PERCOBAAN 5 Analisis Kualitatif Metabolit Sekunder

I. Tujuan Praktikum Menganalisis hasil isolasi piperin, glukosa flavonoid, aglikon flavonoid, dan glikosida dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan pereaksi warna II. Alat dan Bahan Alat yang digunakan yaitu KLT, spektrofotogiavi UV, pipet, tabung reaksi, kertas saring, corong, beaker glass, penggaris, labu ukur, pipet ukur, filler. Dan pengangas uap. Bahan yang digunakan yaitu hasil isolasi piperin, hasil isolasi glikosida flavonoid, hasil isolasi aglikon, hasil isolasi glikosida, diklormetan, etilasetat, silika gel GF 254, piperin standar, pereaksi anisaldehid-asam sulfat, selulosa, asam asetat, ruti, metanol, pereaksi sitroborat n-butanol, air, larutan glukosa, larutan ramnosa, larutan kalium permanganat basa, amonia, kloroform, HCl, pereaksi dragendrof, pereaksi mayer, logam magnesium atau seng, amil alkohol, pereaksi besi (III) klorida, gelatin, eter, pereaksi Liebermann Burchad, dan KOH.

III. Skema Kerja A. Analisis Kualitatif I (hasil isolasi piperin)Larutan kristal dalam etanol dan sari hasil penyaringan dengan soxhlet

Ditotolkan pada silika gel GF 254 sbg fase diam Dielusi dalam fase gerak dklormetanBercak pada silika gel GF 254

RF

Diamati pada : a. Sinar tampak b. Sinar UV 254nm dan 366nm Disemprot pereaksi anisaldehid asam sulfat Dipanaskan 110oC selama 10 menit

Hasil

Dihitung dan dibandingkan dengan Rf piperin standar

B. Analisis Kualitatif II (hasil isolasi flavonoid)Sari I Sari II Sari III Larutan rufin dalam metanol 50%

Ditotolkan pada selulosa sebagai fase diam Dielusi pada asam asetat sebagai fase gerak

Bercak pada selulosa

Diamati pada:a. Sinar UV 266 nm b.uap amoniak, sinar tampak c. uap amoniak, sinar 366nm Disemprot pereaksi sitroborat Dipanaskan 110oC selama 5 menit Diamati dibawah UV 366nm

Rf dan warna yang terbentuk

Hasil

Dicatat, Dihitung

C. Analisis kualitatif III (hasil isolasi glukosa)Sari I Sari II Sari III Larutan glukosa dalam metanol 50%

Ditotolkan pada selulosa (10 totol) kecuali sari III (30 totol) Dieluasi padan n-butanol;as.asetat;air Bercak pada selulosa Diamati pada sinat UV 366 nm dan flouresensi Diuapi dengan amoniak Catat harga Rf Semprot dengan kalium permanganat basa Catat harga Rf dan warna yang terbentukHasil

D. Reaksi Warna 1. AlkaloidEkstra k

Dibasakan oleh amonia Ditambahkan kloroform Digerus kuat Cairan Dipipet melalui kapas kedalam tabung reaksi Ditambah HCl 1 NFase air

Filtrat I

Filtrat II

Filtrat III

Ditambah 1 tetes pereaksi ragendrofEndapan / keruhan berwarna coklat

ditambah 2 tetes pereaksi mayerEndapan putih Blanko/kontrol negatif

Alkaloid Alkaloid

2. FlavanoidEkstrak

Ditambah sedikit air Ditambah logam magnesium / seng Ditambah HCl 2 N Dipanaskan selama 5-10 menitFiltrat

Disaring ketika panas Didinginkan Ditambah amil alkohol dikocokWarna merah Flavonoid

3. Tanin dan PolifenolEkstrak

Filtrat

Digerus dengan air Dididihkan Disaring

Filtrat I

Filtrat II

Ditetesi pereaksi besi (III) kloridaWarna biru hingga hitam

Ditetesi gelatinGumpalan

Tanin / polifenol

Endapan gelatin

Disaring Ditetesi besi (III) kloridaTanin / polifenol Warna hitam

4. SaponinEkstrak

Dilarutkan dengan air Dipanaskan Didinginkan Dikocok kuat selama beberapa menitBusa setingg 1 cm

Persisten selama 5-10 menit

Tidak hilang pada penambahan satu tetes larutan HCl 0,1 N

Saponin

5. Triterpenoid dan steroid Ekstrak Digerus dengan eterFase air

Dipipet melaui penyaringan kapas Diuapkan hingga keringResidu

Ditetesi pereaksi Liebermann BurchadWarna ungu Terpenoid Warna hijau

Steroid

6. Monoterpenoid dan SesquiterpenoidEkstrak

dilarutkan dalam eterFiltrat

diuapkan hingga keringresidu

ditambah pereaksi anisaldehid-asam sulfat / vahilm-asam sulfatWarna-warna Monoterpen dan Sesquiterpenoid

7. QuinonEkstrak

Dilumatkan dengan air, disaringFiltrat

Ditetesi basa kuat (KOH)

Warna kuning Quinon

IV. Hasil Praktikum A. Analisis Kualitatis hasil isolasi piperin Sinar UV Harga Rf Sinar tampak (normal) 0.7125 Sinar UV 256 nm 0.725 Sinar UV 366 nm 0.775 B. Analisis Kualitatif hasil isolasi sari I dan sari II Bahan Harga Rf Sari I Sari II 0.89 C. Reaksi warna 1. Hasil isolasi piperin Reaksi warna Alkaloid Flavonoid Tanin dan polifenol Saponin Triterpenoid dan steroid Monoterpenoid dan sesquiterpenoid Quinon 2. Hasil isolasi daun sirsak (sari I) Raksi warna Flavonoid Saponon Tanin dan Polifenol Triterpenoid dan Steroid Monoterpen dan Sesquiterpenoid Quinon

Harga HRf 71.25% 72.5 % 77.5%

Harga Hrf 89%

Hasil Positif (+) coklat jingga Negatif (-) Negatif (-) warna kuning Negatif (-) warna kuning Negatif (-) tidak berbusa Negatif (-) tidak ada warna Negatif (-) tidak memberi warna Positif (+) warna kuning

Hasil Sari I : negatif (-) Sari II : negatif (-) Sari I : negatif (-) Sari I : negatif (-) Positif (+) warna kuning Positif (+) warna orange Positif (+) warna kuning

V. Pembahasan Analisi kualitatif merupakan analisis untuk melakukan identifikasi elemen, spesies, dan atau senyawa-senyawa yang ada di dalam sampel. Dengan kata lain analisis kualitatif berkaitan dengan cara untuk mengetahui ada ataunya suatu analit yang dituju dalam suatu sampel. (Gandjar,2005). Analisis kuantitatif adalah analisis untuk menentukan jumlah (kadar) absolut atau relatif dari suatu elemen atau spesie yang ada di dalam sampel. (Gandjar,2005)

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan membahasnya lebih lanjut. Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.(Clark, 2007) Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.(Clark, 2007) Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan zat secara cepat dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas karena itu pada lempeng yang sama disamping kromatogram dari zat yang diperiksa perlu dibuat kromatogram dari zat pembanding kimia lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2 bercak dengan harga Rf dan ukuran yang lebih kurang sama. Ukuran dan intensitas bercak dapat digunakan untuk memperkirakan kadar. Penetapan kadar yang lebih teliti dapat digunakan dengan cara densito metri atau dengan mengambil bercak dengan hati-hati dari lempeng, kemudian disari dengan pelarut yang cocok, dan ditetapkan dengan cara spektrofotometri. Pada percobaan yang pertama dilakukan uji kualitatif terhadap hasil isolasi piperin, perlakuan yang dilakukan pada percobaan tersebut dengan ditotolkan larutan kristal dalam etanol dan sari hasil penyaringan dengan soxhlet pada silika gel GF 254 yang berperan sebagai fase diam, kemudian di elusi dalam fase gerak (diklormetan ; etilasetat). Setelah selesai akaan timbul bercak pada silika gel GF 254 yang kemudian diamati di bawah sinar tampak dan sinar UV 254nm dan 366 nm. Kemudian semprot dengan pereaksi anisaldehid asam sulfat lalu dipanaskan

selama 10 menit pada suhu 110C. Hitung jarak bercak yang kemudian akan didapatkan harga Rf untuk hasil isolasi piperin. Harga Rf pada percobaan ini adalah 0.7125 pada sinar tampak, 0.725 pada sinar UV 256 dan 0.775 pada sinar UV 366 nm. Dan harga Hrfnya secara beruratan adalah 71.25%, 72.5% dan 77.5%. Pada percobaan yang kedua dilakukan uji kualitatif hasil isolasi daun sirsak. Sari I dan sari II ditotolkan pada selulosa sebagai fase diam. Bercak yang timbul pada selulosa diamati pada sinar U 256 nm, uap amoniak dibawah sinar tampak dan uap amoniak dibawah sinar UV 366 nm. Kemudian disemprot pereaksi sitroborat dan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 110C diamati dibawah UV 366 nm. Rf dan warna yang terbentuk dicatat dan dihitung. Pada sari I tidak tampak bercak warna hal ini mungkin disebabkan pereaksi yang dipakai tidak sesuai dengan kandungan senyawa aktif pada sari I, pada sari II mempunyai harga Rf sebesar 0.89 dan harga HRf 89%. Pada percobaan kedua dilakukan reaksi warna terhadap kedua hasil isolasi. A. Hasil isolasi piperis albi 1. Uji Alkaloid Ekstrak yang didapat ditambahkan dengan amonia yang berfungsi untuk membasakan ekstrak tersebut. Kemudian ditambahkan kloroform dan dikocok dengan kuat sampai larutannya terlihat secara jelas terpisah. Pisahkan Cairan terxebut kemudian ditambah dengan HCl untuk menetralkan. Ambil fase air yang kemudian dipisahakan menjadi dua bagian. Bagian pertama ditambah dengan satu tetes pereaksi dragendorf,hasil yang didapat tidak terbentuk endapan. Bagian kedua ditambahkan 2 tetes pereaksi mayer terbentuk endapan putih. Hasil isolasi piperis albi mengandung alkaloid dengan pereaksi mayer. 2. Uji Flavonoid Ekstrak ditambah dengan sedikit air kemudian ditambah logam magnesium atau seng, lalu ditambah dengan HCl 2 N yang kemudian dipanaskan selama 5-10 menit. Filtrat yang didapat setelah pemanasan disaring ketika panas kemudian didinginkan dan ditambah amil alkohol kemudian dikocok. Warna yang timbul adalah warna kuning hal ini membuktikan bahwa hasil isolasi piperis albi tidak mengandung flavonoid yang seharusnya berwana merah. 3. Uji Tanin dan Polifenol Ekstrak digerus dengan air kemudian dididihkan lalu disaring mendapatkan filtrat. Filtrat ditetesi pereaksi besi (III) klorida.warna teteap kuning tidak berubah menjadi warna biru hingga hitam hal ini menunjukkan hasil isolasi piperin tidak mengandung tanin dan polifenol. 4. Uji Saponin Percobaan yang dilakukan mula-mula ekstrak dilumatkan dengan air lalu dipanaskan. Setelah dingin tabung dikocok selama beberapa menit. Bila

terjadi busa setinggi minimal 1cm dan persisten selama 5-10 menit, serta tidak menghilang pada penambahan 1 tetes larutan HCl 0,1 N, menunjukan adanya senyawa saponin. Pada percobaan ini tidak menghasilkan busa hal ini menunjukkan bahwa hasil isolasi tidak mengandung saponin hal ini berbeda dengan literatur yang menyebutkan bahwa piperin mengandung saponin mungkin

dikarenakan ketika mengisolasi ekstrak dan ketidak telitian ketika menguji hasil isolasi. 5. Uji Terpenoid dan Steroid Percobaan yang dilakukan mula-mula ekstrak digerus dengan eter. Fase eter dipipet dengan penyaringan melalui kapas, lalu diuapkan hingga kering. Terhadap residu diteteskan reaksi Liebermann Burchad. Jika terbentuk warna ungu, menunjukan adanya senyawa golongan triterpenoid, sedangkan jika terbentuk warna hijau berarti ekstrak mengandung steroid. Pada praktikum ini menghasilkan tidak berwarna hal ini menunjukkan bahwa hasil isolasi piperis albi tidak mengandung triterpenoid dan dteroid. 6. Uji monoterpenoid dan sesquiterpenoid Percobaan yang dilakukan mula-mula ekstrak dilarutkan dalam eter, lalu filtrat diuapkan hingga kering. Residu ditambahkan pereaksi anisaldehid asam sulfat / vanilin-asam sulfat. Pembentukan warna-warna menunjukan adanya senyawa tersebut. Pada uji ini tidak menunjukkan perubahan warna hal ini berarti bahwa piperin tidak mngandung monoterpenoid dan sesquiterpenoid. 7. Uji Quinon Ekstrak dilumatkan dengan air. Saring melalui kapas, filtrat ditetesi larutan basa kuat (KOH). Warna kuning menunjukkan adanya senyawa golongan quinon, hal ini sama dengan uji yang menunjukkan warna kuning pada hasil uji.

VI. Kesimpulan - Hasil yang didapat praklikum ini adalah Reaksi warna Alkaloid Flavonoid Hasil Positif (+) coklat jingga Negatif (-) Negatif (-) warna kuning Hasil

Tanin dan polifenol Negatif (-) warna kuning ponin Negatif (-) tidak berbusa Triterpenoid dan Negatif (-) tidak ada steroid warna Monoterpenoid dan Negatif (-) tidak memberi Positif (+) warna orange sesquiterpenoid warna Quinon Positif (+) warna kuning Positif (+) warna kuning - Nilai Rf pada hasil isolasi piperin adalah 0.7125 pada cahaya tampak, 0.725 pada sinar UV 256nm, 0.775 pada sinar UV 366nm. Pada hasil isolasi daun sirsak sari I tidak menampilkan bercak dan sari II 0.89. Nilai HRf pada hasil isolasi piperin adalah 71.25 % pada cahaya tampak, 72.5% pada sinar UV 256nm, 77.5% pada sinar UV 366 dan 89% pada dari II.

Sari I : negatif (-) Sari II : negatif (-) Sari I : negatif (-) Sari I : negatif (-) Positif (+) warna kuning

DAFTAR PUSTAKA

Clark, Jim. 2007. Kromatografi Lapis Tipis. http://www.chem-is-try.org. Ganjar, I. G., Abdul Rohman, 2010. Kimia Farmasi Analisis.Pustaka Pelajar: Yogyakarat Setiono, Lilik. 2009. Kromatografi. http://liliksetiono.co.cc Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Penerbit ITB. Bandung.

Jawaban soal Pertanyaan. 1. Keuntungan kromatografi lapis tipis adalah : a. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. b. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. c. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. d. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugian kromatografi lapis tipis adalah : a. Waktu yang dibutuhkan cukup lama b.