11.2.3 vektor kloning plasmid

Dalam rangka untuk mengkloning fragmen DNA tidak cukup untuk mentransfer ke dalam sel bakteri, dengan harapan bahwa hal itu akan direplikasi bersama dengan DNA sel sendiri. Kecuali DNA asing mengandung urutan nukleotida yang diterima oleh bakteri itu sebagai 'asal mula replikasi' tidak akan direplikasi. Jadi biasanya perlu untuk melampirkan DNA fragmen lain yang mengandung asal replikasi. Asal seperti replikasi terjadi secara alami di plasmid, yang kecil, molekul melingkar DNA, ditemukan di banyak bakteri. Mereka terpisah dari DNA kromosom utama, namun direplikasi dan biasanya diteruskan ke sel anak selama pembelahan sel. Beberapa gen yang sangat penting dapat dibawa oleh plasmid tersebut, termasuk untuk resistensi terhadap antibiotik, toksin atau produksi antibiotik, untuk fiksasi nitrogen, dan enzim yang diperlukan untuk degradasi sejumlah besar 'tidak biasa' substrat seperti herbisida atau limbah industri . Hanya beberapa gen ini hadir dalam satu plasmid tetapi, karena pertukaran sering materi genetik antara plasmid dan DNA kromosom, koleksi baru dari gen yang terus berkembang, sehingga membantu populasi bakteri untuk merespon dengan cepat terhadap kondisi lingkungan yang baru. Ini bisa menjadi masalah serius di rumah sakit jika berbagai antibiotik digunakan, karena transfer gen melalui plasmid dapat segera menghasilkan penampilan bakteri dengan resistensi terhadap beberapa antibiotik perbedaan sekaligus.

Untuk kloning gen, plasmid menawarkan sumber yang nyaman asal replikasi, tetapi sebagian besar gen mereka berlebihan, dan akan membuat molekul sulit untuk memanipulasi. Plasmid Therefour telah dibangun dari bentuk alami, melestarikan hanya fitur-fitur yang akan membantu kloning. Salah satu yang paling banyak digunakan plasmid, pBR322, dibangun oleh ada bagian bagian alami plasmid, menggunakan pembatasan enzim, dan bergabung kembali mereka dalam orientasi yang benar, dalam serangkaian manipulasi yang membuat pemecahan kubus Rubik terlihat sederhana. Plasmid yang dihasilkan menunjukkan banyak fitur yang diinginkan dalam vektor plasmid kloning (Gambar. 11.4). Molekul berisi asal replikasi, yang berasal dari plasmid terkait dengan plasmid alami Col El. Asal ini sangat berguna karena 'santai', yaitu, replikasi tidak terkait dengan DNA kromosom, dan karenanya inisiasi replikasi plasmid bisa lebih sering daripada DNA bakteri utama. Consequntly beberapa salinan plasmid menumpuk di setiap sel. Procces ini dapat diambil lebih jauh jika kloramfenikol (penghambat sintesis protein) ditambahkan ke kultur sel, karena sintesis protein yang dibutuhkan untuk kromosom, tetapi tidak plasmid, replikasi. Dengan cara ini kloramfenikol dapat digunakan untuk 'memperkuat' plasmid, sehingga sampai dengan 3000 eksemplar per sel.

Plasmid juga telah hati-hati dibangun sehingga berisi situs pengakuan unik untuk 20 endonuklease restriksi yang berbeda. Ini berarti bahwa salah satu dari enzim akan membuat potongan tunggal dalam plasmid melingkar, menghasilkan satu molekul linier yang dapat dilampirkan fragmen untuk kloning, maka molekul dapat reclosed untuk menumbuhkan sedikit membesar, melingkar plasmid. Ini akan terlihat dari contoh di gambar. 11.4 bahwa situs pembatasan didistribusikan di sekitar plasmid, dan ini memungkinkan fleksibilitas yang besar dalam pendekatan untuk memilih untuk molekul rekombinan, seperti yang dijelaskan di bawah ini.

Ini memberikan dasar bagi metode membedakan antara sel-sel yang hanya mengandung plasmid, dan orang-orang yang mengandung plasmid dengan sisipan DNA (lihat Gambar. 11.1). Lempeng kedua adalah diinokulasi ditekan terhadap pad beludru. Setelah inkubasi, koloni belum tumbuh pada tetrasiklin, dan ini dapat pulih dari piring pertama dan tumbuh untuk karakterisasi lebih lanjut dari sisipan yang terkandung dalam plasmid mereka.

Plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning telah dipangkas dengan ukuran sekecil mungkin. Hal ini telah dilakukan karena dua alasan: pertama, molekul kecil DNA jauh lebih mudah demaged oleh geser selama isolasi daripada molekul besar. Stabilitas meningkat ini memungkinkan metode yang relatif kekerasan yang akan digunakan untuk proses seperti deproteinisasi persiapan plasmid, dan membuatnya lebih mudah untuk mendapatkan hasil yang baik dari DNA murni. Kedua, molekul kecil yang lebih efisien diambil oleh bakteri selama proses 'transformasi', suatu pertimbangan penting ketika berhadapan dengan jumlah yang sangat kecil dari DNA yang berharga. Ukuran plasmid karena itu harus disimpan ke minimum, sehingga jelas bahwa inseration fragmen besar DNA dalam plasmid akan menghasilkan molekul yang secara fisik tidak stabil, dan yang mungkin memiliki efisiensi rendah praktis transformasi.

11.2.4 DNA Bergabung

Proses kloning DNA tidak hanya tergantung pada ketersediaan pembatasan enzim dan vektor, tetapi juga pada kemampuan kita untuk bergabung panjang DNA bersama-sama kovalen. Jika fragmen DNA yang akan bergabung telah dipotong menggunakan enzim pembatasan yang sama, untuk memberikan ujung kohesif identik, mereka akan cenderung untuk tetap bersatu jika mereka bertabrakan, yang diselenggarakan oleh ikatan hidrogen antara pasangan basa complmentary. Namun, asosiasi ini hanya sementara, karena kelemahan obligasi dan sejumlah kecil basa yang terlibat. Linkage dapat dibuat permanen dengan menggunakan enzim ligase ', yang akan membentuk hubungan fosfodiester antara gratis 5'-fosforil dan kelompok 3-hidroksil, sehingga menggabungkan dua molekul DNA bersama-sama, atau circularizing sebuah molekul linear tunggal. Sumber utama ligase T4 adalah fag, dan ini memerlukan enzim ATP untuk mendorong ligasi tersebut. Dalam rangka untuk menstabilkan pasangan dasar kali inkubasi kohesif untuk memungkinkan untuk tingkat rendah aktivitas enzim pada suhu tersebut. Sebuah disediakan konsentrasi enzim dan DNA yang cukup tinggi.

Untuk beberapa tujuan jenis ligations memadai, terutama ketika langkah-langkah berikutnya akan memilih untuk produk 'rekombinan'. Namun, ada cara untuk mengerahkan lebih banyak kontrol atas produk yang dapat dibentuk. Sebagai contoh, jika vektor diperlakukan dengan alkalin fosfatase setelah pembatasan, 5 'kelompok -phosphoryl yang akan dihapus (gbr. 11.5). Ligase hanya akan bergabung 3 'dan 5' berakhir DNA bersama-sama jika ujung 5 'adalah terfosforilasi; dan sebagainya, pada ligasi dengan fragmen DNA yang tidak diobati, link hanya dapat terbentuk antara fragmen dan vektor atau fragmen dan fragmen, sehingga mencegah recircularization sederhana vektor dan meningkatkan hasil molekul rekombinan.

Idealnya, kedua vektor dan 'memasukkan' DNA harus dipotong dengan enzim restriksi yang sama, atau dengan pasangan yang menghasilkan ujung menonjol identik (isoschizomers), tetapi hal ini tidak selalu mungkin. Dalam kasus tersebut, setiap ujung kohesif dapat dikonversi ke bentuk tumpul, baik dengan menghilangkan menonjol nukleotida menggunakan S1 nuklease (yang menurunkan DNA beruntai tunggal), atau dengan mengisi ujung untai tunggal menggunakan polymerase DNA dan keempat trifosfat nukleosida. Pada prinsipnya, molekul berujung tumpul kemudian bisa dihubungkan dengan menggunakan ligase T4 DNA. Namun, hal ini tidak biasanya dilakukan, karena molekul rekombinan yang dihasilkan mungkin tidak mengandung situs untuk pembatasan pada titik-titik di mana link yang telah dibuat, dan sehingga akan sulit untuk memulihkan DNA dimasukkan dari vektor setelah kloning. Karena itu, jauh lebih bermanfaat untuk melaksanakan tumpul ligasi berakhir antara fragmen DNA dan 'linker', yang merupakan oligonukleotida sintesis kimia yang mengandung satu atau lebih pembatasan situs.

Jika vektor mengandung, misalnya, tempat pembelahan HindIII dalam satu gen resistensi antibiotik, dari fragmen DNA, setelah konversi bentuk tumpul berakhir, akan diikat untuk linker mengandung situs HindIII. Pembatasan berikutnya dari fragmen-plus-linker menggunakan HindIII akan menghasilkan molekul yang dapat diligasi ke vektor. Ada begitu banyak linker (dan molekul terkait dikenal sebagai adapter) tersedia secara komersial yang sekarang mungkin untuk mengatasi hampir semua masalah ketidakcocokan antara vektor dan insert.

Sebuah teknik yang dikenal sebagai 'homopolimer tailing' dapat digunakan untuk bergabung dengan molekul berujung tumpul, dan memiliki keuntungan yang hanya ikatan antarmolekul, antara vektor dan insert, dapat terjadi. Vektor dan insert diperlakukan secara terpisah dengan transferase terminal dan baik dATP atau TTP, sehingga hanya ekor yang dibangun di atas 3'-termini dari satu, dan ekor poli T di sisi lain. Pada pencampuran, ekor pelengkap akan menghasilkan stabil, molekul hybrid yang dapat digunakan untuk transformasi. Kerugian dari metode ini adalah bahwa hal itu tidak secara otomatis membuat situs pembatasan di kedua sisi dari DNA dimasukkan, sehingga pemulihan sisipan mungkin sulit. Ketika dGTP dan dCTP digunakan sama dengan molekul yang telah dipotong dengan enzim restriksi PstI, sebuah situs pembelahan PstI akan dibuat ulang pada ligasi, dan dapat digunakan untuk pemulihan insert fram plasmid setelah kloning.