pigmentos fotosinteticos

5/20/2018 Pigmentos fotosinteticos

1/23

5. EFECTOS DEL SO2 Y DEL O3 SOBRE LA CONCENTRACIN

FOLIAR DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS

5.1. INTRODUCCIN

La cuantificacin de los pigmentos fotosintticos es un mtodo que se ha

empleado tradicionalmente como complemento a las valoraciones de los daos

visibles en bosques afectados por contaminantes atmosfricos en interaccin con

otros tipos de estrs (Tausz et al., 1996). Comenz a emplearse a raz de los

fenmenos de declive registrados en los bosques de Europa y Norteamrica desde los

aos 1980 que incluan, como sntoma ms aparente, la decoloracin de las acculas

de las conferas, particularmente en las acculas ms viejas (Kstner et al., 1990;

Siefermann-Harms, 1992; Tausz et al., 1996). La alteracin en la composicin de

pigmentos se ha relacionado as clsicamente con los contaminantes atmosfricos

(Wolfenden et al., 1988) constituyendo una herramienta ampliamente extendida para

la cuantificacin de la decoloracin y la valoracin del dao producido por los

contaminantes (Darrall y Jgger, 1984;Pandey y Agrawal, 1994)

No obstante, las alteraciones en la composicin de los pigmentos del aparato

fotosinttico no son especficas del impacto de un determinado tipo de estrs por lo

que su valor de diagnstico es limitado si no se acompaa de otras determinaciones

fisiolgicas (Bermandinger et al., 1990; Tausz et al., 1996).

En los tejidos fotosintticamente activos de las plantas superiores se

encuentran, entre otros, los pigmentos clorofila a, clorofilab y carotenoides. Los

pigmentos estn asociados a protenas especficas formando sistemas ligados a las

estructuras de membrana de los cloroplastos. El pigmento mayoritario es la clorofilaa. La clorofilab y los carotenoides funcionan como pigmentos accesorios en la

captacin y la absorcin de luz, aunque parece que el papel fundamental de estos

ltimos sera actuar como pigmentos fotoprotectores. Molculas especializadas de

clorofilaa son el nico pigmento con capacidad de transduccin de la energa

luminosa en energa fotoqumica en los centros de reaccin del fotosistema II (el

P680) y el fotosistema I (el P700) en los organismos oxignicos. Adems de la clorofila

a/protena, en el centro de reaccin existe -caroteno, cuya misin parece ser la

proteccin de la clorofilaa de la fotooxidacin (Lichtenthaler, 1987) y feofitinas.Los centros de reaccin tienen estrechamente asociados a su vez complejos

pigmento-protena que contienen clorofila a, clorofila by xantofilas (light harvesting


2/23

complex, LHC) que funcionan como antenas recolectoras de la energa luminosa

procedente del sol. Los LHC contienen principalmente clorofila b, clorofilaa (en

menor proporcin que la b) y xantofilas. Las xantofilas son carotenoides cuya

funcin es triple: por una parte, atrapan la energa luminosa en bandas no accesibles

a la clorofila en el rango del visible (Sieferman-Harms, 1985, 1987). Por otra, poseenuna funcin de fotoproteccin de los sistemas pigmento-protena mediante la

extincin (quenching) del estado de triplete de las molculas de clorofila y la

eliminacin de especies de oxgeno txicas, radicales libres que se generan en los

cloroplastos como consecuencia de las reacciones primarias de la fotosntesis

(Cogdell, 1988; Koyama, 1991). Ms recientemente se ha propuesto un papel de las

xantofilas en la disipacin del exceso de energa que no se canaliza a travs de

procesos fotoqumicos u otros procesos. Esa capacidad fotoprotectora parece estar

relacionada con la interconversin cclica de las xantofilas violaxantina,

antheraxantina y zeaxantina en lo que se ha dado en denominar ciclo VAZ (Demmig-

Adams, 1990; Demmig-Adams y Adams, 1992b). En el ciclo VAZ o ciclo de la

xantofila la zeaxantina (forma libre de grupos epoxi) se forma en condiciones de

exceso de luz a travs de la des-epoxidacin de la violaxantina (con dos grupos

epoxi) va anteraxantina (con un grupo epoxi). El exceso de luz se alcanza no

solamente debido a un incremento de la irradiacin incidente, sino tambin cuando

ante una determinada irradiacin constante las plantas se exponen a otros factores de

estrs que reducen sus tasas fotosintticas y por tanto su capacidad de utilizar la luz

solar absorbida (Demmig-Adams, 1990).

Adems de los carotenoides, en el cloroplasto existen otros sistemas de

eliminacin de los radicales libres que se forman comnmente en las clulas. Los

radicales libres son molculas con electrones desapareados muy agresivas, que

reaccionan con los cidos grasos insaturados de membrana y con las protenas y

pueden conducir a la destruccin de sistemas de membrana celulares. As, pueden

causar dao a membranas y molculas asociadas, entre ellas los pigmentos

fotosintticos. Los radicales libres se forman comnmente en el metabolismo de lasclulas, por ejemplo en la cadena de transporte electrnico de los organismos que

poseen sistemas fotosintticos que utilizan el O2y el H2O como aceptor y donador de

electrones, respectivamente. En condiciones normales los radicales libres son

eliminados por el sistema antioxidante de la clula, formado por enzimas como la

superxido dismutasa, la peroxidasa, la catalasa y otras sustancias como el ascorbato,

el glutatin y los carotenoides.

Se ha demostrado que los contaminantes atmosfricos, entre ellos el SO2y elO3, estimulan la formacin de radicales libres en las clulas (Asada, 1980; Elstner,

1987). Ambos contaminantes tienen en comn un mismo mecanismo de accin: la


3/23

destoxificacion del SO2 en las clulas, con formacin de sulfatos, incluye su

oxidacin a travs de mecanismos enzimticos (a travs de la sulfito oxidasa) o bien

a travs de mecanismos que incluyen la formacin de radicales libres (Jger, 1982).

La molcula de O3es en s una molcula altamente reactiva que puede reaccionar

con cidos insaturados de las membranas y otras molculas, pero adems suhidratacin forma radicales libres (Tingey y Taylor, 1982; Elstner, 1987).

Numerosos autores han observado una alteracin de los sistemas

antioxidantes de las clulas en plantas por efecto de los contaminantes atmosfricos.

En conferas se han descrito cambios en esas sustancias por efecto del SO2y del O3

en concentraciones realistas (Bermandinger et al., 1990; De Kok, 1990; Smith et al.,

1990; Lucas et al., 1993; Winsgle y Hallgren, 1993; Pandey y Agrawal, 1994; Tausz

et al., 1996; Elvira et al., 1998). Ahora bien, cuando la acumulacin de radicales

libres excede la capacidad destoxificadora de la planta, puede existir un dao

fotooxidativo en los sistemas pigmento-protena y peroxidacin de lpidos de

membrana, entre otros tipos de dao (Asada y Takahashi, 1987; Beauregard, 1991;

Elstner y Owald, 1991). Sin embargo, en experimentos in vivoe in vitro, se ha

observado que son necesarias unas concentraciones de contaminante elevadas

(tpicamente del orden de 1000 ppb, que no ocurren en condiciones naturales en la

troposfera) para encontrar efectos directos de destruccin de pigmentos, tanto en el

caso del SO2(Grunwald, 1981; Sandman y Gonzales, 1989; Hegazy y El Hamid,

1998) como en el del O3(Senser et al., 1987).

Teniendo en cuenta esta premisa y la metodologa experimental utilizada en

nuestra experimentacin no son esperables efectos directos de dao fotooxidativo en

el caso del SO2ni del O3, debido a las bajas concentraciones empleadas. De hecho,

los efectos que una gran mayora de autores ha observado en el contenido de

pigmentos en conferas en experimentaciones controladas y en condiciones naturales

con concentraciones realistas de contaminantes, han sido interpretados generalmente

desde el punto de vista de efectos indirectos. Los efectos de los contaminantes sobrelos pigmentos pueden estar mediados por deficiencias nutricionales o por la

induccin de la senescencia acelerada, consecuencia de la inhibicin o disminucin

de actividades enzimticas.

As, se han encontrado efectos del SO2a travs de deficiencias nutricionales,

fundamentalmente en Mg (Lange et al., 1989; Oren y Schultze, 1989; Weikert et al.,

1989; Kstner et al., 1990) y en N (Wedler et al., 1995). El hecho de encontrar

efectos del SO2 y del O3 solamente en las hojas ms maduras, con ausencia deefectos e incluso estimulacin de los pigmentos en las hojas ms jvenes

(Bermandinger et al., 1990; Senser et al., 1990; Siefermann-Harms, 1990; Ballach et


4/23

al., 1992a; Wallin et al., 1992; Lucas et al., 1993; Elvira et al., 1998) se ha

interpretado por algunos autores como una manifestacin de la aceleracin de la

senescencia inducida por los contaminantes (Ballach et al., 1992a; Lucas et al.,

1993).

Otros autores no han observado en conferas efectos destacables del SO2

(Wolfenden et al., 1991; Pfanz y Beyschlag, 1993; Wingsle y Hllgren, 1993; Polle

et al., 1994; Tausz et al., 1996; Mller et al., 1997) ni del O3(Alscher et al., 1989;

Bermandinger et al., 1990; Bytnerowicz et al., 1990; Siefermann-Harms, 1990;

Thornton et al., 1990; Fincher y Alscher, 1992; Wedler et al., 1995; Mller et al.,

1997). En algunas ocasiones se ha sugerido que la ausencia de efectos puede deberse

a que los productos dainos no llegan al cloroplasto, o bien son destoxificados antes

de que se pongan en contacto con los pigmentos (Wolfenden et al., 1991).

No solamente el contenido de pigmentos en trminos absolutos puede verse

afectado por los contaminantes, sino tambin sus proporciones relativas. Por ejemplo,

una disminucin preferente de la clorofila a respecto a la clorofila b (con la

consiguiente disminucin de la relacina/b)puede ser indicativo de acculas daadas

por fotooxidacin, y se ha encontrado disminucin del cociente por efecto del SO2y del

O3 (Van Hove et al., 1992; Lucas et al., 1993; Takemoto et al., 1997). Otros autores, sin

embargo, no han encontrado efectos (Grunwald, 1981; Bermandinger et al., 1990;

Siefermann-Harms, 1990; Wallin et al., 1992). Por otra parte, dada la funcin

protectora del -caroteno sobre la clorofila, una destruccin preferente de ste (con

disminucin de la relacin -caroteno/clorofila) indicara una fotooxidacin directa de

los pigmentos (Senser et al., 1990). Se han propuesto tambin otros ndices de dao,

como el ndice de feofitinizacin (A435/415); cuando la relacin de absorbancias a esas

longitudes de onda disminuye, implica que ha habido un proceso de degradacin de

clorofila a feofitinas. El ndice de absorbanciasA430/665nm tiene un significado similar.

La clorofilaa absorbe la radiacin luminosa especialmente alrededor de dos mximos o

picos situados a 430 y 665 nm de longitud de onda. Los carotenoides y los productos dedegradacin de las clorofilas tienen una relacin de absorbancias aA430/665mayor que la

de la clorofila a. Por tanto, el ndice A430/665 estima la proporcin de los pigmentos

totales con respecto a la clorofila a. Por otra parte, a medida que distintos factores del

entorno limitan las posibilidades de crecimiento, la proporcin de pigmentos diferentes

a la clorofilaa aumenta relativamente (aumentando el ndice), por lo que dicho cociente

ha sido sugerido por Margalef (1986) como indicador de la productividad de los

ecosistemas.

Los factores que en el clima mediterrneo causan disminucin de la actividad

fotosinttica, como en verano el exceso de luz, las altas temperaturas y la sequa,


5/23

pueden estimular asimismo la produccin de especies reactivas de oxgeno (Faria et

al., 1996), incrementar por tanto el dao fotooxidativo potencial a los pigmentos e

interactuar con los contaminantes atmosfricos en la produccin de daos.

Los objetivos del captulo que se presenta a continuacin son: evaluar losefectos del SO2, del O3y de la mezcla de SO2+O3 en la concentracin de pigmentos

fotosintticos y sus proporciones relativas; sugerir los posibles mecanismos de accin

implicados en esos efectos; evaluar las variaciones estacionales de los pigmentos y las

posibles interacciones con los efectos de los contaminantes; establecer los efectos de la

cmara, que se producen por aclimatacin de las plantas a distintos regmenes de luz

entre otros factores.


6/23

5.2. MATERIAL Y MTODOS

La concentracin foliar de clorofila a, clorofila b y carotenoides totales se

midi en una muestra de dos acculas de cada clase de edad, plenamente

desarrolladas, extradas de 6 individuos tomados al azar en cada cmara y parcela

ambiente (un total de 18 individuos por tratamiento). Se realizaron 8 muestreos de la

concentracin foliar de pigmentos a lo largo de la experimentacin, coincidiendo con

cada estacin del ao. En el momento de la recoleccin de las acculas, se

desecharon en todos lo tratamientos aqullas con sntomas visibles de dao. Una vez

recolectadas, las acculas se conservaron inmediatamente en nieve carbnica y a

continuacin se almacenaron a -80 C hasta su procesamiento. La duracin del

perodo de almacenamiento fue inferior a 6 meses.

Se seccion la base y el pice de las acculas, emplendose solamente

fragmentos centrales para el anlisis. Una vez pesados en fresco, los pigmentos se

extrajeron mediante homogeneizacin con un equipo PotterS Braun utilizando una

solucin acuosa de acetona al 80 % (V/V) hasta obtener los fragmentos de acculas

de color blanco. Los extractos, de volumen conocido, se clarificaron mediante

centrifugacin, midindose su absorbancia a las longitudes de onda que se indican a

continuacin con un espectrofotmetro Shimadzu UV240. El proceso se realiz a

4C y en oscuridad. El clculo del contenido en clorofilas y los carotenoides se bas

en las ecuaciones de Lichtenthaler (1987):

Ca= 12.25 A663.2- 2.79 A646.8

Cb= 21.50 A646.8 - 5.10 A663.2

Cx+c= (1000 A470- 1.82 Ca-85.02 Cb) / 198

siendo:Ca= clorofila a(mg/l)

Cb= clorofila b(mg/l)

Cx+c= carotenoides (mg/l)

An= absorbancia a la longitud de onda n

Conocido el volumen del extracto acetnico y el peso fresco de la muestra

foliar de la que proceda, se obtuvo la cantidad de pigmento por unidad de masa

foliar en mgg-1

peso fresco. Se midi tambin la relacin entre el peso fresco y el pesoseco de las acculas y su rea especfica (ver captulo 8.2), calculndose la

concentracin foliar de pigmentos sobre la base del rea foliar (en mgm-2) y del peso


7/23

seco (en mgg-1peso seco). Se analizaron estadsticamente las concentraciones de

pigmentos expresadas en las tres unidades, peso fresco, rea foliar y peso seco,

obtenindose resultados similares. Los resultados que se presentan a continuacin

estn calculados sobre la base del rea foliar.

Para cada muestra se calcularon tambin las relaciones clorofila a/b,

clorofila/carotenoides y la relacin de absorbancias A430/665. Los resultados de los 6

individuos de cada cmara o parcela ambiente se promediaron con lo que al existir

tres cmaras por tratamiento, el tamao de muestra fue n=3. El tratamiento

estadstico consisti en un anlisis de la varianza de dos factores (SO 2 y O3) con

interaccin para determinar el efecto del SO2y del O3y su posible interaccin. En el

caso de observarse una interaccin significativa entre ambos factores, se procedi a

un anlisis de la mnima diferencia significativa (LSD) calculada para el nivel del 5

%, con objeto de determinar las diferencias significativas entre los tratamientos.

Cuando se compararon solamente dos muestras independientes (por ejemplo el SO2

con el AF, el AA con el ANF, o dos clases de edad diferentes), se emple el test de la

t-Student. En los casos en que se estudi el comportamiento de las mismas unidades

experimentales a lo largo del tiempo, se realiz un test ANOVA con medidas

repetidas, con la finalidad de valorar posibles tendencias de variacin. En los

resultados que se presentan a continuacin se sealan las diferencias significativas

para p


8/23

5.3. RESULTADOS

Variaciones estacionalesLa concentracin media de pigmentos en el tratamiento de control se presenta

en la tabla 5.1 expresada en diversas unidades. Las variaciones de la concentracin

de pigmentos en el mismo tratamiento a lo largo del experimento se muestran en la

figura 5.1. La concentracin de pigmentos mostr variaciones en funcin de la poca

de muestreo en todos los parmetros estudiados.

Tabla 5.1. Concentracin media de pigmentos a lo largo del experimento en el tratamiento de control(aire filtrado, AF). Cada parmetro medido se ha expresado en diversas unidades. En las grficas quesiguen se han expresado en mgm-2.

EdadPigmento Unidades

1995 1996 1997

mgm-2 704 409 218

mggps-1 2.68 1.98 1.15

Clorofilaa + b

mggpf-1

1.37 0.87 0.51

mgm-2 544 326 177

mggps-1 2.05 1.57 0.93lorof

ila amggpf

-1 1.06 0.69 0.42

mgm-2 159 83 40

mggps-1 0.62 0.41 0.22lorof

ila bmggpf

-1 0.31 0.18 0.01

Mgm-2 219 131 78

mggps-1 0.83 0.64 0.42

arote

noides mggpf

-1 0.43 0.28 0.19

En las acculas de 1996 se observaron mximas concentraciones de clorofilaa,b,clorofilaa+b y carotenoides totales en otoo-invierno y mnimas concentraciones enverano (figura 5.1). Las acculas de 1997 mostraron el mismo patrn de

comportamiento entre verano y otoo, con los mnimos valores registrados enverano. En las acculas ms maduras (de 1995) la concentracin de pigmentostambin mostr una disminucin en verano de 1996, pero a partir de ese muestreo los


9/23

valores no experimentaron aumento, como en las otras clases de edad, sino quesufrieron una disminucin durante el resto del experimento, probablemente comoconsecuencia de un proceso de senescencia.

Tambin se presenta la evolucin de las relaciones entre pigmentos (clorofila

a/b, clorofila/carotenoides), la relacin de absorbancias A430/665y la proporcin declorofila con respecto a la concentracin de nitrgeno foliar (figura 5.2). En esta

ltima relacin solamente se representan los promedios, debido a que la

concentracin de N y la de pigmentos se analizaron en muestras vegetales distintas

(ver en el captulo 5.2 una descripcin detallada del protocolo seguido). En las

acculas de 1995 la proporcin clorofila a/clorofilab fue mnima en verano, mientras

que en las acculas de 1996 permaneci aproximadamente constante a lo largo del

experimento con una disminucin en verano de 1997. En las acculas de 1997 la

relacin permaneci constante. La proporcin clorofila/carotenoides se mantuvoconstante en las acculas de 1996, reflejando que las variaciones en la clorofila

fueron similares a los cambios en los carotenoides. Sin embargo en las acculas de

1995 la relacin fue superior en verano que en el resto de los muestreos, indicando

una disminucin ms acentuada de los carotenoides que de la clorofila en esa poca.

La relacin de absorbancias A430/665, que expresa la cantidad de pigmentos totales

respecto a la clorofila a, se mantuvo constante en las acculas de 1995 a lo largo de

1996, aumentando en el ao siguiente. En las acculas de 1996, tras una disminucin

en otoo de 1996, la proporcin A430/665 aument durante el ao siguiente. En lasacculas de 1997 la relacin disminuy entre verano y otoo. La proporcin de

clorofila con respecto a la concentracin foliar de N mostr valores mnimos en

verano en las tres clases de edad.

La importancia de las variaciones en funcin de la fecha de muestreo est

reflejada en la elevada significacin estadstica del factor muestreo en los

resultados de los ANOVA (tabla 5.2 y siguientes).

La concentracin foliar de pigmentos fue significativamente superior en las

acculas ms maduras respecto a las ms jvenes (p


10/23

Tabla 5.2. Resultados del anlisis de la varianza con medidas repetidas a lo largo de los sucesivosmuestreos (ANOVA-RM) del efecto de la edad de las acculas sobre la concentracin foliar de

pigmentos para el tratamiento de control (aire filtrado). El anlisis se ha realizado sobre las acculas de1995 y 1996. Se indican las probabilidades p. Las probabilidades menores de 0.05 se han sealado con

negrita, las p


11/23

1995SO2MuestreoSO2 x muestreo

0.6760.0000.927

0.6830.0000.916

0.6580.0000.954

0.2990.0000.976

0.4920.0020.850

(0.083)0.0000.023

0.2620.0000.851

1996SO2Muestreo

SO2 x muestreo

0.2030.000

0.490

0.1820.000

0.483

0.2800.001

0.508

0.1830.000

0.692

0.2580.000

0.459

0.9790.000

0.012

0.5900.000

0.275

1997SO2MuestreoSO2 x muestreo

0.7430.0340.965

0.6290.0300.851

0.833(0.093)0.559

0.531(0.084)0.773

0.6250.2390.302

0.7580.0280.324

0.7000.0160.784

En las acculas ms jvenes (de 1997) la tendencia fue similar a la observada

en las acculas de 1996, con un aumento en julio de 1997 del 23 % de la

concentracin de clorofilab en el tratamiento de SO2respecto al AF (p


12/23

acculas. Los resultados del ANOVA con medidas repetidas (RM) a lo largo de los

muestreos se presentan en la tabla 5.4.

El efecto del O3fue, como en el caso del SO2, de distinta ndole en funcin de

la edad de las acculas. En las acculas de 1995 se registr un aumento de laconcentracin de clorofilaa, b y a+b debido al O3 en un 18, 23 19 %

respectivamente en mayo de 1997 (p


13/23

1996

SO2O3SO2 x O3MuestreoSO2 x muestreoO3x muestreo

SO2 x O3x muestreo

0.5510.1590.8440.0000.7100.443

0.760

0.5760.1440.8310.0000.6770.469

0.774

0.4870.2270.8870.0000.7820.365

0.727

0.4420.1540.7640.0000.7400.547

0.889

0.4360.7610.9980.0000.4470.152

0.918

0.7610.3240.5480.0000.7250.138

0.007

0.8130.3480.3880.0000.6580.596

(0.066)

1997

SO2O3SO2 x O3MuestreoSO2 x muestreoO3x muestreoSO2 x O3x muestreo

--

0.0280.0010.9220.7220.983

--

(0.050)0.0010.8960.7310.838

--

0.0130.0060.9640.7170.366

--

(0.058)0.0040.9930.8040.612

0.5490.1630.2410.0420.7380.7770.063

0.4730.8690.3230.0310.5590.6600.141

0.1880.6630.2970.0120.6470.9850.497

La relacin clorofilaa/b no indic un efecto preferente del O3 sobre uno u

otro tipo de clorofila, excepto en las acculas de 1997 en octubre del mismo ao

(figura 5.4a), sealando en consonancia con lo que se ha descrito anteriormente una

disminucin ms acusada de la clorofilab que de la clorofilaapor efecto del O3. Por

otra parte, las diferencias significativas encontradas en el ndice

clorofila/carotenoides sealan que las alteraciones producidas por el O3 en la

clorofila fueron ms importantes que las generadas en los carotenoides (figura 5.4b).

El O3solamente afect a la relacin de absorbanciasA430/665en las acculas de 1995

en mayo de 1997, en que produjo una disminucin de esa relacin. En el resto de los

muestreos y clases de edad no se observaron diferencias significativas debidas al

contaminante (figura 5.4c).

Los efectos de la mezcla de SO2+O3no reflejaron interacciones entre los

contaminantes en las acculas de 1995 y 1996: en marzo de 1997 los efectos de la

mezcla fueron similares a los del SO2, con una disminucin de la concentracin de

pigmentos respecto al control. En las acculas de 1996 los efectos del SO2+O3fueron

semejantes a los del O3con una tendencia, como se ha comentado, al aumento de la

concentracin de pigmentos respecto al control.

Sin embargo, en las acculas de 1997 se observaron interacciones

significativas de los contaminantes: mientras que los pigmentos, principalmente la

concentracin de clorofila b, reaccionaron al SO2con una tendencia a aumentar y al

O3con una tendencia a disminuir, la coexistencia de los dos contaminantes aument

proporcionalmente ms la concentracin que con slo SO2. Aunque la existencia de

interaccin fue generalizada (tabla 5.4), el anlisis LSD no seal diferenciassignificativas entre el SO2+O3y el AF en cada muestreo (figura 5.3). Las mximas

diferencias entre esos tratamientos fueron del 16 % en el caso de la clorofila a en


14/23

octubre de 1997. En las acculas de 1995 la presencia del SO2 increment las

diferencias debidas al O3, aunque la interaccin no fue estadsticamente significativa.

Efecto de cmaraLa comparacin entre la concentracin de pigmentos en las cmaras con aire

no filtrado (ANF) respecto a las parcelas ambiente (AA) se presenta en las figuras

5.5 y 5.6. Los resultados del ANOVA-RM para el efecto de cmara se muestran en la

tabla 5.5.

La cmara increment la concentracin foliar de clorofilaa, b ya+b en las

dos clases de edad, 1995 y 1996, de manera significativa (p


15/23

respectivamente, tabla 5.5 y figura 5.6c) en el tratamiento de ANF respecto al AA.

La proporcin de la concentracin de clorofila con respecto a la concentracin de N

tuvo tendencia a ser superior en el tratamiento de ANF que en el de AA (figura 5.6d).

La cmara tambin influy en las variaciones estacionales de la concentracinde clorofila, puesto que mientras en otoo de 1996 su concentracin se mantuvo

constante (acculas de 1995) o aument en un 46 % (acculas de 1996) en el interior

de las cmaras, en el aire ambiente dicha concentracin disminuy en un 15 %

(acculas de 1995) o aument slo en un 11 % (acculas de 1996) (figura 5.5 a). En el

caso de los carotenoides el efecto de la cmara en la evolucin temporal fue menos

marcado (figura 5.5d).


16/23

5.4. DISCUSIN

Variaciones estacionales

Se observ una marcada estacionalidad en la concentracin foliar de

pigmentos, con una disminucin en verano y una recuperacin de valores en otoo-

invierno, salvo en las acculas ms maduras, en las que no se registr la recuperacin

otoal debido posiblemente a su senescencia. Se han descrito cambios estacionales

en la concentracin de pigmentos en una amplio rango de especies arbreas (Martin

y quist, 1979; quist, 1983; Weikert et al., 1989; Kstner et al., 1990; Garca-

Plazaola et al., 1997; Elvira et al., 1998). En la mayora de esos estudios se han

encontrado, no obstante, aumentos de la concentracin de pigmentos en verano y

disminuciones en invierno. Sin embargo, en consonancia con los resultados de

nuestra experimentacin, enPinus halepensisse han registrado disminuciones de la

concentracin de pigmentos en verano en condiciones naturales (Velissariou et al.,

1992), en nuestros experimentos previos en invernadero (Barrantes et al., 1993,

1994) y en experimentacin de OTCs (Elvira et al., 1995, 1998; Elvira, 1996). La

reduccin de la concentracin de pigmentos en determinadas pocas del ao se ha

interpretado como una posible fotooxidacin de las clorofilas mediada por altas

temperaturas y sequa estivales en el caso dePinus halepensisen Grecia (Velissariou

et al., 1992), altas temperaturas asociadas a elevados niveles de radiacin luminosa

en verano en esa misma especie en el NE espaol (Elvira et al., 1998) o por bajas

temperaturas invernales en el caso dePinussylvestrisyPicea abies(quist, 1983;

Kstner et al., 1990). Otros autores han sealado tambin a los cambios

ultraestructurales en la organizacin de los cloroplastos como responsables de la

prdida de clorofila durante la estacin de reposo del perodo vegetativo (Martin y

quist, 1979). En condiciones mediterrneas, se ha sugerido que la disminucin de la

concentracin de clorofila en verano puede formar parte de una estrategia adaptativade proteccin del dao fotoinhibitorio (Kyparissis et al., 1995; Elvira et al., 1998)

mediante la disminucin de la captacin de luz y por tanto disminucin de la

sobreexcitacin de los fotosistemas.

La disminucin de la clorofila en verano estuvo asociada en las acculas de un

ao de edad a una disminucin de la proporcin clorofila a/b, mientras que en las del

ao en curso la proporcin clorofila a/b permaneci aproximadamente constante.

Tales resultados indican una disminucin preferente de los complejos core (corecomplex, CC) respecto a los pigmentos captadores de luz (light harvesting complex,

LHC) en acculas de un ao (Lichtenthaler, 1987). Elvira et al. (1998) obtuvieron


17/23

similares resultados, aunque no existieron diferencias en funcin de la edad de las

acculas.

La concentracin de pigmentos, tanto en lo que se refiere a la clorofila como

a los carotenoides, fue superior en las acculas ms maduras que en las ms jvenes,coincidiendo con los resultados obtenidos por diversos autores para otras especies en

condiciones naturales (Kstner et al., 1990; Pfanz y Beyschlag, 1993; Wedler et al.,

1995) y en cmaras de cultivo (Siefermann-Harms, 1990; Tausz et al., 1996) y otras

condiciones de experimentacin (Ballach et al., 1992a; Wulff et al., 1996). Los

valores medios de la concentracin foliar de pigmentos registrados en nuestra

experimentacin son similares a los de experimentos anteriores realizados en

invernadero (Barrantes et al., 1993, 1994) y a los descritos por otros autores para

Pinus halepensis(Barnes et al., 1991; Elvira et al., 1995; Elvira, 1996).

Efectos del SO2Los efectos del SO2sobre el contenido de pigmentos fotosintticos fueron

mnimos en 1996, no observndose una influencia generalizada de ese tratamiento a

lo largo de la experimentacin durante dicho ao. Sin embargo, en 1997, aunque

cuantitativamente el efecto del SO2no fue muy importante, se observaron ciertas

tendencias: las acculas de dos aos (originadas en 1995) mostraron una disminucin

de la concentracin de clorofila de hasta un 11 % en marzo de 1997. En las acculasde un ao (de 1996) no se observaron diferencias significativas, mientras que en las

acculas ms jvenes (de 1997) se registr un aumento significativo (p


18/23

Se han descrito efectos directos del SO2 sobre la disminucin de la

concentracin de pigmentos en algunos estudios con concentraciones de SO2

elevadas, del orden de 800 a 1000 ppb (Shimazaki et al., 1980; Grunwald, 1981;

Sandman y Gonzales, 1989). Sin embargo, la concentracin empleada en nuestro

estudio est considerada por diversos autores como demasiado baja para producirefectos directos importantes (Wedler et al., 1995; Tausz et al., 1996). Dichos autores,

as como Cornic (1987), Wolfenden et al. (1991), Pfanz y Beyschlag (1993),

Wingsle y Hallgreen (1993) y Polle et al. (1994) no obtuvieron efectos en una amplia

variedad de conferas con tratamientos de SO2de entre 10 y 80 ppb. Contrastan no

obstante con los resultados anteriores los efectos de disminucin de la concentracin

de pigmentos en experimentos con 36 ppb de SO2durante 8 meses enPseudotsuga

menziesii (Van Hove et al., 1992) y con 28 ppb de SO2 en tan slo 3 meses de

tratamiento conPinus sylvestris(Prez-Soba, 1995).

Los efectos directos del SO2 sobre los pigmentos fotosintticos se han

relacionado con la formacin de sulfatos a partir de sulfitos, proceso en el que se

desencadena una serie de reacciones que involucran la formacin de radicales libres

(Asada y Takahashi, 1987; Weigel et al., 1989a). Los radicales libres son molculas

muy reactivas que atacan a los sistemas de membranas fotosintticas, los sistemas

pigmento-protena y las biomembranas en general (Shimazaki et al., 1980;

Beauregard, 1991; Elstner y Osswald, 1991). Las clulas tienen mecanismos de

proteccin frente a los radicales libres, como son los carotenoides (carotenos y

carotenoides del ciclo de la xantofila), ascorbato, glutatin, superxido dismutasa,

conocidos genricamente con el trmino de antioxidantes. Numerosos estudios han

demostrado la existencia de tales mecanismos de proteccin de los sistemas

pigmentarios por los radicales libres y la alteracin de las sustancias o enzimas del

sistema antioxidante de las clulas por efecto de contaminantes atmosfricos como el

SO2 (Wellburn, 1982; Peiser y Yang, 1985; Sandman y Gonzales, 1989;

Bermandinger et al., 1990; Tausz et al., 1996). Sin embargo, cuando la acumulacin

de radicales libres excede a la capacidad destoxificadora de la planta, se puedeproducir un dao fotooxidativo con prdida de pigmentos.

En nuestra experimentacin, se observaron en agosto de 1996 disminuciones

de -caroteno y alteraciones en las relaciones de los componentes del ciclo de las

xantofilas por efecto del SO2, as como alteraciones en la concentracin de ascorbato

a lo largo de toda la experimentacin (Moliner et al., datos no publicados); adems,

se registraron debido al contaminante una disminucin de los carotenoides totales y

una tendencia a la disminucin de la relacin clorofila a/b en las acculas msmaduras en marzo de 1997, as como una tendencia al aumento de la relacin

clorofila/carotenoides generalizada a lo largo del experimento en las acculas de


19/23

1995. Segn Senser et al., (1987), el pigmento ms sensible a la fotooxidacin es el

-caroteno, por lo que una degradacin preferente de ste podra indicar una accin

fotooxidativa. Ello se puede relacionar con el papel del -caroteno como protector de

la clorofila a cerca o en el centro de reaccin (Lichtenthaler, 1987). La funcin de

proteccin del complejo protena-pigmento y de los cloroplastos frente a la oxidacines desempeada por los carotenoides en general (Siefermann-Harms, 1990), pero es

el -caroteno, junto con la lutena, el ms activo (Young y Britton, 1990). En otros

trabajos se ha encontrado tambin una disminucin de la concentracin foliar de

carotenoides por efecto del SO2 (Sandmann y Gonzales 1989; Bermadinger et al.,

1990; Prez-Soba, 1995; Tausz et al., 1996), en algunos casos junto con otras

alteraciones en el sistema de antioxidantes. Algunos autores (Lichtenthaler y

Buschann, 1984) han observado una proporcin de clorofilaa/breducida en acculas

daadas por fotooxidacin, aunque en otros estudios no se han observado variaciones

(Siefermann-Harms, 1990).

Los resultados obtenidos en nuestra experimentacin en cuanto a las

alteraciones en el sistema de extincin de radicales libres (Moliner et al., datos no

publicados) apuntan a un incremento del estrs oxidativo en las acculas por efecto

del SO2. Sin embargo, debido al empleo de una concentracin relativamente baja del

contaminante, la capacidad destoxificadora en las plantas sera suficiente para evitar

el dao fotooxidativo de los sistemas pigmento-protena, no detectndose en general

disminucin de las concentraciones de clorofila. Solamente la coexistencia de varios

factores disminuy la concentracin de pigmentos. Tales factores fueron: el tiempo

de fumigacin con SO2superior a 1 ao; la edad de las acculas (de 2 aos de edad),

puesto que las acculas ms maduras posiblemente tienen una menor capacidad

destoxificadora que las acculas ms jvenes (Grunwald, 1981). El efecto observado

pudo adems estar coadyuvado por fenmenos de retranslocacin de N desde las

acculas ms viejas a las de menor edad. Finalmente, esos efectos se produjeron

precisamente en el momento de la produccin de nuevos brotes de acculas, lo que

apoya la hiptesis de mecanismos compensatorios de estimulacin de la actividad delas hojas ms jvenes frente a las de menor actividad.

Efectos del O3Los efectos del O3sobre la concentracin de pigmentos variaron como en el

caso del SO2en funcin de la edad de las acculas. No obstante, fueron opuestos a los

observados para el SO2en 1997, en el sentido de que mientras la concentracin de

clorofila tendi a aumentar en las acculas ms jvenes y a disminuir en las msmaduras por efecto del SO2, el O3produjo una disminucin de la concentracin de

clorofila (sobretodo de la clorofila b) en las acculas ms jvenes y una tendencia al


20/23

aumento de la concentracin de clorofila en las ms maduras. En las acculas de un

ao de edad, de 1996, no se produjeron efectos importantes, aunque la tendencia fue

similar a la observada en las acculas ms maduras. La disminucin de la clorofila b

por efecto del O3en las hojas ms jvenes fue de hasta un 29 %, el aumento en las

ms maduras fue de hasta un 19 %.

En estudios realizados por diversos autores en conferas se ha observado

tambin un efecto distinto del O3dependiendo de la edad de las acculas, pero la

tendencia fue diferente a la observada en nuestra experimentacin: en Picea abiesse

observ una disminucin de la concentracin de clorofila en las acculas ms

maduras y una disminucin no significativa en las ms jvenes (Wallin et al., 1992)

o bien aumento de la concentracin de clorofila en las acculas del ao en curso

(Senser et al., 1990); el aumento de la concentracin de clorofila en las hojas ms

jvenes y su disminucin en las ms viejas ha sido tambin observado enPopulus

nigra(Ballach et al., 1992a). EnPinus halepensisse observ una disminucin de la

concentracin de clorofila en las acculas de un ao y no se observaron efectos en las

acculas del ao en curso (Elvira, 1995; Elvira et al., 1998). Sin embargo, en general

en esos trabajos las acculas de ms edad estuvieron expuestas a una mayor

dosificacin acumulada de O3, mientras que en nuestro caso las tres clases de edad

recibieron la misma dosificacin acumulada del contaminante. Se ha descrito una

disminucin de la conductancia estomtica con la edad de las acculas (p.e.,

Zimmermann et al., 1988; Wedler et al., 1995) lo que podra explicar una mayor

captacin y efecto del contaminante en las acculas ms jvenes respecto a las ms

maduras. Otra posibilidad sera una interferencia del O3 con el patrn normal de

movilizacin y retranslocacin de nutrientes desde las acculas de ms edad a las de

menor edad, tal y como ha sido sugerido por algunos autores (Lucas et al., 1993). Sin

embargo, esta hiptesis no parece plausible, ya que no se registraron cambios, como

en el caso del SO2, en la concentracin de nutrientes debidos al efecto del O3.

La concentracin foliar de glutatin disminuy por efecto del O3en octubrede 1997 en acculas del ao en curso y del ao anterior (Moliner et al., datos no

publicados), lo que indica la existencia de mecanismos de destoxificacin de

radicales libres generados por el contaminante. Otros autores han observado tambin

alteraciones en el sistema de extincin de radicales libres de las clulas por efecto del

O3 (Weigel et al., 1989a; Bermandinguer et al., 1990; Elstner y Osswald, 1991;

Lucas et al., 1993; Elvira et al, 1998). Sin embargo, aparentemente esos mecanismos

no fueron suficientes para evitar el dao en la clorofila ben las acculas de 1997. La

degradacin preferente de la clorofila bobservada por efecto del O3por algunosautores (Khl y Wagner, 1970; Nobel, 1974) y el aumento consistente de la relacin

clorofilaa/bimplica un mayor ataque del O3a los sistemas de captacin de luz, ya


21/23

que la clorofila b se localiza fundamentalmente en los pigmentos antena del LHC

(ligth-harvesting complex, complejo captador de luz) perifricos asociados al PSII.

En ese sentido, algunos autores han relacionado el efecto del O3con una degradacin

del PSII, como en el caso de exceso de luz (Godde y Buchhold, 1992).

No obstante, es difcil establecer si el O3 produjo un dao fotooxidativo

directo sobre la clorofila en las acculas de 1997. En nuestro trabajo no se observ un

efecto del O3sobre la concentracin de carotenoides y de hecho hubo una tendencia

al aumento de la relacin clorofila/carotenoides en esa clase de edad. Segn Senser et

al. (1987) los carotenoides (y fundamentalmente el -caroteno) son los pigmentos

ms susceptibles al dao fotooxidativo, por lo que habra cabido esperar un aumento

de la relacin clorofila/carotenoides. Sin embargo, esos resultados se obtuvieron

solamente a altas intensidades de luz y exposicin a altos niveles de O3(del orden de

1000 ppb) y otros autores no han observado tampoco tal aumento con niveles de O3

ms realistas (Bermandinger et al., 1990; Senser et al., 1990; Lucas et al., 1993;

Elvira, 1995; Takemoto et al., 1997)


22/23

Efectos del SO2+O3Se observ un efecto de interaccin entre el SO2y el O3en las acculas ms

jvenes, de 1997, con un aumento proporcionalmente mayor en la concentracin de

pigmentos en el tratamiento con SO2+O3que con el SO2slo; adems, el tratamiento

con slo O3, como se ha mencionado, produjo el efecto opuesto al del SO2con unadisminucin de la concentracin de pigmentos. En cualquier caso, las diferencias

entre el control y el tratamiento con SO2+O3 no fueron cuantitativamente

importantes, observndose como mximo un 16 % de aumento en la concentracin

de clorofilaa .

Son relativamente escasas las referencias a trabajos acerca de la interaccin

del SO2y del O3sobre los pigmentos fotosintticos. A pesar de que hipotticamente

la coexistencia de los dos contaminantes disminuye el umbral de dao para los

contaminantes por separado, en estudios realizados con concentraciones bajas y

realistas no se ha encontrado dicho efecto. As, Siefermann-Harms (1990) no

encontr efectos interactivos sobre la concentracin de pigmentos, observando

efectos similares en Picea abies fumigados con SO2 y con SO2+O3. En el mismo

experimento, Bermandinger et al. (1990) hallaron un efecto ms bien antagnico de

ambos contaminantes, donde el efecto de disminucin de la concentracin de

clorofila por efecto del SO2fue menos pronunciado en presencia de SO2+O3. Ballach

et al.(1992a) sealaron mayor reactividad del tratamiento de SO2+O3+NOxque de

los tratamientos por separado en la disminucin de la concentracin de pigmentos en

las hojas ms maduras y aumento en las ms jvenes.

Las interacciones observadas en nuestro estudio son difciles de interpretar.

Se descartan efectos mediados por una acumulacin diferencial de nutrientes en la

mezcla, ya que apenas se observaron efectos interactivos en ese aspecto (ver captulo

4). Los resultados apuntan a una estimulacin de la sntesis o disminucin de la

degradacin de los pigmentos en las acculas ms nuevas, al menos en los primeros

meses de experimentacin. Nuestros resultados coinciden con el aumento de laconcentracin de pigmentos registrado por (Wedler et al., 1995) en el tratamiento de

SO2+O3respecto al control enPicea abiesdurante el primer ao de experimentacin.

Efecto de cmara

El efecto de la cmara sobre la concentracin y composicin de los pigmentos

fotosintticos se explica satisfactoriamente desde el punto de vista de la aclimatacin

de las plantas a mayores o menores intensidades de luz durante un perodo de tiempo

suficientemente extenso (tratamiento fuera de las cmaras, AA, respecto al interiorde stas, ANF).


23/23

La concentracin de clorofila a , b , a+b, carotenoides y la proporcin

clorofila/carotenoides fueron menores en el exterior de las cmaras respecto a su

interior, mientras que la proporcin clorofila a/by la relacin de absorbanciasA430/665

aumentaron fuera de las cmaras. Otros autores han encontrado resultados similares

en experimentaciones con plantas de Pinus halepensisexpuestas a niveles de PARcrecientes (Espelta, 1996) y debidos al efecto de las cmaras OTC (Peuelas et al,

1995), que los autores atribuyen a la atenuacin de la radiacin solar y de la

velocidad del viento que se produce en el interior de las cmaras.

La disminucin de la proporcin clorofila a/b en hojas adaptadas a la sombra

se ha interpretado como una respuesta adaptativa de las hojas encaminada a

maximizar la capacidad de captacin de luz de los cloroplastos (Alberte et al., 1976;

Chow et al., 1991; Dale y Causton, 1992). Al parecer el PSII, con su LHC asociado

compuesto mayoritariamente por clorofila b, carotenoides, clorofila ay protenas

asociadas, es el fotosistema que ms importancia tiene en la aclimatacin de las hojas

a diferentes regmenes de luz (Chow et al., 1991). Como la clorofila ase encuentra

en todos los complejos pigmento-protena del cloroplasto pero la clorofila bse sita

fundamentalmente en el LHC asociado al PSII, el mayor desarrollo que experimenta

el LHCII en condiciones de sombra explica la menor relacin clorofila a/b y el

aumento de la relacin clorofila/carotenoides en esas condiciones (Lichtenthaler,

1987).

Adems, es interesante sealar una tendencia a la mayor proporcin

clorofila/N en las plantas del interior de las cmaras respecto al AA, lo que coincide

con los resultados obtenidos por Espelta (1996) en Pinus halepensisaclimatados a

condiciones de menor PAR. La mayor proporcin clorofila/N se ha interpretado

como una distribucin preferente de este nutriente a la formacin de pigmentos que a

enzimas fotosintticos, maximizando por tanto la captacin y absorcin de luz frente

a la fijacin de CO2. En condiciones de mayor iluminacin la distribucin de N se

dedicara preferentemente a los enzimas implicados en la carboxilacin,disminuyendo la proporcin Clorofila/N (Seeman et al., 1987; Evans, 1989;

Ellsworth y Reich, 1992).

pigmentos fotosinteticos

Documents