PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASE DARI

BAKTERI YANG DIISOLASI DARI LIMBAH RUMPUT LAUT

ISNA RAHMADINI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan

pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan,

penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak

merugikan kepentingan yang wajar IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya

tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa Tesis Pemurnian dan Karakterisasi

Enzim Selulase dari Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut adalah

karya saya sendiri yang merupakan bagian dari penelitian kelompok peneliti

Bioteknologi BBP4BKP tahun anggaran 2010/2011 dan belum diajukan dalam

bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang

berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari

penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di

bagian akhir tesis ini.

Bogor, Mei 2012

Isna Rahmadini

NIM P051090191

ABSTRACT

ISNA RAHMADINI. Purification and Characterization of Cellulase Enzyme from

Bacteria Isolated from Seaweed Waste. Under direction of NISA RACHMANIA

MUBARIK and EKOWATI CHASANAH.

Seaweedwasteis a sourceof bacteria thatcanproduce cellulaseenzyme.

PMP0126yisolateis one collection isolateof the Research and Development Center

for Marine and Fisheries Product Proecessing and Biotechnology Agency for

Marine and Fisheries Research and Development Ministry of Marine Affairs and

Fisheries obtainedfromseaweed wastefrom Pameungpeukarea, Garut, West Java.

The aims this research were to purify, characterize the cellulase enzyme, and

identify the bacteria producing the enzyme using 16S-rRNA. PMP

0126yisolatewasa Gram-negativeshortrodshape bacteria. Based on

thesequencingof the 16S-rRNA genfrom 1282base pairPMP0126y isolate

had96%similaritywith Chryseobacteriumindologenesstrain McR-1. Theisolate had

1.9 cellulolytic index onCarboxymethyl Cellulose(CMC) agar medium. The

highestcellulaseactivityobtained onthe thirdday offermentation timewith

acellulaseactivityof0.108U/mLandspecificactivityof0.120U/mg.

Initialpurificationof cellulasebyultrafiltrationproducedactivityof0.112U/mL.

Purificationthe enzyme byanionexchange chromatographyproducedthe

highestpeak of proteininthefraction no. 48withcellulaseactivityof0.154U/mLat

37.3mMNaCl.Optimumactivity ofthe cellulaseenzymeafterultrafiltrationwaspH

5and300C,while optimumactivity ofthe cellulaseenzymebyanionexchange

chromatographywaspH 5and400C. At 30

0C, the enzymeremainedstableup

to4hourincubation.Theactivity ofthe cellulasewasincreasedbyaddition ofCaCl2ions

by 53%anddecreased bythe additionof ZnCl2 ions by 78%. Thecellulase showed

the highest activity i.e. 0.149U/mL using treated seaweed wasteGlacilariasp. as

substrate. Using SDS-PAGE and zimogram analysis, the molecular weight of the

cellulase was estimated to be 39 kDa, 30 kDa, and 14 kDa.

Keywords:cellulase,characterization,purification, seaweedwaste.

RINGKASAN

ISNA RAHMADINI. Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri

yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut. Dibimbing oleh Nisa Rachmania

Mubarik dan Ekowati Chasanah.

Limbah pengolahan rumput laut merupakan salah satu sumber bakteri

yang dapat menghasilkan enzim selulase. Industri pengolahan agar-agar dari

rumput laut Glacilaria sp. di daerah Pemeungpeuk Garut, Jawa Barat merupakan

sumber isolat PMP 0126y yang mampu menghasilkan enzim selulase. Isolat ini

merupakan koleksi BBP4BKP yang dapat tumbuh baik pada suhu 37 0C. Hasil

pewarnaan Gram isolat PMP 0126y bersifat Gram negatif dengan bentuk batang

pendek. Berdasarkan hasil sekuensing gen penyandi16S-rRNA dari 1282 pasang

basa, isolat PMP 0126y memiliki kemiripan sebesar 96% dengan bakteri

Chryseobacterium indologenes galur McR-1.

Uji kualitatif dilakukan dengan mengukur indeks selulolitik yang

dihasilkan oleh bakteri pada media agar-agar yang mengandung Carboxymethyl

Cellulose (CMC). Indeks selulolitik yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y pada

media agar-agar CMC 1% sebesar 1,9 pada hari kelima dengan suhu inkubasi

37 0C. Uji kuantitatif yang dilakukan terhadap selulase yang dihasilkan oleh isolat

PMP 0126y menghasilkan aktivitas selulase tertinggi pada hari ketiga produksi

dengan aktivitas selulase sebesar 0,108 U/ml dan aktivitas spesifik sebesar

0,120 U/ml.

Enzim selulase dipekatkan dengan melakukan pengendapan amonium

sulfat dan ultrafiltrasi. Persentase amonium sulfat yang terbaik dihasilkan pada

50% amonium sulfat dengan aktivitas selulase yang diperoleh sebesar 0,072 U/ml

dan aktvitas spesifik 0,128 U/mg pada endapan. Pemekatan dengan ultrafiltasi

menghasilkan aktivitas selulase sebesar 0,112 U/ml dan aktivitas spesifik

0,136 U/mg. Pemurnian selanjutnya dilakukan dengan kromatografi penukar

anion (KPA) yang menghasilkan puncak tertinggi pada fraksi ke-48 dengan

aktivitas selulase sebesar 0,154 U/ml ketika dielusi dengan NaCl sebesar

37,3 mM. Pra pemurnian enzim selulase dengan ultrafiltrasi menghasilkan

rendemen sebesar 17,5% dengan tingkat kemurnian 15,82 kali. Enzim hasil

pemurnian dengan KPA menghasilkan rendemen sebesar 19,6% dengan tingkat

kemurnian sebesar 15,08 kali. Hasil SDS-PAGE dan zimogram menunjukkan ada

tiga protein enzim selulase dari isolat PMP 0126y pada berat molekul yaitu

39 kDa, 30 kDa, dan 14 kDa.

Aktivitas optimum enzim selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi tertinggi

pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C. Enzim tetap stabil selama 4 jam

inkubasi pada suhu 30 0C. Aktivitas relatif tertinggi enzim selulase meningkat

dengan penambahan logam CaCl2 sebesar 53% dan menurun pada penambahan

logam ZnCl2 sebesar 78%. Aktivitas enzim selulase tertinggi pada substrat limbah

pengolahan rumput laut Pameungpeuk yang telah didelignifikasi dengan

NaOH 6% sebesar 0,149 U/ml.

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASE DARI

BAKTERI YANG DIISOLASI DARI LIMBAH RUMPUT LAUT

ISNA RAHMADINI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program StudiBioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S.

Judul Penelitian : Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri

yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut

Nama : Isna Rahmadini

NIM : P051090191

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.

Ketua

Dr. Ekowati Chasanah, M.Sc.

Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi

Bioteknologi

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA.

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.

Tanggal Ujian : 16 April 2012 Tanggal Lulus:

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Lahat pada tanggal 19 April 1988 dari Ayah H. Hardi

Bustanuddin dan Ibu Hj. Muchlisa. Penulis merupakan anak kelima dari lima

bersaudara.

Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Lahat dan masuk seleksi

PBUD di Universitas Riau pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan (THP)

dan berhasil menyelesaikan kuliah pada tahun 2009. Pada tahun yang sama,

penulis melanjutkan sekolah dan masuk ke dalam Mayor Multidisiplin, Program

Studi Bioteknologi, IPB.

Penulis melaksanakan penelitian di Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan

(BBP4BKP) dan berhasil menyelesaikan penelitian dengan judul tesis Pemurnian

dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput

Laut.

PRAKATA

Puji syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kepada Allah SWT atas

segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2011 ini ialah

enzim selulase, dengan judul Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari

Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut.

Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tinggi kepada

Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku ketua komisi pembimbing yang

telah memberikan bimbingan dan perhatian penuh dalam penulisan tesis. Ucapan

terima kasih dan penghargaan yang tinggi juga kepada Ibu Dr. Ekowati Chasanah,

M.Sc. selaku anggota komisi pembimbing yang telah memberikan kesempatan

kepada penulis untuk melakukan penelitian dan bimbingan selama penelitian,

serta kepada Ibu Ir. Yusro Nuri Fawzya, M.Si. yang telah banyak memberikan

saran dan bimbingan selama penelitian. Tidak lupa penulis mengucapkan terima

kasih banyak kepada Ibu Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S. sebagai penguji ujian

tesis dan Bapak Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA. sebagai ketua Program Studi

Bioteknologi yang telah memberikan saran dan masukan terhadap penulisan demi

kesempurnaan tesis ini. Di samping itu, penulis menyampaikan terima kasih

kepada Balai Besar Penelitian Pengembangan Pengolahan Produk dan

Bioteknologi Kelautan dan Perikanan (BBP4BKP) yang telah membiayai dan

memberikan segala fasilitas kepada penulis untuk melakukan penelitian di

Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi BBP4BKP Petamburan, Jakarta

Pusat.

Ucapan terima kasih yang sangat mendalam kepada Papa tersayang H.

Hardi Bustanuddin dan Mama tersayang Hj. Muchlisa atas doa dan kasih sayang

tulus yang tidak hentinya kepada penulis. Kepada saudaraku Uni Neci, Uni Neva,

Uni Nani, Kakak Aden, dan semua kakak ipar serta seluruh keponakanku yang

telah memberikan semangat dan doa kepada penulis selama kuliah sehingga dapat

menyelesaikan sekolah di Institut Pertanian Bogor. Rasa terima kasih kepada

rekan-rekan di Laboratorium Bioteknologi BBP4BKP (Mbak Asri, Mbak Maya,

Mbak Ayu, Mbak Dewi, Mas Gintung, Bu Ifah, Bu Devi, Bu Dewi) yang telah

membantu selama penelitian di BBP4BKP. Teman-teman seperjuangan di

Program Studi Bioteknologi Angkatan 2009 dan Jurusan THP, serta semua alumni

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Riau yang sedang sekolah di

IPB atas persahabatan, dorongan, semangat, dan bantuan dalam penyelesaian tesis

ini. Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan yang telah diberikan dengan

balasan yang sempurna. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Mei 2012

Isna Rahmadini

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL .......................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvii

PENDAHULUAN

Latar belakang. ....................................................................................... 1

Tujuan Penelitian .................................................................................... 3

Manfaat Penelitian .................................................................................. 3

TINJAUAN PUSTAKA

Selulosa ................................................................................................... 5

Rumput Laut ........................................................................................... 6

Enzim Selulase........................................................................................ 7

Mikroorganisme Penghasil Enzim Selulase ........................................... 12

Pemekatan Enzim ................................................................................... 13

Kromatografi Kolom............................................................................... 15

Elektroforesis .......................................................................................... 19

Identifikasi Mikroorganisme dengan 16S-rRNA .................................... 20

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat .................................................................................. 23

Bahan dan Alat Penelitian....................................................................... 23

Peremajaan Isolat PMP 0126y ................................................................ 24

Pengamatan Morfologi Isolat PMP 0126y.............................................. 24

Identifikasi Bakteri secara Molekuler ..................................................... 24

Uji Kualitatif Enzim Selulase ................................................................. 26

Penentuan Waktu Optimum Produksi Enzim Selulase ........................... 27

Produksi Enzim Kasar Selulase .............................................................. 28

Pemurnian Enzim Selulase ..................................................................... 29

Analisis Elektroforesis SDS-PAGE dan Zimogram ............................... 30

Pengukuran Kadar Protein ...................................................................... 32

Karakterisasi Enzim Selulase .................................................................. 32

HASIL

Identifikasi Isolat PMP 0126y ................................................................ 35

Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase ........................................... 37

Pemurnian Enzim Selulase ..................................................................... 40

Analisis Berat Molekul Enzim Selulase Menggunakan SDS-

PAGE dan Zimogram ............................................................................. 42

Karakterisasi Enzim Selulase ................................................................. 44

PEMBAHASAN

Identifikasi Isolat PMP 0126y ................................................................ 49

Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase ........................................... 50

Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase ........................................ 51

SIMPULAN ..................................................................................................... 59

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 61

LAMPIRAN ..................................................................................................... 71

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Komposisi kimia rumput laut ................................................................... 7

2 Hidrolisis berbagai substrat oleh enzim selulase ...................................... 9

3 Substrat selulosa berdasarkan kelarutan air dan jenis enzim selulase ...... 10

4 Metode kromatografi untuk fraksinasi protein ......................................... 15

5 Teknik kromatografi yang digunakan pada pemurnian selulase .............. 16

6 Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk sepasang gel ................... 30

7 Aktivitas selulase hasil ultrafiltrasi ........................................................... 41

8 Hasil uji aktivitas selulase PMP 0126y pada beberapa tahap

pemurnian .................................................................................................. 42

9 Pemurnian dan karakterisasi selulase dari berbagai jenis bakteri ............... 54

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Struktur serat selulosa ........................................................................... 5

2 Struktur selulosa teratur (kristalin) dan kurang teratur (amorphous) ... 6

3 Pemecahan selulosa menjadi glukosa oleh enzim selulase .................. 8

4 Klasifikasi enzim selulase.................................................................... 9

5 Mekanisme degradasi selulosa ............................................................ 11

6 Pemurnian enzim dengan kromatografi penukar ion ........................... 17

7 Isolat PMP 0126y ................................................................................ 35

8 Pewarnaan Gram isolat PMP 0126y dengan perbesaran 1000 x ......... 35

9 Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y . 36

10 Sebagian sekuen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y

dari(arah 5’-3’)..................................................................................... 36

11 Pohon filogenetik isolat PMP 0126y ................................................... 37

12 Zona bening isolat PMP 0126y ........................................................... 38

13 Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y................................................ 38

14 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel

bakteri PMP 0126y .............................................................................. 39

15 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel

bakteri PMP 0126y pada media glukosa 0,1% .................................... 39

16 Aktivitas spesifik dari pengendapan amonium selulase

dengan amonium sulfat ....................................................................... 40

17 Profil elusi enzim selulase pada kromatografi DEAE penukar

ionmenggunakan matriks Sepharose ................................................... 41

18 Hasil elektroforesis SDS-PAGE enzim ultrafiltrasi dan

fraksi pemurnian kromatografi penukar anion dan ilustrasi

pita-pita protein selulase PMP 0126y .................................................. 43

19 Hasil zimogram PMP 0126y pada gel akrilamida yang

mengandung CMC 0,1% dan ilustrasi pita yang terbentuk dalam

zimogram ............................................................................................. 44

20 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil

ultrafiltrasi............................................................................................ 45

21 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil

kromatografi penukar anion ................................................................. 45

22 Suhu optimum aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi

dan kromatografi penukar anion .......................................................... 46

23 Pengaruh suhu dan waktu inkubasi terhadap aktivitas

selulase PMP 0126y ............................................................................. 46

24 Substrat spesifik enzim selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi ........... 47

25 Aktivitas relatif selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi pada

penambahan logam 5 mM dan 10 mM .............................................. 48

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Prosedur pembuatan media dan reagen yang digunakan dalam

penelitian .............................................................................................. 73

2 Kurva standar glukosa .......................................................................... 77

3 Kurva standar bovin serum albumin (BSA) ......................................... 78

4 Kurva hubungan log sel dan kerapatan optis dan jumlah sel isolat

PMP 0126y selama 27 jam pengamatan ............................................... 79

5 Hasil uji aktivitas selulase isolat PMP 0126y ....................................... 80

6 Prosedur delignifikasi limbah rumput laut dengan NaOH dan H2SO4

oleh BBP4BKP ............................................................................................................................. 82

7 Gambar metafile hasil sekuensing isolat PMP 0126y (primer f) .......... 83

8 Gambar metafile hasil sekuensing isolat PMP 0126y (primer r) .......... 85

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Perkembangan industri berbasis hayati termasuk hayati laut dengan

memanfaatkan senyawa biologi seperti enzim yang berasal dari mikroorganisme

seperti bakteri dan kapang saat ini terus ditingkatkan di berbagai negara. Telah

banyak peneliti yang mengisolasi bakteri baru dan memanfaatkan senyawa

metabolit bakteri tersebut. Salah satu sumber yang dapat dimanfaatkan pada

sektor Kelautan dan Perikanan yaitu limbah hasil pengolahan rumput laut.

Mengingat bahwa 75% wilayah Indonesia terdiri atas perairan laut, maka berbagai

jenis rumput laut telah banyak dimanfaatkan untuk produk pangan seperti agar-

agar maupun karagenan. Pengolahan agar-agar memanfaatkan rumput laut jenis

Glacilaria sp., sedangkan karagenan menggunakan rumput laut jenis Eucheuma

sp. Berbagai industri rumput laut akan menghasilkan limbah sekitar 65-70% dari

bahan baku segar yang masuk dan diolah (Kim et al. 2008).

Peningkatan pengolahan rumput laut Glacilaria sp. untuk diolah menjadi

agar-agar tentu saja akan meningkatkan jumlah limbah rumput laut sehingga akan

menjadi masalah pencemaran karena limbah tersebut mengandung selulosa yang

sulit larut dalam air. Limbah rumput laut Glacilaria sp. mengandung selulosa

sebanyak 15-25% (Kim et al. 2008). Salah satu alternatif pemanfaatan yang dapat

dilakukan ialah dengan memanfaatkan bakteri asal limbah rumput laut tersebut.

Bakteri yang hidup pada limbah ini diduga dapat menghasilkan enzim yang dapat

menguraikan limbah selulosa menjadi sumber nutrisi untuk pertumbuhannya.

Enzim yang dihasilkan oleh bakteri tersebut dapat menghidrolisis limbah selulosa

menjadi glukosa, yang selanjutnya dapat digunakan sebagai bahan untuk

fermentasi dalam memproduksi bioetanol. Pemanfaatan limbah selulosa dan

bakteri penghasil enzim penghidrolisis selulosa dapat memberikan peluang pada

pengembangan bioenergi dari bahan hayati laut.

Enzim selulase adalah suatu sistem enzim yang terdiri atas tiga tipe enzim

utama yaitu kompleks endo-β-1,4-glukanase (CMCase, Cx selulase endoselulase,

atau carboxymethyl cellulase), kompleks ekso-β-1,4-glukanase (aviselase,

selobiohidrolase, C1 selulase), dan β-1,4-glukosidase atau selobiase (Crueger &

2

Crueger 1984). Ketiga enzim ini bekerja secara sinergis mendegradasi selulosa

dan melepaskan gula reduksi (selobiosa dan glukosa) sebagai produk akhirnya

(Deng & Tabatabai 1994). Enzim selulase akan memutuskan ikatan glikosidik β-

1,4 di dalam selulosa yang memiliki ikatan β-1,4-glikosidik pada polimer

glukosanya (Jeong et al. 2004) sehingga menjadi gula sederhana turunannya.

Proses hidrolisis selulosa dapat dilakukan dengan menggunakan asam dan

suhu tinggi. Proses ini relatif mahal karena kebutuhan energi yang besar serta

dapat mengakibatkan degradasi produk monosakarida yang dihasilkan sehingga

produk yang akan dihasilkan rendah. Riyanti (2008) juga melaporkan efisiensi

proses hidrolisis dengan asam masih rendah karena proses yang dilakukan cukup

panjang dan membutuhkan banyak tahap. Kekurangan lain dari proses ini antara

lain penanganan limbah asam yang tidak mudah. Baru pada tahun 1980-an, mulai

dikembangkan hidrolisis selulosa dengan menggunakan enzim selulase (Coral et

al. 2002). Hidrolisis secara enzimatik akan berjalan spesifik dan efisien sehingga

produk yang akan dihasilkan lebih tinggi dan menghasilkan produk monosakarida

dengan biaya produksi rendah.

Pemanfaatan mikrob dalam menghasilkan enzim selulase akan menjadi

alternatif yang akan terus dikembangkan karena produksi enzim dari mikrob

memiliki beberapa keuntungan. Jika dibandingkan dengan sel hewan maupun

tumbuhan, sel mikrob relatif mudah ditumbuhkan, relatif lebih singkat kecepatan

pertumbuhannya, skala produksi sel besar dan lebih mudah ditingkatkan, biaya

produksi relatif rendah disebabkan waktu yang dibutuhkan untuk produksi enzim

lebih singkat, dan kondisi selama produksi tidak tergantung musim (Poernomo &

Djoko 2003). Beberapa contoh bakteri penghasil enzim selulase, yaitu Bacillus

amyoliquefaciens DL-3 (Jung et al. 2008), B. pumilus EB3 (Arifin 2006), B.

flexus (Trivedi et al. 2011), B. licheniformis C108 (Aygan et al. 2011),

Cellulomonas biazotea (Rajoka & Malik 1997), C. flavigena (Ponce & Torre

2001), Streptomyces sp. galur J2 (Jaradat et al. 2008), S. ruber (El-Sersy et al.

2010), Pseudomonas sp (Gautam et al. 2010), P. fluorescens sub sp. cellulosa

(Shimada et al. 1994). Beberapa isolat bakteri penghasil enzim selulase untuk

bioetanol yaitu Escherichia coli KO11 (Jong et al. 2011), Zymomonas mobilis

3

NRRL-B-14023 (Ruanglek et al. 2006), Z. mobilis ATCC 10988 (Tanaka et al.

1999).

Selain dalam bidang industri, pemanfaatan enzim selulase dari bakteri

dapat memberikan solusi dalam masalah pencemaran yakni mengurangi jumlah

limbah selulosa, salah satunya dari industri pengolahan agar-agar dan karagenan,

dan mendapatkan produk bernilai tambah dari pemanfaatan limbah rumput laut

tersebut. Balai Besar Penelitian Pengembangan Pengolahan Produk dan

Bioteknologi Kelautan Perikanan (BBP4BKP) telah melakukan eksplorasi mikrob

dari rumput laut termasuk limbah pengolahan rumput laut. Beberapa isolat bakteri

yang memiliki aktivitas selulase ekstraseluler yaitu isolat PMP 0126y berhasil

diisolasi dari limbah pengolahan agar-agar rumput laut Glacilaria sp. dari daerah

Pameungpeuk, Garut Jawa Barat (Munifah et al. 2011).

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi, melakukan pemurnian

parsial, dan mengkarakterisasi enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP

0126y penghasil enzim selulase dari limbah pengolahan rumput laut Glacilaria

sp., serta melakukan identifikasi secara molekuler bakteri tersebut.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi mengenai

bakteri penghasil enzim selulase dari limbah rumput laut dan enzim yang

dihasilkan nantinya diharapkan dapat diaplikasikan dalam proses produksi

bioetanol berbahan dasar limbah rumput laut.

4

TINJAUAN PUSTAKA

Selulosa

Selulosa merupakan polimer karbohidrat terbanyak yang terdapat di alam

(Han & Chen 2007). Selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding sel

tumbuhan bersama-sama dengan hemiselulosa dan pektin. Komposisi selulosa

dalam tumbuhan dapat mencapai 40-50% dari massa tumbuhan sehingga selulosa

merupakan biopolimer terbarukan yang paling berlimpah di alam (Milala et al.

2005). Classen (1999) menambahkan bahwa diperkirakan 50% dari biomassa

tumbuhan berupa selulosa dan jumlahnya sekitar 50 milyar ton. Selulosa

merupakan polimer glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β-1,4-D-glukosidik

(Gambar 1).

Gambar 1 Struktur serat selulosa (Beguin & Aubert 1994).

Polimer glukosa tersusun secara paralel dan berikatan silang membentuk

struktur kristalin yang disebut mikrofibril. Panjang mikrofibril ini bervariasi dari

2.000-15.000 unit glukosa, tergantung organismenya. Bentuk mikrofibril selulosa

ditentukan oleh kompleks geometri sintase dan lingkungan lokal. Pada tumbuhan,

unit mikrofibril mempunyai jumlah sekitar 3-4 unit dan terdiri atas sekitar 36

rantai selulosa dan seringkali dikemas dalam bentuk lebih besar (Doblin et al.

2002).

Mikrofibril pada selulosa memiliki orientasi beragam, tersusun secara

pararel, dan setiap molekul glukosa dapat berotasi hingga 1800 (Beguin & Aubert

1994; Brown 1996). Mikrofibril ini pada tempat-tempat tertentu memiliki struktur

yang teratur (crystalin) dan pada tempat-tempat tertentu memiliki struktur yang

5

kurang teratur (amorphous). Struktur amorphous terjadi karena proses kristalisasi

yang berlangsung secara tidak sempurna pada mikrofibril yang terbentuk (Gambar

2). Dimensi serat selulosa dan proporsi dari bagian kristalin dan amorf sangat

tergantung pada keadaan alaminya (Linder & Teeri 1997). Setiap serat selulosa

tersusun oleh kira-kira 3.000 molekul glukosa dan berat molekulnya diperkirakan

mencapai 500.000 (Hardjo et al. 1984).

Gambar 2 Struktur selulosa teratur (kristalin) dan kurang teratur (amorphous)

(Beguin & Aubert 1994).

Secara alamiah molekul selulosa tersusun dalam fibril yang terdiri atas

beberapa molekul glukosa yang dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang kuat

mengakibatkan dapat tahan terhadap tarikan tinggi. Fibril-fibril ini membentuk

struktur kristal yang dibungkus oleh lignin, oleh karena itu sumber selulosa dari

tumbuh-tumbuhan sulit sekali dihidrolisis secara langsung oleh katalis asam.

Molekul selulosa berbentuk lurus dan tidak pernah bercabang, serta gugus

hidroksilnya bebas membentuk ikatan hidrogen dengan gugus hidroksil molekul

selulosa lainnya yang terletak sejajar (paralel) dengannya (Beguin & Aubert

1994).

Rumput Laut

Selulosa juga diproduksi oleh tanaman laut yaitu rumput laut (Linder &

Teeri 1997). Rumput laut merupakan makroalga laut yang dapat digolongkan ke

dalam alga merah, alga hijau, dan alga coklat. Rumput laut tidak memiliki daun,

batang, dan akar sejati. Akan tetapi, bagian tubuhnya disebut dengan talus, dapat

berupa filamen, lembaran tipis berdaun banyak, persegi dengan kulit keras, dan

lumut raksasa. Uji proksimat yang dilakukan pada ampas rumput laut kering

6

didapatkan presentase masing-masing komponen kadar air sebesar 11.28%, kadar

abu 36,05%, kadar lemak 0,42%, kadar protein 1,86%, kadar serat kasar 8,96%

dan karbohidrat 41,43% (Harvey 2009).

Jenis rumput laut yang telah banyak dimanfaatkan berasal dari marga

Euchema, Gelidium, Gracilaria, Hypnea, dan Sargassum. Selain itu, terdapat

jenis lainnya seperti Caulerpa dan Dictosphaeria masih dimanfaatkan dalam skala

kecil untuk konsumsi lokal (Atmadja et al. 1996). Beberapa jenis rumput laut

memiliki komposisi kandungan selulosa maupun kandungan senyawa kimia

lainnya yang berbeda. Berikut ini komposisi kimia dari beberapa jenis rumput laut

(Tabel 1).

Tabel 1 Komposisi kimia rumput laut (Kim et al. 2008)

Jenis alga Selulosa

(%)

Galaktan (%) Karbo-

hidrat (%)

Protein

(%)

Lipid

(%)

Alga merah

Gelidium amansii,

marocco

Gelidium amansii, joju

Glacilaria

E. cottonii

16,8

23

19,7

7,1

55,2

56,4

54,4

43,4

72,0

79,4

74,1

50,5

21,1

11,8

11

4,9

6,9

8,8

14,9

44,6

Alga hijau

Codium fragile

10,9

47,8

58,7

34,7

6,6

Alga coklat

Undaria pinattinda

Laminaria japonica

2,4

6,7

38,7

40,0

41,1

46,7

24,2

12,2

34,7

38,1

Rumput laut Glacilaria sp. banyak dimanfaatkan dalam industri

pengolahan agar-agar. Limbah industri agar-agar yang dihasilkan mengandung

selulosa sebesar 15-25% (Kim et al. 2008). Selain itu, limbah agar-agar Glacilaria

sp. merupakan salah satu sumber bakteri yang berpotensi menghasilkan enzim

selulase. Pemanfaatan limbah agar-agar dan enzim selulase dari bakteri tersebut

memegang peranaan yang sangat penting dalam pengembangan bioenergi.

Enzim Selulase

Enzim selulase atau enzim yang dikenal dengan nama sistematik β-1,4

glukan-4-glukano hidrolase adalah enzim yang dapat menghidrolisis selulosa

dengan memutus ikatan glikosidik β-1,4 dalam selulosa, selodektrin, selobiosa,

dan turunan selulosa lainnya menjadi gula sederhana atau glukosa. Sistem

7

pemecahan selulosa menjadi glukosa terdiri atas tiga jenis enzim selulase yaitu

endo-β-1,4-glukanase, ekso-β-1,4-glukanase, dan β-glukosidase. Endo-β-1,4-

glukanase menyerang bagian tengah rantai secara random, ekso-β-1,4-glukanase

(selobiohidrolase) memecah unit-unit disakarida (selobiosa) dari ujung rantai, dan

β-glukosidase memecah selobiosa menjadi glukosa (Da silva et al. 2005) (Gambar

3).

Gambar 3 Pemecahan selulosa menjadi glukosa oleh enzim selulase.

Menurut Enari (1983) (Tabel 2) demikian pula Prescott dan Dunns (1981)

(Gambar 4) mengelompokkan enzim utama selulase berdasarkan kespesifikan

substrat masing-masing enzim yaitu :

1. Endo-β-1,4-glukanase (β-1,4-D-glukan-4-glukanohidrolase, EC 3.2.1.4)

menghidrolisis ikatan glikosidik β-1,4 secara acak. Enzim ini dapat

bereaksi dengan selulosa kristal tetapi kurang aktif. Enzim ini secara

umum dikenal sebagai CMC-ase atau selulase Cx.

2. β -1,4-D-glukan selobiohidrolase (EC.3.2.1.91) atau secara umum dikenal

dengan selulase C1, menyerang ujung rantai selulosa non pereduksi dan

membebaskan selobiosa.

8

3. β-1,4-D-glukan glukohidrolase (EC.3.2.1.74) menyerang ujung rantai

selulosa non pereduksi dan membebaskan glukosa. Enzim ini

menghidrolisis selulosa yang telah dilunakkan dengan asam fosfat, selo-

oligosakarida dan CMC.

4. β-1,4-glikosidase (β-1,4-D-glukosida glukohidrolase, EC 3.2.1.21)

menghidrolisis selobiosa dan rantai pendek selo-oligosakarida yang

menghasilkan glukosa. Enzim ini tidak dapat memecah selulosa dan

selodekstrin.

Gambar 4 Klasifikasi enzim selulase (Prescott & Dunns 1981).

Tabel 2 Hidrolisis berbagai substrat oleh enzim selulase (Enari 1983)

Jenis Enzim

selulolitik

Substrat

Selulosa

kristalin

CMC Selulosa

amorf

Selotetraosa Selobiosa

Endoglukanase - + + + -

Selobiohidrolase + - + + -

β- Glukosidase - - - + +

Berdasarkan kelarutannya, selulosa dapat dibagi menjadi dua katagori

yaitu substrat yang larut dalam air dan substrat yang tidak dapat larut dalam air

beserta enzim selulase yang menghidrolisis substrat tersebut (Tabel 3).

Enzim

selulase

β-1,4

glukanase

β-1,4-glukan

glukohidrolase

β-1,4-glukan

selobiohidrolase

(=C1 selulase)

Endo-β-1,4-glukanase

(=Cx-selulase)

Ekso-β-

1,4,

glukanase

β-1,4 glukosidase

9

Tabel 3 Substrat selulosa berdasarkan kelarutan air dan jenis enzim selulase

(Zhang et al. 2006)

Substrat Selulosa Enzim Selulase

Larut dalam air

- Rantai pendek (derajat polimerisasi rendah)

Silodekstrin

Radio-labeled selodekstrin

- Turunan silodekstrin

β-methyllumberlliferil oligosakarida

p-nitrofenol oligosakarida

- Turunan selulosa dengan rantai panjang

Carboxymethylecellulose (CMC)

Dye CMC

Tidak larut dalam air

- Selulosa kristalin

Katun, selulosa mikrokristalin (Avisel),

selulosa bakteri

- Selulosa Amorf – PASC

- Dyed Selulosa

- Kromogenik dan turunan fluoreforik

Trinitrofenil-karboksimetilselulase

(TNP-CMC)

- Flurant Selulosa

- α-selulosa

Endo, ekso, BG

Endo, ekso, BG

Endo, ekso, BG

Endo, ekso, BG

Endo

Endo

Total,endo, ekso

Total, endo.ekso

Total, endo

Endo

Endo, total

Total

Endo ; endoglukanase, Ekso ; eksoglukanase, BG ; glukosidase, Total ; ketiga tipe

enzim selulase.

Perbedaan antara masing-masing enzim selulase terletak pada kespesifikan

struktur di sekeliling substrat. Perbedaan kespesifikan dari enzim endoglukanase

dan selobiohidrolase bersifat tidak mutlak karena kedua enzim tersebut dapat

menghidrolisis ikatan β-1,4 glukosida dari selulosa amorf. Penentuan aktivitas

enzim selulase akan sulit apabila filtrat yang akan diukur aktivitas enzimnya

merupakan campuran dari berbagai enzim selulase. Enzim-enzim ini tidak hanya

dapat menghidrolisis substrat yang sama tetapi juga dapat bekerja secara sinergis

memecah substrat yang sama, sehingga menyebabkan aktivitas yang diukur

dipengaruhi oleh proporsi dari masing-masing enzim yang ada (Enari 1983).

Aktivitas enzim endoglukanase pada umumnya dapat diuji dengan substrat

CMC (Carboxymethyl cellulose) sehingga enzim endoglukanase juga disebut

dengan istilah CMCase, sedangkan aktivitas enzim selobiohidrolase atau

10

eksoglukanase seringkali diuji dengan substrat avisel sehingga enzim

eksoglukanase disebut dengan aviselase (Zhang et al. 2006).

Tahapan hidrolisis selulosa tergantung kepada struktur selulosa, interaksi

antara enzim selulase dengan serat selulosa, mekanisme hidrolisis enzim tersebut

di alam dan inhibitor yang terbentuk. Fase adsorbsi dan pembentukan kompleks

enzim substrat adalah fase kritis di dalam hidrolisis selulosa. Glukosa dan

selobiosa adalah inhibitor enzim dalam menghidrolisis selulosa. Selobiosa

menghambat enzim selobiohidrolase dan glukosa menghambat enzim

penghidrolisis selobiosa yaitu β-glukosidase pada kompleks enzim selulase.

Selobiosa mempunyai potensi lebih kuat menjadi inhibitor dibandingkan dengan

glukosa (Coughlan 1985). Laju hidrolisis enzim selulase ditentukan oleh struktur

substrat (Mandels 1985). Struktur kristal lebih sulit dihidrolisis dibandingkan

dengan struktur amorf maka hidrolisis dilakukan oleh enzim endoselulase atau

endoglukanase (Coughlan 1985) (Gambar 5).

Gambar 5 Mekanisme degradasi selulosa (Beguin & Aubert 1994).

Aktivitas enzim selulase dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain

derajat keasaman (pH), suhu, dan senyawa penghambat. Aktivitas enzim

dipengaruhi oleh pH karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah

dipengaruhi oleh pH sehingga apabila terjadi perubahan pH maka akan

menyebabkan denaturasi enzim dan menghilangkan aktivitas enzim. Suhu

memiliki peranan yang sangat penting dalam reaksi enzimatik. Ketika suhu

11

bertambah sampai suhu optimum, kecepatan reaksi enzim naik karena energi

kinetik bertambah. Bertambahnya energi kinetik enzim akan mempercepat gerak

vibrasi, translasi, dan rotasi baik enzim maupun substrat. Hal ini akan

memperbesar peluang enzim dan substrat bereaksi. Ketika suhu lebih tinggi dari

suhu optimum, protein enzim berubah konformasi sehingga gugus reaktif

terhambat. Perubahan konformasi ini dapat menyebabkan enzim terdenaturasi.

Substrat juga dapat berubah konformasinya pada suhu yang tidak sesuai, sehingga

substrat tidak dapat masuk ke dalam sisi aktif enzim (Ottaway 1984).

Selain pH dan suhu, faktor lain yang mempengaruhi aktivitas selulase

yaitu adanya senyawa penghambat berupa ion logam. Penghambatan tersebut

dapat dinetralkan dengan menambahkan sistein sehingga aktivitas enzim dapat

berlangsung kembali (Kulp 1975). Beberapa senyawa logam dan senyawa lainnya

yang dapat menghambat aktivitas selulase ialah Hg2+

, Ag2+

, dan Cu2+

(Deng &

Tabatai 1994; Oikawa et al. 1994), glukanolakton (Kulp 1975), surfaktan,

senyawa pengkelat khususnya Sodium Dodecyl Sulphate (SDS), Ethylene

Diamine Tetraacetyc Acid (EDTA) (Oikawa et al. 1994), laktat dalam konsentrasi

agak rendah (Chesson 1987), dan etanol serta alkohol lainnya (Ooshima et al.

1985). Senyawa penghambat tersebut dapat menekan seluruh kecepatan hidrolisis

dengan menghambat adsorbsi eksoglukanase dan endoglukanase pada selulosa,

dan menghambat aksi sinergis eksoglukanase dan endoglukanase yang bekerja

pada permukaan selulosa.

Mikroorganisme Penghasil Enzim Selulase

Mikroorganisme didefinisikan sebagai organisme yang berukuran sangat

kecil (biasanya kurang dari 1 milimeter) sehingga untuk mengamatinya

diperlukan bantuan mikroskop atau alat pembesar. Mikroorganisme dapat berupa

sel tunggal atau kelompok sel yang mempunyai kemampuan untuk mengatur

proses hidupnya tanpa bergantung sel lainnya. Mikroorganisme terdiri atas

bakteri, virus, dan cendawan (fungi) yang masing-masing memiliki perbedaan

karakteristik secara morfologi, ekologi, dan fisiologi. Bakteri merupakan sel

prokariot dengan rRNA bakteri yang dihubungkan oleh ikatan ester dan membran

lipid yang merupakan diasil gliserol dieter (Madigan et al. 2000).

12

Beberapa contoh genus bakteri yang diketahui mempunyai aktivitas

selulolitik ialah Acetobacter, Bacillus, Clostridium, Cellulomonas, Pseudomonas,

Cytophaga, Sarcina, dan Vibrio, sedangkan contoh genus cendawan yang

mempunyai aktivitas selulolitik ialah Bulgaria, Chaetomium, Helotium, Coriolus,

Phanerochaete, Poria, Schizophyllum, Serpula, Aspergillus, Cladosporium,

Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium, dan

Trichoderma (Rao 1994). Beberapa jenis organisme juga dapat menghasilkan

enzim selulase seperti rayap (Watanabe & Tokuda 2001), remis (Xu et al. 2000),

dan arabidopsis.

Di alam, degradasi selulosa kebanyakan dilakukan oleh mikroorganisme

aerobik. Mikroorganisme aerobik menghasilkan enzim selulase nonkompleks

yang terdiri atas endoglukanase, eksoglukanase, dan glukosidase yang bekerja

secara sinergis untuk menghidrolisis selulosa. Mikroorganisme anaerobik

menghasilkan enzim selulase kompleks yang disebut selulosom (Doi et al. 2003;

Bayer et al. 2004). Meskipun mikroorganisme anaerobik hanya menyumbang

sekitar 5-10% dari biodegradasi total selulosa di alam, namun peranannya sangat

penting karena bertanggung jawab terhadap degradasi daerah anoksik pada danau,

laut, dan saluran pencernaan hewan pemamah biak maupun rayap, yang tidak

dapat dilakukan oleh mikroorganisme aerobik (Zhang et al. 2006).

Pemekatan Enzim

Pada tahap awal pemurnian enzim biasanya dilakukan klarifikasi dan

pengendapan protein enzim. Klarifikasi berfungsi memisahkan larutan enzim dari

partikel-partikel yang tidak larut, misalnya debris sel dan partikel substrat.

Klarifikasi dapat dilakukan dengan penyaringan atau sentrifugasi. Pemekatan

protein enzim merupakan tahap awal dari prosedur pemurnian enzim sebelum

tahap pemurnian berikutnya atau dapat pula digunakan untuk keperluan analisis

enzim. Pemekatan protein enzim berfungsi untuk meningkatkan konsentrasi

protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan protein enzim

dengan protein pengotor yang lain (Harris 1989).

Pemekatan protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu analitik dan

preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pengendapan asam

(misalnya asam trikloroasetat), pengendapan organik (misalnya aseton atau

13

etanol), dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein.

Pemekatan protein dengan metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas

protein misalnya dengan menggunakan pengendapan garam, pengendapan dengan

pelarut organik, pengendapan dengan polimer organik, ultrafiltrasi, liofilisasi, dan

dialisis (Harris 1989).

Metode pengendapan protein yang biasa dilakukan dalam pengendapan

selulase ialah dengan menggunakan amonium sulfat (Jung et al. 2008) dan

ultrafiltrasi (Arifin 2006). Amonium sulfat merupakan garam yang paling sering

digunakan untuk mengendapkan protein karena memiliki daya larut tinggi di

dalam air, relatif tidak mahal, dan kestabilan protein di dalam larutan amonium

sulfat (2M- 3M) tahan bertahun-tahun (Scopes 1987).

Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein

yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam,

dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH

dan suhu tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in).

Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada

penambahan garam dengan konsentrasi tertentu menyebabkan kelarutan protein

menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam semakin

banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan

protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregasi, dan

kemudian mengendap (Harris 1989; Scopes 1987).

Garam berlebih yang terdapat di dalam larutan enzim setelah tahap

fraksinasi dapat dihilangkan dengan cara dialisis. Pada tahap dialisis, protein

ditempatkan di dalam kantung (membran) semipermeabel yang direndam di

dalam larutan bufer tertentu. Molekul yang berukuran kecil akan ke luar melalui

membran, dan molekul yang berukuran besar akan tertahan di dalam membran

dialisis. Ukuran pori kantung dialisis yang terbuat dari bahan selulosa asetat

berdiameter 1-20 nm. Ukuran ini menunjukkan berat molekul minimum yang

dapat tertahan di dalam membran. Selain dengan dialisis, penghilangan garam

dapat dilakukan dengan filtrasi gel. Metode ini biasanya diterapkan untuk sampel

yang sedikit, yaitu tidak melampaui 25-30% volume kolom untuk mendapatkan

resolusi yang memadai antara protein dan garam. Matriks filtrasi gel memiliki

14

pori yang berukuran kecil, misalnya Sephadex G-25 buatan Phamacia.

Kekurangan metode ini adalah terjadi pengenceran sampel protein (Harris 1989).

Ultrafiltrasi merupakan suatu metode untuk mengkonsentrasikan protein

dengan menekan cairan larutan protein enzim supaya tertahan di dalam membran.

Ukuran cairan yang akan ditahan (retentat) dan yang dikeluarkan (permeat) sesuai

dengan ukuran membran yang digunakan. Prinsip pemisahan dengan ultrafiltrasi

adalah pemisahan komponen berdasarkan berat molekul (Bollag & Edelstein

1991). Pemisahan komponen ini terjadi karena adanya membran ultrafiltrasi.

Membran ultrafiltrasi berfungsi sebagai penghalang (barrier) tipis yang sangat

selektif di antara dua fasa, hanya dapat melewatkan komponen tertentu dan

menahan komponen lain dari suatu aliran fluida yang dilewatkan melalui

membran (Mulder 1996). Proses membran ultrafiltrasi merupakan upaya

pemisahan dengan membran yang menggunakan gaya dorong beda tekanan yang

dipengaruhi oleh ukuran dan distribusi pori membran (Malleviale 1996).

Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom pada prinsipnya yaitu pengaliran suatu cairan melalui

kolom yang mengandung bahan pengisi dan substanta yang ingin dipisahkan

menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan terhadap daya ikat bahan

pengisi (Tabel 4).

Tabel 4 Metode kromatografi untuk fraksinasi protein (Ersson et al. 1998)

Sifat Protein Jenis Kromatografi

Ukuran dan bentuk Filtrasi gel

Muatan neto dan distribusi grup

bermuatan

Penukar ion

Titik isoelektris Kromatofokusing

Hidrofobisitas Interaksi hidrofobik dan fase balik

Pengikatan logam Afinitas ion logam terimobilisasi

Kandungan tiol yang terbuka Kovalen

Afinitas biospesifik terhadap ligan,

inhibitor, reseptor, antibodi, dsb

Afinitas

Teknik kromatografi kolom banyak digunakan dalam bioteknologi untuk

mengamati tingkat kemurnian dan stabilitas protein (Neville 1998). Beberapa

peneliti melakukan pemurnian enzim selulase yang dihasilkan oleh bakteri dengan

berbagai teknik kromatografi kolom (Tabel 5).

15

Tabel 5 Teknik kromatografi yang digunakan pada pemurnian selulase

Selulase Metode Kromatografi Sumber

Endoglukanase dari

Sinorhizobium fredii

Penukar ion, interaksi

hidrofobisitas

Po et al. (2004)

Endoglukanase dari

Mucor circinelloides

Gel filtrasi Saha (2003)

Endoglukanase dari

Bacillus sp

Penukar ion, gel filtrasi Mawadza et al. (2000)

Endoglukanase dari

Bacillus sp

Penukar ion Singh et al. (2004)

Endoglukanase dari

Pseudomonas fluorescens

Penukar ion, gel filtrasi Bakare et al. (2005)

Endoglukanase dari

Bacillus sp

Penukar ion Ji et al. (2005)

Endoglukanase dari

Bacillus pumilus

Gel filtrasi, penukar ion Christakopoulus et al.

(1999)

Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas antara

molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif yang

bermuatan berlawanan sebagai pengisi kolom (Scopes 1987). Kromatografi

penukar ion memisahkan protein berdasarkan muatan bersih protein dan kekuatan

relatif dari muatan bersih protein tersebut. Kromatografi penukar ion memerlukan

fase diam yang biasanya merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut

seperti selulosa, dekstran dan agarosa. Gugus penukar ion diimobilisasikan pada

matriks. Beberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (AE-), kuaternari

aminoetil (QAE-), dan dietilaminoetil (DEAE-). Gugus penukar kation yaitu

sulfopropil (SP-), metil sulfonat dan karboksimetil (CM-). Penukar ion lemah

seperti DEAE- (penukar anion lemah) dan CM- (penukar kation lemah) hanya

dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH sempit dan kehilangan

muatannya pada pH tertentu. Gugus penukar anion lemah DEAE- terionisasi

sempurna di bawah pH 6,0 dan akan kehilangan muatannya pada pH 9,0,

sedangkan gugus penukar kation lemah CM- akan kehilangan muatannya di

bawah pH 4,5. Penukar ion kuat dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada

rentang pH yang luas. Gugus penukar ion QAE- (penukar anion kuat) dan SP-

(penukar kation kuat) dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH

1-10 (Coligan et al. 2003).

16

Kolom untuk kromatografi penukar ion biasanya tidak panjang dan

memiliki diameter lebih besar dari pada kolom untuk filtrasi gel. Banyaknya

sampel yang dimasukkan umumnya sekitar 10-20% dari kapasitas kolom.

Pembilasan dengan gradien konsentrasi NaCl yang linier baik digunakan untuk

memisahkan molekul-molekul yang memiliki perbedaan muatan bersih yang tidak

terlalu besar sedangkan gradien NaCl bertahap baik digunakan untuk memisahkan

molekul-molekul yang memiliki perbedaan muatan bersih yang besar.

Pada dasarnya prinsip kromatografi penukar ion adalah ion bermuatan

bebas dipertukarkan dengan ion yang memiliki tipe muatan yang sama. Protein

yang bermuatan negatif dapat ditukar dengan ion klorida. Awalnya gugus

fungsional matriks yang bermuatan negatif mengikat ion dari bufer (misalnya

Na+). Pada saat sampel dimasukkan ke dalam kolom, maka protein yang

bermuatan positif akan menggantikan ion Na+

sedangkan protein yang bermuatan

negatif atau netral tidak akan terikat. Protein yang tidak terikat dibilas dengan

menggunakan bufer (biasanya dengan konsentrasi 10-50 mM). Selanjutnya ikatan

protein yang terikat gugus fungsional matriks akan terlepas setelah dibilas dengan

bufer yang mengandung NaCl atau KCl secara linier atau bertahap sehingga

protein yang memiliki ikatan lemah dengan matriks akan lepas terlebih dahulu

dan diikuti oleh protein yang memiliki ikatan lebih kuat (Gambar 6).

Gambar 6 Pemurnian enzim dengan kromatografi pertukar ion

(http://voh.chem.ucla.edu/vohtar/winter99/153L/lec1.html).

17

Pemilihan penukar ion tergantung pada muatan protein target. Muatan

bersih protein tergantung pada pH yaitu protein akan bermuatan positif dengan

menurunkan pH dan bermuatan negatif dengan menaikkan pH. Pada saat

menentukan pH untuk kromatografi, kestabilan protein target pada pH yang

dipilih perlu dijaga. Apabila protein stabil pada pH di atas titik isoelektriknya (pI)

maka digunakan penukar anion (positif), tetapi bila protein stabil pada pH di

bawah pI nya maka digunakan penukar kation (negatif). Jika protein stabil pada

rentang 1 unit di atas dan di bawah pI maka kedua penukar ion dapat digunakan.

Matriks yang mengikat gugus fungsional menentukan sifat aliran, ion yang dapat

diikat, kestabilan mekanik dan kimia. Ada 3 kelompok matriks yang biasanya

digunakan, yaitu: 1) polistiren, poliakrilik atau polifenol; 2) selulosa; dan 3)

dekstran (Sephadex) atau agarosa (Sepharose). Matriks polistiren dan polifenolik

lebih sering digunakan untuk memisahkan molekul-molekul kecil seperti asam-

asam amino, peptida kecil, nukleotida, nukleotida siklik, asam-asam organik.

Matriks selulosa biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk

enzim), polisakarida dan asam nukleat. Matriks DEAE-selulosa, CM-selulosa dan

fosfoselulosa paling sering digunakan. Matriks polidekstran dan agarosa

(misalnya DEAE-Sephadex, CM-Sephadex) digunakan untuk memisahkan

protein, hormon, tRNA dan polisakarida (Scopes 1987).

Pemilihan penukar ion kuat atau lemah tergantung pada pH molekul

target. Molekul yang memerlukan pH sangat rendah atau sangat tinggi untuk

dapat berionisasi atau apabila molekul stabil pada pH ekstrem maka penukar ion

kuat harus digunakan. Penukar ion lemah akan memberikan hasil pemisahan yang

lebih baik untuk protein-protein yang memiliki muatan bersih yang berdekatan.

Keuntungan kromatografi penukar ion diantaranya adalah tidak merusak protein

yang dimurnikan dan pada umumnya memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi.

Kelemahannya adalah protein-protein yang memiliki distribusi gugus bermuatan

pada permukaannya atau memiliki pI yang sama atau mirip akan sulit dipisahkan

dengan cara kromatografi penukar ion. Selain itu larutan enzim hasil kromatografi

penukar ion mengandung kadar garam cukup tinggi yang harus dihilangkan untuk

proses pemurnian selanjutnya (Scopes 1987).

18

Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu proses perpindahan partikel-partikel bermuatan

atau suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran berdasarkan atas

pergerakan partikel koloid yang bermuatan di bawah pengaruh medan listrik

(Suhartono 1989). Elektoforesis dengan menggunakan gel polakrilamida sodium

dodesil sulfat (SDS-PAGE) merupakan teknik elektroforesis gel yang

menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang bermuatan

berdasarkan berat molekulnya. Penentuan berat molekul yang menyusun enzim

selulase dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE (Sodium dodecyl

sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis). Pada metode ini digunakan 2 gel

yaitu gel penahan (stacking gel) dan gel pemisah (separating gel). Gel akrilamida

diperoleh dengan cara polimerisasi akrilamida dengan sejumlah crosslinking

agent metilen bis akrilamida dan amonium persulfat (APS) sebagai katalisator.

Radikal bebas yang terbentuk dari pelarutan amonium persulfat dalam air akan

bereaksi dengan akrilamida membentuk akrilamida aktif yang dapat bereaksi satu

dengan yang lain membentuk polimer (Janson & Ryden 1998).

Ada beberapa jenis elektroforesis, yaitu elektroforesis kertas,

elektroforesis selulosa asetat/nitrat dan elektroforesis gel. Elektroforesis gel

berguna untuk pemisahan protein, sedangkan dua jenis lainnya berguna untuk

memisahkan molekul yang lebih kecil. Matriks gel dapat berupa pati, agarosa atau

poliakrilamida. Saat ini gel poliakrilamida lebih sering digunakan. Matriks ini

disusun oleh akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida yang berpolimerisasi

dengan bantuan katalisator amonium persulfat dan N,N,N’,N’tetrametilen diamin

(TEMED). Elektroforesis gel dengan SDS digunakan untuk meneliti jumlah dan

ukuran rantai protein atau rantai subunit protein. SDS merupakan detergen lemah

anionik yang akan memutuskan ikatan di antara subunit penyusun dan membentuk

kompleks yang bermuatan negatif sehingga pergerakan protein dalam medan

listrik hanya berdasarkan pada ukuran molekul sedangkan β-merkaptoetanol

digunakan untuk mereduksi ikatan disulfida pada protein. Protein yang berukuran

kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan yang berukuran besar (Copeland

1994).

19

Elektroforesis protein dapat dilakukan dengan proses denaturasi (SDS-

PAGE) dan nondenaturasi (Native-PAGE). Mekanisme pada SDS-PAGE

dijelaskan bahwa protein akan bereaksi dengan SDS yang merupakan detergen

anionik membentuk kompleks yang bermuatan negatif. Protein akan terdenaturasi

dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS yang berbentuk elips

atau batang yang ukurannya sebanding dengan berat molekul protein. Protein

dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini akan dapat terpisahkan

berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel

poliakrilamida (Smith 1984).

Berbeda dengan SDS-PAGE, pada gel pemisah disisipi substrat yang akan

dihidrolisis oleh enzim selama masa inkubasi yang disebut sebagai zimogram.

Elektroforesis zimogram memisahkan protein terlarut yang tidak mengendap atau

beragregasi selama elektroforesis. Pada elektroforesis gel yang terdenaturasi,

seperti pada SDS-PAGE, molekul-molekul protein yang telah terpisah dengan

elektroforesis dapat kehilangan aktivitas biologi dan biokimianya, tetapi pada

elektroforesis zimogram aktivitas tersebut masih bertahan (Dunn 1989). Enzim

dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS), namun dalam kondisi tidak tereduksi.

SDS dilepaskan dengan penambahan larutan renaturasi (misalnya detergen Triton

X-100) dan kembali terjadi pelipatan protein. Kemudian gel diwarnai dengan

pewarna yang sesuai dengan enzim yang diujikan. Metode zimogram bersifat

mudah, sensitif, dan kuantitatif dalam menganalisis aktivitas enzim (Kleiner &

Stetler-Stevenson 1994; Leber & Balkwil 1997).

Berat molekul protein dapat ditetapkan dengan menggunakan protein

standar yang telah diketahui berat molekulnya dan memperbandingkan nilai Rf

(mobilitas relatif) yang diperoleh. Pita pada gel dapat divisualisasi dengan

pewarnaan, misalnya menggunakan pewarna coomasie blue atau pewarna perak

nitrat (Suhartono 1989).

Identifikasi Mikroorganisme dengan 16S-rRNA

Madigan et al. (2000) menyatakan bahwa pada bakteri atau prokariot

memiliki tiga macam ribosom RNA (rRNA) yaitu 23S-rRNA (2900 unit

nukleotida), 16S-rRNA (1500 nukleotida) dan 5S-rRNA (sekitar 120 nukleotida).

Gen penyandi 16S-rRNA mempunyai daerah sekuen yang konservatif yang dapat

20

digunakan untuk menduga hubungan kekerabatan secara alami antara spesies yang

mempunyai kekerabatan dekat sehingga sangat menguntungkan untuk analisis

filogenetik bakteri di tingkat famili, genus, spesies, maupun subspesies. (Chen et

al. 2000). Woese (1987) menambahkan bahwa molekul 16S-rRNA paling banyak

digunakan sebagai target asam nukleat untuk mendeteksi dan mengidentifikasi

bakteri yang belum pernah terdeteksi sebelumnya. Sekuen variabel berevolusi

pada laju yang berbeda sehingga memberikan cukup informasi untuk menentukan

kedekatan atau jauhnya hubungan filogenetik suatu organisme (Woese 1987).

Madigan et al. (2000) menyatakan sekuen gen penyandi 16S-rRNA

digunakan untuk menentukan pohon filogenetik dari keragaman makhluk hidup di

bumi. Kekerabatan evolusi antar spesies dalam keseluruhan sistem biologi

diperlukan parameter yang memenuhi persyaratan sebagai berikut : 1) terdapat

pada semua makhluk hidup, 2) fungsinya identik, 3) dapat dibandingkan secara

obyektif, dan 4) parameter tersebut berubah sesuai dengan jarak evolusinya

sehingga dapat dijadikan sebagai kronometer evolusi yang handal.

Analisis molekuler dengan sekuen gen penyandi 16S-rRNA pada

prinsipnya meliputi ekstraksi DNA total, amplifikasi gen penyandi 16S-rRNA,

penentuan sekuen klon yang mengandung gen 16S-rRNA dan analisis

perbandingan sekuen yang telah diketahui dalam database (Madigan et al. 2000).

21

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2011 sampai Februari 2012 di

Laboratorium Bioteknologi, Balai Besar Penelitian Pengembangan Pengolahan

Produk dan Bioteknologi Kelautan Perikanan (BBP4BKP), Jakarta.

Bahan dan Alat Penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain ialah isolat PMP

0126y koleksi dari BBP4BKP hasil isolasi dari limbah pengolahan rumput laut

Glacilaria sp. dari daerah Pameungpeuk Jawa Barat. Beberapa bahan kimia yang

digunakan dalam penelitian ini yaitu agar-agar nutrien (NA), kaldu nutrien (NB),

Carboxymethyl Cellulose (CMC), MgSO4.7H2O, K2HPO4, FeSO4

.7H2O,

CaCl2.2H2O, ekstrak khamir, NH4NO3, KH2PO4, glukosa. Bahan kimia lain yang

digunakan antara lain yaitu bovin serum albumin (BSA) standar, sodium tartarat,

asam dinitrosalisilat (DNS), bufer sitrat-fosfat, bufer asetat, bufer tris-HCl, NaCl,

etanol, merah kongo, sodium dodesil sulfat (SDS), Triton X-100, glysin, dan

membran ultrafiltrasi yaitu polyetersulfon (Model UFP-10-E-4MA, dengan area

permukaan 420 cm2 dan tipe membran sebesar 10.000 NMWC (Nominal

Molecular Weigth Cutoff)) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp), matriks DEAE

SepharoseTM

Fast Flow (Amersham Bioscience, Upsalla Sweden).

Alat yang akan digunakan antara lain : laminar/transfer box (Labconco),

jarum tanam bulat (ose), jarum tanam tajam, marker OHP permanen, penggaris,

gunting, pematik api mekanik, cawan petri steril, tabung reaksi, tabung

erlenmeyer, gelas beaker, gelas ukur, pembakar spritus, botol alkohol, spatel

Drygalski, Colony counter (Chiltern), spektrofotometer UV (Spectronic ®

20

Genesys TM

), sentrifugasi mikro suhu rendah (Beckman Coulter TM

Microfuge ®

22 R Centrifuge), timbangan analitik (Mettler Toledo Model : ML204/02 Type

New Classic MF), timbangan digital (Mettler PE 360 Deltra Range®), pemanas air

kompor listrik (Maspion), vorteks (Thermolyne maxi mix plus), tabung mikro,

autoklaf (Hirayama Tokyo Japan), oven (Sanyo), inkubator (GallenKamp),

inkubator statis/goyang (Shel Lab), mikropipet 10 mL, 1 mL, 200 µL, dan 20 µL

(NICHIRYO Tokyo Japan), lemari pendingin, PCR (Gen Amp PCR System 9700

22

Applied Biosystem dan BIOMETRA Tprofesional Thermoclyne), Microspin (FV-

2400), piranti elektroforesis SDS-PAGE (Amersham Bioscience, Swedia), piranti

elektroforesis DNA (Portsmouth NH, USA), batang pengaduk, Akta Purifier

(Amersham Biosciences UPC-900, Upsalla Sweden), Blok panas (Biometra),

Ultrafiltrasi (Watson Marlow).

Peremajaan Isolat PMP 0126y

Peremajaan isolat PMP 0126y dilakukan dengan menumbuhkan isolat

bakteri pada media agar-agar nutrien (NA). Bakteri tersebut diinkubasi di dalam

inkubator selama 1 x 24 jam pada suhu 37 0C (Munifah et al. 2011). Kemudian,

dilanjutkan dengan pengamatan secara morfologi bakteri yaitu pewarnaan Gram.

Pengamatan Morfologi Isolat PMP 0126y

Morfologi isolat PMP 0126y diamati dengan melakukan pewarnaan Gram

yang dilihat dengan menggunakan mikroskop. Pewarnaan Gram dilakukan dengan

cara memfiksasi bakteri pada kaca objek gelas dengan menggunakan larutan

KH2PO4 (Lampiran 1) sebanyak 3 tetes di atas api bunsen. Preparat olesan bakteri

yang telah difiksasi panas digenangi pewarna ungu kristal violet selama 1 menit,

dibilas dengan air, dan ditiriskan. Olesan digenangi iodium Gram selama 1 menit

dan dicuci dengan 95% etanol (decoloration solution) selama 30 detik sampai

pewarna ungu kristal pada preparat tidak terbilas lagi dan dicuci dengan akuades

sampai warna olesan menjadi bening. Olesan digenangi kembali dengan larutan

safranin selama 1 menit, dibilas dengan akuades, dan ditiriskan sampai kering.

Bakteri yang telah diwarnai diamati dengan mikroskop medan terang pada

perbesaran 1000-2000 x (Cappucino & Sherman 1983). Hasil pewarnaan Gram

isolat PMP 0126y difoto menggunakan kamera mikroskop (Olympus DP12) yang

dikerjakan di laboratorium Mikrobiologi, BBP4BKP.

Identifikasi Bakteri secara Molekuler

Identifikasi isolat bakteri secara molekuler dilakukan berdasarkan sekuen

gen penyandi 16S-rRNA (Suwanto et al. 2000). Identifikasi isolat dilakukan

dengan menentukan sekuen gen penyandi 16S-rRNA melalui PCR dan

membandingkannya dengan data sekuen yang tersedia di Gene Bank. Tahap-tahap

23

analisis isolasi bakteri secara molekuler meliputi a) isolasi DNA total, b)

amplifikasi gen penyandi 16S-rRNA dengan PCR, c) verifikasi dengan

elektroforesis gel agarosa, d) ekstraksi DNA dari agarosa, e) cycle sequencing, f)

purifikasi hasil PCR, dan g) sequencing hasil PCR.

Isolasi DNA Total (Maniatis et al. 1989). Isolasi DNA total dilakukan

dengan menggunakan kit Genomic DNA Purification (Fermentas Life

Biosciences, EU). Isolat bakteri dikulturkan pada media kaldu nutrien selama

12-14 jam. Sebanyak 1,5 mL kultur dimasukkan ke dalam tabung mikro dan

disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 9000 x g. Supernatan dibuang

dan ditambahkan kultur lagi berulang-ulang sampai diperoleh pelet dalam jumlah

yang cukup. Ke dalam pelet ditambahkan 200 µL bufer TE dan 50 µL lisozim

(10 mg dalam 167 ml), dibolak-balik dan diinkubasi selama semalam pada suhu

37 0C. Selanjutnya ke dalam tabung mikro ditambahkan 200 µL bufer lisis,

diinkubasi pada suhu 65 0C selama 10 menit (setiap 3 menit dilakukan

inversi/tabung dibolak-balik). Kemudian ditambahkan 600 µL kloroform,

diinversi perlahan sampai terbentuk dua fase yaitu fase atas dan fase bawah.

Selanjutnya disentrifugasi pada suhu 4 0C dengan kecepatan 13.000 x g selama

10 menit. Saat sedang dilakukan sentrifugasi, disiapkan larutan pengendapan

dengan mencampurkan 80 µL larutan pengendapan dengan 720 µL air distilasi.

Setelah sentrifugasi selesai dilanjutkan dengan mengambil fase atas/fase cair

(aqueous phase) perlahan-lahan dan dimasukkan ke dalam larutan pengendapan.

Pada saat dimasukkan ke dalam larutan pengendapan akan terlihat benang-benang

DNA dan didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang.

Setelah itu, dilakukan sentrifugasi pada suhu 4 0C dengan kecepatan

13.000 x g selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan DNA yang

mengendap ditambahkan dengan 100 µL NaCl dan dikocok kuat dengan vortex.

Selanjutnya ditambahkan 300 µL etanol absolut (100%) dan diinkubasi pada suhu

4 0C selama 20 menit. Kemudian disentrifugasi pada suhu 4

0C dengan kecepatan

13.000 x g selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan DNA yang

mengendap ditambahkan dengan etanol 70% dan disentrifugasi kembali pada

suhu 4 0C dengan kecepatan 13.000 x g selama 10 menit. Supernatan dibuang dan

24

DNA yang mengendap dikeringkan sebelum diresuspensi dengan bufer TE untuk

penyimpanan di dalam lemari es suhu 4 0C.

Amplifikasi Gen Penyandi 16S-rRNA dengan PCR (Suwanto et al.

2000). DNA template diamplifikasi dengan PCR menggunakan dua primer

universal spesifik untuk bakteri yaitu 63f (5’-CAGGCCTAACACAGGCAAGTC)

dan 1387r (5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC) (Marchesi et al. 1998). Ke dalam

tabung mikro steril dimasukkan 18 µL ddH2O; 1,0 µL primer 63f; 1,0 µL primer

1387r; dan 25 µL Taq polymerase, kemudian dimasukkan ke dalam PCR. Kondisi

PCR terdiri atas tahap: pre-PCR (95 0C, 5 menit), denaturasi (95

0C, 1 menit),

annealing atau pelekatan primer (56 0C, 1 menit 15 detik), elongasi atau

pemanjangan primer (72 0C, 1 menit 30 detik), post-PCR (72

0C, 7 menit), dan

penyimpanan/pendinginan (4 0C). Proses PCR tersebut dilakukan sebanyak 30

siklus. Hasil PCR kemudian divisualisasi dengan elektroforesis 1% gel agarosa.

Proses selanjutnya yaitu ekstraksi DNA dari agarosa, analisis sekuen

parsial gen penyandi 16S-rRNA, dan sequencing hasil PCR dilakukan oleh 1st

base, Singapura. Data sekuen DNA yang telah diperoleh dibandingkan dengan

data sekuen di Gene Bank untuk menentukan pohon filogenetiknya. Analisis

klaster dilakukan dengan menggunakan program dari National Center

Biotechnology Information (NCBI) (Van de Peer & De Watcher 1993), sedangkan

pembuatan pohon filogenetik menggunakan program Clustal X2 dan NJ-plot.

Uji Kualitatif Enzim Selulase

Uji aktivitas selulolitik dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Uji

kualitatif dilakukan dengan metode pewarnaan merah kongo 0,1%. Isolat PMP

0126y ditotolkan pada media agar-agar CMC (Lampiran 1). Bakteri diinkubasi

selama 5 hari pada suhu 37 0C. Kemudian dilakukan uji aktivitas bakteri dengan

menambahkan merah kongo 0,1% sebanyak 15 mL dan didiamkan selama

30-60 menit. Setelah itu dibilas sebanyak 2-3 kali dengan 15 mL NaCl 1 M dan

didiamkan selama 15 menit. Diameter zona bening dan diameter koloni yang

terbentuk diukur. Uji aktivitas selulase dilihat dari indeks selulase yang terbentuk.

Indeks selulase merupakan nisbah antara diameter zona bening dengan diameter

koloni. Semakin besar indeks selulolitik yang dihasilkan maka semakin besar

enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri tersebut. Indeks selulolitik atau indeks

25

aktivitas selulase (IAS) diperoleh dengan menggunakan rumus sebagai berikut

(Kader & Omar 1998):

Indeks selulolitik =

Penentuan Waktu Optimum Produksi Enzim Selulase

Penentuan waktu optimum produksi enzim selulase diawali dengan

penentuan waktu penuangan inokulum. Hal ini dilakukan agar dapat diketahui

waktu pertumbuhan eksponensial bakteri pada inokulum yang akan digunakan.

Penentuan waktu inokulum dilakukan dengan mengkultur 2 lup isolat di dalam

10 mL kaldu nutrien dan diinkubasi selama 12-14 jam, kemudian dituang ke

dalam 50 mL media cair CMC. Kultur diinkubasi pada suhu 30 0C di dalam

penangas goyang dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Pengambilan sampel

dilakukan selama 27 jam inkubasi dengan rentang waktu sampling 3 jam untuk

diukur nilai Optical Density (OD) pada panjang gelombang 600 nm. Setelah itu,

dibuat kurva pertumbuhan bakteri untuk menentukan waktu yang terbaik pada

penuangan inokulum pada media produksi. Selanjutnya, dilakukan penghitungan

jumlah koloni total pada cawan (TPC) untuk memperkirakan jumlah sel bakteri

pada setiap nilai OD yang dihasilkan.

Setelah waktu penuangan inokulum ke dalam media produksi diketahui,

dilanjutkan dengan penentuan waktu optimum aktivitas enzim selulase. Sebanyak

5 mL kaldu nutrien yang telah mengandung biakan sel diinokulasikan ke dalam

25 mL media inokulum yang mengandung glukosa 0,1%. Inokulum tersebut

dituang ke dalam 250 mL media produksi tanpa glukosa (sebanyak 10% dari

media produksi). Waktu penuangan inokulum dilihat dari waktu pertumbuhan

eksponensial bakteri (fase pertumbuhan logaritmik) yang telah diketahui dari

kurva pertumbuhan bakteri. Pengambilan sampel dilakukan setiap hari selama

6 hari waktu inkubasi dilakukan.

Supernatan yang dihasilkan kemudian diuji aktivitas enzimnya dengan

menggunakan metode Miller yang dimodifikasi berdasarkan absorbansi

maksimum larutan pereaksi (Wood & Saddler 1988). Larutan sampel

disentrifugasi pada suhu 4 0C dengan kecepatan 9000 x g selama 10 menit.

Sebanyak 1,8 mL substrat (selulosa 1%) yang dilarutkan dalam 0,1 M bufer sitrat

26

fosfat pH 5, kemudian ditambah dengan 0,2 mL enzim selulase, dikocok kuat

dengan vortex, selanjutnya diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30 0C, dan

reaksi enzim dihentikan dengan pendidihan pada suhu 100 0C selama 15 menit.

Setelah itu, diambil sebanyak 1 mL dari campuran reaksi dan ditambah dengan

1 mL DNS, dididihkan pada suhu 100 0C selama 15 menit. Setelah larutan dingin

absorbansi diukur pada λ 575 nm. Perlakuan kontrol dan blanko dilakukan secara

bersamaan dengan metode dan tahapan yang sama. Pada kontrol, enzim yang akan

direaksikan dengan substrat telah diinaktivasi terlebih dahulu dengan

memanaskan enzim selama 15 menit dalam air mendidih. Pada blanko, larutan

enzim diganti dengan akuades untuk direaksikan dengan substrat. Aktivitas enzim

diukur pada setiap pengambilan sampel yang dilakukan sehingga dapat diketahui

waktu optimum produksi enzim selulase.

Aktivitas selulase dinyatakan dalam satuan internasional yaitu U/mL. Satu

unit merupakan jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memecah 1 µmol selulosa

menjadi gula pereduksi per menit pada kondisi pengujian. Kadar glukosa yang

dihasilkan dari hidrolisis selulosa dengan enzim selulase berdasarkan nilai

absorbansi pada λ 575 nm.

Absorbansi = ((As - Ab) - (Ak - Ab))

Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam

persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa (Lampiran 2). Kemudian,

aktivitas selulase dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut (Irawan et al. 2008)

yang dimodifikasi.

Aktivitas selulase (U/mL) =

Keterangan : As = Absorbansi sampel

Ab = Absorbansi blanko

Ak = Absorbansi kontrol

V = volume enzim (0,2 mL)

t = waktu inkubasi (30 menit)

BM = Berat molekul glukosa (180 Dalton)

Produksi Enzim Kasar Selulase

Produksi enzim selulase dilakukan berdasarkan prosedur dan waktu

inkubasi yang telah diketahui aktivitas selulase tertinggi pada kurva aktivitas

27

selulase yang dihasilkan. Media pertumbuhan produksi diinkubasi pada suhu

30 0C di dalam penangas goyang dengan kecepatan agitasi 150 rpm, kemudian

enzim selulase dipanen selama waktu produksi tertinggi yang telah didapatkan

sebelumnya.

Kultur sel pada media produksi yang mengandung enzim selulase

ekstraseluler disentrifugasi pada kecepatan 10.000 x g selama 15 menit untuk

memisahkan larutan enzim dengan pelet bakteri. Supernatan hasil sentrifugasi

kemudian disimpan pada suhu 10 0C sebagai enzim ekstrak kasar.

Pemurnian Enzim Selulase

Pemurnian awal enzim dilakukan dengan melakukan pemekatan enzim

menggunakan ultrafiltrasi dan pengendapan amonium sulfat. Pemekatan enzim

ekstrak kasar dengan ultrafiltrasi pada penelitian ini dilakukan dengan

menggunakan alat ultrafiltrasi dan membran filtrasi. Enzim ekstrak kasar

dimasukkan ke dalam tabung dan kecepatan pompa ultrafiltrasi sebesar

200-250 rpm. Pemekatan enzim dilakukan sampai 10 kali pemekatan, sehingga

pada akhirnya akan menghasilkan enzim hasil ultrafiltrasi dan filtrat yang keluar

dari membran filtrasi.

Pengendapan enzim kasar selulase dengan amonium sulfat dilakukan

dengan menambahkan amonium sulfat ke dalam 20 mL enzim kasar selulase pada

beberapa tingkat konsentrasi yaitu 30-90% dengan selang konsentrasi 10%

kemudian diaduk perlahan dengan pengaduk magnetik pada suhu dingin selama

30 menit sampai semua amonium sulfat larut. Sebelum hasil endapan

disentrifugasi, campuran enzim dan amonium sulfat pada berbagai konsentrasi

didiamkan di dalam lemari pendingin suhu 4 0C selama semalam. Hal ini

dilakukan agar amonium sulfat yang diberikan pada enzim dapat mengendapkan

semua enzim selulase. Kemudian hasil pengendapan disentrifugasi dengan

kecepatan 9000 x g pada suhu 4 0C selama 15 menit. Endapan yang dihasilkan

dipisahkan dengan supernatan, kemudian endapan ditambah dengan bufer sitrat

fosfat 0,05 M pH 5 sebanyak dua kali volume pelet yang dihasilkan (Rosenberg

1996). Endapan enzim dengan amonium sulfat ini akan dihitung aktivitas enzim

selulase, kadar protein, dan diukur volume enzim hasil pemurnian. Selanjutnya

28

dipilih salah satu metode pemekatan berdasarkan hasil uji aktivitas selulase

tertinggi.

Enzim hasil pemekatan dimurnikan dengan menggunakan Akta Purifier.

Proses purifikasi dengan kromatografi yang dilakukan tergolong ke dalam

kromatografi penukar anion (KPA) dengan menggunakan kolom (40 cm, diameter

50 mm). Matriks DEAE SepharoseTM

Fast Flow sebagai fase diamnya, dan bufer

Tris-HCl 0,05 M pH 8 dengan gradien konsentrasi 1 M NaCl dalam Tris-HCl

0,05 M pH 8 sebagai fase geraknya. Matriks sepharose merupakan cross-linked

agarosa 6% berbentuk bola berukuran 45-165 µm, dapat bekerja pada suhu

4-40 0C dan stabil pada pH 2-14 (GE Healthcare). Kecepatan alir eluen

1 mL/menit. Volume selulase yang dimurnikan sebanyak 4 mL. Volume fraksi

yang ditampung masing-masing sebanyak 5 mL. Serapan setiap fraksi yang

ditampung diukur oleh alat spektrofotometer (mAu) yang terdapat pada alat Akta

Purifier. Hasil pemurnian dengan Akta Purifier selanjutnya diuji aktivitas enzim

selulasenya.

Analisis Elektroforesis SDS-PAGE dan Zimogram

Elektroforesis protein dilakukan dengan dua metode yaitu elektroforesis

SDS-PAGE dan Zimogram. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan 10%

poliakrilamida sebagai gel pemisah dan 4% poliakrilamida sebagai gel pengumpul

atau penahan (Tabel 6).

Tabel 6 Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk sepasang gel

Komposisi 10% Gel Pemisah 4% Gel

Penahan (mL) SDS (mL) Zimogram (mL)

Akuades 3,4 2,4 3,05

Substrat CMC - 1 -

1,5 M Bufer Tris-HCl pH 8,8 2,5 2,5 -

0,5 M bufer Tris-HCl pH 6,8 - - 1,25

10% SDS 0,1 0,1 0,05

30% akrilamida/bis 4 4 0,65

10% Amonium Persulfat 0,05 0,05 0,05

TEMED (N,N,N’,N’-

tetrametilen-etilendiamin 0,025 0,025 0,025

Sebelum dimasukkan ke dalam sumur, sebanyak 20 µL sampel dan 1 µL

standar protein masing-masing dicampur dengan 5X bufer sampel (Lampiran 1)

29

dalam tabung mikro. Sampel protein yang telah dicampur dengan bufer sampel

dipanaskan di dalam blok panas selama 5-7 menit, kecuali pada sampel untuk

zimogram tidak dipanaskan. Kemudian sebanyak 20 µL campuran tersebut

dimasukkan ke dalam sumur pada gel penahan menggunakan mikropipet 10 µL.

Setelah gel dipasang dalam piranti elektroforesis, sebayak 300-400 mL 1X bufer

elektroforesis (Lampiran 1) dituangkan pada tempatnya.

Proses elektroforesis berlangsung selama 2 jam pada tegangan 100 volt

dan 50 mA di dalam piranti elektroforesis (Amersham Bioscience, Swedia).

Setelah selesai, gel dilepas dan jarak migrasi diukur dari batas atas gel pemisah.

Gel SDS-PAGE kemudian direndam dalam larutan pewarna perak nitrat

berdasarkan protokol kit Fermentas dengan berbagai tahapan perendaman dengan

berbagai larutan yaitu larutan peluntur gel 1 dan 2, larutan sensitizer, larutan

pewarna, larutan pencuci gel, dan larutan akhir (Lampiran 1). Setelah itu, pita

protein hasil elektroforesis terlihat dan difoto.

Pada gel elektroforesis untuk zimogram, gel kemudian direnaturasi dengan

merendam gel di dalam 2,5% Triton X-100 selama satu jam sambil digoyang

konstan. Gel ditiriskan dan direndam dalam 0,05 M bufer sitrat fosfat pH 5 selama

1,5-2 jam sambil digoyang perlahan dalam inkubator goyang pada suhu 30 0C.

Kemudian gel diwarnai dengan 0,1% kongo merah selama 30 menit, selanjutnya

direndam dengan 1 M NaCl selama 15 menit (perendaman dilakukan sebanyak

tiga kali). Zona bening di sekitar pita yang terbentuk dibandingkan dengan

penanda berat molekul sehingga dapat diketahui berat molekul enzim selulase

yang dapat menghidrolisis substrat CMC pada gel akrilamida.

Perkiraan berat molekul relatif ditentukan dengan membandingkan migrasi

pita protein dengan pita standar penanda massa molekul relatif berberat molekul

rendah (14,4-97 kDa, GE) dan molekul tinggi (53-220 kDa, GE). Standar protein

berat molekul rendah terdiri atas Fosforilase b (otot kelinci) 97 kDa, albumin

(serum bovin) 66 kDa, ovalbumin (putih telur) 45 kDa, karbonat anhidrase

(eritrosit bovin) 30 kDa, tripsin inhibitor (kedelai) 20,1 kDa, dan α-laktalbumin

(susu bovin) 14,4 kDa. Standar berat molekul tinggi terdiri atas miosin (otot

kelinci) 212 kDa, α-2-makroglobulin (plasma bovin) 170 kDa, β-galaktosidase

30

(E. Coli) 116 kDa, transferin (manusia) 76 kDa, dan glutamat dehidrogenase

(hati bovin) 53 kDa.

Pengukuran Kadar Protein

Pengukuran kadar protein bertujuan untuk mengukur kandungan protein

yang terdapat dalam enzim selulase yang dihasilkan menggunakan metode

Bradford (1976). Sebanyak 20 µL enzim direaksikan dengan 1,0 mL Coomassie

Brilliant Blue G-250 kemudian dikocok kuat dengan vortex. Absorbansi dibaca

pada λ 595 nm. Blanko menggunakan 20 µL air distilasi yang direaksikan dengan

1,0 mL Coomassie Brilliant Blue G-250. Standar protein menggunakan bovine

serum albumin (BSA) pada kisaran 0,1-1,0 mg protein/mL dari 2 mg/mL larutan

stok BSA. Pengujian mikro dalam mengukur kadar protein menggunakan BSA

pada kisaran 0,01-0,1 mg protein/mL.

Karakterisasi Enzim Selulase

pH Optimum. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan

menambahkan 0,2 mL enzim yang direaksikan dengan 1,8 mL substrat. Substrat

dibuat dengan mencampurkan 1,8 g CMC ke dalam bufer dengan berbagai

tingkatan pH 3-9, antara lain yaitu 0,05 M bufer asetat (3, 4, 5), 0,05 M bufer

sitrat fosfat (5, 6, 7), dan 0,05 M bufer tris-HCl (7, 8, 9). Masing-masing enzim

diinkubasi pada suhu 30 0C selama 30 menit. Aktivitas enzim selulase diukur

sesuai dengan prosedur pengujian sebelumnya.

Suhu Optimum. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim dilakukan

dengan mereaksikan 0,2 mL enzim dengan 1,8 mL substrat di mana substrat

dibuat dengan mencampurkan 1,8 g CMC dalam bufer pH optimum. Enzim yang

telah dicampurkan dengan substrat kemudian diinkubasi pada tingkatan suhu

antara 30 0C sampai dengan 90

0C dengan selang 10

0C selama 30 menit waktu

inkubasi. Aktivitas enzim selulase diukur sesuai dengan prosedur pengujian

sebelumnya.

Kestabilan Suhu. Pengukuran kestabilan suhu enzim dilakukan dengan

menginkubasi enzim selulase selama 15, 30, 45, 60, 90, 120, dan 240 menit pada

tiga variasi suhu yaitu 30 0C, 40

0C, 50

0C. Kestabilan enzim dilihat dari besarnya

persentase penurunan aktivitas relatif dari aktivitas relatif tertinggi (100%) yaitu

31

pada suhu dan pH optimumnya dikondisi pengujian sebelumnya (Jung et al.

2008).

Substrat Spesifik. Pengujian aktivitas selulase pada berbagai substrat

dilakukan dengan CMC teknis, CMC murni, avisel, kertas Whatman filter paper

No. 1, limbah rumput laut pengolahan agar-agar PT. Agarindo yang

didelignifikasi dengan NaOH 6%, Limbah rumput laut pengolahan agar-agar

Pemeungpeuk yang didelignifikasi dengan 4 dan 6% NaOH serta 1% H2SO4,

limbah pengolahan alginat dari rumput laut Sargassum sp. yang dilarutkan dalam

bufer pH optimum dan diinkubasi pada suhu optimum selama 30 menit.

Kestabilan Enzim pada Ion Logam dan Bahan Aditif. Kestabilan enzim

pada bahan aditif yang diberikan antara lain yaitu ion logam KCl, NaCl

(monovalen), CaCl2.2H2O, MgCl2

. 6 H2O, ZnCl2 (divalen), FeCl3 (trivalen),

senyawa pengkelat logam EDTA yang ditambahkan sebanyak 5 mM dan 10 mM

(Jung et al. 2008). Campuran enzim dengan ion logam diinkubasi pada pH dan

suhu optimum enzim.

Reaksi enzim pada pengujian pH, suhu, substrat spesifik, serta kestabilan

pada ion logam dan bahan aditif serta kestabilan suhu dihentikan dengan

menambahkan 1 mL DNS, kemudian dipanaskan pada air mendidih selama

15 menit. Absorbansi diukur menggunakan spektofotometer pada λ 575 nm.

32

HASIL

Identifikasi Isolat PMP 0126y

Isolat PMP 0126y merupakan isolat koleksi BBP4BKP yang diisolasi dari

limbah hasil pengolahan rumput laut Glacilaria sp. menjadi agar-agar di daerah

Pemeungpeuk, Jawa Barat. Isolat PMP 0126y dapat tumbuh baik pada media

agar-agar nutrien dan tergolong pada bakteri mesofilik karena tumbuh pada suhu

37 0C.

Isolat PMP 0126y diidentifikasi secara langsung dengan melihat morfologi

koloni bakteri (Gambar 7). Ciri morfologi yang dimiliki oleh isolat PMP 0126y

yaitu warna koloni kuning jingga, bundar, mengkilat. Berdasarkan hasil

pewarnaan Gram menggunakan mikroskop (Olympus DP12) dengan perbesaran

1000 x, isolat PMP 0126y tergolong dalam bakteri Gram negatif berbentuk batang

pendek (Gambar 8).

Gambar 7 Isolat PMP 0126y. Gambar 8 Pewarnaan Gram isolat

PMP 0126y dengan

perbesaran 1000 x.

Analisis gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y dilakukan dengan

proses amplifikasi dengan PCR (GeneAMP PCR System 9700, Applied

Biosystem) menggunakan sekuen komplemen DNA genom isolat PMP 0126y

yang digandakan dengan primer 63f dan 1387r. Gen penyandi 16S-rRNA dari

isolat PMP 0126y yang berhasil diamplifikasi dengan PCR sebesar ±1282 pasang

basa (Gambar 9). Hasil analisis sekuen parsial DNA penyandi 16S-rRNA isolat

PMP 0126y sebanyak 1282 pasang basa dari arah 5’-3’ (Gambar 10).

33

Gambar 9 Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y.

1 GAGAGCGGCG TACGGGTGCG GAACACGTGT GCAACCTGCC TTTATCTGGG

51 GGATAGCCTT TCGAAAGGAA GATTAATACC CCATAATATA TTGAATGGCA

101 TCATTTGATA TTGAAAACTC CGGTGGATAG AGATGGGCAC GCGCAAGATT

151 AGATAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG TCAGCGATCT TTAGGGGGCC

201 TGAGAGGGTG ATCCCCCACA YTGGTAMTTG AGACAMGGRC CCAGAMTYCT

251 TACGGGAGGG CAGCCAGTGA AGGAATATTT GGACAATGGG GTGAGAGCCT

301 TGATCCCAGC CATCCCGGCG TGAAAGGACG ACGGCCCTTA TGGGTTGTAA

351 ACTTYTTTTT GTATAGGGGA TAAACCTACC CTCGTGAGGG TAGCTGAAGG

401 TACTATACGA ATAAGCACCG GCTAACTCCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA

451 CGGAGGGTGC AAGCGTTATC CGGATTTATT GGGTTTAAAG GGTCCGTAGG

501 CTGATTTGTA AGTCAGTGGT GAAATCTCAC AGCTTAACTG TGAAACTGCC

551 ATTGATACTG CAAGTCTTGA GTGTTGTTGA AGTAGCTGGA ATAAGTAGTG

601 TAGCGGTGAA ATGCATAGAT ATTACTTAGA ACACCAATTG CGAAGGCAGG

651 TTACTAAGCA ACAACTGACG CTGATGGACG AAAGCGTGGG GAGCGAACAG

701 GATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA ACGATGCTAA CTCGTTTTTG

751 GGCTTTTGGG TTCAGAGACT AAGCGAAAGT GATAAGTTAG CCACCTGGGG

801 AGTACGAACG CAAGTTTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA

851 GCGGTGGATT ATGTGGTTTA ATTCGATGAT ACGCGAGGAA CCTTACCAAG

901 GCTTAAATGG GGAAATGACA GGCTTAGAAA ATAGGCTTTT CTTCGGACAT

951 TTTTCAAGGT GCTGCATGGT TGTCGTCAGC TCSTGCCCGT GAGGTGTTAA

1001 GGTTAAGTCC TTGCAACGAA GCGCAACCCC TTGTCACTAR TTTGCCATCA

1051 TTTAAKTTGG GGGACTCTAG TKARAACTGC CTACSCCAAG TARARARGAA

1101 AAGKTGGGGA TRAMGTCAAA TCATCACGGC CCTTACGCCT TGGGCCACAC

1151 ACGTAATACA ATGGCCGGTA CAGAGGGCAG CTACACTGCG AAGTGATGCA

1201 AATCTCGAAA GCCGGTCTCA GTTCGGATTG GAGTCTGCAA CTCGACTCTA

1251 TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGCGCATC AG

Gambar 10 Sebagian sekuen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y dari

(arah 5’-3’).

Sekuen komplemen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y

dianalisis dengan program FASTA dari koleksi Genebank National Center

Biotechnology Information (NCBI). Berdasarkan analisis sekuen DNA tersebut,

isolat PMP 0126y memiliki kemiripan sebesar 96% dari 1282 nukleotida yang

M + - PMP 0126Y

1282 bp

bp

34

overlapped (bertumpang tindih) dengan 1234 nukleotida dengan bakteri

Chryseobacterium indologenes galur McR-1 (Gambar 11).

Gambar 11 Pohon filogenetik isolat PMP 0126y.

Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase

Isolat PMP 0126y ditumbuhkan pada media agar-agar yang mengandung

1% CMC membentuk zona bening pada uji kualitatif yang dilakukan (Gambar

12). Zona bening yang dihasilkan menunjukkan adanya enzim selulase

ekstraseluler yang dikeluarkan oleh isolat PMP 0126y. Indeks selulolitik isolat

PMP 0126y sebesar 1,9 pada inkubasi hari kelima dengan pH media 6 dan suhu

37 0C.

35

Gambar 12 Zona bening isolat PMP 0126y.

Isolat PMP 0126y merupakan bakteri aerob yang membutuhkan oksigen

untuk pertumbuhannya. Pada saat dilakukan optimasi produksi enzim, isolat ini

ditumbuhkan pada suhu 30 0C dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Pertumbuhan

bakteri dilihat dari nilai kerapatan optis yang dihasilkan pada setiap jam

pengukuran yaitu setiap 3 jam pada panjang gelombang 600 nm (Lampiran 4).

Isolat PMP 0126y mulai mengalami peningkatan pertumbuhan bakteri

(fase eksponensial) pada 6-12 jam inkubasi dengan jumlah sel yang tertinggi

dihasilkan sebesar 9,7 log10 CFU/mL. Selanjutnya pada jam ke-12 sampai jam ke-

21, jumlah sel yang dihasilkan konstan yaitu 9,7 log10 CFU/mL. Pada jam ke-24

sampai jam ke-27 isolat PMP 0126y terjadi penurunan menjadi 8,9 log10 CFU/mL

(Gambar 13).

Gambar 13 Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y.

Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y yang dihasilkan menjadi dasar

waktu penuangan inokulum yang terbaik yaitu saat isolat berumur 6-9 jam.

Diperkirakan bahwa kultur isolat yang akan dituang ke dalam media produksi

sekitar 9,4-9,5 Log sel10/mL. Selanjutnya, optimasi produksi enzim selulase

dilihat dengan mengukur aktivitas selulase yang dihasilkan selama waktu

inkubasi/fermentasi. Pada akhirnya diperoleh aktivitas enzim selulase yang

tertinggi selama enam hari pengamatan yaitu pada hari ketiga inkubasi (Lampiran

36

5), dengan aktivitas selulase sebesar 0,108 U/mL dan aktivitas spesifik

0,120 U/mg serta kadar protein sebesar 0,895 mg/mL. Kadar glukosa yang

dihasilkan pada saat itu sebesar 0,117 mg/L. Fase pertumbuhan eksponensial

bakteri pada media produksi pada hari pertama dan kedua sebesar 9,1 log10

CFU/mL dan jumlah sel terus stabil sampai hari keempat dan semakin menurun

sampai hari keenam dengan jumlah sel bakteri sebesar 8,9 Log10 CFU/mL

(Gambar 14, Lampiran 5).

Gambar 14 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel bakteri

PMP 0126y.

Produksi selulase oleh isolat PMP 0126y pada media yang mengandung

glukosa 0,1% menunjukkan aktivitas selulase tertinggi dihasilkan pada hari ketiga

inkubasi (Gambar 15, Lampiran 5) sama seperti pada media produksi yang tidak

mengandung glukosa (Gambar 14).

Gambar 15 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel bakteri

PMP 0126y pada media yang mengandung glukosa 0,1%.

37

Penambahan glukosa sebanyak 0,1% pada media produksi menghasilkan

jumlah sel sebesar 9,4 log10 CFU/mL, sedangkan jumlah sel tertinggi pada media

produksi tanpa glukosa hanya 9,1 log10 CFU/mL. Aktivitas selulase yang tertinggi

pada hari ketiga sebesar 0,070 U/mL dan aktivitas spesifik 0,116 U/mg dengan

kadar protein sebesar 0,606 mg/mL pada media produksi yang mengandung

glukosa 0,1%.

Pemurnian Enzim Selulase

Enzim selulase diproduksi selama 3 hari yang menunjukkan waktu

produksi tertinggi, kemudian dimurnikan dengan melakukan pemekatan enzim

melalui dua cara pemekatan yaitu pengendapan amonium sulfat dan ultrafiltrasi.

Persen kadar amonium sulfat yang menghasilkan aktivitas selulase tertinggi

diperoleh pada 50% kejenuhan amonium sulfat. Aktivitas selulase yang dihasilkan

sebesar 0,072 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar 0,128 U/mg pada endapan,

sedangkan pada supernatan dihasilkan aktivitas selulase sebesar 0,068 U/mL dan

aktivitas spesifik sebesar 0,105 U/mg. Selulase tanpa penambahan amonium sulfat

(kontrol) memiliki aktivitas sebesar 0,064 U/mL dan aktivitas spesifik

0,075 U/mg (Gambar 16, Lampiran 5).

Gambar 16 Aktivitas spesifik dari pengendapan selulase dengan amonium sulfat.

Selain melakukan pemekatan enzim dengan amonium sulfat, pemekatan

enzim juga dilakukan dengan ultrafiltrasi. Aktivitas selulase yang diperoleh pada

ultrafiltrasi 10 kali pemekatan (10.000 NMWC) sebesar 0,112 U/mL pada hasil

ultrafiltrasi (retentat), dan 0,059 U/mL pada filtrat yang keluar dari alat

38

ultrafiltrasi (permeat). Aktivitas selulase tanpa pemekatan dengan ultrafiltrasi

(kontrol) menghasilkan aktivitas sebesar 0,069 U/mL (Tabel 7).

Tabel 7 Aktivitas selulase hasil ultrafiltrasi

Enzim

selulase

Kadar

glukosa

(mg/L)

Aktivitas

selulase (U/mL)

Kadar protein

(mg/mL)

Aktivitas

spesifik

(U/mg)

Ultrafiltrasi

Retentat 0,121 0,112 0,822 0,136

Permeat

Kontrol

0,064

0,069

0,059

0,064

0,598

0,750

0,099

0,086

Hasil ultrafiltrasi kemudian dimurnikan dengan menggunakan

kromatografi penukar anion menggunakan alat Akta Purifier. Dari 75 fraksi hasil

kromatografi penukar anion, puncak tertinggi dihasilkan oleh fraksi ke-48 pada

konsentrasi NaCl sebesar 37,3 mM (Gambar 17). Hasil uji aktivitas selulase fraksi

ke-48 sebesar 0,154 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar 1,301 U/mg. Aktivitas

selulase pada fraksi ke-51 sebesar 0,147 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar

1,591 U/mg.

No Fraksi

Gambar 17 Profil elusi enzim selulase pada kromatografi DEAE penukar ion

menggunakan matriks Sepharose.

Hasil uji aktivitas selulase yang dilakukan, memperlihatkan bahwa fraksi

yang membentuk fraksi puncak (fraksi 46-55) dapat menghasilkan aktivitas

mA

U

1 M

NaCl (0,5 M)

0,0 M

46

6

55

6

48

6 51

6

39

selulase (Lampiran 5). Selulase dari fraksi ke-48 dan 51 digabung dan diukur

aktivitasnya sebesar 0,143 U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar 1,361 U/mg.

Gabungan fraksi ke-46 sampai fraksi ke-55 (tanpa fraksi 48 & 51) menghasilkan

aktivitas selulase sebesar 0,157 U/ml dengan aktivitas spesifik sebesar

1,297 U/mg.

Hasil pengukuran tingkat kemurnian enzim selulase yang dihasilkan oleh

ultrafiltrasi sebesar 1,58 kali dibandingkan ekstrak kasar, dan tingkat kemurnian

enzim hasil penukar anion (fraksi 48 & 51, fraksi 46-55) secara berturut-turut

sebesar 15,82 dan 15,08 kali (Tabel 8).

Tabel 8 Hasil uji aktivitas selulase PMP 0126y pada beberapa tahap pemurnian

Tahap

pemur-

nian

Volu

me

(ml)

Aktivi-

tas

selulase

(U/mL)

Aktivi-

tas total

(unit)

Konsen-

trasi

protein

(mg/mL)

Protein

total

(mg)

Aktivi-

tas spe-

sifik

(U/mg)

Ren-

de

men

(%)

Ting-

kat

Kemur-

Nian

Ekstrak

kasar 500 0,064 32,0 0,750 375 0,086 100 1,000

Ultrafil-

trasi 50 0,112 5,6 0,822 41,1 0,136 17,5 1,581

Penukar

anion

(fraksi

48 & 51)

10 0,143 1,43 0,105 0,840 1,361 4,47 15,825

Penukar

anion

(46-55)

40 0,157 6,28 0,121 4,84 1,297 19,6 15,081

Analisis Berat Molekul Enzim Selulase Menggunakan SDS-PAGE dan

Zimogram

Pada setiap tahap pemurnian, selulase dari isolat PMP 0126y dianalisis

jumlah pita protein dan berat molekulnya dengan SDS-PAGE (Gambar 18), dan

zimogram dengan menggunakan substrat CMC 0,1% (Gambar 19). Pita protein

enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y hasil pemekatan

ultrafiltrasi, dengan pewarnaan perak nitrat didapatkan sebanyak 13 pita dengan

berat molekul masing-masing sebesar : 84, 59, 55, 44, 39, 34, 30, 25, 21, 20, 17,

16, 14 kDa. Setelah dilakukan pemurnian ke dalam kolom dengan matriks

Sepharose, pita protein yang dihasilkan sebanyak 5 pita dengan berat molekul

masing-masing pita yaitu 75, 55, 39, 25, 19 kDa.

40

Gambar 18 Hasil elekroforesis SDS-PAGE enzim ultrafiltrasi dan fraksi

pemurnian kromatografi penukar anion (kiri) dan ilustrasi berat

molekul protein selulase PMP 0126y (kanan). Keterangan:

A: Penanda berat protein rendah, B: Ultrafiltrasi, C: Fraksi 47, D:

Fraksi 48, E: Fraksi 49.

Selain SDS-PAGE, analisis zimogram juga dilakukan untuk mengetahui

berat molekul protein enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y.

Hasil zimogram ditandai dengan terbentuknya zona bening pada gel yang

menunjukkan adanya aktivitas selulase pada gel akrilamida yang mengandung

0,1% CMC. Hasil optimasi waktu inkubasi gel memperlihatkan waktu terbaik

yaitu 60 menit dengan menggunakan bufer sitrat fosfat pH 5 yang didahului

dengan perlakuan renaturasi menggunakan larutan 2,5% Triton X-100 selama

1 jam. Hasil zimogram enzim hasil pemekatan (ultrafiltrasi) menunjukkan ada tiga

molekul protein yang memiliki aktivitas selulolitik pada gel dengan masing-

masing berat molekul yaitu 39, 30, 14 kDa yang dihitung berdasarkan mobilitas

relatif terhadap standar protein (Gambar 19).

41

Gambar 19 Hasil zimogram PMP 0126y pada gel akrilamida mengandung CMC

0,1% (kiri) dan ilustrasi pita yang terbentuk dalam zimogram (kanan).

Keterangan: M: Marker protein rendah A : Enzim hasil ultrafiltrasi,

B : Fraksi KPA (Fraksi 48 & 51).

Ketiga pita protein yang dapat diukur ditunjukkan pada enzim selulase

hasil ultrafiltrasi. Enzim hasil pemurnian dengan kromatografi penukar anion

(gabungan fraksi 48 & 51) tidak dapat terdeteksi. Jumlah enzim yang terlalu

sedikit pada selulase hasil pemurnian kromatografi diduga menjadi penyebab

sehingga zona bening tidak terlihat pada gel dan hanya terlihat pada enzim hasil

ultrafiltrasi.

Karakterisasi Enzim Selulase

pH Optimum. Aktivitas selulase enzim hasil ultrafiltrasi tertinggi

didapatkan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dengan nilai aktivitas selulase sebesar

0,088 U/mL (Gambar 20), sedangkan aktivitas tertinggi enzim selulase hasil

pemurnian dengan kromatografi penukar anion (KPA) didapatkan pada bufer dan

pH yang sama yaitu pH 5 dengan aktivitas selulase sebesar 0,142 U/ml (Gambar

21).

42

Gambar 20 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi.

Pengukuran dilakukan pada suhu 30 0C.

Gambar 21 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil

kromatografi penukar anion. Pengukuran dilakukan pada suhu

30 0C.

Suhu Optimum. Aktivitas selulase tertinggi yang dihasilkan oleh isolat

PMP 0126y pada enzim hasil ultrafiltrasi didapatkan pada suhu 30 0C dengan nilai

aktivitas sebesar 0,086 U/mL, sedangkan suhu optimum enzim hasil kromatografi

penukar anion ialah suhu 40 0C dengan aktivitas sebesar 0,145 U/mL (Gambar

22).

43

Gambar 22 Suhu optimum aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi dan

kromatografi penukar anion. Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat

fosfat pH 5.

Hasil uji stabilitas pada variasi suhu 30, 40, 50 0C yang diperlakukan pada

enzim selulase PMP 0126y memperlihatkan bahwa enzim selulase relatif stabil

pada ketiga suhu tersebut. Sampai dengan 240 jam waktu inkubasi enzim, tidak

terjadi penurunan aktivitas relatif enzim masih di atas 50% dari aktivitas relatif

optimum (Gambar 23).

Gambar 23 Pengaruh suhu dan waktu inkubasi terhadap aktivitas selulase PMP

0126y. Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu

30 0C, 40

0C, 50

0C.

Substrat Spesifik. Pengujian aktivitas enzim selulase hasil ultrafiltasi

pada berbagai substrat menunjukkan aktivitas tertinggi pada substrat limbah

rumput laut Glacilaria sp. dari pengolahan agar-agar Pameungpeuk yang telah

(0C)

Waktu inkubasi enzim (menit)

44

didelignifikasi dengan NaOH 6% (Lampiran 6), dengan aktivitas selulase sebesar

0,149 U/mL, diikuti aktivitas selulase pada limbah rumput laut dari pengolahan

agar-agar PT. Agarindo sebesar 0,133 U/mL (Gambar 24).

Gambar 24 Substrat spesifik enzim selulase isolat PMP 0126y hasil ultrafiltrasi.

Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C.

Keterangan : a) CMC murni, b) CMC teknis, c) Avisel, d) kertas

Whatman No.1 e) limbah agar-agar PT Agarindo NaOH 6%, f) limbah

Alginat, g) limbah agar-agar Pameungpeuk NaOH 4%, h) limbah

agar-agar Pameungpeuk NaOH 6%, dan i) limbah agar-agar

Pameungpeuk H2SO4 1%.

Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Selulase. Beberapa ion logam

ditambahkan pada reaksi uji aktivitas selulase isolat PMP 0126y untuk

mengetahui pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase. Pada konsentrasi

5 mM logam dapat meningkatkan aktivitas relatif secara berturut-turut menjadi

153% pada CaCl2 dan 129% pada MgCl2 dari aktivitas relatif optimum (100%)

enzim selulase tanpa penambahan logam. Akan tetapi, pada konsentrasi 10 mM,

logam KCl dan FeCl3 dapat meningkatkan aktivitas relatif secara berturut-turut

menjadi 109% dan 111%. Penurunan aktivitas relatif sebanyak 50% terjadi pada

penambahan logam ZnCl2 10 mM yaitu sebesar 78% dengan aktivitas relatif yang

tersisa sebesar 22% (Gambar 25, Lampiran 4).

45

Gambar 25 Aktivitas relatif selulase isolat PMP 0126y hasil ultrafiltrasi pada

penambahan logam 5 mM dan 10 mM. Pengukuran dilakukan pada

bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C.

Pada penambahan senyawa pengkelat logam seperti EDTA dapat

menurunkan aktivitas relatif selulase PMP 0126y sebesar 19% pada konsentrasi

5 mM dan 34% pada konsentrasi 10 mM. Penambahan senyawa pengkelat logam

dengan CaCl2 5 mM menurunkan aktivitas relatif sebesar 53% dengan aktivitas

relatif yang tersisa sebesar 47%.

MgCl2 FeCl3 CaCl2 ZnCl2

46

PEMBAHASAN

Identifikasi Isolat PMP 0126y

Isolat PMP 0126y merupakan salah satu isolat koleksi BBP4BKP yang

diisolasi dari limbah rumput laut (Munifah et al. 2011). Hasil analisis sekuen

DNA menunjukkan bahwa sebanyak 1282 pasang basa DNA isolat PMP 0126y

memiliki kemiripan sebesar 96% dengan bakteri Chryseobacterium indologenes

galur McR-1.

Berdasarkan laporan yang dikutip dari Health Protection Agency dalam

National Collection of Type Culture (NCTC) bakteri Chryseobacterium

indologenes rentan terhadap kalium sianida, secara aerob dapat menghidrolisis

kasein, dan bakteri ini dapat menghasilkan enzim gelatinase. Selain itu, bakteri ini

dapat menghidrolisis pati (Graevenitz dalam Murray et al. 1995), dan dapat

menghasilkan enzim mananase (Rattanasuk & Cairns 2009).

Genus Chryseobacterium termasuk ke dalam famili Flavobacteriaceae

(Calderon et al. 2011). Karakter bakteri genus Chryseobacterium berbentuk

batang dengan sisi yang sejajar dan ujung bulat, berukuran 0,5 x 1,0-3,0 µm,

endospora tidak terbentuk, sel bakteri bersifat Gram negatif, nonmotil, aerobik,

oksidase positif, katalase positif, menghasilkan pigmen yang berwarna kuning

terang sampai jingga. Pada umumnya Flavobacterium terdapat di tanah dan air

(Murray et al. 1995). Selain itu, ditemukan pula pada daging, susu, dan makanan

lainnya, serta pernah ditemukan di lingkungan rumah sakit dan material klinis

manusia (Holt 1994).

Bakteri Chryseobacterium indologenes atau nama lainnya Flavobacterium

indolegenes merupakan bakteri aerob yang hidup pada suhu pertumbuhan 37 0C di

media kaldu nutrien. Koloni bakteri ini berbentuk bulat cembung, permukaan

koloni berwarna kuning mengkilat dan licin, Gram negatif, dan secara

mikroskopis berbentuk batang pendek. Bakteri ini pernah diisolasi dari manusia

yaitu pada bedah trakea pada tahun 1958 (Yabuuchi et al. 1983). Genus

Flavobacterium adalah salah satu genus yang penting dalam degradasi

polisakarida. Berdasarkan penelitian yang dilakukan untuk mengisolasi bakteri

47

pendegradasi selulosa asetat diketahui bahwa 3 dari 35 galur yang berhasil

diisolasi dari genus Flavobacterium (Yang et al. 1985).

Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase

Uji kualitatif selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y ditandai

dengan terbentuknya zona bening di sekitar zona koloni pada media agar-agar

yang mengandung selulosa. Teather dan Wood (1982), melakukan penapisan

secara cepat mikrob selulolitik dengan cara pengukuran indeks zona bening. Luas

zona bening yang dihasilkan bergantung pada konsentrasi CMC dan agar-agar

yang digunakan. Semakin banyak CMC dan agar-agar yang diberikan maka akan

menyebabkan pori-pori mengecil sehingga enzim selulase yang disekresikan lebih

sulit melewati pori-pori tersebut dan mengakibatkan terhambatnya proses

degradasi (Hankin & Anagnostakis 1997). Zverlova et al. (2003) menyatakan

bahwa diameter zona bening umumnya berukuran lebih besar dibandingkan

dengan diameter koloni, karena enzim selulase disekresikan ke lingkungan

sekitarnya oleh bakteri pendegradasi selulosa.

Pada media kultur produksi enzim, isolat PMP 0126y mulai memasuki

fase eksponensial/logaritmik selama 6-12 jam waktu inkubasi. Fase logaritmik

merupakan tahapan fase pertumbuhan bakteri yang berlangsung sangat cepat

karena terjadi penggandaan sel bakteri secara cepat (Madigan et al. 2009),

sehingga bakteri yang berada dalam fase ini baik sekali untuk dijadikan inokulum.

Selanjutnya pada jam ke-12 sampai jam ke-21 inkubasi isolat PMP 0126y

mengalami fase stasioner yaitu jumlah bakteri yang hidup sebanding dengan

bakteri yang mati. Pada fase ini terjadi pengurangan nutrien esensial dalam media

dan terjadi akumulasi bahan-bahan terbuang pada media pertumbuhan (Madigan

et al. 2009). Selanjutnya pada jam ke-24 sampai jam ke-27 isolat PMP 0126y

mengalami fase kematian yaitu bakteri tidak dapat mengalami pertumbuhan

kembali.

Laju pertumbuhan bakteri pada fase logaritmik (antara 6-9 jam waktu

inkubasi) digunakan sebagai penentuan waktu terbaik untuk penuangan media

inokulum ke media produksi. Hal ini dilakukan agar isolat tidak membutuhkan

waktu lama untuk fase adaptasi di dalam media produksi sehingga diharapkan

48

produksi enzim selulase pada media produksi lebih cepat. Isolat PMP 0126y

mengalami pertumbuhan eksponensial pada media produksi pada hari pertama

dan kedua, dan pada hari ketiga terjadi penurunan jumlah sel bakteri. Hal ini

diduga sumber karbon pada media mulai berkurang atau habis sehingga isolat

PMP 0126y mulai memanfaatkan CMC sebagai sumber karbon dengan enzim

selulase yang dihasilkannya sehingga diperoleh aktivitas selulase tertinggi pada

hari ketiga inkubasi.

Glukosa merupakan salah satu nutrisi dalam pertumbuhan bakteri sebagai

sumber karbon. Penggunaan glukosa dalam jumlah kecil untuk memproduksi

enzim selulase berfungsi sebagai sumber energi bagi isolat untuk menunjang

pertumbuhannya sehingga dapat beraktivitas lebih baik dalam menghidrolisis

selulosa amorf maupun kristal (Fikrinda et al. 2001). Akan tetapi, penambahan

glukosa sebanyak 0,1% pada media produksi ternyata tidak memberikan

peningkatan aktivitas selulase. Adanya glukosa yang memberikan nutrisi

tambahan selain ekstrak khamir menyebabkan jumlah sel isolat PMP 0126y

menjadi lebih banyak dan tetap stabil pertumbuhannya sampai hari ketiga dan

mulai mengalami penurunan pada hari keempat. Jumlah sel isolat PMP 0126y

yang tumbuh lebih banyak pada media produksi yang ditambah glukosa 0,1%

mencapai 9,4 log10 sel/mL. Madigan et al. (2009) menyatakan bahwa glukosa

yang ditambahkan menyebabkan bakteri akan tumbuh lebih cepat jika

dibandingkan media tanpa adanya glukosa.

Aktivitas selulase tidak meningkat dengan penambahan glukosa 0,1%,

sedangkan pada kadar glukosa yang lebih tinggi (1% atau lebih) dapat

menghambat pembentukan selulase (Purwadaria 1998; Rickard et al. 1989).

Selama ada glukosa pada media, maka enzim selulase belum dapat disintesis oleh

bakteri. Sintesis berbagai enzim yang berperan dalam proses katabolisme pada

umumnya direpresi bila sel ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa

(Madigan et al. 2009).

Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase

Produksi enzim selulase untuk pemurnian menggunakan media produksi

tanpa penambahan glukosa. Pemurnian enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat

PMP 0126y diawali dengan melakukan pemekatan enzim yang bertujuan untuk

49

memekatkan enzim selulase yang dihasilkan. Pemekatan enzim dilakukan dengan

metode preparatif yaitu pengendapan dengan amonium sulfat dan ultrafiltrasi.

Persentase amonium sulfat yang dapat mengkonsentrasikan enzim selulase yang

dihasilkan oleh isolat PMP 0126y secara maksimal yaitu sebesar 50% dengan

aktivitas spesifik sebesar 0,128 U/mg, lebih tinggi jika dibandingkan dengan

aktivitas spesifik enzim selulase kasar sebelum dikonsentrasikan yaitu sebesar

0,075 U/mg. Pengendapan selulase dengan amonium sulfat juga dilakukan oleh

Jung et al. (2008) yang melaporkan bahwa 70% amonium sulfat dapat

meningkatkan aktivitas spesifik selulase yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus

amyoliquefaciens DL-3 sebesar 533,4 U/mg dari aktivitas spesifik ekstrak kasar

sebesar 292,1 U/mg dan tingkat kemurnian sebesar 2,3 kali dari enzim ekstrak

kasar. Akan tetapi, aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP

0126y pada 50% amonium sulfat pada supernatan menghasilkan aktivitas selulase

sebesar 0,068 U/mL. Aktivitas selulase ini hampir sama besar dengan aktivitas

selulase pada endapan yaitu sebesar 0,072 U/mL. Oleh karena itu, dapat dikatakan

bahwa pengendapan amonium sulfat ternyata tidak cocok untuk memekatkan

enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y. Selain itu, pengendapan

amonium sulfat pada enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat ini dapat

membentuk gel dan gumpalan setelah sentrifugasi yang diduga berasal dari CMC.

Berdasarkan beberapa kelemahan ini, maka pemekatan enzim selanjutnya

dilakukan dengan cara ultrafiltrasi.

Pemekatan enzim selulase PMP 0126y dilakukan dengan menggunakan

membran ultrafiltrasi berukuran 10.000 NMWC (10.000 Dalton). Hasil pemisahan

supernatan dengan membran ultrafiltrasi menghasilkan retentat dan permeat.

Permeat merupakan protein yang dapat melewati membran dan berukuran lebih

kecil dari 10.000 Dalton, sedangkan retentat adalah protein yang berukuran Iebih

besar dari 10.000 Dalton sehingga tidak dapat melewati membran. Enzim selulase

isolat PMP 0126y dalam retentat yang berukuran lebih dari 10.000 Dalton dapat

dipisahkan. Hasil ultrafiltrasi yang dilakukan memberikan peningkatan pada

jumlah protein enzim selulase yaitu menjadi 0,822 mg/mL dari 0,750 mg/mL. Hal

ini diduga bahwa enzim selulase dari isolat PMP 0126y memiliki bobot molekul

protein di atas 10.000 Dalton. Aktivitas spesifik selulase pada retentat meningkat

50

sebesar 0,136 U/mg dari aktivitas spesifik pada permeat sebesar 0,099 U/mg dan

aktivitas spesifik enzim sebelum dipekatkan yaitu sebesar 0,086 U/mg.

Peningkatan aktivitas spesifik enzim selulase melalui pemekatan dengan

ultrafiltrasi juga dilaporkan oleh Arifin (2006) yang menunjukkan aktivitas

spesifik selulase meningkat dari 2,31 U/mg menjadi 2,84 U/mg dengan

ultrafiltrasi (Arifin 2006). Selain selulase, proses pemurnian dan pemisahan enzim

dengan ultrafiltrasi juga dilakukan pada enzim α-amilase dari bakteri Bacillus

sterothermophilus sebanyak 10 kali pemekatan yang dapat meningkatkan aktivitas

spesifik menjadi 6,68 U/mg dari 2,86 U/mg (Lestari et al. 2000).

Pemurnian enzim selulase dari isolat PMP 0126y setelah ultrafiltrasi

dilakukan dengan kromatografi penukar anion dengan kolom Sepharose

menggunakan bufer 0,05 M Tris-HCl pH 8 dan protein target dielusi dengan 1 M

NaCl. Puncak tertinggi dihasilkan oleh fraksi ke-48 pada konsentrasi NaCl

sebesar 37,3 mM. Aktivitas spesifik selulase hasil kromatografi penukar ion pada

enzim selulase dari Bacillus amyoliquefaciens DL-3 meningkat menjadi

1772,3 U/mg dari hasil pengendapan amonium sulfat sebesar 533,4 U/mg (Jung et

al. 2008). Pada kromatografi penukar anion yang dilakukan oleh Arifin (2006)

diperoleh aktivitas spesifik sebesar 1,91 U/mg dari hasil ultrafiltrasi sebesar

2,84 U/mg. Pada penelitian ini, pemurnian parsial dengan kromatografi kolom

penukar anion yang dilakukan berhasil meningkatkan kemurnian sebesar 15 kali

dari enzim selulase ekstrak kasar. Jung et al. (2008) melaporkan bahwa perolehan

enzim selulase hasil kromatografi penukar ion dari Bacillus amyoliquefaciens

DL-3 sebesar 15,0% dengan tingkat kemurnian sebesar 9,0.

Enzim selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi dan pemurnian kolom

penukar anion memperlihatkan aktivitas optimum yang cenderung asam yaitu

pada bufer sitrat fosfat 0,05 mM pH 5. Salah satu contoh bakteri yang memiliki

pH optimum ekstrem asam ialah Clostridium acetobutylicum dengan pH optimum

4,6 (Allcock & Woods 1981). Kisaran pH untuk selulase tergolong luas, Bacillus

sp. galur N-4 menghasilkan selulase yang aktif pada rentang pH 5-10 (Horikhosi

1999).

Enzim selulase hasil pemekatan dengan ultrafiltrasi bekerja optimal pada

suhu 30 0C, sedangkan hasil pemurnian kolom penukar anion memperlihatkan

51

aktivitas optimum pada suhu 40 0C. Adanya perbedaan pada suhu optimum antara

enzim kasar (ultrafiltrasi) dengan enzim hasil pemurnian parsial (kromatografi)

disebabkan karena diduga enzim hasil kromatografi penukar anion kehilangan

senyawa seperti logam, kotoran, dan garam yang memelihara konformasi enzim

(Irawadi 1991). Hal ini menyebabkan enzim akan spesifik menghidrolisis substrat,

sehingga suhu optimum yang dihasilkan pada enzim hasil kromatografi penukar

anion lebih tinggi yaitu 40 0C.

Karakterisasi selulase hasil pemurnian isolat PMP 0126y dan beberapa

jenis bakteri yang telah dilakukan oleh sejumlah peneliti disajikan pada Tabel 9.

Tabel 9 Pemurnian dan karakterisasi selulase dari berbagai jenis bakteri

Bakteri Teknik

Kromatografi

Suhu

(0C)

pH

Berat

molekul

(kDa)

Pustaka

Bacillus

amyoliquefaciens

DL-3

Penukar ion 50 7 53 Jung et al.

(2008)

Bacillus pumilus Penukar anion 60 6 30-65 Arifin (2006)

Pseudomonas

fluorescens

Penukar ion

dan gel filtrasi

35 6,5-7 26-36 Bakare et al.

(2005)

Bacillus pumilus Gel filtrasi dan

penukar ion

60 7-8 67 Christako-

poulus et al.

(1999)

Bacillus sp. PDV Penukar ion 60 5 33 Sharma et al.

(1990)

Bacillus

spaerichus JS1

Penukar ion 60 8 42 Singh et al

(2004)

Bacillus

amyoliquefaciens

MTCC610

Penukar anion

DEAE

45 7 - Selvanku-

mar et al.

(2011)

Bacillus pumilus Gel filtrasi 60 6,5-7 80 &170 Kotchoni et

al. (2006)

Bacillus

circulans

Penukar ion 50 4,5 82 Kim & Kim

(1995)

Bacillus sp. Penukar anion 40 5-9 103-130 Yoshimatsu

et al. (1990)

Bacillus galur

M-9

Penukar anion

DEAE

60 5 54 Bajaj et al.

(2009)

Bacillus

licheniformes

Pengendapan

amonium

65 6 37-43 Bischoff et

al. (2006)

Bacillus galur

CH43 & HR68

Gel filtrasi &

Penukar ion

65

&70

5-6,5 40 Mawadza et

al. (2000)

PMP 0126y Penukar anion 40 5 14, 30, 39 Penelitian ini

52

Aktivitas enzim selulase isolat PMP 0126y menurun pada suhu di atas

suhu optimum disebabkan oleh terputusnya ikatan sekunder enzim karena

besarnya energi kinetika dari molekul enzim sehingga mengakibatkan hilangnya

struktur sekunder dan tersier dari enzim, disertai dengan hilangnya aktivitas enzim

(Suhartono 1989). Selain itu, turunnya aktivitas enzim akibat panas menyebabkan

putusnya sebagian besar ikatan yang kurang kuat pada struktur protein enzim.

Penurunan aktivitas selulase pada suhu di bawah suhu optimum disebabkan oleh

rendahnya afinitas antara enzim dengan sumber karbon atau rendahnya kecepatan

awal pemutusan kompleks enzim dengan sumber karbon (Irawadi 1991). Bakteri

Chryseobacterium indologenes yang diduga sama dengan isolat PMP 0126y

menghasilkan aktivitas tertinggi enzim mananase pada suhu 30 0C (Rattanasuk &

Cairns 2009).

Di antara substrat yang digunakan, aktivitas selulase yang dihasilkan oleh

isolat PMP 0126y tertinggi dihasilkan pada substrat limbah rumput laut Glacilaria

sp. dari Pameungpeuk yang didelignifikasi dengan NaOH 6%. Aktivitas selulase

yang cukup tinggi pada limbah rumput laut hasil pengolahan agar-agar ini diduga

karena telah dilakukan perlakuan awal terhadap limbah yaitu dengan melakukan

delignifikasi dengan basa NaOH 6% (w/w) baik pada pengolahan limbah agar-

agar dari daerah Pameungpeuk maupun dari PT. Agarindo. Pada kedua limbah

rumput laut tersebut diduga masih mengandung lignin. Lignin membungkus dan

mengikat selulosa secara fisik sehingga menghalangi enzim selulase bekerja

maksimal pada substrat (Meryandini et al. 2009), sehingga perlu dilakukan

delignifikasi. Proses delignifikasi merupakan suatu proses dalam menghilangkan

lignin dari liginiselulosa yang dilakukan dengan menggunakan bahan kimia asam

atau basa (Ahmed et al. 2001). Perlakuan awal dengan asam pekat H2SO4 1%

(v/w) tidak menghasilkan hasil yang sebaik pada substrat limbah dengan

perlakuan basa NaOH. Berdasarkan aktivitas selulase yang dihasilkan oleh isolat

PMP 0126y dapat disimpulkan bahwa pada perlakuan awal terbaik atau

delignifikasi terhadap limbah selulosa dari pengolahan agar-agar rumput laut

Glacilaria sp. dengan menggunakan basa NAOH 6%.

Enzim selulase dari isolat PMP 0126y dapat tergolong sebagai

endoglukanase karena dapat menghidrolisis dengan baik substrat selulosa CMC

53

murni dan CMC teknis. Aktivitas enzim selulase pada CMC murni lebih besar

yaitu sebesar 0,118 U/mL dibandingkan dengan aktivitas selulase pada CMC

teknis sebesar 0,073 U/mL. Substrat CMC merupakan substrat selulosa murni

yang berbentuk amorphous sehingga aktivitas enzim selulase pada substrat CMC

merupakan aktivitas enzim endo-1,4-β-glukanase karena enzim bekerja pada

rantai dalam CMC menghasilkan oligosakarida atau rantai selulosa yang lebih

pendek (Lynd et al. 2002). Hampir semua mikroorganisme selulolitik mampu

menghidrolisis CMC (Goto et al. 1992), dengan kata lain bahwa hampir semua

mikroorganisme dapat menghasilkan enzim endoselulase yang sangat aktif

mendegradasi derivat selulosa seperti CMC (Mattinen 1998). Hidrolisis terhadap

selulosa amorf (CMC) dilakukan secara acak oleh enzim CMC-ase yang

memutuskan ikatan β-1,4-glukosidase dari bagian dalam reaksi (Enari 1983).

Selain itu, enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y dapat

juga tergolong ke dalam enzim selobiohidrolase karena dapat menghasilkan

aktivitas selulase yang cukup tinggi pada media avisel dengan aktivitas selulase

sebesar 0,103 U/mL. Substrat selulosa untuk selobiohidrolase antara lain katun,

avisel, dan selulosa amorf (Fogarty 1983). Selobiohidrolase juga dapat

menghidrolisis mikrokristalin yaitu substrat selulosa yang berbentuk kristalin

(Kim & Kim 1995). Hal ini menunjukkan bahwa enzim selulase yang dihasilkan

oleh isolat PMP 0126y memiliki aktivitas enzim ekso-1,4-β-glukanase yang

memotong ujung rantai oligosakarida menjadi selobiosa, yaitu dua molekul

glukosa yang berikatan secara β-1,4-glikosidik (Kim & Kim 1995). Mulcahy

(1996) menambahkan bahwa bakteri pendegradasi selulosa baik aerob atau

anaerob cenderung untuk mendegradasi selulosa kristalin dan biasanya degradasi

enzim dilakukan lebih dari satu enzim selulase.

Aktivitas relatif selulase tertinggi terjadi pada penambahan logam CaCl2

5 mM yang dapat meningkatkan sebesar 53% dari aktivitas relatif optimum tanpa

penambahan logam. Peningkatan aktivitas relatif selulase menjadi 109,3% dengan

penambahan ion logam CaCl2 juga dilaporkan oleh Jung et al. (2008) dan

Kotchoni et al. (2006), aktivitas relatif meningkat sebesar 20% pada 5 mM CaCl2

dan 18% pada ion MgCl2. Ion Ca2+

merupakan modelator positif yang

menyebabkan perubahan konformasi sisi katalitik enzim, yang akan

54

mempermudah interaksi antara enzim dengan substrat sehingga meningkatkan

aktivitas katalitik enzim (Scopes 1987). Penambahan senyawa pengkelat logam

seperti EDTA tidak menurunkan aktivitas relatif sebesar 50%, akan tetapi pada

penambahan EDTA dengan logam CaCl2 5 mM yang menghasilkan aktivitas

relatif selulase tertinggi dapat menurunkan aktivitas relatif selulase sebanyak 53%

dari aktivitas relatif pada penambahan logam CaCl2 5 mM. Hal ini karena

senyawa EDTA merupakan senyawa pengkhelat logam yang menyebabkan

penurunan aktivitas katalitik enzim. Penghambatan EDTA maupun ion logam

terhadap selulase dengan cara membuat kompleks dengan substrat, bereaksi

dengan gugus aktif protein dari enzim, atau bereaksi dengan kompleks substrat

enzim (Deng & Tabatai 1994).

Dari zimogram menunjukkan ada tiga molekul protein yang memiliki

aktivitas selulolitik pada gel dengan berat molekul yaitu 39, 30, 14 kDa. Imam

et al. (1993) melaporkan enzim selulase yang dihasilkan oleh bakteri yang

diisolasi dari cacing kapal laut memiliki berat molekul sebesar 63 kDa dengan

menggunakan bufer renaturasi 0,1 M 2-[N-Morpholino] ethane-sulfonic acid

(MES) pH 5,8 selama 15 menit. Berat molekul protein selulase sebesar 37-43 kDa

dari enzim selulase yang dihasilkan oleh beberapa bakteri penghasil selulase

antara lain bakteri Bacillus circulans (Hakamada et al. 2002) dan Bacillus sp.

KSM-330 (Ozaki & Ito 1991). Berat molekul sebesar 61-78 kDa ditunjukkan oleh

enzim selulase dari Bacillus sp. AC-1 (Li et al. 2006) dan Bacillus sp. KSM-522

(Okoshi et al. 1990).

Isolat PMP 0126y merupakan isolat yang mampu menghasilkan enzim

ekstraseluler selulase tertinggi pada limbah agar-agar Pameungpeuk dengan

delignifikasi NaOH 6% sehingga dapat dimanfaatkan dalam mengolah limbah

pengolahan rumput laut. Enzim yang diperoleh dapat diaplikasikan pada limbah

rumput laut tersebut menjadi produk gula pereduksi. Gula pereduksi seperti

glukosa sebagai hasil penguraian limbah selulosa dari rumput laut mempunyai

prospek bioteknologi yang besar, karena glukosa tersebut dapat dikembangkan ke

arah industri bioetanol (Gilbert & Hazlewood 1993). Beberapa penelitian

pemanfaatan limbah rumput laut menjadi bioetanol sudah dilakukan oleh Ge et al.

(2011) dan John et al. (2011).

55

SIMPULAN

Isolat PMP 0126y merupakan bakteri yang diisolasi dari limbah

pengolahan agar-agar dari rumput laut Glacilaria sp. dari daerah Pameungpeuk,

Garut, Jawa Barat. Isolat ini tumbuh pada suhu 30 0C, bersifat Gram negatif

berbentuk batang pendek. Berdasarkan hasil sekuensing gen penyandi 16S-rRNA

dari isolat PMP 0126y sebanyak 1282 pasang basa diperoleh kemiripan sebesar

96% dengan bakteri Chryseobacterium indologenes galur McR-1.

Uji kualitatif terhadap isolat PMP 0126y menghasilkan indeks selulolitik

sebesar 1,9 pada suhu inkubasi 37 0C selama 5 hari waktu inkubasi. Pada uji

kuantitatif, aktivitas selulase tertinggi dihasilkan pada hari ketiga dengan aktivitas

selulase sebesar 0,108 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar 0,120 U/mg. Enzim

selulase dipekatkan dengan ultrafiltrasi pada 10 kali pemekatan (10.000 NMWC)

menghasilkan aktivitas selulase sebesar 0,112 U/mL. Pemurnian enzim dengan

kromatografi penukar anion DEAE menghasilkan puncak tertinggi pada fraksi

ke-48 dengan aktivitas selulase sebesar 0,154 U/mL. Terdapat 3 pita selulase

dengan perkiraan berat molekul yaitu 39 kDa, 30 kDa, dan 14 kDa.

Enzim selulase kasar dari PMP 0126y memiliki aktivitas optimum pada

pH 5 dan suhu inkubasi 30 0C, sedangkan enzim hasil kromatografi penukar anion

memiliki aktivitas optimum pada suhu 40 0C dan pH yang sama. Enzim relatif

stabil terhadap inkubasi pada suhu 30 0C selama 4 jam. Pengujian substrat

selulosa dari limbah rumput laut Pameungpeuk dengan NaOH 6%, merupakan

substrat terbaik yang menghasilkan aktivitas tertinggi yaitu 0,149 U/ml.

Penambahan logam 5 mM CaCl2 menyebabkan aktivitas relatif meningkat sebesar

53%, sedangkan penambahan ZnCl2 10 mM menurunkan aktivitas relatif

sebanyak 78% dari aktivitas optimum.

56

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed Z, Banu H, Rahman M, Akhter FM, Haque MS. 2001. Microbial activity

on the degradation lignocellulosic polysaccharides. J Biol Sci 1: 993-997.

Allcock ER, Woods DR. 1981. Cellulase enzyme from Clostridium

acetobutylicum. J Appl Environ Microbiol 41:539.

Arifin H. 2006. Bacterial cellulase from a local isolate Bacillus pumilus EB3

[tesis]. Kuala Lumpur: Universitas Putra Malaysia.

Atmadja WS, Kadi A, Sulistijo, Rachmaniar. 1996. Pengenalan Jenis-jenis

Rumput Laut Indonesia. Jakarta: PUSLITBANG Oseanologi LIPI.

Aygan A, Karcioglu L, Arikan B. 2011. Alkaline thermostable and halophilic

endoglucanase from Bacillus licheniformis C108. Afric J Biotechnol 10:

789-796.

Bajaj KB, Pangotra H, Wani MA, Sharma P, Sharma A. 2009. Partial purification

and characterization of a highly thermostable and pH stable

endoglucanase from a newly isolated Bacillus strain M-9. Indian J Chem

Technol 16: 382-387.

Bakare MK, Adewale IO, Ajayi A, Shonukan OO. 2005. Purification and

characterization of cellulase from the wild-type and two improved

mutants of Pseudomonas fluorescens. Afric J Biotech 4: 898-904.

Bayer EA, Belaich JP, Shoham Y, Lamed R. 2004. The cellulosomes:

multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides.

Annu Rev Microbiol 58:521-54.

Beguin P, Aubert JP. 1994. The biological degradation of cellulose. FEMS

Microbiol Rev 13:25-28.

Bischoff KM, Rooney AP, Li XL, Liu S, Hughes SR. 2006. Purification and

characterization of a family 5 endoglucanase from a moderately

thermophilic strain of Bacillus licheniformis. J Biotechnol Lett 28:1761-

1765.

Bollag MD, Edelstein SJ. 1991. Protein Methode. New York: Wiley-Liss.

Bradford MM. 1976. A Rapid and sensitive methode for the quantitation of

micogram quantitaties of protein in utilizing the principle of protein-dye

Binding. J Anal Biochem 72: 248-254.

Brown MR. 1996. The biosynthesis of cellulose. J Macromol Sci-Pure App Chem

33:1345-1373

57

Calderon G et al. 2011. Chryseobacterium indologenes infection in a newborn: a

case report. J Medical 5:10.

Cappucino JG, Sherman N. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Wesley:

Addison.

Chen J, Banks D, Jarret RL, Chang CJ, Smith BJ. 2000. Use of 16S-rRNA

sequences as signature characters to identify Xylella fastidiosa. Curr. J

Microbiol 40:29-33

Chesson A. 1987. Supplementary enzymes to improve the utilization of pig and

poultry diets. Di dalam Haresign dan Cole DA, editor. Advances in Animal

Nutrition. London: Recent. hlm 71-89.

Christakopoulus P et al. 1999. Purification and mode of action of an alkali-

resistant endo-1,4-β-glucanase from Bacillus pumilus. Arch Biochem

Biophys 361:61-66.

Classen PAM. 1999. Utilization of biomassa for the supply of energy carrier.

Appl Microbiol Biotechnol 52:741-755.

Coligan JE, Dunn BM, Speicher DW, Wingfield PT. 2003. Short Protocol in

Protein Science: A Compendium of Methods from Current Protocols in

Protein Science. New York: John Wiley & Sons Inc.

Copeland RA. 1994. Electrophoretic and Chromatographic Method for Assesing

Protein Purity. Di dalam: Methods for Protein Analysis: A Practical Guide

to Laboratory Protocols. New York: Chapman and Hall.

Coral G, Arikan B, Nisa UM, Guvenmez H. 2002. Some properties of crude

carboxylmethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain. Turk J

Biol 26:209-213.

Coughlan MP. 1985. The properties of fungal and bacterial cellulases with

comment on their production and application. Biotechnol Gen Eng Rev

3:39-109.

Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology. Di dalam: Brock TD, editor. A

Textbook of Industrial Microbiology. Sunderland: Minuaer Associates.

hlm 267-276.

Da Silva R, E.S. Lago, C.W. Merheb, M.M. Machione, Y.K. Park, E. Gomes.

2005. Production of xylanase and CMCase on solid state fermentation in

different residues by Thermoascus auranticus miehe. Braz J Microbiol

36:235-241.

Deng SP, Tabatabai MA. 1994. Cellulase activity of soils. Soil Biol Biochem

26:1347-1354.

58

Doblin MS, Kurek I, Jacob WD, Delmer DP. 2002. Cellulose biosynthesis in

plants: from genes to rosettes. Plant Cell Physiol 43:1407-1420.

Doi RH, Kosugi A, Murashima K, Tamaru Y, Han SO. 2003. Cellulosomes from

mesophilic bacteria. J Bacteriol 185:5907-5914.

Dunn MJ. 1989. Electrophorethic analysis methods. Di dalam ELV. Harris ELV.

Angal S, editor. Protein Purification Methods. A Practical Approach.

Oxford: IRL Press. Hlm 18-40.

El-Sersy NA, Elnaby HA, Abou-Elela GM, Ibrahim HAH, El-Toukhy NMK.

2010. Optimization, economization and characterization of cellulase

produced by marine Streptomyces ruber. Afric J Biotechnol 9: 6355-6364.

Enari TM. 1983. Microbial Cellulases. Di dalam W.M Fogarty, editor. Microbial

Enzymes and Biotechnology. New York: Applied Science Publisher.

Ersson B, Ryden L, Janson JC. 1998. Introduction to protein purification. Di

dalam Janson JC dan Ryden L, edisi ke-2. Protein Purification: Principle,

High Resolution, Mehods and Application. New York: John Wiley and

Sons, Inc Publication. hlm 1-40.

Fikrinda, Anas I, Purwadaria T, Santosa DA. 2001. Identifikasi ekstremozim

selulase isolat bakteri dari ekosistem air hitam. Hayati 8: 5-10.

Fogarty MW. 1983. Microbial Enzymes and Biotechnology. London: Applied

Science Publisher.

Gautam SP, Bundela PS, Pandey AK, Jamaluddin, Awasthi MK, Sarsaiya S.

2010. Cellulase production by Pseudomonas sp. isolated from municipal

solid waste compost. Int J Acad Res 2: 330-333.

Ge LL, Wang P, Mou H. 2011. Study on saccharification technique of seaweed

waste for the transformation of ethanol. J Renew Energy 36: 84-89.

Gilbert HJ, Hazlewood. 1993. Bacterial cellulases and xylanases. J Gen Microbiol

139: 187-194.

Goto MK, Furukawa, Hayashida S. 1992. An avicel-affinity site in an avicel-

digesting exocellulase from a Trichoderma viride mutant. Biosci Biotec

Biochem 56: 1523-1528.

Hakamada Y et al. 2002. Enzymatic properties, crystallization, and deduced

amino acid sequence of an alkaline endoglucanase from Bacillus circulans.

J Biochim Biophy Acta 1570:174-180.

Han YJ, Chen HZ. 2007. Synergism between corn stover protein and cellulose. J

Enzyme Microbiol Technol 41:638-645.

59

Hankin L, Anagnostakis SL. 1997. Solid media containing

carboxymethylcellulose to detect Cx cellulase activity of microorganisms.

J Gen Microbiol 98: 109-115.

Hardjo S, Indrasti NS, Baytacut T. 1984. Biokonversi Pemanfaatan Limbah

Industri Pertanian. Bogor: PAU Pangan dan Gizi IPB.

Harris ELV. 1989. Purification strategy. Di dalam: Harris ELV & Angal S, editor.

Protein Purification Methods: A Practical Approach. New York: IRL

Press.

Harvey F. 2009. Produksi bioetanol dari limbah karegenan [skripsi] Bogor: Insitut

Pertanian Bogor.

Holt JG. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9.

Baltimore: Williams and Wilkins.

Horikhosi K. 1999. Enzim selulase dari Bacillus sp. galur N-4. J Microbiol Molec

Biol Rev 64:735.

Imam SH, Greene RV, Hockridge ME. 1993. Zymographic analyses of

carboxymethylcelulases secreted by the bacterium from wood-boring

marine shipworms. J Biotech Techniq 8:579-584.

Irawadi TT. 1991. Produksi enzim ekstraselular (selulase dan xylanase) dari

Neurospora sitophila pada substrat limbah padat kelapa sawit [disertasi].

Bogor : Institut Pertanian Bogor.

Irawan B, Sutihat, Sumardi. 2008. Uji aktivitas selulase dan lipase pada

mikrofungi selama proses dekomposisi limbah cair kelapa sawit dengan

pengujian kultur murni. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan

Pengabdian kepada Masyarakat. Lampung: Universitas Lampung. hlm

284-291.

Jaradat Z, Dawagreh A, Ababneh Q, Saadoun I. 2008. Influence of culture

condition on cellulase production by Streptomyces sp. (strain J2). Jordan J

Biol Sci 1: 141-146.

Janson JC, Ryden I. 1998. Protein Purification: Principles, High Resolution

Methods and Applications. Ed ke-2. New York: John Wiley & Sons.

Jeong KH et al. 2004. Utilization. Compost Sci 12:242.

John RP, Anisha GS, Nampoothiri KM, Pandey A. 2011. Micro and macroalgal

biomass : a renewable source for bioethanol. J Biores Technol 102: 186-

193.

60

Ji YK, Sung HH, Jeong HH. 2005. Purification and characterization of an alkaline

cellulase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp. HSH-810. Biotech

Let 27: 313-316.

Jong NK, Li H, Jung K, Nam HC, Cheon PL. 2011. Ethanol production from

marine algal hydrolysates using Escherichia coli KO11. J Biores Technol

102: 7466-7499.

Jung LY et al. 2008. Purification and characterization of cellulase produced by

Bacillus amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice hull. J Biores Technol

99:378-386.

Kader AJ, Omar O. 1998. Isolation of cellulolytic fungi from Sayap-Kinabalu

Park, Sabah. Serawak. J Biodiversity Bio-Conserv (ARBEC): 1-6.

Kim CH, Kim DS. 1995. Purification and specificity of specific endo-β-D-

glucanase (Avicelase II) resembling exo-cellobiohydrolase from Bacillus

circulans. Enzyme Microbial Technol 17: 248-254.

Kim GS, Myung KS, Kim YJ, Oh KK, Kim JS, Ryu HJ, Kim KH. 2008. Methode

of Producing Biofuel Using Sea Algae. Seoul: World Intelectual Property

Organization.

Kleiner DE, Stetler-Stevenson WG. 1994. Quantitative zymography: detection of

picogram quantities of gelatinases. Anal Biochem 218:325-329.

Kotchoni SO, Gachomo EW, Omafuvbe BO, Shonukan OO. 2006. Purification

and biochemical characterization of carboxymethyl cellulase (CMCase)

from a catabolite repression intensive mutant of Bacillus pumilus. Inter J

Agri Biol 8: 286-292.

Kulp K. 1975. Carbohydrases. Di dalam Reed G. Editor. Enzymes and

Processing. New York: Academic Press.

Leber TM, Balkwill FR. 1997. Zymography: a single-step staining method for

quantitation of proteolytic activity on substrat gel. Anal Biochem 249:24-

28.

Lestari P, Richana N, Murdiyatmo U. 2000. Pemurnian α-amilase Bacillus

stearothermophilus dengan membran ultrafiltrasi. J Mikrobiol Indo 1: 10-

14.

Li YH, Ding M, Wang J, Xu GJ, Zhao F. 2006. A novel thermoacidophilic

endoglucanase, Ba-EGA, from a new cellulose-degrading bacterium,

Bacillus sp. AC-1. J Appl Microbiol Biotechnol 70:430-436.

Linder M & Teeri T. 1997. The role and function of cellulose-binding domains. J

Biotech 57:15-28.

61

Lynd LR, Paul JW, Willem H, Isak SP. 2002. Microbiol molecul. Bio Reviewers

66:506.

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biology of Microorganisms.

London: Prentice-Hall International (UK) Limited. hlm 991.

Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2009. Brock Biology of

Microorganisms. Ed ke-12. San Francisco : Pearson Benjamin Cummings.

Malleviale J. 1996. Water treatment membran processes, Di dalam : Awwa

Lyonnaise des Eaux. Water Research Commision of South Africa. New

York : Mc Graw Hill.

Mandels M. 1985. Application of cellulases. Biochem Society Trans 13:414-416.

Maniatis T, Sambrook J, Fritsch EF. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Marchesi JR et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR

primers that amplify genes coding for bacterial 16S-rRNA. Appl Environ

Microbiol 64:795-799.

Mattinen ML. 1998. Structural and functional studies of fungal cellulose binding

domain by NMR spectroscopy [disertasi]. Turku: University of Helsinki.

Mawadza C, Hatti KR, Zvauya R, Mattiasson B. 2000. Purification and

characterization of cellulases produced by two Bacillus strains. J

Biotechnol 83:177-187.

Meryandini A et al. 2009. Isolasi bakteri selulotik dan karakterisasi enzimnya.

Makara Sains 13:33-38.

Milala MA, Shugaba A, Gidado A, Ene AC Wafar JA. 2005. Studies on the use of

agricultural wastes for cellulase enzyme production by Aspegillus niger.

Res J Agric Bio Sci 1:325-328.

Mulcahy. 1996. An investigation of cellulose Binding Domain in non-cellulose

binding domain in non-cellulolytic enzymes. Limerick: Final Year Project

University of Limerick.

Mulder M. 1996. Basic Principles of Membrane Processes. Netherland: Kluwer

Academic Publisher.

Munifah I, Chasanah E, Fawzya YN. 2011. Screening of cellulolytic bacteria from

Indonesia’s marine environment. Di dalam: Prosiding Seminar ISISM

(International Seminar of Indonesian Society for Microbiology); Bogor, 26

Juni 2011. Bogor: Perhimpunan Mikrobiologi Cabang Bogor.

62

Murray PR, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. 1995. Manual of Clinical

Microbiology. Ed ke-6. Washington DC: American Society for

Microbiology Press.

Neville B. 1998. Reserved-phase HPLC. Di dalam: Rapley R, Walker JM, editor.

Molecular Biomethods Handbook. Totowa: Humana Pr. hlm 479-489.

Oikawa T, Takagi M, Ameyama MA. 1994. Detection of carboxymethyl cellulase

activity in Acetobacter xylinum KU-1. Biosci Biotech Biochem 58: 2102-

2103.

Okoshi H, Ozaki K, Shikata S, Oshino K, Kawai S, Ito S. 1990. Purification and

characterization of multiple carboxymethyl cellulases from Bacillus sp.

KSM-522. J Agri Biol Chem 54: 83-89.

Ooshima H, Sakata H, dan Harano Y. 1985. Simultaneous saccharification and

fermentation of cellulose: Effect of ethanol on enzymatic saccarification of

cellulose. Biotechnol Bioeng 27: 389-397.

Ottaway JH, Apps DK. 1984. Biochemistry. Ed ke-4. Cambridge: ELBS.

Ozaki K, Ito S. 1991. Purification and properties of an acid endo-1,4-β-glucanase

from Bacillus sp. KSM-330. J Gen Microbiol 37:41-48.

Po JC, Tao CW, Yao TC, dan Lian PL. 2004. Purification and characterization of

carboxymethyl cellulase from Sinorhizobium fredii. Bull Acad Sin 45: 111-

118.

Poernomo AT, Djoko DA. 2003. Uji aktivitas enzim proteolitik ekstrak kasar

Bacillus subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah. Majal Farmasi 3:103-

107.

Ponce TN, Torre MDL. 2001. Regulation of cellulases and xylanases from a

depressed mutant of Cellulomonas flavigena growing on sugar-cane

bagasse in continuous culture. J Biores Technol 78: 285-291.

Prescott SC, Dunns CG. 1981. Industrial Microbiology. Eastport: AV1 Pub

Connecticut.

Purwadaria MBT. 1998. Purification and characterisation of a Cellulomonas

cellulase complex [disertasi]. New South Wales: University of New South

Wales.

Rajoka MI, Malik KA. 1997. Cellulase production by Cellulomonas biazotea

cultured in media containing different cellulosic substrates. J Biores

Technol 59:21-27.

63

Rao NSS. 1994. Soil Microorganisms and Plant Growth. London: Oxford and

IBM Publishing Co.

Rattanasuk S, Cairns MK. 2009. Chryseobacterium indologenes, novel mananase-

producing bacteria. J Sci Technol 31: 395-399.

Rickard PAD, Ghani BA, Lucas RJ, Dunn NW. 1989. Kinetic properties and

contribution to cellulose saccharification of a cloned Pseudomonas β-

glucosidase. Aust J Biotechnol 31:43-49.

Riyanti EI. 2008. Biomassa sebagai bahan baku Bioetanol. Bogor: Balai Besar

Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika

Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Rosenberg Ian M. 1996. Protein Analysis and Purification Benchtop Techniques.

Boston: Birkhauser.

Ruanglek V, Maneewatthana D, Tripetchkul S. 2006. Evaluation of Thai agro-

industrial wastes for bio-ethanol production by Zymomonas mobilis.

Process Biochem 41: 1432-1437.

Saha BC. 2003. Production, purification, and properties of endoglucanase from a

mewly isolated strain of Mucor circinelloides. Proc Biochem 39: 1871-

1876.

Scopes RK. 1987. Protein Purification and Practice. Ed ke-2. New York:

Springer Verlag.

Selvankumar T, Govarthanan M, Govindaraju M. 2011. Endoglucanase

production by Bacillus amyoliquefaciens using coffe pulp as substrate in

solid state fermentation. Inter J Pharma Bio Sci 2: 355-362.

Sharma P, Gupta JK, Vadehra DV, Dube DK. 1990. Purification and properties of

Bacillus sp. PDV endoglucanase. Enzyme Microbiol Technol 12:132-137.

Shimada K. Karita S, Sakka K, Obmiya K. 1994. Cellulase, xylanase and their

genes from bacteria. Di dalam: Murooka & lmanaka T, editor.

Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications. New

York: Marcel Dekker. hlm. 395-429.

Smith BJ. 1984. SDS Polyacrilamide Gel Electrophoresis of Protein. Di dalam:

Walker JM, editor. Proteins Methods in Molecular Biology. Volume ke-1.

Clifton: Humana Pr. hlm 41-55.

Singh J, Batra N, Sobti RC. 2004. Purification and characterization of alkaline

cellulase produced by a novel isolate Bacillus sphaericus JS1. J Indust

Microbiol Biotechnol 31: 51-56.

64

Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: IPB. hlm 71-75.

Suwanto, Yogiana, Suryanto D, Tan I, Puspitasari E. 2000. Selectes Protocols

Training Course on Advances in Molecular Biology Techniques to Asses

Microbial Diversity. Bogor: SEAMEO-BIOTROP. hlm 22-31.

Tanaka K, Hilary ZD, Ishizaki A. 1999. Investigation of the utility of pineapple

juice and and pineapple waste material as low-cost substrate for ethanol

fermentation by Zymomonas mobilis. J Bioscie Bioeng 87: 642-646.

Teather RM, Wood PJ. 1982. Use of congo red polysaccharide interactions in

enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine

rumen. Appl Environ Microbiol 43:777-780.

Trivedi N, Gupta V, Kumar M, Kumari P, Reddy CRK, Jha B. 2011. An alkali-

halotolerant cellulase from Bacillus flexus isolated from green seaweed

Ulva lactuca. Carbohyd Polym 83: 891-897.

Van de Peer Y, De Watcher. 1993. TREECON : a software package for the

construction and drawing of evolutionary trees. Comput Applic Biosci

9:177-182.

Watanabe H, Tokuda G. 2001. Animal cellulases. Cell Mol Life Sci 58:1167-1178.

Wood TM, Saddler JN. 1988. Increasing the availability of cellulose in biomass

materials. Di dalam Wood WA and Kellog JA, editor. Methode in

Enzymology Cellulose and Hemicellulose. Volume ke-160. New York:

Academic press. hlm 3-11.

Woese CR. 1987. Bacterial evolution. J Microbiol Rev 51: 221-271.

Xu B, Hellman U, Ersson B, Janson JC. 2000. Purification, characterization and

amino-acid sequence analysis of a thermostable, low molecular mass

endobeta-1,4-glucanase from blue mussel, Mytilus edulis. Eur J Biochem

267:4970-4977.

Yang VC, Linhardt RJ, Bernstein H, Cooney CL, Langer R. 1985. Purification

and characterization of heparinase from Flavobacterium heparinum. J Biol

Chem. 260: 1849-1857.

Yabuuchi E, Hashimoto Y, Ezaki T, Ido Y, Takeuchi N. 1983. Genotypic and

phenotypic difeerentiation of Flavobacterium indologenes. J Microbiol

Immunol 34:73-76.

Yoshimatsu T et al. 1990. Purification and characterization of alkaline endo-1,4,β-

glucanases from alkalophilic Bacillus sp. KSM-635. J Gen Microbiol 136:

1973-1979.

65

Zhang YHP, Himmel ME, Mielenz JR. 2006. Outlook for cellulase improvement:

screening and selection strategies. Biotechnol Adv 24:452-481.

Zverlova VV, Holl W, and Schwarz H. 2003. Enzymes for digestion of cellulose

and other polysaccharides in the gut of longhorn beetle larvae, Rhagium

inquisitor L. (Col., Cerambycidae). Inter Biodet Biodeg. 51:175–179.

66

LAMPIRAN

67

Lampiran 1 Prosedur pembuatan media dan reagen yang digunakan dalam

penelitian

Media kultur cair dan padat bakteri PMP 0126y

Pembuatan media kultur cair bakteri yang mengandung CMC dilakukan

dengan melarutkan 1% CMC di dalam air yang terus dipanaskan dan diaduk

sampai larutan menjadi homogen. Kemudian sebanyak 0,02% MgSO4.7H2O;

0,03% NH4NO3; 0,05% K2HPO4; 0,1% KH2PO4; 0,002% FeSO4.7H2O; 0,004%

CaCl2.2H2O; 0,2% ekstrak khamir dilarutkan dalam larutan CMC yang sudah

homogen. Pada media inokulum, ditambahkan sebanyak 0,1% glukosa.

Sedangkan pada media produksi tidak ditambahkan glukosa.

Pembuatan media kultur padat CMC dibuat dengan perlakuan yang sama

dengan media kultur cair. Akan tetapi, media kultur padat ditambahkan sebanyak

1,5% agar-agar bakto. Kemudian media disterilisasi menggunakan autoklaf pada

suhu 121 0C selama 15 menit.

Merah Kongo 0,1%

Sebanyak 1 g reagen merah kongo dilarutkan dalam 100 mL air distilasi.

Larutan ini harus disimpan dalam botol gelap dan sebaiknya dalam keadaan segar

setiap kali akan dilakukan uji kualitatif.

Reagen DNS

Sebanyak 1% NaOH dilarutkan dalam air distilasi, kemudian ditambahkan

sebanyak 1% DNS, 18,2% Na K Tartarat (sodium tartarat), 0,2% Fenol, 0,05%

Na2SO4. Semua bahan dilarutkan dalam air distilasi dan disimpan dalam botol

gelap pada suhu 4 0C.

Larutan stok KH2PO4 (SNI 01-2332-3-2006)

Sebanyak 34 g KH2PO4 ditambahkan ke dalam 500 ml akuades. pH diatur

7,2 dengan 1 N NaOH dan larutan ditepatkan sebanyak 1 L dengan ditambah

akuades. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121 0C. Larutan disimpan dalam

lemari pendingin.

68

Pereaksi Bradford (Bradford 1976)

Sebanyak 175 mg Coomassie Briliant Blue G250 (C.L. 42655) dilarutkan

dalam 50 mL etanol 95% dan 100 mL asam ortofosfat 88% untuk larutan stok

Bradford. Pada larutan bufer pereaksi Bradford 100 mL dibuat dengan

mencampurkan sebanyak 6 mL larutan stok Bradford dengan 6 mL asam fosfat, 3

mL etanol, dan 90,4 mL air distilasi. Kemudian, campuran pereaksi disaring

dengan menggunakan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap pada suhu

ruang atau dingin.

Gel Agarosa

Sebanyak 0,25 g dilarutkan dalam 25 mL bufer TBE 1x. Kemudian

dipanaskan dalam oven pada suhu 50 0C selama 2 menit.

Elektroforesis gel poliakrilamida, SDS 30% (29%, 1%)

Sebanyak 14,5 g akrilamida (Acrylamide) dan 0,5 g bis akrilamida (N, N’-

Methylenebisacrylamide) dilarutkan dalam 50 mL air distilasi (30%). Kemudian,

larutan disaring dengan menggunakan kertas saring dan disiman dalam botol

gelap pada suhu 4 0C.

1,5 M Bufer Tris-HCl pH 8,8

Sebanyak 9,1 g Tris basa dilarutkan di dalam 50 mL air distilasi,

kemudian pH diatur hingga menjadi 8,8 dengan menggunakan HCl 1 N. Larutan

disimpan pada suhu 4 0C.

0,5 M Tris-HCl pH 6,8

Sebanyak 5,85 g Tris basa dilarutkan dalam 100 mL air distilasi,

kemudian pH diatur dengan menggunakan HCl 1 N hingga menjadi 6,8. Larutan

disimpan pada suhu 4 0C.

10% SDS

Sebanyak 0,1 g SDS dilarutkan dalam 1 mL air distilasi. Larutan ini

disimpan dalam suhu 4 0C. Larutan ini harus dibuat segar setiap minggunya.

10% Amonium Persulfat (APS)

Sebanyak 20 mg dilarutkan dalam 0,2 mL air distilasi (dalam 1 mL

mengandung 0,1 g APS). Larutan ini harus dibuat segar setiap kali akan

69

digunakan. Tidak dianjurkan untuk menggunakan APS yang sudah dibuat sehari

sebelumnya.

5X Bufer Sampel SDS dan Zimogram

Bufer sampel SDS-PAGE dibuat dengan mencampurkan sebanyak 0,6 mL

1 M Tris-Cl pH 6,8 dengan 5 ml 50% gliserol, 2 ml 10% SDS, 0,5 ml

β-mercaptoethanol, 1 ml 1% bromophenol blue dan 0,9 ml H2O. Untuk bufer

sampel Zimogram tanpa penambahan 10% SDS, dan β-mercaptoethanol yaitu

sebanyak 1,2 ml 1 M Tris-Cl (pH 6,8) ditambah dengan 5 ml 50% gliserol, 0,5 ml

bromophenol blue, dan 1,4 ml H2O.

1X Bufer Elektroforesis SDS

Sebanyak 3 g Tris, 14,4 g glysin, dan 1 g SDS dilarutkan dalam 1 L air

distilasi kemudian pH diatur menjadi 8,3. Larutan bufer ini dapat digunakan

sampai 10 kali elektroforesis SDS-PAGE dan dapat disimpan dalam suhu ruang

(Bollag & Edelstein 1991)

Larutan Pewarna Gel (Kit Pewarna Silver) Fermentas

a. Larutan peluntur gel 1 (gel fixing)

Sebanyak 25 mL etanol absolut dicampur dengan 20 mL air distilasi dan

ditambah dengan 5 mL asam asetat glasial.

b. Larutan peluntur gel 2 (gel fixing)

Sebanyak 30 mL etanol absolut dicampur dengan 70 mL air distilasi.

c. Larutan sensitizer

Sebanyak 200 µL konsentrat sensitizer dilarutkan dalam 50 mL air

distilasi.

d. Larutan pewarna

Sebanyak 2 mL bahan reaksi pewarna ditambahkan 50 air distilasi,

kemudian saat akan digunakan baru ditambah dengan 27 µL larutan

formaldehida.

70

e. Larutan pencuci gel

Sebanyak 10 µL konsentrat sensitizer dicampur dengan 5 ml larutan

pencuci, dan 50 mL air distilasi. Kemudian, ditambah dengan 13,5 µL

larutan formaldehida saat larutan ini akan digunakan.

f. Larutan akhir

Sebanyak 4 ml larutan akhir (Stop solution) ditambah dengan 46 ml air

distilasi.

71

Lampiran 2 Kurva standar glukosa

Kurva standar glukosa dibuat dengan pembuatan larutan standar glukosa

0,1% dengan berbagai konsentrasi (0-100 ppm). Sebanyak 1 mL substrat glukosa

0,1% dalam akuades steril dengan berbagai konsentrasi ditambah dengan 1 mL

DNS pada masing-masing tabung reaksi. Setiap larutan kemudian diinkubasi di

dalam air mendidih selama 15 menit dan absorbansi diukur pada λ 575 nm.

Konsentrasi glukosa (mg/L) Absorbansi

0 0,000

20 0,142

40 0,534

60 0,994

80 1,397

100 1,765

72

Lampiran 3 Kurva standar bovin serum albumin (BSA)

Konsentrasi BSA (mg/mL) Absorbansi λ595

0 0

0,1 0,033

0,2 0,046

0,3 0,057

0,4 0,080

0,5 0,097

0,6 0,115

0,7 0,140

0,8 0,152

0,9 0,166

1 0,171

73

Lampiran 4 Kurva hubungan log sel dan kerapatan optis dan jumlah sel isolat

PMP 0126y selama 27 jam pengamatan

Pengenceran OD Jumlah sel Log10

1:1 1,190 2950000000 9,47

1:2 0,783 1475000000 9,17

1:4 0,441 737500000 8,87

1:8 0,249 368750000 8,57

1:16 0,143 184375000 8,27

1:32 0,088 92187500 7,96

Jumlah sel (Log10 CFU/mL) isolat PMP 0126y selama 27 jam pengamatan

Waktu sampling (jam) OD Log10 CFU/mL

0 0,141 8,3

3 0,450 8,7

6 0,991 9,4

9 1,123 9,5

12 1,251 9,7

15 1,271 9,7

18 1,252 9,7

21 1,263 9,7

24 1,091 9,5

27 0,605 8,9

74

Lampiran 5 Hasil uji aktivitas selulase isolat PMP 0126y

Hasil uji aktivitas selulase pada media produksi selama 6 hari pengamatan

Hari

Konsentrasi

glukosa

(mg/L)

Aktivitas

selulase

(U/mL)

Jumlah sel

(Log10

CFU/mL)

Konsentrasi

protein

(mg/mL)

Aktivitas Spesifik

(U/mg)

0 0,069 0,064 8,7 1,193 0,053

1 0,071 0,065 9,1 0,875 0,074

2 0,079 0,073 9,1 0,927 0,079

3 0,117 0,108 9,1 0,895 0,120

4 0,076 0,070 9,1 1,070 0,066

5 0,075 0,069 9,0 1,052 0,066

6 0,068 0,063 8,9 1,030 0,061

Hasil uji aktivitas selulase pada media produksi mengandung glukosa 0,1% setiap

hari pengamatan

Hari

Konsentrasi

glukosa

(mg/mL)

Aktivitas

selulase

(U/mL)

Jumlah sel

(Log10

CFU/mL)

Kadar

Protein

(mg/mL)

Aktivitas spesifik

(U/mg)

0 0,070 0,065 8,4 1,024 0,063

1 0,070 0,065 9,4 1,010 0,065

2 0,071 0,066 9,4 0,860 0,077

3 0,076 0,070 9,4 0,606 0,116

4 0,068 0,063 9,3 1,119 0,056

5 0,064 0,059 9,2 1,235 0,048

6 0,054 0,050 8,9 1,241 0,040

Aktivitas unit, aktivitas spesifik endapan dan supernatan pada berbagai persen

kelarutan amonium sulfat

Persen kelarutan

amonium sulfat

(%)

Aktivitas selulase (U/mL)

Aktivitas spesifik (U/mg)

Endapan Supernatan Endapan Supernatan

Kontrol 0,064 0,075

30 0,069 0,059 0,092 0,106

40 0,069 0,065 0,117 0,085

50 0,072 0,068 0,128 0,105

60 0,071 0,064 0,079 0,077

70 0,066 0,065 0,062 0,090

80 0,064 0,065 0,047 0,056

90 0,064 0,062 0,047 0,054

75

Hasil uji aktivitas selulase hasil pemurnian kolom DEAE

Fraksi

Konsentrasi

glukosa

(mg/mL)

Aktivitas

selulase (U/mL)

Kadar protein

(mg/mL)

Aktivitas spesifik

(U/mg)

46 0,064 0,127 0,124 1,024

47 0,064 0,127 0,087 1,468

48 0,077 0,154 0,118 1,301

49 0,064 0,127 0,107 1,190

50 0,064 0,128 0,144 0,888

51 0,073 0,147 0,092 1,591

52 0,070 0,141 0,133 1,062

53 0,066 0,131 0,130 1,009

54 0,061 0,121 0,130 0,933

55 0,068 0,137 0,115 1,187

Aktivitas relatif selulase pada penambahan logam 5 mM dan 10 mM

Ion logam Aktivitas relatif (%)

5 mM 10 mM

Kontrol 100

KCl 99 109

NaCl 80 80

MgCl2 129 74

FeCl3 83 111

CaCl2 153 82

ZnCl2 71 22

EDTA 81 66

Aktivitas selulase pada 5 mM dan 10 mM pada aktivitas selulase

Ion logam Aktivitas selulase (U/mL)

pada 5 mM

Aktivitas selulase (U/mL)

pada 10 mM

Kontrol 0,090

KCl 0,089 0,098

NaCl 0,072 0,072

MgCl2 0,116 0,067

FeCl3 0,075 0,100

CaCl2 0,138 0,074

ZnCl2 0,064 0,020

EDTA 0,073 0,059

76

Lampiran 6 Prosedur delignifikasi limbah rumput laut dengan NaOH dan H2SO4

oleh BBP4BKP

limbah rumput laut digerus sampai halus

ditambah NaOH (w/w) 4 dan 6%, dan H2SO4 1% (w/v)

diautoklaf selama 20 menit pada suhu 121 0C

disaring

dikeringkan di dalam oven sampai kadar air ± 10%

77

BIOTRACEBioEdit version 7.0.5.3 (10/28/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_672451_Isna_16SF.ab1

�

672451_Isna_16SF

Lane 13

Signal G:110 A:191 T:231 C:195

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2201 to 18200

Page 1 of 2

8/24/2011

Spacing: 15.3345308303833

G GGGGGGAA

10

ACTTT CG GGG

20

ACTT G AGAGC

30

GGCGTACGGG

40

TGCGGAACAC

50

GTGTGCAACC

60

TGCCTTTATC

70

TGGGGGATAG

80

CC TTTCGAAA

90

GGAAGATTAA

100

TACCCCATAA

110

TATATTGAAT

120

GGCATCAT TT

130

GATATTGAAA

140

ACTCCGG T

GG

150

ATAGAGATGG

160

GCACGCGCAA

170

GATTAGATAG

180

TTGGTGAGGT

190

AACGGCTCAC

200

CAAG TCAGCG

210

ATCTTTAGGG

220

GGCCTG AGAG

230

GGTGATCCCC

240

CACACTGGTA

250

CTGAG ACACG

260

G ACCAGACTC

270

CTACGGGAGG

280

CAGCAGTG AG

290

GAAT

ATTGGA

300

CAATGGGTGA

310

GAGCCTGATC

320

CAGCCATCCC

330

GCGTGAAGGA

340

CGACGGCCCT

350

ATGGGTTGTA

360

AACTTCTTTT

370

GTATAGGGAT

380

AAACCTACCC

390

TCGTGAGGGT

400

AGCTGAAGGT

410

ACTATACGAA

420

TAAGCACCGG

430

CTAACTCCGT

440

GCCA

GCAGCC

450

GCGGTAATAC

460

GGAGGGTGCA

470

AGCGTTATCC

480

GGATTTATTG

490

GGTTTAAAGG

500

GTCCGTAGGC

510

TGATTTGTAA

520

GTCAGTGGTG

530

AAATCTCACA

540

GCTTAACTGT

550

GAAACTGCCA

560

TTGATACTGC

570

AAGTCTTGAG

580

TGTTGTTGAA

590

GTAG

CTGGAA

600

TAAGTAGTGT

610

AGCGGTGAAA

620

TGCATAGATA

630

TTACTTAGAA

640

CACCAATTGC

650

GAAGGCAGGT

660

TACTAAGCAA

670

CAACTGACGC

680

TGATGGACGA

690

AAGCGTGGGG

700

AGCGAACAGG

710

ATTAGATACC

720

CTGGTAGTCC

730

ACGCCGTAAA

740

CG

78

BIOTRACEBioEdit version 7.0.5.3 (10/28/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_672451_Isna_16SF.ab1

�

672451_Isna_16SF

Lane 13

Signal G:110 A:191 T:231 C:195

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2201 to 18200

Page 2 of 2

8/24/2011

Spacing: 15.3345308303833

ATGCTAAC

750

TCGTTTTTGG

760

GCTTTTGGGT

770

TCAGAGACTA

780

AGCGAAAGTG

790

ATAAGTTAGC

800

CACCTGG GGA

810

GTACGAACGC

820

AAGTT TGAAA

830

CTCAAAGGAA

840

TTGACGGGGG

850

CCCGCACAAG

860

CGGTGGATTA

870

TGTGGTTTAA

880

TTCGA

TGATA

890

CGCGAGGAAC

900

CTT ACCAAGG

910

CTTAAATGGG

920

GAAATGAC AG

930

GCTT AGAAAA

940

TAGGCTT TT C

950

TTC GGACATT

960

TTTCAAGGTG

970

CTGCATGG TT

980

GTC GTCAGCT

990

CCTGCCCGTG

1000

AGGTGTTAAG

1010

GTTAAGTCCT

1020

T GCAACGAAG

1030

CGCAACCCCT

1040

TGTCACTAA T

1050

TTGCCATCAT

1060

TT AATTTGGG

1070

GGACTCTAGT

1080

T AAAACTGCC

1090

T ACCCCAA GT

1100

A AAAAAGAAA

1110

AGTT GGGGAT

1120

AAA

79

BIOTRACEBioEdit version 7.0.5.3 (10/28/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_672450_Isna_16SR.ab1

672450_Isna_16SR

Lane 15

Signal G:126 A:146 T:183 C:157

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2200 to 18281

Page 1 of 2

8/24/2011

Spacing: 15.2945175170898

N GGGGGCAA

10

ACCG CG CCAT

20

G G CT G ATGCG

30

CGATTACTAG

40

CGATTCCAGC

50

T TCATAG AGT

60

CGAGTTGCAG

70

ACTCCAATCC

80

GAACTG AG AC

90

CGG C TTTCGA

100

GATTTGCATC

110

AC TTCGCAG T

120

G TAGC TGCCC

130

TC TG TACCGG

140

CCAT TG

TATT

150

ACGTG TG TGG

160

CCCAAGGCG T

170

AAGGGCCG TG

180

ATG ATTTGAC

190

GTCATCCCCA

200

CC TTCCTCTC

210

TACTTGCGTA

220

GGCAGTCTCA

230

CTAG AGTCCC

240

CAACTTAATG

250

ATGGCAACTA

260

G TGACAGGGG

270

TTGCGCTCGT

280

TGCAGGACTT

290

AACCTAACAC

300

CTCACGGCAC

310

GAGCTGACGA

320

CAACCATGCA

330

GCACCTTG AA

340

AAATGTCCGA

350

AGAAAAGCCT

360

ATTTCTAAGC

370

CTGTCATTTC

380

CCATTTAAGC

390

CTTGGTAAGG

400

TTCCTCGCGT

410

ATCATCGAAT

420

TAAACCACAT

430

AATCCACCGC

440

TTGTGCGGGC

450

CCCCGTCAAT

460

TCCTTTGAGT

470

TTCAAACTTG

480

CGTTCGTACT

490

CCCCAGGTGG

500

CTAACTTATC

510

ACTTTCGCTT

520

AGTCTCTGAA

530

CCCAAAAGCC

540

CAAAAACGAG

550

TTAGCATCGT

560

TTACGGCGTG

570

GACTACCAGG

580

GTATCTAATC

590

CTGTTCGCTC

600

CCCACGCTTT

610

CGTCCATCAG

620

CGTCAGTTGT

630

TGCTTAGTAA

640

CCTGCCTTCG

650

CAATTGGTGT

660

TCTAAGTAAT

670

ATCTATGCAT

680

TTCACCGCTA

690

CACTACTTAT

700

TCCAGCTACT

710

TCAACAACAC

720

TCAAGACTTG

730

CAGT ATCA

80

BIOTRACEBioEdit version 7.0.5.3 (10/28/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_672450_Isna_16SR.ab1

672450_Isna_16SR

Lane 15

Signal G:126 A:146 T:183 C:157

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2200 to 18281

Page 2 of 2

8/24/2011

Spacing: 15.2945175170898

AT

740

GGCAGTTTCA

750

CAGTT AAGCT

760

GTGAGATTTC

770

ACCACTGACT

780

TACAAATCAG

790

CCTACGGACC

800

CTTTAAACCC

810

AATAAATCC G

820

GAT AAC GCTT

830

GCACCCTCCG

840

TATTACCGCG

850

GCTGCTGGCA

860

CG GAGTT AG C

870

CGGTGCTT AT

880

TCGTATAGTA

890

CCTT CAGCTA

900

CCCT CACGA G

910

GGTAGGTTT A

920

TCCCCTATAC

930

AAAAA AAAGT

940

TT ACAACCC A

950

TAA GGG CCGT

960

CGTCCTTTCA

970

CGCCGGGATG

980

GCTGGGATCA

990

AGGCT CTCAC

1000

CCCATTGTCC

1010

AAATATTCCT

1020

TCAC

TGGCTG

1030

CCCTCCCGT A

1040

AGAATTCTGG

1050

G CCC TTGT CT

1060

CAA TTACCAA

1070

TT TTN

81

82