“obtención y optimización de líneas celulares vegetales de...
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Facultat de Farmacia
Departament de Productos Naturales, Biología Vegetal y Edafología
Máster en Biotecnología Molecular
“Obtención y Optimización de Líneas Celulares vegetales de Corylus avellana para la producción de
Taxanos”
Liliana Lalaleo Córdova
Tutor: Javier Palazón Barandela
Barcelona, 2012
“Obtención y Optimización de Líneas Celulares vegetales de Corylus avellana para la producción de
Taxanos”
Barcelona, Julio 2012
Visto Bueno del Director Trabajo de Investigación del Máster
En Biotecnología Molecular
Dr. Javier Palazón Barandela Liliana Lalaleo Córdova
Estudios de Máster financiados por una beca del Gobierno de Ecuador (SENESCYT Convocatoria Abierta 2011).
ÍNDICE
I INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
1.1 Descripción química del taxol ....................................................................................................... 1
1.2. Mecanismo de acción del taxol .................................................................................................... 1
1.3. Alternativas para la producción de taxol ...................................................................................... 1
1.4. Producción in vitro de taxol ......................................................................................................... 2
1.4.1. Inducción de callos .................................................................................................................... 2
1.4.2. Obtención de suspensiones celulares......................................................................................... 2
1.5. Requerimientos nutritivos y medios de cultivo ............................................................................ 3
1.5.1. Fuente de carbono ..................................................................................................................... 3
1.5.2. Fitohormonas ............................................................................................................................. 3
1.5.3. Uso de elicitores ........................................................................................................................ 3
1.6. Corylus avellana ........................................................................................................................... 4
1.6.1. Descripción botánica ................................................................................................................. 4
1.6.2. Interés farmacológico para la producción de taxol .................................................................... 5
1.7. Aproximaciones moleculares en la manipulación de genes implicados en la ruta biosintética del taxol. .................................................................................................................................................... 6
1.8. Objetivos ...................................................................................................................................... 7
General ................................................................................................................................................ 7
Específicos .......................................................................................................................................... 7
II MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 8
2.1. Material vegetal ............................................................................................................................ 8
2.2. Métodos de esterilización ............................................................................................................. 8
2.2.1. Fruto (avellanas enteras) ........................................................................................................... 8
2.3. Inducción y cultivo de callo. ........................................................................................................ 8
2.3.1. Inducción de callo ..................................................................................................................... 8
2.3.2. Inducción de plántulas de C. avellana ....................................................................................... 9
2.4. Obtención y mantenimiento de cultivos celulares en suspensión ................................................. 9
2.5. Elicitación de cultivos celulares ................................................................................................... 9
2.6. Viabilidad y crecimiento ........................................................................................................... 10
2.7. Preparación de muestras y extracción de taxanos. ..................................................................... 10
2.7.1. Preparación de muestras .......................................................................................................... 10
2.7.2. Extracción de taxanos a partir de células liofilizadas .............................................................. 11
2.7.3. Extracción de taxanos a partir de medios de cultivo ............................................................... 11
2.8. Análisis de resultados ................................................................................................................ 11
2.8.1. HPLC – DAD (Diode array detector) ...................................................................................... 11
2.8.2. HPLC MS/MS ......................................................................................................................... 11
2.9. Optimización del medio de cultivo para C. avellana .................................................................. 12
2.10. Obtención de material transformado. ....................................................................................... 12
2.10.1. Trasformación de líneas celulares (Método de co-cultivo) ................................................... 12
2.11. Confirmación de líneas celulares.............................................................................................. 13
2.11.1. Extracción de ADN de las líneas celulares ............................................................................ 13
2.11.2. PCR ....................................................................................................................................... 13
2.11.3. Electroforesis ......................................................................................................................... 14
III RESULTADOS ........................................................................................................................... 15
3.1. Inducción de callo ...................................................................................................................... 15
3.2. Estudio de crecimiento y obtención de suspensiones celulares. ................................................ 15
3.3. Estudios de elicitación en suspensiones celulares de C. Avellana ............................................ 16
3.4. Cuantificación de taxanos del estudio de elicitación .................................................................. 16
3.5. Estudio de optimización de medios de cultivo. .......................................................................... 18
3.6. Obtención de plántulas a partir de embriones de avellana ......................................................... 19
3.7. Confirmación de líneas celulares transformadas con el gen de interés ...................................... 19
IV DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 21
V CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 24
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
ÍNDICE DE GRAFICAS
Grafica Nº1 (a) Determinación del peso fresco en el estudio de crecimiento en C. avellana ……. 15
Gráfica Nº1 (b) Determinación del peso seco en el estudio de crecimiento en C. avellana ………. 15
Gráfica Nº2 (a) Determinación del peso fresco de cultivos celulares de C. avellana elicitados....... 16
Gráfica Nº2 (b) Determinación del peso seco de cultivos celulares de C. avellana elicitados ……. 16
Gráfica Nº3 Cuantifiación de taxanos mediante HPLC en el estudio de elicitación ……………… 17
Grafica Nº4 Determinación del peso seco de la biomasa correspondiente a los cultivos evaluados 18
Grafica Nº5. Cuantificación de la producción de taxanos en los cultivos celulares evaluados …... 19
1
I
INTRODUCCIÓN
1.1 Descripción química del taxol
El género Taxus que corresponde a la clase Pinopsida, del orden de los Taxales y de la
familia Taxaceae, ha generado especial interés debido a su contenido de alcaloides
diterpénicos entre los que destaca el taxol cuyo nombre como droga genérica es paclitaxel, ya
que se ha descubierto su potente actividad antimitótica empleada para el tratamiento de una
variedad de cánceres.
El taxol es un complejo diterpeno obtenido de Taxus spp., que es sin duda el género de mayor
interés. Su fórmula molecular es C47H51NO14 y su peso molecular es de 853,9 Da [1].
1.2. Mecanismo de acción del taxol
El taxol inhibe la proliferación celular por la unión a la superficie del microtúbulo,
específicamente a la subunidad β de los heterodímeros de la tubulina promoviendo así su
polimerización incluso en ausencia de GTP, induciendo la apoptosis celular. El número de
casos de cáncer tratados con taxol han incrementado en los últimos años, demostrando gran
eficacia en el tratamiento de las metástasis en el carcinoma de ovario. El taxol es actualmente
estudiado para el tratamiento de otras enfermedades no relacionadas al cáncer pero que
también requieren la estabilización de microtúbulos y el impedimento de proliferación celular
y angiogénesis [2].
1.3. Alternativas para la producción de taxol
Desde el descubrimiento del taxol considerables esfuerzos se han enfocado en tratar de
incrementar su producción, ya que hasta la fecha las disponibilidades de este compuesto no
son suficientes para satisfacer los requerimientos comerciales. La mayor dificultad encontrada
ha sido en la baja concentración (0.001 – 0.05%) de taxol que se acumula en las especies más
productivas, incluyendo a Taxus brevifolia que fue la primera fuente de donde se aisló taxol.
Una de las alternativas a este problema es la producción por semisíntesis, la cual requiere
2
intermediarios biosintéticos como baccatina III o 10-deacetilbaccatina III, encontradas
también en Taxus sp.
Una fuente alternativa y ambientalmente sostenible de taxol y compuestos análogos, es el
cultivo de células vegetales. Esta metodología ofrece diferentes ventajas, como el no estar
condicionado a variaciones medio ambientales, estaciones y contaminaciones, además que el
material vegetal puede crecer en condiciones in vitro independientemente de su origen. Con el
fin de incrementar la productividad de taxanos en cultivos celulares vegetales, diferentes
estrategias han sido empleadas como la optimización de las condiciones de cultivo, búsqueda
y selección de líneas celulares de alta producción en diferentes especies de Taxus y la adición
de elicitores o precursores [3,4].
1.4. Producción in vitro de taxol
1.4.1. Inducción de callos
El callo es una masa indiferenciada de células que crecen en medio sólido, el cual constituye
la materia de partida para el establecimiento de suspensiones celulares. El primer reporte de
inducción de callos y la proliferación desde gametofitos de Taxus baccata fue publicado en
por Rohr R.[5] y más tarde por David y colaboradores [6]. Ellos iniciaron el cultivo de callos
a partir de hojas y estudiaron la composición mineral y fitohormonal de los medios de cultivo,
con el fin de optimizar la proliferación de celular de callos de ahí la pauta para el desarrollo
de numerosas investigaciones.
Diferentes explantes tales como hojas, tallos y embriones han sido usados para la inducción
de callo. Se ha observado que el tejido joven es más sensible y propenso a la inducción de
callos en comparación con plantas adultas y además que el uso del ácido 2-4
diclorofenoxiacetico y kinetina es la mejor combinación hormonal para la inducción de callo.
1.4.2. Obtención de suspensiones celulares
Las suspensiones celulares son iniciadas con la inoculación de callo friable en medio líquido y
agitación, mediante el empleo de uno o más pequeños agregados celulares. Estos sistemas de
rápido crecimiento pueden ser usados para establecer procesos de escalado a nivel industrial y
obtener productos valiosos.
3
Ensayos de actividades biosintéticas de cultivos celulares han sido desarrollados para
incrementar la producción de taxol, muchos enfoques incluyen la optimización de las
condiciones de cultivo, identificación de líneas altamente productoras, optimización del
crecimiento y medio de producción, inducción de vías de producción de metabolitos
secundarios por elicitación y precursores, o el uso de sistemas de cultivo en dos etapas y
técnicas de inmovilización [4].
1.5. Requerimientos nutritivos y medios de cultivo
El taxol es producido en cultivos celulares cuando el crecimiento en la fase exponencial ha
terminado y las células se encuentran en fase estacionaria. Por ello, un sistema óptimo para la
producción biotecnológica de taxol es el cultivo en 2 etapas, la primera para el desarrollo de
biomasa que luego es transferida a un segundo medio de cultivo, favorable para la producción
de taxanos. Este sistema ha constituido una efectiva estrategia para mejorar la producción de
taxol en Taxus y podría ser utilizado en otras especies alternativas como Corylus avellana.
1.5.1. Fuente de carbono
El crecimiento y producción de metabolitos secundarios a partir de cultivos celulares depende
de una fuente de carbono adecuada, sin embargo la concentración, puede variar, en función de
la ruta biosintética o procesos involucrados, así como de la especie vegetal en estudio [8].
1.5.2. Fitohormonas
Diferentes concentraciones y combinaciones de auxinas (NAA, 2,4-D y picloram) y
citoquininas (Kin, BAP) han sido usadas para mejorar la optimización del crecimiento celular
y la producción de taxol a partir de suspensiones celulares. En el caso particular de C.
avellana se ha estudiado el uso del ácido 2-4 diclorofenoxiacético y kinetina con resultados
alentadores [4,17].
1.5.3. Uso de elicitores
Un elicitor es una sustancia que cuando es introducida en pequeñas concentraciones a un
sistema celular vivo, inicia o mejora la biosíntesis de compuestos específicos, por ello, la
elicitación es el proceso de inducir o mejorar la biosíntesis de metabolitos secundarios
4
vegetales debido a la adición de elicitores. Estos presentan un efecto sinérgico debido a su
interacción con diferentes enzimas de la ruta metabólica de producción [9,10]
Los elicitores pueden ser clasificados en abióticos, como iones metálicos y otros compuestos
inorgánicos mientras que los bióticos, como polisacáridos derivados de la pared celular
vegetal, de microrganismos, glycoproteinas, etc. Entre los más representativos elicitores
abióticos están el sulfato vanadilo, nitrato de plata, cloruro de cobalto y ácido araquidónico,
los cuales han sido usados para mejorar la producción de taxanos [11].
Elicitores bióticos desde Rhyzopus stelonifera usado en combinación con otros elicitores
como jasmonato de metilo y ácido salicílico han demostrado eficazmente, mejorar la
producción de taxol [12]
1.6. Corylus avellana
Corylus avellana es una angioesperma dicotiledonea, que pertenece a la familia Betulaceae,
donde se ubican otros árboles forestales y ornamentales tales como: Betula, Alnus, Carpinus y
Ostrya. Esta especie vegetal es originaria de Eurasia, sin embargo se encuentra ampliamente
extendida por el sureste de Europa, suroeste de Asia occidental, Norte América, etc., lo que ha
diversificado las especies existentes, actualmente se han descrito entre 14 y 18 especies de
avellanos [13].
Figura 1. Explantos Corylus avellana
1.6.1. Descripción botánica
Corylus avellana es un pequeño árbol que no sobrepasa los 10 m de altura, presentándose con
frecuencia con porte arbustivo y tallas de 3-6 m de altura. Corteza pardo-grisácea o gris rojiza,
lisa o algo resquebrajada en la parte inferior, agrietándose con los años. Hojas suborbiculares
o anchamente obovadas, acuminadas bruscamente, cordiformes en la base. Miden 5-10 cm de
longitud y 4-9 cm de anchura. Margen doblemente aserrado, a veces ligeramente lobulado.
5
Haz glabro, verde oscuro y envés con pelos en las nerviaciones. Flores en amentos precoces.
Los masculinos colgantes, de 5 cm de longitud, amarillentos, apareciendo en el otoño
anterior. Los femeninos más pequeños, ovoides, de color marrón, semejando yemas foliares.
El fruto, las avellanas, están amparadas por un involucro de dos brácteas verdosas que apenas
sobrepasan el tamaño de fruto, tiene de 1.5-2 cm de diámetro y se encuentran dispuestos en
grupos de 1-5 [14].
Esta especie vegetal se multiplica por semillas. Tolera el frío y casi todo tipos de suelos a
condición de que no sean alcalinos. Exposición a media sombra. Su madera es blanco-rojiza,
ligera, empleada en la confección de mangos, cribas, aviones de aeromodelismo, carbón para
pólvora, etc. Los frutos son muy apreciados y alimenticios [15].
1.6.2. Interés farmacológico para la producción de taxol
Se ha mencionado que la mayor limitación encontrada en el extensivo uso del taxol, es su
escasa fuente de obtención, incluso en Taxus spp., ya que los cultivos presentan baja cantidad
de taxol y la extracción de este compuesto desde la planta misma requiere un labor muy
extensa, sin tomar en cuenta el impacto ambiental que implicaría este proceso no sostenible.
Por otro lado se ha reportado que el aislamiento y cultivo de hongos endófitos asociados a
Taxus producen taxol, sin embargo la cantidades obtenidas son muy bajas en comparación a
la obtenida en especies vegetales.
El avellano ha sido reportado como una especie productora de taxol a través de la
bioprospección de angioespermas. Hoffman y colaboradores [16] informaron sobre la
presencia de taxol en avellano, sin embargo cabía la posibilidad que el taxol encontrado en
esta planta derivara de hongos endófitos presentes en ella. Estudios posteriores, por parte de
Bestoso y colaboradores [17] confirmaron que los cultivos celulares de avellano producen
taxol y taxanos bajo condiciones controladas, lo cual implica que posee las enzimas
necesarias para la producción de taxol, una ruta biosintética, considerada antes como
exclusiva del género Taxus.
El principal beneficio de producir taxol a partir de cultivos celulares de C. avellana radica en
que estos cultivos puede constituir una fuente alternativa para la demanda existente, además
tiene un crecimiento mucho más acelerado en condiciones in vivo y es muy fácil de cultivar
en condiciones in vitro. En adición, la producción de taxanos en cultivos celulares de avellano
6
pueden ser incrementada con el uso de elicitores o manipulando genes implicados en la ruta
biosintética del taxol, mediante técnicas de ingeniería metabólica [17].
1.7. Aproximaciones moleculares en la manipulación de genes implicados en
la ruta biosintética del taxol.
El conocimiento de la ruta biosintética es otro paso importante para mejorar la producción de
este fitofármaco. La regulación de la biosíntesis del taxol por sobreexpresión de genes
seleccionados en las especies productoras puede potencialmente direccionar la obtención de
más cantidad del compuesto de interés [17].
La mayor parte de transformaciones genéticas en vegetales se realiza mediante infecciones
con Agrobacterium, que es un género de bacterias habitualmente encontradas en el suelo y
causante de muchas patogenias. Las cepas de interés biológico son A.tumefaciens, que
produce tumoraciones y A. rhizogenes que induce la formación de raíces. Estas cepas
transfieren de manera natural una parte de su DNA, el llamado T-DNA, a las células
vegetales, lo cual constituye una herramienta biotecnológica importante para la producción de
plantas transgénicas.
La virulencia de Agrobacterium se debe a la presencia de genes vir, los cuales coordinan el
proceso de transferencia del T-DNA (fragmento del plásmido bacteriano que se transfiere al
genoma vegetal) en las células vegetales. La eficiencia de estos genes puede ser incrementada
con un pH ácido, alta concentración de monosacáridos y la presencia de inductores fenólicos
como acetosiringona [18]
Nuevos estudios sugieren trabajar con cepas “desarmadas” de Agrobacterium, a las cuales se
les retiró los genes para la biosíntesis de opinas y fitohormonas y solo se han conservado los
genes vir de los plásmidos Ti o Ri propios de la cepa empleada. Esto confiere la ventaja de
modificar cepas y transferir DNA de interés al genoma vegetal, sin perder su capacidad de
infección.
Cepas mutadas en el gen virG han sido descritas, el cual tiene la capacidad de inducir la
infección de manera eficaz sin la adición de acetosiringona. La actividad de este gen virG
mutante se debe a la sustitución de Asn ubicada en la posesión 54 por Asp [19]
Por otro lado, estudios desarrollados del gen TB595 que codifica un péptido regulador del
metabolismo secundarios, genera grandes expectativas, ya que podría estar implicado en la
7
biosíntesis de taxol y ayudaría a sobreexpresar genes de la biosíntesis de taxanos y de esta
forma mejorar la producción biotecnológica del fitofármaco (Goossens y colaboradores [20]).
Este gen sería candidato de interés, a transferir en líneas celulares determinadas. La
transformación se llevaría a cabo con cepas de Agrobacterium desarmadas y mutadas que
efectivicen el proceso de transformación y nos permita evaluar la producción de taxol.
1.8. Objetivos
General
• Obtener líneas celulares vegetales de Corylus avellana optimizadas para la producción
de taxanos
Específicos
• Establecer cultivos de callo de C. avellana a partir de semillas utilizadas como
explantos.
• Establecer suspensiones celulares de C. avellana.
• Realizar estudios de elicitación en suspensiones celulares de C. avellana con el fin de
mejorar la producción de taxanos
• Realizar estudios de optimización de medios de cultivo para C. avellana con el
propósito de establecer sistemas de dos fases para el cultivo y la producción.
• Obtener líneas celulares transformadas con el gen de interés (TB595).
• Obtener plántulas in vitro a partir de embriones.
8
II
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Material vegetal
El material vegetal con el que se han llevado acabo los estudios proviene de la especie
Corylus avellana.
2.2. Métodos de esterilización
2.2.1. Fruto (avellanas enteras)
Las avellanas enteras fueron lavadas con abundante agua y un cepillo para eliminar cualquier
residuo y disminuir la contaminación más externa.
Una vez que las avellanas fueron desprovistas de su cáscara, se procedió a lavarlas con agua
destilada estéril. Seguido se sometieron en una solución de etanol al 70 % durante 30 seg y
lavadas nuevamente con abundante agua destilada. Posteriormente se sumergieron las
avellanas en una solución de HgCl al 1%, por 15 min en un baño de ultrasonido y
nuevamente fueron lavadas con agua destilada estéril. A continuación se sumergieron en una
solución de NaOH al 30% con 4 gotas de Tween 20, se llevó a baño de ultrasonido durante 15
min. Finalmente se lavaron con agua destilada estéril varias veces para la eliminación total de
residuos.
2.3. Inducción y cultivo de callo.
2.3.1. Inducción de callo
Los tejidos vegetales cultivados in vitro al ser sometidos a un tratamiento hormonal adecuado,
presentan la capacidad de forman agregados de células no diferenciadas denominados callos.
Las células de los callos son totipotentes, es decir, que de ellas se puede regenerar cualquier
tejido y hasta formar una planta completa. Sin embargo, esta característica depende del nivel
hormonal provisto, en los cultivos in vitro. Finalizado el proceso de esterilización, se precedió
al corte de las semillas en 4 fragmentos, los cuales fueron sembrados en medio nutritivo de
9
Murashige and Skoog (MS) (Anexo 1, Tabla Nº1) adicionado con 4 mg/L de ácido 2-4
diclorofenoxiacético y kinetina, como reguladores de crecimiento. Los cortes de semilla se
colocaron con la parte interna en contacto con el medio de cultivo y se llevaron a oscuridad a
25ºC, transcurrido de 3 a 4 semanas se obtuvo el desarrollo de masa celular en la mayor parte
de ellos, seguido se separó la masa de callo del explanto para establecer líneas de callo que se
mantienen, mediante su subcultivo en medio fresco, cada 20 a 30 días.
2.3.2. Inducción de plántulas de C. avellana
Para la inducción de plántulas se parte de los embriones aislados de avellanas enteras
esterilizadas. Con la ayuda de un bisturí se aísla el embrión que se encuentra en la parte
interna de la avellana, tratando de no dañarlo. Posteriormente son llevados a medio MS2 que
tiene la mitad de concentración de nitratos, el doble de sales y otros compuestos detallados en
el (Anexo 1, Tabla 2). Los embriones se cultivaron a 25ºC y exposición lumínica, con un
fotoperiodo de 18 h luz/ 8 h oscuridad, durante 30 días.
2.4. Obtención y mantenimiento de cultivos celulares en suspensión
Los cultivos celulares de C. avellana en medio líquido se establecieron a partir de pequeñas
muestras de callo friable de cada línea celular, en relación 4 g de masa celular en 30 mL de
medio MS adicionado con 4 mg/L de ácido 2-4 diclorofenoxiacético y kinetina. Los cultivos
son mantenidos a agitación constante a 110 rpm y 25ºC, durante 15 días con el fin de
disgregar el callo y oxigenar las células. Transcurrido el tiempo señalado se filtraron las
células por filtros de metal de 1 mm de diámetro, para separar la masa celular de la no
disgregada y obtener las suspensiones celulares finas. Las nuevas suspensiones se mantienen
con esta metodología de subcultivo en medio fresco, el cual se cambia ya sea parcialmente, es
decir extrayendo parcialmente el medio de cultivo viejo y añadiendo medio fresco o
cambiándolo por completo, mediante filtración como anteriormente se señala, dicho
procedimiento se alterna cada 15 días.
2.5. Elicitación de cultivos celulares
En la búsqueda para optimizar la producción de taxol en líneas celulares de C. avellana, se
iniciaron estudios de elicitación con el uso de jasmonato de metilo [1 µM] y coronatina [1
µM] que es una toxina patogénica producida por Pseudomoneas syringae y que ha recibido
mucha atención recientemente, como regulador de crecimiento en plantas. Este compuesto
10
presenta una estructura análoga a los conjugados de jasmonato a isoleucina, el cual constituye
el interruptor intracelular para la activación de la ruta metabólica de los jasmonatos.
En el estudio se homogenizaron muestras de distintas líneas celulares y se tomó 3 g de masa
celular en 30 mL de medio líquido MS suplementado con jasmonato de metilo o coronatina a
las concentraciones citadas. Se tomaron muestras en peso fresco al día 7 y 14 del
experimento. Los resultados obtenidos se compararon frente a un control para establecer
diferencias.
2.6. Viabilidad y crecimiento
Para la determinación de la viabilidad de las células vegetales se empleó el método
establecido por Duncan y Widholm [21]. Esta técnica consistió en colocar sobre la superficie
de un portaobjetos una gota de suspensión celular junto con una gota de una solución
marcadora que contiene diacetato de fluoresceína (DAF) y yoduro de propidio (IP) a una
concentración de 0,01% en un 1 mL de medio de cultivo, es importante mantener esta
solución protegida de la luz para impedir que se degrade.
El fundamento de emplear estos marcadores fluorescentes es debido a que el DAF es
hidrolizado por esterasas que poseen las células vivas produciendo de este modo la fluorecína,
al cual se excita a una longitud de onda ( λ ) de 490nm (luz en el espectro visible azul) y
emite a 520 nm fluorescencia verde que puede ser observada al microscopio estereóscopio de
fluorescencia (Leica MZFIII). Con respecto a IP este tiene la capacidad de intercalarse entre
las bases del ADN y permite observar los núcleos de células muertas de color rojo, se excita a
una λ de 530 nm para emitir a 620 nm. Por tanto la exposición simultanea de una muestra
representativa de suspensión celular a estos marcadores permitió analizar cualitativa y
semicuantitativamente la viabilidad de las células vegetales.
2.7. Preparación de muestras y extracción de taxanos.
2.7.1. Preparación de muestras
Los cultivos celulares se filtraron mediante un filtro de nylon de 41 µm de diámetro de poro
para separar la masa celular del medio de cultivo y las dos partes se recuperaron por separado.
Las masa celular se liofilizó a -56ºC y 50 mT durante 48 h a 96 h. Se realiza este proceso para
evitar la degradación de los compuestos de interés. Al finalizar el proceso de liofilización las
células fueron trituradas y se registró su peso seco.
11
2.7.2. Extracción de taxanos a partir de células liofilizadas
La metodología utilizada fue propuesta por Expositó y colaboradores [3]. El peso final
empleado para la extracción fue de 400 mg de peso seco (Anexo 2, Diagrama 1).
2.7.3. Extracción de taxanos a partir de medios de cultivo
La metodología utilizada fue propuesta por Expóxito y colaboradores [3]. (Anexo 2,
Diagrama 2).
2.8. Análisis de resultados
2.8.1. HPLC – DAD (Diode array detector)
La cuantificación de taxanos en C. avellana se realizó mediante HPLC. Se utilizó una
columna Supelcosil TM LC-F-5µm (25 cm x 4.6cm) de Supelco, conectada a un sistema de
HPLC (Agilent 1100) a temperatura ambiente.
En cuanto a la fase móvil se refiere, esta estuvo compuesta por acetonitrilo y agua formando
un gradiente a diferentes concentraciones (Anexo 3, Tabla 5). El volumen de inyección
utilizado fue de 15 μL y el flujo de 1 mL/min y se trabajó a una longitud de onda desde 200 a
300 nm.
Se usaron 5 patrones (taxol, baccatina III, deacetilbaccatina III, 10-deacetiltaxol y
cefalomanina) empleando una matriz de metanol absoluto. La curva patrón realizada osciló
entre concentraciones de 0.3 a 2.1 μg/mL.
2.8.2. HPLC MS/MS
Se utilizó un HPLC Acquity UPLC (Waters) acoplado a un triple cuadrupolo API 300
(ABSciex) con una fuente Turbo Ion spray con las siguientes especificaciones de trabajo: gas
nebulizante (N2) a 10 (unidades arbitrarias) cortina de gas (N2) a 12 (unidades arbitrarias), gas
auxiliar (N2) a 8000 cm3-min calentada a 400 ºC. Se utilizó un voltaje de +5Kv, gas CAD (N2)
a 4 (unidades arbitrarias). El potencial de “declustering” fue de 60 V y el potencial de enfoque
de 200 V, mientras que el potencial de entrada utilizado fue de 10 V, la energía de colisión de
20 V y el potencial de colisión de salida fue de 15V.
12
En esta técnica se utilizó una fase móvil formada por acetonitrilo y agua a la siguientes
relaciones descritas (Anexo 3, Tabla 6) y las condiciones usadas para la cromatografía liquida
inicial fueron las mismas detalladas para HPLC.
2.9. Optimización del medio de cultivo para C. avellana
En el estudio de optimización del medio de cultivo se empleó un modelo estadístico factorial
fraccionado, del cual se obtuvieron 32 medios de cultivo para ser evaluados (Anexo 1, Tabla
4). Para ello se tomaron 4 g de células y se cultivaron en 30 mL del correspondiente medio
(Anexo1, Tabla 1 y 3). Los cultivos fueron mantenidos en agitación constante a 110 rpm,
25ºC durante 15 días. Transcurrido el tiempo señalado, los cultivos celulares se filtraron con
un filtro de nylon de 41 µm de diámetro de poro, para separar la masa celular del medio de
cultivo y las dos partes se recuperaron por separado y se procedió a la preparación de la
muestras, extracción de taxanos y cuantificación de HPLC como se detalla en el apartado 3.8
y 3.9.
2.10. Obtención de material transformado.
La cepa usada para la trasformación fue la LBA4404 de A. tumefaciens, que contiene tres
plásmidos. i) Un plásmido desarmado con solo la región vir del plásmido Ti. ii) Un plásmido
pBBR1MCS virGN54D el cual se ha mutado en la posición 54 del gen virG donde la
asparagina se modifica por ácido aspártico, que ayuda a aumentar la virulencia, un gen de
resistencia a gentamicina y se encuentra bajo el control del promotor constitutivo p35S. iii) Y
un plásmido pk7WG2D con la secuencia del péptido regulador TB595 que suponen un
aumento en la producción de taxol (Goossens y colaboradores [20].), el promotor constitutivo
p35S, un gen que codifica para la green flourencence protein (GFP) y dos genes de
resistencia, uno que corresponde a espectromicina/estreptomicina (Sm/SpR) y otro a la
kanamicina (npII).
Las cepas de A. tumefaciens LBA4404 fueron mantenidas en medio de cultivo sólido YEB
(Anexo 4, Tabla Nº7) adicionado con rifampicina (100 mg/L), estreptomicina (100 mg/L), y
gentamicina (100 mg/L).
2.10.1. Trasformación de líneas celulares (Método de co-cultivo)
Para la obtención de material transformado, las cepas bacterianas fueron cultivadas en medio
líquido YEB con los antibióticos correspondientes, a 28ºC, 145 rpm en agitación constante
13
durante 48 h. Se determinó la absorbancia mediante la OD600 y esta fue llevada a 0.05
mediante diluciones.
Una vez que se filtra la biomasa celular, se sumerge en el cultivo líquido de Agrobacterium
durante 2 minutos para que la infección bacteriana pueda llevarse a cabo. Luego las células
son filtradas y colocadas en placas de Petri con medio nodriza a la mitad de la concentración,
suplementado con acetosyringona a [15 mg/L]. El medio nodriza se obtuvo cultivando 10 g de
células de avellano en 4 mL de medio durante 4 h a 110 rpm de agitación. Una vez trascurrido
este tiempo se eliminan las células y se recupera el medio de cultivo.
Finalmente las células vegetales fueron filtradas y lavadas con una solución de Clf [500
mg/L]. Posteriormente se llevaron a medio MS con los factores de crecimiento 2-4D [2mg/L]
y Kin [2mg/L]. Para eliminar la presencia de Agrobacterium se adicionó claforam (Clf) [500
g/L] y el antibiótico de selección kanamicina (Kan) [200 mg/L] el cual ayudó a seleccionar el
material transformado. Se obtuvieron 12 líneas celulares potencialmente transformadas, las
cuales se establecieron en base al proceso de filtración e inoculación realizado para cada
suspensión celular
2.11. Confirmación de líneas celulares
2.11.1. Extracción de ADN de las líneas celulares
La extracción de ADN se realizó siguiendo el método de Dellaporta y colaboradores [22].con
algunas modificaciones (Anexo 5, Diagrama Nº3). Los reactivos son detallados en el Anexo
5, Tabla Nº8.
2.11.2. PCR
El kit usado para la PCR fue PureTag TM Ready-To-Go (Perla) GE HealthCare, y se trabajó
según las especificaciones del fabricante.
La PCR se llevó a cabo en el equipo termociclador MiniCyclerTM, modelo PTC-150 de MJ
RESEARCH INC, con las siguientes condiciones de reacción: Tº hold inicial de 94ºC (5 min),
temperatura de desnaturalización de 94ºC (30 seg), temperatura de hibridación de 67ºC (30
seg), temperatura de síntesis de 72ºC (45 seg), temperatura de síntesis final a 72ºC (5 min) y
temperatura de stop a 22 ºC.
14
2.11.3. Electroforesis
En un gel de agarosa a una concentración de 1.8% en TAE 1X se cargaron de 15 µL de
muestra de ADN correspondiente a cada una de las líneas celulares junto con un control
positivo y uno negativo para el gen TB595 y se sometieron a un voltaje de 60 V durante 45
minutos.
15
III
RESULTADOS
3.1. Inducción de callo
Una vez realizado el proceso de esterilización de las avellanas, la inducción de callos se llevó
a cabo en medio de cultivo MS, suplementado con una combinación de reguladores de
crecimiento. El uso de 2-4 D a [2mg/L] y kinetina a [0,4 mg/L] demuestra que la combinación
de ambos reguladores del crecimiento es un buen sistema para la inducción de callo, con lo
cual se evidencia que la inducción de callo de avellano fue exitosa. El desarrollo de masa
celular en los explantos fue observado a partir del día 10 hasta el día 30, posteriormente se
trasladó la masa celular generada a un medio de cultivo fresco para obtener callos blancos y
friables con lo que se establecieron las suspensiones celulares finas.
Figura 2. Etapas de desarrollo del callo a partir de semillas.
3.2. Estudio de crecimiento y obtención de suspensiones celulares.
El objetivo de este estudio fue determinar la cinética de crecimiento que tienen las líneas
celulares de avellano. Los resultados obtenidos (Gráficas Nº1 (a y b)) evidencian un activo
crecimiento celular hasta el día 12, momento en el que el índice de crecimiento (peso fresco
de la muestra/peso fresco inóculo) fue de 7,5. A partir del día 12, en adelante hasta el día 24
constituye la fase estacionaria y se observó una disminución del 27,5% de masa celular lo que
nos indica la muerte celular.
Gráfica Nº1(a). Determinación del peso fresco en el estudio de crecimiento en C. avellana
Gráfica Nº1(b). Determinación del peso seco en el estudio de crecimiento en C. avellana
16
3.3. Estudios de elicitación en suspensiones celulares de C. Avellana
La elicitación fue llevada a cabo en la fase de crecimiento celular con la adición de jasmonato
de metilo a una concentración de [100 µM] y Coronatina a [1µM]. Se observa que la adición
de elicitores reduce significativamente la viabilidad celular, si se compara frente a un control.
El jasmonato de metilo redujo el porcentaje de células vivas al 30% mientras que la
coronatina dimuyó en un 35%.
En uso de elicitores produjo un descenso en el crecimiento celular que se observó a lo largo
de los 14 días de cultivo. Los resultados son representados en base al peso fresco y seco
obtenido después de los 14 días, tanto para los cultivos elicitados y el control. Gráficas Nº2(a)
y 2(b)
3.4. Cuantificación de taxanos del estudio de elicitación
La técnica empleada para la detección y cuantificación de taxanos fue por HPLC. Estudios
anteriormente realizados por el grupo de investigación del departamento, han puesto a punto
la metodología para la determinación de taxol y otros precursores de interés [23].
Los resultados obtenidos han permitido evaluar la presencia de taxanos en sus diferentes
estadios de crecimiento y los efectos del elicitor utilizado (Gráfica Nº 3).
0
2
4
6
8
10
12
7 14
we
igh
t (g
)
Day
Peso Fresco
Methyl jasmonate
Coronatine
Control
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
7 14
we
igh
t (g
)
Day
Peso Seco
MeJ
Coronatine
Control
Grafica Nº 2 (a). Determinación del peso fresco de los cultivos celulares de C. avellana elicitados
Grafica Nº 2 (b). Determinación del peso seco de los cultivos celulares de C. avellana elicitados
17
Gráfica Nº3. Cuantificación de taxanos mediante HPLC en el estudio de elicitación.
El análisis muestra en el día 7, una mayor presencia de baccatina III en todos los cultivos
elicitados con jasmonato de metilo y coronatina, sin embargo solo en los tratamientos con
coronatina se observa la presencia de 10-deacetilbaccatina III, 10 acetiltaxol, cefalomanina y
taxol en muy baja proporción.
El análisis realizado al día 14 muestra un incremento significativo de baccatina III en los
cultivos elicitados con coronatina, más que los elicitados con jasmonato de metilo. En cuanto
a los otros taxanos se refiere el mayor aumento se observa en taxol, en los tratamientos
elicitados. Si se comparan dichos resultados con el control, ya que este solo presentó
baccatina III y 10-acetiltaxol.
Con respecto a la excreción de taxanos al medio de cultivo, la bacatina III fue detectada en
grandes cantidades en el medio de cultivo de los tratamientos elicitados con coronatina, el
mismo comportamiento se observa con la 10-deacetilbaccatina, la cual es más notable en
tratamientos con jasmonato de metilo.
Desde un análisis en general se puedo determinar una mayor concentración de baccatina III
en todos los tratamientos del estudio, en relación a otros taxanos y el taxol en sí, siendo la
elicitación un método efectivo para incrementar taxanos en C. avellana.
050
100150200250300350400450500550600
Day 7
coronatine
Day 7
methyl
jasmonate
Day 14
coronatine
Day 14
methyl
jasmonate
Day 14
Control
Co
nce
ntr
ati
on
ng
/LTaxanos Totales
taxol
cephalomannine
10-deathetyltaxol
baccatine III
10-deathetylbaccatine
18
3.5. Estudio de optimización de medios de cultivo.
El experimento se desarrolló en base a un diseño factorial fraccional de 6 factores y 2 niveles,
producto del análisis estadístico se determinó ensayar 32 medios de cultivo. Los resultados
experimentales a determinarse fueron el peso fresco y seco de la biomasa de cada cultivo.
Los resultados (Gráfica Nº4) muestran que el factor determinante para incrementar la biomasa
celular es la fuente de carbono, siendo mejor la sacarosa a la combinación frutosa/sacarosa. El
análisis estadístico se realizó mediante el programa STATGRAPHICS Centurion (Anexo 6,
Tabla 9 y 10) y confirma que la fuente de carbono y la citoquinina utilizada en el medio de
cultivo inciden en el crecimiento celular de C. avellana. El estudio matemático sugiere como
medio idóneo para el crecimiento celular al medio MS suplementado con sacarosa, y los
reguladores de crecimiento, NAA [1mg/L] y BAP [0,5 mg/L], con el cual se obtendría un
aumento en la biomasa, sin embargo este medio no ha sido evaluado, razón por la cual el
siguiente paso sería realizar estudios con esta formulación para evaluar si aumenta realmente
el crecimiento celular.
Grafica Nº4. Determinación del peso seco de la biomasa correspondiente a los cultivos evaluados.
Por otro lado, la cuantificación de taxanos por HPLC MS/MS determina que los medios
óptimos de producción son M7, M10 y M29, encontrándose taxol y baccatina III. El medio
M10 presentó una mayor producción de taxol y en el medio M7 además de cuantificarse taxol
se detectó baccatina III (Gráfica Nº5). El análisis estadístico mostró que ninguna variable
estudiada es significativa, sin embargo con el análisis matemático se observa que el medio B5
suplementado con 2-4D [1mg/L] y BAP [0,5 mg/L] es el mejor, lo cual representaría ser un
candidato para la establecer sistema de dos fases en cultivos de C. avellana, que estimularía la
producción de taxanos.
0
100
200
300
400
500
600
700
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
mg
medios de cultivo
Peso Seco
19
0
500
1000
1500
2000
2500
Medium 7 Medium 10 Medium 29
ng
/L
Producción de Taxanos
T B
Grafica Nº5. Cuantificación de la producción de taxanos en los cultivos celulares evaluados.
3.6. Obtención de plántulas a partir de embriones de avellana
La obtención de plántulas in vitro en medio MS2 suplementado con 30 g/L y 7 g/L de Bacto
Agar Difco bajo las condiciones antes mencionadas resulto efectivo. Al cabo de un mes se
observó la germinación de un 30% de los embriones. Estudios previos realizados sugieren
trabajar con embriones en lugar de explantos de hojas y tallos, ya que se ha demostrado que la
mayor parte de estos no llegan a forman plántulas debido a la abundante contaminación que
presentan, aun con métodos efectivos de esterilización [17,23]. Las plántulas obtenidas
constituirán una fuente renovable de explantos estériles para estudios posteriores.
Figura Nº 3. Desarrollo de plántulas de C. avellana in vitro a partir de embriones
3.7. Confirmación de líneas celulares transformadas con el gen de interés
La trasformación de cultivos supone ser exitosa, debido a que las líneas celulares obtenidas
después de ser inoculadas con la cepa A. tumefaciens LBA 4404 (pBBR1MCS, pk7WG2D y
pTi desarmado) fueron subcultivadas en un medio suplementado con los antibióticos de
selección y se evidencia que las líneas crecen normalmente.
La confirmación de la transformación se hizo por PCR donde se determinó las condiciones
favorables de reacción para identificar presencia del gen TB595, el cual podría ser un gen
20
candidato implicado en la regulación de la ruta biosintética del taxol Goossens y
colaboradores [20]. Los resultados de PCR mostraron que dos líneas celulares se encuentran
trasformadas con el gen TB595 (Figura Nº 4a y 4b)
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura Nº 4a. 1). Marcador 100pb. 2).Control (+) LBA4404. 3). Control (-) WT C. avellana 1. 4 ). Control (-) WT C. avellana 2. 5).Línea C. 6). Línea E. 7). Línea F. 8). Línea H. 9). Línea I. 10). Línea K
Figura Nº 4b. 1). Marcador 100pb. 2).Control (+) LBA4404. 3). Control (-) WT C. avellana 1. 4 ). Control (-) WT C. avellana 2. 5).Línea K+L. 6). Línea L. 7). Línea M. 8). Línea M3. 9). Línea M4. 10). Línea 595.
21
IV
DISCUSIÓN
Los cultivos celulares son considerados uno de los métodos más promisorios para
proporcionar un suministro constante y adecuado de taxol. La presencia de este compuesto en
un género muy distante como es Corylus, el cual es una angiosperma, en comparación a
Taxus que es gimnosperma y que constituye la principal fuente de obtención actualmente,
sugiere que el taxol podría ser encontrado en otras más especies vegetales que aún se
desconocen hoy en día [17, 25].
Estudios realizados en nuestro grupo de investigación reportan una inducción exitosa de callo
a partir de tallos, hojas y semillas de C. avellana, debido al rápido crecimiento celular y su
fácil cultivo in vitro [23]. Sin embargo, se ha determinado que el explanto más adecuado para
la inducción de callo y la obtención de suspensiones celulares es el fruto, la avellana, ya que
genera callos más claros y friables, a partir de los cuales se pueden obtener las suspensiones
celulares. Además, los cultivos iniciados a partir de este tipo de explanto presentan unas tasas
más baja de contaminación, en comparación a los tallos y hojas.
En cuanto a las suspensiones celulares, se han logrado suspensiones finas que se han
mantenido como líneas estables y que son capaces de sintetizar taxanos, lo que confirma
otros estudios previos realizados por otros autores [17], y hace suponer que en plantas de
avellano y en las suspensiones celulares derivadas, la ruta metabólica para la síntesis de
taxanos es funcional, aunque se desconoce si es similar a la desarrollada el género Taxus.
En lo que respecta a la elicitación de suspensiones celulares, se reporta que los ensayos de
elicitación con jasmonato de metilo y coronatina incrementan la producción de taxanos en
líneas las líneas de avellano de forma similar a lo que sucede en los cultivos celulares de
Taxus [4]. Esto se fundamenta en que las células vegetales cuando perciben cambios
ambientales por receptores específicos o ciertos mecanismos de percepción, generan
respuestas biológicas a través señales de transducción específicas. La acumulación de taxol y
taxanos relacionados en plantas de Taxus se piensa que pueden ser una respuesta biológica a
estímulos externos específicos.
22
El ácido jasmónico ha sido reportado como un compuesto que juega un papel importante en
los procesos de señalización regulando la expresión los genes de defensa en plantas. Este,
aplicado de manera exógena mejora la producción de metabolitos secundarios en un variedad
de especies y en particular ha resultado es más efectivo para elicitar la producción de taxol,
razón por la cual se decidió estudiar el uso de jasmonato de metilo y coronatina como
elicitores en cultivos celulares de C. avellana.
Los resultados muestran un efecto positivo en la producción de taxanos, con una mayor
producción en el día 14, correspondiente a la fase estacionaria. Como se ha comentado, los
cultivos presentaron dos veces más, el contenido de taxanos con jasmonato de metilo y 14
veces más con coronatina, respecto al control no elicitado, encontrándose también más
cantidad de baccatinna III. Sin embargo la adición de estos compuestos de manera exógena
produjo un descenso significativo en el crecimiento celular. Existe controversia por parte de
algunos autores, sobre el efecto que genera la adición de ciertos elicitores en la viabilidad
celular [24], lo que sí queda claro es que efecto que generan los elicitores no solo dependen
del propio elicitor, sino también de la concentración, el periodo de elicitación que se someta
un cultivo celular, la especie vegetal, la línea celular y el estado de desarrollo del cultivo para
el estudio.
En cuanto al estudio de optimización se refiere, Bestoso y colaboradores [17] indicaron que
diferentes combinaciones de fitohormonas son capaces de inducir callos a partir de hojas,
tallos y semillas de C. avellana, pero presenta una preferencia para el ácido
diclorofenoxyacético (2,4-D) cuando es usado solo o en combinación con 6-
benzilaminopurina (BAP). La inducción de callo obtenida de avellanas ha presentado un
incremento de más del 50% cuando fue cultivado en un medio suplementado con ácido
naftalenacético (NAA) y 6-benzilaminopurina (BAP). En base a esto, en el estudio de
optimización se decidió evaluar el efecto de seis variables: medio de cultivo (MS; B5), fuente
de carbono (sacarosa; frutosa/sacarosa) y reguladores de crecimiento auxinas (2-4D; NAA) y
citoquininas (Kin; BAP).
El análisis estadístico de los resultados demostró, en este estudio, que la fuente de carbono es
el factor determinante para incrementar la masa celular, en relación a los otros factores.
Sugiriendo además que el mejor medio para obtener un incremento de biomasa sería el medio
de cultivo MS suplementado con sacarosa, NAA [1mg/L] y BAP [0,5 mg/L] el cual no fue
testado, Por tanto el siguiente paso será realizar estudios de crecimiento en este medio de
cultivo. La presencia de taxanos se observó en los medios de cultivo M7, M10 y M29
23
identificando que el mejor medio de producción para taxanos sería B5 suplementado con 2-
4D [1mg/L] y BAP [0,5 mg/L]. Todo esto confirma que mantener líneas celulares en buenas
condiciones es factible con numerosas combinaciones de fitohormonas que se adicionen al
medio de cultivo y que el desarrollo de sistemas de dos fases de cultivo, podría mejorar el
crecimiento celular y a la vez incrementar la producción de taxanos.
Como se ha mencionado anteriormente el conocimiento de la ruta biosintética del taxol es
otro paso importante para mejorar la producción de este compuesto en avellano.
Aproximaciones moleculares fueron estudiadas en C. avellana, con la trasformación de líneas
celulares mediante el método de co-cultivo con una cepa LBA 4404 mutada de Agrobaterium
tumefaciens que tiene el gen de interés. El gen TB595 codifica probablemente para un péptido
regulador que estaría implicado en la ruta biosintética del taxol.
Se logró poner a punto las condiciones de reacción de la PCR que permitió confirmar la
presencia del gen de interés, identificando dos líneas celulares transformadas, con lo cual, el
siguiente paso sería realizar pruebas de expresión de gen y evaluar la producción de taxanos
en estas líneas. Esta información confirmaría la idoneidad de la ingeniería metabólica para
establecer sistemas biotecnológicos que permitan una mayor producción de taxanos.
Por otro lado, se logró inducir el desarrollo de plántulas in vitro a partir de embriones,
demostrando ser un buen sistema para la regeneración de plantas de C. avellana. De esta
manera se puede obtener explantos estériles para posteriores estudios, sin la necesidad de
realizar procesos previos de esterilización del material, ya que muchos de ellos resultan ser
muy agresivos y tienden a dañar el material vegetal.
24
V
CONCLUSIONES
5.1. Se ha logrado obtener y mantener líneas celulares a partir de semillas de C. avellana,
demostrando así que las semillas pueden ser un buen explanto para obtener masa de callo de
alto crecimiento y viabilidad, friable y de buen color, que permita realizar estudios a posterior.
5.2. Se establecieron suspensiones celulares en medio de cultivo MS suplementado con 2-4D
a [2mg/L ] y Kin [0.2mg/L]. El estudio de la cinética de crecimiento ha revelado que a los 12
días el índice de crecimiento era de 22.5, un valor muy superior a las máximas tasas de
crecimiento obtenidos en los cultivos celulares de Taxus sp.
5.3. El estudio de elicitación mostró que el jasmonato de metilo y la coronatina pueden ser
usados como elicitores en C. avellana para mejorar la producción de taxanos, sin embargo
decrecen la viabilidad celular de los cultivos. La mayor concentración cuantificada fue de
baccatina III en medios elicitados con coronatina obteniendo 609 µg/L.
5.4. En el estudio de optimización, se demostró que el uso de sacarosa como fuente de
carbono mejora considerablemente el crecimiento celular, además que el medio MS
suplementado con sacarosa, NAA [1mg/L] y BAP [0,5 mg/L] (a testar) podría ser el mejor
medio de cultivo para incrementar la biomasa. Por otro lado, en los medios 7,10 y 29 se
detectó la producción de taxanos, por lo que podrían ser seleccionados como medios de
producción para establecer sistemas de cultivo en 2 fases.
5.5. En las aproximaciones moleculares realizadas en C. avellana se logró trasformar con la
cepa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens portadora del gen de Taxus baccata TB595, a dos
líneas celulares con el gen de interés. La transformación se confirmó con PCR para la cual
dieron positivo.
5.6. El 30% de los embriones de C. avellana sembrados, germinaron en medio MS2
obteniendo plántulas in vitro que serán utilizadas como material de partida para estudios
posteriores.
25
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ANEXO 1
Tabla 1. Composición del medio de Murashige and Skoog adicionado con fitohormonas para la inducción de callo.
Componentes Inorgánicos Componentes Orgánicos Macronutrientes Vitaminas KNO3 1900 mg/L Piroxidina HCL 0,5 mg/L CaCl2 . 2H2O 440 mg/L Ácido Nicotínico 0,5 mg/L MgSO4 . 7 H2O 370 mg/L Tiamina HCL 0,5 mg/L (NH4) . NO3 1650 mg/L Glicina 2 mg/L KH2PO4 170 mg/L Micronutrientes Hormonas KI 0,83 mg/L 2-4 D 2 mg/L H3BO3 6,2 mg/L Kinetina 0,4 mg/L MnSO4 . H2O 16,9 mg/L ZnSO4 . 7 H2O 8,63 mg/L Otros Na2MoO4 . 2 H2O 0,25 mg/L Mio-inositol 0,1mg/L CuSO4 . 5 H2O 0,0025 mg/L Sucrosa 30 g/L CoCl2 . 6 H2O 0,0025 mg/L Hierro pH Na2EDTA . 2 H2O 37.2 mg/L 5,8 ± 0,2 Fe SO4 . 7 H2O 27.8 mg/L
Tabla 2. Composición del medio Murashige and Skoog a la mitad de concentración de macro y micronutrientes para la inducción de plántulas de C. avellana.
Componentes Inorgánicos Componentes Orgánicos Macronutrientes Vitaminas KNO3 950 mg/L Piroxidina HCL 0,5 mg/L CaCl2 . 2H2O 880 mg/L Ácido Nicotínico 0,5 mg/L MgSO4 . 7 H2O 740 mg/L Tiamina HCL 0,5 mg/L (NH4) . NO3 825 mg/L Glicina 2 mg/L KH2PO4 170 mg/L Ácido ascórbico 2mg/L Micronutrientes Otros KI 0,83 mg/L Mio-inositol 2 mg/L H3BO3 6,2 mg/L Sucrosa 0,4 mg/L MnSO4 . H2O 16,9 mg/L Bactoagar 7 g/L ZnSO4 . 7 H2O 8,63 mg/L Na2MoO4 . 2 H2O 0,25 mg/L CuSO4 . 5 H2O 0,0025 mg/L CoCl2 . 6 H2O 0,0025 mg/L Hierro pH Na2EDTA . 2 H2O 37.2 mg/L 5,8 ± 0,2 Fe SO4 . 7 H2O 27.8 mg/L
Tabla 3. Composición del medio B5 en el estudio de optimización.
Componentes Inorgánicos Componentes Orgánicos
Macronutrientes Vitaminas
KNO 3 2527,5 mg/L Piroxidina HCL 1 mg/L
CaCl2 . 2H2O 150 mg/L Ácido Nicotínico 1 mg/L
MgSO4 . 7 H2O 246,5 mg/L Tiamina HCL 10 mg/L
(NH4)2 . SO4 134 mg/L
NaH2PO4. H2O 150 mg/L
Micronutrientes Hormonas
KI 0,75 mg/L 2-4 D (1-2) mg/L
H3BO3 3 mg/L Kinetina (0,5-1) mg/L
MnSO4 . H2O 10 mg/L BAP (0,5-1) mg/L
ZnSO4 . 7 H2O 2 mg/L NAA (1-2) mg/L
Na2MoO4 . 2 H2O 0,25 mg/L Otros
CuSO4 . 5 H2O 0,025 mg/L Mio-inositol 0,1mg/L
CoCl2 . 6 H2O 0,0025 mg/L Sucrosa 30 g/L
Hierro
Na2EDTA . 2 H2O 37.2 mg/L 5,8 ± 0,2
Fe SO4 . 7 H2O 27.8 mg/L
Tabla 4. Composición de los medios de cultivo utilizados en el ensayo de optimización
Medio Fuente de Carbono Auxinas Nivel Citoquininas Niveles
1 B5 F/S 2,4D 1 KIN 0,5
2 B5 F/S 2,4D 1 BAP 1
3 B5 F/S 2,4D 2 KIN 1
4 B5 F/S 2,4D 2 BAP 0,5
5 B5 F/S NAA 1 BAP 0,5
6 B5 F/S NAA 1 KIN 1
7 B5 F/S NAA 2 KIN 0,5
8 B5 F/S NAA 2 BAP 1
9 B5 S 2,4D 1 KIN 1
10 B5 S 2,4D 1 BAP 0,5
11 B5 S 2,4D 2 KIN 0,5
12 B5 S 2,4D 2 BAP 1
13 B5 S NAA 1 BAP 1
14 B5 S NAA 1 KIN 0,5
15 B5 S NAA 2 BAP 0,5
16 B5 S NAA 2 KIN 1
17 MS F/S 2,4D 1 KIN 1
18 MS F/S 2,4D 1 BAP 0,5
19 MS F/S 2,4D 2 KIN 0,5
20 MS F/S 2,4D 2 BAP 1
21 MS F/S NAA 2 KIN 1
22 MS F/S NAA 2 BAP 0,5
23 MS F/S NAA 1 KIN 0,5
24 MS F/S NAA 1 BAP 1
25 MS S 2,4D 1 KIN 0,5
26 MS S 2,4D 1 BAP 1
27 MS S 2,4D 2 KIN 1
28 MS S 2,4D 2 BAP 0,5
29 MS S NAA 1 KIN 1
30 MS S NAA 1 BAP 0,5
31 MS S NAA 2 BAP 1
32 MS S NAA 2 KIN 0,5
ANEXO 2
Diagrama 1. Extracción de taxanos a partir de células liofilizadas
Diagrama 2. Extracción de taxanos a partir de medio de cultivo
20 ml de Medio de Cultivo
Agitación en vórtex durante 2 min
Sonicación 1H a 25°C
Desecación over night
Cuantificación por técnicas cromatográficas o de inmunoensayo
+ 5mL de Diclorometano
Recolección de fase Orgánica
ANEXO 3
Tabla 5. Gradiente de concentraciones de la fase móvil para HPLC
Minuto % Acetonitrilo % Agua
0 25 75
38 90 10
40-43 90 10
45-55 25 75
Tabla 6. Gradiente de concentraciones de la fase móvil para HPLC MS/MS
Minuto % Acetonitrilo % Agua
0 25 75
28.5 90 10
32 90 10
32.5 25 75
35 25 75
ANEXO 4
Tabla Nº7. Medio de Cultivo YEB (Medio de cultivo de Extracto de levadura y Bacto peptona)
Componentes Concentración
Extracto de Carne 5 g/L
Peptona 5g/L
Sacarosa 5 g/L
Extracto de Levadura 1g/L
MgSO4. 7H2O 0,493 g/L
Bacto-agar 15 g/L
Acetosiringona 100 µM
pH 5.6
ANEXO 5
Diagrama Nº3. Protocolo de extracción de ADN (método de Dellaporta et al. 1983)
Tabla Nº8. Reactivos correspondientes al método de Dellaporta et al. 1983.
Reactivos Concentración Buffer de Extracción Tris-HCl (pH= 8) 100 mM EDTA (pH = 8) 50 mM NaCl 500 mM β-mecapto etanol SDS 20% CH3CO2K 5 M T10 E1 Tris – HCl (pH=8) 10 mM EDTA (pH=8) 1 mM CH3CO2Na 3 M Tris-HCl (pH=8) 1 M
ANEXO 6
Tabla Nº9. Análisis de Varianza del estudio de optimización de medios de cultivo- Crecimiento Celular (95% confianza)
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS
PRINCIPALES
A Medio de cultivo 2319,23 1 2319,23 2,64 0,1166
B:Fuente de carbono 720938, 1 720938, 821,36 0,0000
C:auxinas 11695,9 1 11695,9 13,33 0,0012
D: nivel de auxinas 743,292 1 743,292 0,85 0,3662
E:citoquininas 1833,0 1 1833,0 2,09 0,1608
F: nivel de citoquininas 462,085 1 462,085 0,53 0,4748
RESIDUOS 21943,4 25 877,735
TOTAL (CORREGIDO) 760205, 31
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
Tabla Nº10. Análisis de Varianza del estudio de optimización de medios de cultivo- Producción de taxanos (95% confianza)
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS
PRINCIPALES
A:Medio de cultivo 2,06364E9 1 2,06364E9 0,02 0,8928
B:Fuente de carbono 2,11858E11 1 2,11858E11 1,90 0,1800
C:auxinas 1,9976E9 1 1,9976E9 0,02 0,8945
D:nivel de auxinas 2,11858E11 1 2,11858E11 1,90 0,1800
E:citoquininas 1,54642E9 1 1,54642E9 0,01 0,9071
F:nivel de citoquininas 1,61246E9 1 1,61246E9 0,01 0,9052
RESIDUOS 2,78369E12 25 1,11348E11
TOTAL (CORREGIDO) 3,21508E12 31
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual