de vin de palme et de koutoukou de levure

Avant l'alcoolisation au Koutoukou de levure-sucre-eau et au Koutoukou de vin de

palme, tous les rats soumis à l'épreuve de pesé durant une semaine ont eu un gain de poids.

Ainsi, les rats témoins et ceux destinés à la consommation des deux types de boissons

alcooliques, ont des performances presque identiques. A ce sujet, la comparaison entre les

témoins et les rats devant consommer le koutouk:ou de levure n'est pas significative. De

même, la différence entre les témoins et les sujets destinés à la consommation du Koutoukou

de vin de palme n'est également pas significative. Aussi, il n'y a pas de différence

significative entre les deux groupes destinés à la consommation

Après l'alcoolisation au koutoukou de levure et au Koutoukou de vin de palme, la Figure 10

montre que les performances des deux groupes tests <liftèrent très hautement significative (p<

0,001) de celle des témoins. En effet, entre les rats gavés au koutoukou de levure-sucre-eau et

les rats témoins, la différence de prise de poids est très significative. De même, cette différence

entre les traités au Koutoukou de vin de palme et les témoins, est également très significative.


Les rats témoins réussissent à augmenter de poids durant la période d'expérimentation, tandis

que les deux groupes de rats tests ne réussissent pas mais plutôt ont une perte considérable de

leurs poids corporel.

La chute brutale de la courbe au sixième jour s'explique par le fait qu'au quatrième jour

de l'expérimentation, deux rats sont morts et qu'aux cinquièmes jours le poids des rats gavés

au koutoukou de levure a considérablement chuté ce qui a permis le sacrifice des rats. Par

contre les rats traités au koutoukou de vin de palme ont subi une seule perte (au ième jour)

pendant les sept jours.

Le Koutoukou à base de levure-sucre-eau diffère de celui de vin de palme par son taux

d'alcool élevé ( 41 °) et son pH très acide (2,92) et son effet plus persistant sur les rats entrainant

un forte chute de poids (21,7g) par rapport a celui de vin de palme (13,78 g). Le Koutoukou de

par sa composition chimique particulière, due certainement à son mode de production

artisanale, aurait donc un effet néfaste sur les rats.


2- Discussion

Les résultats montrent qu'au cours de l'altération du vin de palme, la flore lévurienne

est dominante par rapport aux autres flores fermentaires notamment les bactéries lactiques et

les bactéries acétiques. Cela pourrait se justifier par le fait que les produits fermentés

contiennent de nombreuses levures responsables de la fermentation alcoolique et de certaines

propriétés organoleptiques, mais aussi du fait que le processus de production du vin de palme

serait propice à l'entretien de la charge levurienne (Jyoti, 2010). Au cours de la fermentation,

la charge en levures du moût augmente en moyenne d'une unité log (UFC/ml) dans un

premier temps, mais cette variation n'est pas significative et ensuite cette charge baisse après

48h. Cette baisse de charge des levures, peut s'expliquer par l'action combinée de produits de

fermentation tels, l'acide acétique, les acides gras et l'acétaldebyde, éventuellement présents

dans le milieu comme l'ont précédemment rapportés certains auteurs (Ludovico et al., 2001;

Fleet, 2003). De plus, à la suite de la consommation et l'épuisement de certains facteurs de

croissance notamment les acides aminés et les vitamines, des levures plus exigeantes

pourraient être inhibées. Cette inhibition entrainerait la croissance ultérieure d'autres espèces.

Selon Fleet (2001) au cours de la fermentation, une grande quantité de cellules meurent et

relarguent les acides aminés et les vitamines qui favorisent la croissance d'autres espèces. Les

études plus récentes de Médina et al. (2012) ont montré que le ralentissement de la

fermentation des levures S. cerevisiae était dû à la compétition pour les nutriments.

Les bactéries lactiques dont la charge initiale est de 4,69-4,79 log (UFC/ml) diminuent après

48h et atteignent la charge de 1,11-2,46 log (UFC/ml) après 72h de fermentation. La

diminution progressive des bactéries lactiques pourrait être due au fait que la modification des

conditions physico-chimiques, notamment la production d'éthanol résultant de la fermentation

alcoolique, exerce une pression sélective vis-à-vis des bactéries. Les résultats obtenus sont en

accord avec ceux de Fleet (2001). Selon cet auteur, au cours d'une fermentation alcoolique

prolongée, certaines bactéries meurent jusqu'à un niveau non détectable. Lonvaud-Funel

(1992) a rapporté que dans le vin de palme, au cours de la fermentation alcoolique, une

sélection naturelle des différentes espèces de bactéries lactiques s'opère progressivement et à

la fin de la fermentation alcoolique, seules les espèces les plus résistantes au milieu alcoolisé

persistent. D'autres auteurs ont rapporté que l'éthanol et le S02 qui sont des produits du

métabolisme levurien, sont responsables de l'inhibition de Lactobacillus (Carreté et al.,

2002; Mendoza et al., 2010). Toutefois d'autres produits du métabolisme levurien tels que


les acides gras sont des puissants inhibiteurs de la croissance des bactéries lactiques

(Edwards et al., 1990).

A côtés de ces germes, pour la plupart d'intérêt technologique, se trouvent des germes de

contamination. La charge moyenne en entérobactéries est respectivement de 4,4 log (UFC/ml)

pour le moût de levure-sucre-eau et 4,3 log (UFC/ml) pour celui de vin de palme ; ce qui

indique une qualité microbiologique non satisfaisante. La présence des entérobactéries dans le

moût s'expliquerait par un défaut d'hygiène notamment une contamination plus récente qui

peut être d'origine fécale, environnementale ou par le matériel d'extraction du vin de palme.

Elle pourrait également être liée aux insectes, particulièrement les mouches attirées par le

sucre et qui pourraient provenir des dépotoirs d'ordure non loin des lieux de fabrication. Selon

Heller (1981) et Amoa-Awua et al. (2007), ces insectes attirés par Je sucre déposeraient ces

microorganismes sur les bords des récipients et par conséquent, lors du service contamine le

moût. Les résultats obtenus, corroborent avec ceux de Laurent Massini (2011) qui indique

que ces microorganismes n'ont aucun rôle dans la fermentation mais tirent profit du moindre

facteur favorisant pour contaminer le moût et altérer ses qualités. Ces facteurs peuvent être, le

contact ou l'exposition prolongée du moût à l'oxygène, le manque d'hygiène lors des

manipulations et Je déséquilibre dans la composition. Il en résulte des défauts de fermentation,

une altération des caractéristiques organoleptiques, une réduction de la teneur en alcool et de

la durée de conservation du produit final.

L'étude a également permis d'aprécier in vivo, l'effet du koutoukou sur la masse (poids)

corporelle des rat.s. Lors de l'expérimentation, les rats à qui ont été administrés à l'eau

distillée se portaient bien et cela s'expliquait par le gain de poids durant la période

d'observation. Par contre, les rats qui ont été traités au koutoukou étaient tous affaiblis ; ce

qui s'est traduit par une perte de leur poids total (P < 0,0001). Le résultat obtenu traduit que

le koutoukou a eu un effet réducteur du poids corporel. La perte de poids ainsi constatée est

une conséquence de la dénutrition survenant chez les rats et pourrait s'expliquer par la

diminution de la masse osseuse (ostéoporose) et l'augmentation du risque de fracture selon

Preedy et al (2001). La perte de poids peut également s'expliquer par le fait que l'alcool

déshydrate l'organisme et perturbe le contrôle de l'équilibre hydrique, ce qui conduit

à une élimination d'eau excessive. Ces résultats sont en accord avec ceux de Nasrallah et

al. (2007) qui ont montré que l'administration excessive d'alcool, n'entraîne pas de gain

de poids. Ils ont aussi noté que les effets de l'alcool sur le poids sont dépendants de la

richesse de la ration alimentaire.


Ainsi, chez le rat, la substitution des glucides par de l'alcool entraîne une perte de poids

comme chez l'homme.

Outre le poids, les rats gavés étaient moins agitées et manifestaient des troubles cognitifs trois

heures après le gavage. En effet, depuis les travaux de Widmark (1932), l'on estime la valeur

de la dégradation de 1' éthanol à une vitesse de 0, 15 g/litre/heure. Ainsi, les résultats obtenus

avec les rats traités au koutoukou concordent avec les travaux de Koob et Volkow (2010) qui

montrent que la dégradation rapide de l'éthanol entrainerait un retour vers une vigilance

normale une heure après l'ingestion de l'alcool. Par contre,. les effets persistants du koutoukou

pourraient provenir de sa composition en méthanol et en propanol (Camara, 1998). En effet,

l'organisme humain, n'ayant pas d'enzyme spécifique pour métaboliser les autres alcools tels

que le méthanol et le propanol, leur dégradation se ferait grâce au même alcool

déshydrogénase, mais de façon plus lente que celle de l'éthanol (Anonyme 2009a, 2009b).

L'observation effectué à partir de l'expérience de cette étude, confirme l'hypothèse selon

laquelle, le koutoukou contiendrait d'autres molécules capables de faire persister les effets de

l'éthanol par compétition sur l'alcool déshydrogénase, lors du métabolisme (Hamon et al,

2002). Le méthanol, le propanol et les autres éléments chimiques contenus dans le koutoukou

seraient la cause de la baisse significative des performances des rats. Comme l'ont mentionné

Camara et al. (2004), de tels composés chimiques ont des effets très prononcés sur les

niveaux de vue qui sont en relation avec les niveaux d'activation du système nerveux central

d'une part et les niveaux de performances d'autre part.


CONCLUSION ET PERSPECTIVES

A l'issue de ce travail, des charges de levures, de bactéries lactiques et d'entérobactéries

indiquant un manque d'hygiène dans le moût ont été révélées. L'administration régulière du

koutoukou entraine la chute du poids des rats ; ce qui signifie que le koutoukou à un impact

négatif sur la santé du consommateur.

La maitrise et l'amélioration du processus de fermentation et de distillation pourraient

permettre l'élimination d'alcool autre que l'éthanol présent dans cette boisson. Ainsi le

koutoukou, comme toute boisson alcoolisée, consommée avec modération, pourrait s'avérer

moins dangereux pour la santé du consommateur.

Dans la perspective d'approfondir notre étude, nous envisageons:

Étudier l'incidence des microorganismes au cours de la fermentation sur le taux d'alcool;

Approfondir les études toxicologiques

Déterminer la toxicité de l'alcool à faible dose sur une période assez prolongée

Mettre en évidence l'effet de l'alcool sur l'expression de certains gènes


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