PLATELIA™ TOXO IgG TMB 96 TESTOV 72741 SÚPRAVA NA KVALITATÍVNU / KVANTITATÍVNU DETEKCIU ANTI-TOXOPLASMA GONDII IgG V ĽUDSKOM SÉRE ALEBO PLAZME POMOCOU ENZÝMOVEJ IMUNOANALÝZY

Výhradne na diagnostiku in vitro

Všetky vyrábané a komercializované reagencie sú kontrolované kompletným systémom kontroly kvality začínajúcim od prijatia surovín až po konečnú komercializáciu produktu. Každá šarža je podrobená kontrole kvality a je uvoľnená na trh len vtedy, keď odpovedá stanoveným kritériám. Dokumentácia vzťahujúca sa ku výrobe a kontrole každej jednotlivej šarže je uchovávaná našou spoločnosťou.

OBSAH

1- POUŽITIE ....................................................................................................... 3

2- KLINICKÝ VÝZNAM ...................................................................................... 3

3- PRINCÍP TESTU.............................................................................................. 3

4- ZLOŽENIE SÚPRAVY ..................................................................................... 4

5- BEZPEČNOSTNÉ PREDPISY, OCHRANA ZDRAVIA .................................... 6

6- MATERIÁL NUTNÝ NA USKUTOČNENIE TESTU, KTORÝ NIE JE SÚČASŤOU DODÁVKY.................................................................................................... 8

7- PRÍPRAVA A UCHOVÁVANIE REAGENCIÍ ................................................ 9

8- ODBER, PRÍPRAVA A UCHOVÁVANIE VZORIEK .................................... 10

9- PRACOVNÝ POSTUP................................................................................. 10

10- VÝPOČET A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV .............................................. 12

11- ÚČINNOSŤ A OBMEDZENIA TESTU ........................................................... 14

12- LITERATÚRA ................................................................................................ 18

1- POUŽITIE PLATELIA™ Toxo IgG TMB je in vitro diagnostická súprava, ktorá umožňuje kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie protilátok IgG proti Toxoplasma gondii v ľudskom sére alebo plazme.

2- KLINICKÝ VÝZNAM T. gondii je prvok, vyvolávajúci infekciu u rôznych druhov živočíchov a vtákov. Toxoplazmóza, častá u ľudí a zvierat, prebieha typicky častejšie bez príznakov. Rozšírenie tejto infekcie v populácii, stanovené pomocou sérologických testov, sa môže líšiť v závislosti od krajiny pôvodu a veku. V priebehu tehotenstva toxoplazmóza spôsobuje vážne vrodené abnormality (najmä poškodenie mozgových funkcií) a občas narodenie mŕtveho dieťaťa. Dôkaz Toxo IgG protilátok u žien pred počatím poskytuje istotu ochrany plodu pred možnou toxoplazmózou počas tehotenstva. Predispozícia ku vážnemu infikovaniu toxoplazmózou je bežná u osôb postihnutých syndrómom získanej imunodeficiencie (AIDS), alebo s iným postihnutím imunity. Tieto infekcie sa prejavia hlavne v dôsledku reaktivácie cýst T. gondii, prítomných pred infekciou HIV. Špecifická diagnostika infekcie T. gondii môže byť komplikovaná a izolácia parazita je vzácna. Sérologická konfirmácia protilátok proti T. gondii svedčí o kontakte s parazitom a stala sa všeobecne uznávanou ako prostriedok na určenie imunitného stavu a citlivosti voči infekcii. Vyšetrenie na niekoľko izotypov umožňuje buď určenie doby infekcie a zvolenie vhodnej terapie v prípade akútnej infekcie, alebo navrhnutie profylaktických doporučení: hygienicko-dietetických smerníc u tehotných žien, chemoprofylaxie u imunokompromitovanej populácie.

3- PRINCÍP TESTU Tento test je v princípe technika enzýmovej imunoanalýzy na pevnej fáze popísaná ako nepriama ELISA. Antigén T. gondii použitý na potiahnutie mikrotitračnej platničky pochádza z ultrazvukom opracovaných tachyzoitov obohatených membránovými proteínmi. Konjugát sa skladá z peroxidázou značených monoklonálnych protilátok špecifických proti ľudským gama reťazcom.

Prvý krok Nariedené vzorky sa napipetujú do jamiek mikrotitračnej platničky potiahnutých antigénom T. gondii. Počas inkubácie po dobu 1 hodiny pri 37 °C sa protilátky proti T. gondii prítomné vo vzorkách naviažu na antigén T. gondii, ktorým sú potiahnuté jamky mikrotitračnej platničky. Po inkubácii sa nenaviazané protilátky a iné sérové proteíny odstránia premytím.

Druhý krok Do jamiek mikrotitračnej platničky sa pridá konjugát (monoklonálna protilátka špecifická proti ľudským gama reťazcom značená peroxidázou). Počas druhej inkubácie po dobu 1 hodiny pri 37 °C sa značená monoklonálna protilátka viaže na komplex protilátka IgG – antigén T. gondii, naviazaný na jamky mikrotitračnej platničky. Nenaviazaný konjugát sa odstráni premytím.

Tretí krok Prítomnosť imúnneho komplexu (T. gondii Ag, anti-T.gondii IgG, konjugát anti-IgG) sa dokáže pridaním roztoku obsahujúceho peroxidázový substrát a chromogén, ktorý vyvolá farebnú reakciu.

Štvrtý krok Po polhodinovej inkubácii pri izbovej teplote sa enzymatická reakcia zastaví pridaním kyseliny, 1 N H2SO4. Hodnota optickej denzity nameranej pomocou spektrofotometra pri 450/620 nm je úmerná množstvu protilátky IgG proti T. gondii, prítomnej vo vzorke. Nameraná optická denzita sa pomocou kalibračnej krivky prevedie na IU/ml. Kalibrátory (R4a, R4b, R4c) sú kalibrované oproti štandardom WHO (TOXM 185).

4- ZLOŽENIE SÚPRAVY Všetky reagencie sú určené výhradne na diagnostiku in vitro.

Štítok Zloženie reagencie Množstvo R1 Mikrotitračná

platnička Mikrotitračná platnička:12 stripov po 8 oddeliteľných jamkách, potiahnutých antigénmi T. gondii (RH kmeň) .

1 platnička

R2 Koncentrovaný premývací roztok

Koncentrovaný premývací roztok (10 x): TRIS-NaCl pufor pH 7,4, 1% Tween® 20. Konzervačné činidlo: 0,01% thimerosal.

1 fľaštička 100 ml

R3 Kalibrátor 0 Kalibrátor 0: ľudské sérum nereaktívne na protilátky anti-T. gondii a nereaktívne na

1 fľaštička 1 ml

povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBs Ag), na protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie(HIV-HIV2) a protilátky proti vírusu hepatitídy C (HCV). Konzervačné činidlo: < 0,01% thimerosal.

R4a Kalibrátor 6 Kalibrátor 6 IU/ml: TRIS-NaCl pufor (pH 8 ± 0,2), ľudské sérum reaktívne na protilátky anti-T. gondii a nereaktívne na povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBs Ag), na protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV-HIV2) a protilátky proti vírusu hepatitídy C (HCV), hovädzí sérový albumín, glycerol, E102 a E12, konzervačné činidlo: < 0,01% thimerosal a < 0,5% Proclin® 300.

1 fľaštička 1 ml

R4b Kalibrátor 60 Kalibrátor 60 IU/ml: TRIS-NaCl pufor (pH 8 ± 0,2), ľudské sérum reaktívne na protilátky anti-T. gondii a nereaktívne na povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBs Ag), na protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV1-HIV2)a protilátky proti vírusu hepatitídy C (HCV), hovädzí sérový albumín, glycerol, E102 a E122, konzervačné činidlo: < 0,01% thimerosal a < 0,5% Proclin® 300.

1 fľaštička 1 ml

R4c Kalibrátor 240 Kalibrátor 240 IU/ml: TRIS-NaCl pufor (pH 8 ± 0,2), ľudské sérum reaktívne na protilátky anti-T. gondii a nereaktívne na povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBs Ag), na protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV1-HIV2)a protilátky proti vírusu hepatitídy C (HCV), hovädzí sérový albumín, glycerol, E102 a E122, konzervačné činidlo: < 0,01 % thimerosal a < 0,5 % Proclin® 300.

1 fľaštička 1 ml

R6 Konjugát (50 x)

Konjugát: myšia monoklonálna protilátka proti ľudským gama reťazcom konjugovaná s chrenovou peroxidázou; koncentrovaná (50x).

1 fľaštička 0,6 ml

R7 Riediaci roztok Riediaci roztok na vzorky alebo konjugát: TRIS-NaCl pufor (pH 7,7 ± 0,15), hovädzí sérový albumín, 0,1 % Tween® 20 a fenolová červeň. Konzervačné činidlo: < 0,01 % thimerosalu.

2 fľaštičky 80 ml

R8 TMB Substrátový

Substrátový pufor: roztok kyseliny citrónovej a acetátu sodného o pH 4,0, obsahujúci

1 fľaštička 60 ml

pufor 0,015 % H2O2 a 4 % DMSO.

R9 Chromogén: roztok TMB

Chromogén: roztok obsahujúci tetrametyl benzidín (TMB).

1 fľaštička 5 ml

R10 Zastavovací roztok Zastavovací roztok:1 N kyselina sírová. 1 fľaštička

28 ml Samolepiace fólie. 4

5- BEZPEČNOSTNÉ PREDPISY, OCHRANA ZDRAVIA

Upozornenia Spoľahlivosť výsledkov závisí od dodržiavania nasledujúcich zásad Správnej laboratórnej praxe: • Nepoužívajte reagencie po uplynutí termínu exspirácie. • Nekombinujte reagencie z rôznych výrobných šarží v jednom behu

testu. POZNÁMKA: U premývacieho roztoku (R2, identifikácia na štítku : 10x, modré sfarbenie), substrátového pufru (R8, identifikácia na štítku: TMB buf., modré sfarbenie), chromogénu (R9, identifikácia na štítku: TMB sol., zelené sfarbenie) a zastavovacieho roztoku (R10, identifikácia na štítku: 1 N, červené sfarbenie) je možné použiť s danou súpravou aj iné výrobné šarže než tie, ktoré sú v súprave obsiahnuté, za predpokladu, že pre daný beh testu sa použije vždy rovnaká šarža. Tieto reagencie možno použiť aj s niektorými ďalšími našimi výrobkami. Pre získanie podrobných informácií kontaktujte náš technický servis.. • Pred použitím ponechajte reagencie ustáliť po dobu 30 minút pri

izbovej teplote. • Reagencie starostlivo narieďte a zabráňte ich kontaminácii. • Test nerobte za prítomnosti reaktívnych výparov (kyseliny, alkalické

látky, výpary aldehydov) alebo v prašnom prostredí, ktoré by mohlo zmeniť enzymatickú aktivitu konjugátu.

• Používajte laboratórne sklo a pomôcky dôkladne umyté a opláchnuté deionizovanou vodou alebo uprednostnite materiál na jednorázové použitie.

• Mikrotitračné platničky nesmú po ukončení premývania pred napipetovaním ďalšej reagencie vyschnúť.

• Enzymatická reakcia je veľmi citlivá na pôsobenie kovových iónov. Preto substrátový a konjugátový roztok nesmie prísť do kontaktu s kovmi.

• Substrátový roztok (substrátový pufor a chromogén) musí byť bezfarebný. Ak sa v priebehu niekoľkých minút po príprave roztoku objaví modré zafarbenie, je roztok nepoužiteľný a musí sa nahradiť iným. Tento roztok sa môže pripravovať v čistej plastovej vaničke na jednorázové použitie alebo v sklenenej nádobke, ktorá bola vopred umytá v 1 N HCl, dôkladne opláchnutá destilovanou vodou a vysušená. Roztok uchovávajte v tme.

• Pre každú vzorku použite novú pipetovaciu špičku. • Premývanie mikrotitračnej platničky je kritickým krokom testu:

dodržujte doporučený počet premývacích cyklov a presvedčite sa, že počas premývania sú všetky jamky úplne naplnené a potom úplne vyprázdnené. Nesprávne premytie môže spôsobovať chybné výsledky.

• Na konjugát a substrátový roztok nikdy nepoužívajte rovnakú nádobku.

• Skontrolujte presnosť a správnu funkciu pipiet a ostatných zariadení.

• Nemeňte pracovný postup.

Ochrana zdravia a bezpečnosť práce Všetky reagencie obsiahnuté v súprave sú určené výhradne na diagnostické použitie in vitro. • Počas manipulácie s reagenciami a vzorkami používajte ochranné

rukavice určené na jednorázové použitie. • Nepipetujte ústami. • Materiál ľudského pôvodu použitý na prípravu reagencií bol

otestovaný ako nereaktívny na povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBs Ag), protilátky proti vírusu hepatitídy C (HCV) a protilátky proti vírusom ľudskej imunodeficiencie (anti-HIV1 a anti-HIV2). Keďže žiadna metóda nemôže úplne vylúčiť prítomnosť infekčných zložiek v materiále, zaobchádzajte s reagenciami ľudského pôvodu a vzorkami ako s potenciálne infekčným materiálom, ktorý je schopný prenášať infekčné ochorenia.

• Za infekčný považujte každý materiál, ktorý prišiel do priameho kontaktu s vyšetrovanými vzorkami a reagenciami ľudského pôvodu, a rovnako tak aj premývací roztok.

• Zabráňte rozliatiu testovaných vzoriek alebo roztokov obsahujúcich vzorky.

• Postihnuté miesta musia byť opláchnuté chlórnanom sodným, nariedeným na 10 %. Miesta zasiahnuté kyselinou musia byť napred neutralizované hydrogénuhličitanom sodným, potom vyčistené roztokom dezinfekčného prostriedku a vysušené

pomocou absorpčného papiera. Materiál použitý na očistenie musí byť odložený do kontajnera na infekčný odpad.

• Vzorky, reagencie ľudského pôvodu a kontaminované materiály musia byť pred odložením dekontaminované: - buď ponorením do roztoku chlórnanu sodného o konečnej

koncentrácii 5 % po dobu 30 minút, - alebo autoklávovaním pri 121 °C minimálne po dobu 2 hodiny.

Autoklávovanie najmenej po dobu 1 hodiny pri 121 °C je najlepšia metóda na inaktiváciu vírusov HIV a vírusov HBV.

UPOZORNENIE: ROZTOKY OBSAHUJÚCE CHLÓRNAN SODNÝ NESMÚ BYŤ AUTOKLÁVOVANÉ.

• UPOZORNENIE: Niektoré reagencie obsahujú: * Proclin™ 300 < 0,5% : DRÁŽDIVÝ PRODUKT R43: Môže vyvolať podráždenie pri styku s kožou S28-37: Pri styku s kožou okamžite umyte veľkým množstvom vody a mydlom. Používajte vhodné

ochranné rukavice. • Pri zaobchádzaní s chemikáliami a pri ich odkladaní je potrebné

postupovať podľa zásad Správnej laboratórnej praxe. • Vyvarujte sa pofŕkaniu kože a slizníc substrátovým pufrom,

chromogénom a zastavovacím roztokom (nebezpečenstvo toxického pôsobenia, podráždenia alebo popálenia).

Bezpečnostný list je k dispozícii na požiadanie.

6- MATERIÁL NUTNÝ NA USKUTOČNENIE TESTU, KTORÝ NIE JE SÚČASŤOU DODÁVKY • Trepačka Vortex • Spektrofotometer na mikrotitračné platničky, vybavený filtrami

450 nm a 620 nm (*). • Vodný kúpeľ alebo rovnocenný inkubátor na mikrotitračné

platničky s termostaticky nastaviteľným na teplotu 37 ± 1 °C (*). • Nádoba na biologický odpad. • Chlórnan sodný a hydrogénuhličitan sodný. • Destilovaná alebo deionizovaná voda. • Kalibrované odmerné valce o objemoch 25, 50, 100 a 1000 ml. • Ochranné latexové rukavice na jednorázové použitie. • Ochranné okuliare. • Absorpčný papier. • Automatické či poloautomatické nastaviteľné či fixné pipety alebo

multipipety o objemoch 10 až 1000 µl a 1 ml, 2 a 10 ml.

• Manuálna, poloautomatická alebo automatická premývačka mikrotitračných platničiek (*).

• Skúmavky na jednorázové použitie. (*) Na požiadanie Vám poskytneme ďalšie informácie o vhodnom vybavení, doporučenom našim technickým servisom.

7- PRÍPRAVA A UCHOVÁVANIE REAGENCIÍ Súprava môže byť uchovávaná pri +2-8 °C až do termínu exspirácie uvedeného na obale. Poznámka: pred použitím ponechajte reagencie ustáliť na izbovú teplotu (+18-30 °C).

1) Reagencie pripravené na použitie • Reagencia 1 (R1): mikrotitračná platnička

Každý rámik obsahuje 12 stripov po 8 jamkách, ktoré je možné odlomiť a je uložený vo vzduchotesne uzavretom fóliovom sáčku so spojom. Sáčok rozstrihajte nožnicami alebo skalpelom 0,5–1 cm nad spojom. Nepoužité stripy ihneď vráťte naspäť do sáčku. Sáčok opäť dôkladne uzavrite a uložte ho pri teplote +2-8 °C. Stripy sú potom stabilné po dobu 1 mesiaca.

• Reagencia 3 (R3), reagencia 4a (R4a), reagencia 4b (R4b), reagencia 4c (R4c), reagencia 10 (R10): reagencie uchovávané pri +2-8 °C sú stabilné až do termínu exspirácie, uvedeného na štítku (aj keď už raz boli otvorené).

2) Reagencie, ktoré je potrebné pripraviť • Reagencia 2 (R2): premývací roztok 10x koncentrovaný

Na získanie roztoku o pracovnej koncentrácii (R2d) ho narieďte 1:10 destilovanou vodou. Pri manuálnom premývaní je potrebné na jednu platničku s 12 stripmi 350 ml. Po nariedení možno pracovný roztok uchovávať 2 týždne pri teplote +2-8 °C. Koncentrovaný roztok možno uchovávať pri teplote +2-25 °C.

• Roztok konjugátu: reagencia 6 (R6) + reagencia 7 (R7) Na prípravu roztoku konjugátu o pracovnej koncentrácii (R6d) pre jednu mikrotitračnú platničku narieďte 0,5 ml 50x koncentrovaného konjugátu v 25 ml riediaceho roztoku (R7). Dôkladne premiešajte. Na prípravu objemu požadovaného pre jeden 8-jamkový strip vydeľte tieto objemy 10. Roztok konjugátu o pracovnej koncentrácii je nutné po nariedení použiť do 60 minút.

• Substrátový roztok: reagencia 8 (R8) + reagencia 9 (R9)

Chromogén (R9) narieďte substrátovým pufrom (R8) v pomere 1 : 11 (napr.: 1 ml reagencie R9 + 10 ml reagencie R8). Po nariedení možno reagenciu uchovávať v tme pri izbovej teplote (+18-30 °C) po dobu 6 hodín.

8- ODBER, PRÍPRAVA A UCHOVÁVANIE VZORIEK 1. Doporučeným typom vzoriek je sérum alebo plazma (EDTA, citrát a

heparín). 2. Dodržujte nasledujúce doporučenia pre prácu so vzorkami, ich

prípravu a uchovávanie: • Vzorky krvi odoberte zo žily obvyklým spôsobom. • Na prípravu séra ponechajte vzorky pred centrifugovaním úplne

zraziť. • Po celý čas nechajte skúmavky úplne uzavreté. • Po centrifugovaní oddeľte sérum alebo plazmu od zrazeniny

alebo červených krviniek do tesne uzavretých skúmaviek vhodných na skladovanie.

• Vzorky môžu byť uchovávané pri +2-8 °C ak budú testované do 7 dní.

• Ak test nebude dokončený v priebehu 7 dní, alebo ak budú vzorky zasielané, zamrazte ich na -20 °C alebo na nižšiu teplotu.

• Vzorky rozmrazujte len 3 krát. • Zamrazené vzorky treba po rozmrazení dôkladne premiešať.

3. Obsah 90 g/l albumínu, 100 mg/l bilirubínu, ekvivalent 36 g/l trioleínu (triglyceridu) vo vzorkách a do 10 g/l hemoglobínu v hemolyzovaných vzorkách neovplyvňuje výsledky.

4. Vzorky nezahrievajte.

9- PRACOVNÝPOSTUP Presne dodržujte uvedený pracovný postup. Pre každú sériu stanovení používajte kontroly na validáciu výsledkov testu. Dodržujte zásady Správnej laboratórnej praxe. 1. Dôkladne zostavte plán umiestnenia a identifikácie vzoriek. 2. Pripravte nariedený premývací roztok (R2d) (Podľa kapitoly 7). 3. Vyberte rámik a stripy (R1) z ochranného obalu. 4. Stripy mikrotitračnej platničky raz premyte premývacím roztokom o

pracovnej koncentrácii. Mikrotitračnú platničku obráťte dnom nahor a ľahkým poklepaním na absorpčný papier z jamiek odstráňte zvyšnú tekutinu.

5. Testované séra narieďte tak, že 10 µl vzorky pridajte do 1 ml riediaceho roztoku (R7). Kalibrátory 0, 6, 60 a 240 IU/ml (R3, R4a,

R4b a R4c) sa riedia rovnakým spôsobom 1/101. Nariedené vzorky premiešajte na vortexe.

6. Pri manuálnom uskutočňovaní testu napipetujte do jamiek 200 µl nariedených kalibrátorov a testovaných vzoriek nasledujúcim spôsobom: Jamka 1A: 200 µl kalibrátora 0 IU/ml (R3) nariedeného 1/101. Jamka 1B: 200 µl kalibrátora 6 IU/ml (R4a) nariedeného 1/101. Jamka 1C: 200 µl kalibrátora 60 IU/ml (R4b) nariedeného 1/101. Jamka 1D: 200 µl kalibrátora 240 IU/ml (R4c) nariedeného 1/101. Jamka 1E,1F,1G, atď.: 200 µl vzorky nariedenej 1/100 .

7. Ak je to možné, prekryte mikrotitračnú platničku samolepiacou fóliou a pevne ju na platničku pritlačte, aby sa tesne prilepila ku povrchu. Potom mikrotitračnú platničku inkubujte na termostaticky riadenom vodnom kúpeli alebo v inkubátore na mikrotitračné platničky pri 37 ± 1 °C po dobu 1 hodiny ± 5 minút.

8. 15 minút pred koncom prvej inkubácie pripravte roztok konjugátu (R6d) o pracovnej koncentrácii. Na jednu mikrotitračnú platničku narieďte 0,5 ml 50 x koncentrovaného konjugátu (R6) v 25 ml riediaceho roztoku (R7). Dôkladne premiešajte (viď kapitola 7).

9. Odstráňte samolepiacu fóliu. Obsah všetkých jamiek odsajte do nádoby na biologický odpad (ktorá obsahuje chlórnan sodný). Mikrotitračnú platničku 3 krát premyte premývacím roztokom (R2d) o pracovnej koncentrácii. Potom ju obráťte dnom nahor a ľahkým poklepaním na absorpčný papier z jamiek odstráňte zvyšnú tekutinu (Podľa kapitoly 10).

10. Do všetkých jamiek ihneď napipetujte 200 µl konjugátu (R6d) o pracovnej koncentrácii. Roztok konjugátu sa musí pred použitím opatrne premiešať.

11. Mikrotitračnú platničku prelepte samolepiacou fóliou a pevne ju na platničku pritlačte, aby sa tesne prilepila ku povrchu. Potom mikrotitračnú platničku inkubujte na termostaticky ovládanom vodnom kúpeli alebo v inkubátore na mikrotitračné platničky pri teplote 37 ± 1°C po dobu 1 hodiny ± 5 minút.

12. Odstráňte samolepiacu fóliu, obsah všetkých jamiek odsajte a mikrotitračnú platničku 4 krát premyte tak, ako je popísané vyššie. Potom ju obráťte a ľahkým poklepaním o absorpčný papier odstráňte zvyšnú tekutinu.

13. Do každej jamky ihneď rýchlo napipetujte 200 µl premiešaného substrátového roztoku (R8 + R9). Reakciu nechajte vyvíjať v tme 30 minút pri izbovej teplote (+18-30 °C). Počas tejto inkubácie neprekrývajte platničku samolepiacou fóliou.

14. Pridajte 100 µl zastavovacieho roztoku (R10) rovnakým spôsobom a rýchlosťou ako pri pipetovaní substrátového roztoku.

15. Dôkladne utrite dno platničky. Zmerajte optickú denzitu na spektrofotometri pri 450/620 nm do 30 minút od zastavenia reakcie (pred meraním musia byť stripy vždy uchovávané mimo svetla).

16. U všetkých výsledkov skontrolujte, či je zhoda medzi meraním a plánom umiestnenia a identifikácie vzoriek.

10- VÝPOČET A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV

1) Detaily kalibrácie Prítomnosť a množstvo protilátok IgG proti T. gondii v testovanej vzorke sa stanoví na základe porovnania optickej denzity (OD) testovanej vzorky so štandardami v ich rozsahu. Kalibrátory 6, 60, 240 IU/ml obsiahnuté v súprave sú kalibrované oproti štandardu WHO (TOX M 185). Ak je rovnaké sérum testované rôznymi sérologickými metódami, môžu sa medzi stanovenými titrami objaviť určité nezrovnalosti. Tieto nezrovnalosti sú spôsobené skutočnosťou, že T. gondii používaná v týchto rôznorodých metódach obsahuje rôzne množstvá rozpustného membránového antigénu.

2) Kontrola kvality Do každej série testov zaraďte všetky kalibrátory. Na validáciu testu musia byť splnené nasledujúce kritériá. • Hodnoty optickej denzity:

- OD R3 ≤ 0,200 - OD R4c ≥ 1,000

• Pomer: OD R4a / OD R3 ≥ 2 Ak tieto kritériá nie sú splnené, test je nutné opakovať.

3) Výpočet kalibračnej krivky a) Zostrojenie kalibračnej krivky Na manuálnu redukciu údajov použite milimetrový papier, pričom namerané hodnoty OD kalibrátorov (R3, R4a, R4b, R4c) naneste na zvislú (y) súradnicovú os a príslušné koncentrácie kalibrátorov (IU/ml) na vodorovnú (x) súradnicovú os. Získanými štyrmi bodmi preložte optimálnu krivku. b) Výpočet koncentrácie v IU/ml Ak sa nameraná hodnota OD vzorky nachádza v intervale OD R4a až OD R4c, nájdite hodnotu zmeranej OD testovanej vzorky na osi y a týmto bodom preložte priamku rovnobežnú s osou x smerom ku štandardnej krivke. V priesečníku so štandardnou krivkou spustite

kolmicu na os x. V priesečníku s osou x vyhodnoťte koncentráciu v IU/ml. Poznámka: V prípade, že zistená hodnota OD vzorky nariedenej v pomere 1/101 je > OD R4c, je nutné pôvodnú vzorku nariediť riediacim roztokom R7 v pomere 1/1010 a vzorku znovu otestovať. Zistené hodnoty IU/ml je potom nutné vynásobiť faktorom 10.

4) Interpretácia výsledkov Dôkaz IgG anti-T. gondii pomocou testu Platelia™ Toxo IgG znamená imúnny stav pacienta. • Titer < 6 IU/ml Hladina protilátok stanovená pomocou tejto metódy nie je výrazná = nie je dosiahnutá imunita. • 6 IU/ml < titer < 9 IU/ml Hladina protilátok stanovená pomocou tejto metódy nie je výrazná = výsledok z jednej vzorky séra nie je dostatočný dôkaz imúnneho stavu pacienta voči T. gondii. Podľa doporučení vo Francii by mala byť znovu testovaná druhá vzorka pomocou dvoch rôznych metód. • 9 IU/ml < titer < 240 IU/ml Výrazná hladina protilátky = dlhodobá imunita alebo včasná fáza sérokonverzie. • Titer > 240 IU/ml Vysoké hladiny protilátky = akútna sérokonverzia alebo trvalo vysoká úroveň imunity, pozorovateľná u niektorých subjektov. • Obmedzenia testu Diagnózu akútnej infekcie parazitom možno stanoviť len na základe kombinácie klinických a sérologických údajov. Výsledok vyšetrenia jednej vzorky séra neposkytuje dostatočný dôkaz pre diagnostikovanie prebiehajúcej infekcie. Iba výrazné zvýšenie titra protilátok IgG proti T. gondii u dvoch vzoriek odobratých s minimálnym odstupom troch týždňov a testovaných v jednej sérii testov umožňuje diagnostiku akútnej infekcie, ale skôr by malo byť považované za dôkaz akútnej infekcie parazitom. Prítomnosť protilátok IgM proti T. gondii by mala byť tiež zaradená do sérologického sledovania jedincov podozrivých na infekciu T. gondii, keďže protilátky IgG proti T. gondii sa môžu objaviť o niečo neskôr než protilátky IgM.

5) Návod na riešenie problémov Nevalidovateľné alebo nereprodukovateľné reakcie sú často spôsobené: • nedostatočným premytím mikrotitračnej platničky,

• kontamináciou negatívnych vzoriek sérom alebo plazmou s vysokým titrom protilátok,

• kontamináciou substrátového roztoku oxidačnými činidlami (chlórnan sodný, ióny kovov …),

• kontamináciou zastavovacieho roztoku.

6) Príklad výpočtu Poznámka: Nasledujúce údaje sú uvádzané iba ako príklad a nemožno ich použiť namiesto výsledkov užívateľa.

• Výsledky Obsah jamiek OD (450/620) Koncentrácia (IU/ml)

R3 (negatívny) 0,121 0 R4a 0,615 6 R4b 1,466 60 R4c 2,099 240 Sérum 1 (riedenie 1/101) 0,108 Negatívny Sérum 2 (riedenie 1/101) 0,675 7 IU/ml Sérum 3 (riedenie 1/101) 0,808 12 IU/ml Sérum 4 (riedenie 1/101) 2,080 231 IU/ml Sérum 5 (riedenie 1/101) 1,283 43 IU/ml

* Pre riedenie 1/1010 je konečná koncentrácia IU/ml x 10

• Validácia testu - Hodnoty optickej denzity - Pomer . OD R3 ≤ 0,200 . OD R4a / OD R3 ≥ 2 . OD R4c ≥ 1,000

11- ÚČINNOSŤ A OBMEDZENIA TESTU Štúdie boli urobené so vzorkami odobratými do suchých skúmaviek, do skúmaviek so separátorom séra, skúmaviek s aktivátorom zrážania alebo skúmaviek s rôznymi protizrážavými prostriedkami (EDTA, heparín, citrát).

1. Účinnosť Nižšie zhrnuté funkčné charakteristiky testu PLATELIA™ Toxo IgG TMB boli stanovené u čerstvých vzoriek sér, pochádzajúcich od tehotných žien, imunosuprimovaných pacientov alebo od obyčajných darcov krvi a u zmrazených vzoriek séra, určených ako pozitívne alebo negatívne.

• Porovnávacie štúdie Celkom 787 náhodne vybratých vzoriek pochádzajúcich od tehotných žien bolo vyšetrených metódou PLATELIA™ Toxo IgG TMB a ďalším komerčne dostupným testom EIA. Na vyriešenie sporných

výsledkov bol použitý test priamej aglutinácie. Neurčité výsledky 23 vzoriek boli z nasledujúcich výpočtov relatívnej špecificity a citlivosti a relatívnej zhody vyradené. PLATELIA™ Toxo IgG TMB Výsledok Negatívny Pozitívny Celkom Iný test EIA Negatívny 488 0 488 Pozitívny 5 271 276 Celkom 493 271 764 Výsledky prospektívnej štúdie (pracovisko 1) Relatívna špecificita 488/488 100 %

(99,0-100,0) Relatívna citlivosť 271/276 98,2 %

(95,6-99,3) Relatívna zhoda 759/764 99,3 %

(98,8-99,9)

• Štúdie špecificity Špecificita tetu PLATELIA™ Toxo IgG TMB bola vyhodnotená na dvoch na sebe nezávislých pracoviskách. Na charakterizáciu sér boli použité komerčne dostupné testy EIA. Špecificita testu bola stanovená na základe tejto charakterizácie. Na vyriešenie sporných výsledkov sa použil test priamej aglutinácie. Neurčité výsledky boli z nasledujúcich výpočtov špecificity vynechané: - pracovisko 1: 99,8 % (403/404) - pracovisko 2: 100 % (488/488)

Celkom: 99,9 % (891/892)

• Štúdie citlivosti Citlivosť testu PLATELIA™ Toxo IgG TMB bola vyhodnotená na dvoch na sebe nezávislých pracoviskách. Na charakterizáciu sér boli použité komerčne dostupné testy EIA. Citlivosť testu bola stanovená na základe tejto charakterizácie. Na vyriešenie sporných výsledkov sa použil test priamej aglutinácie. Neurčité výsledky boli z nasledujúcich výpočtov citlivosti vylúčené: - pracovisko 1: 100 % (196/196) - pracovisko 2: 98,2 % (271/276)

Celkom: 98,9% (467/472) Testom PLATELIA™ Toxo IgG TMB boli vyšetrené sérokonverzné panely (pracovisko 1 a 2) a post-infekčné panely (pracovisko 1) zložené z: • 84 vzoriek séra od 33 tehotných žien (pracovisko 1), • 48 vzoriek od 14 tehotných žien (pracovisko 2).

Na charakterizáciu sér boli použité komerčne dostupné EIA testy. Na vyriešenie sporných výsledkov sa použil test priamej aglutinácie. Na pracovisku 1 bol zaznamenaný pozitívny výsledok metódou PLATELIA™ Toxo IgG TMB v porovnaní s ostatnými použitými EIA testmi skôr v 5 prípadoch. Na pracovisku 2 bol zaznamenaný pozitívny výsledok pomocou iného testu EIA, odlišného od predtým použitého testu, v porovnaní s testom PLATELIA™ Toxo IgG TMB, skôr v 6 prípadoch.

• Prevalencia Prevalencia pozitivity na IgG protilátky proti T. gondii v populácii sa v rôznych krajinách značne líši. V oblasti Paríža (Francia) je v populácii darcov krvi, ktorá je považovaná za zdravú, miera pozitivity 67,6%:

2. Presnosť • Opakovateľnosť testu:

3 pozitívne a 1 negatívna vzorka boli testované 30 krát v rovnakých sériách.

Vzorka Negatívny Pomer

Pozitívna 1 Pozitívna 2 Titer IU/ml

Pozitívna 3

Priemerná hodnota 0,25 11 38 110

Smerodajná odchýlka 0,02 0,83 1,35 9,53 Variačný koeficient 6,29 7,57 3,55 8,64

• Reprodukovateľnosť testu: 3 pozitívne a 1 negatívnu vzorku testovali dvaja laboratórni pracovníci trojmo v 5 rôznych dňoch.

Vzorka Negatívny Pomer

Pozitívna 1 Pozitívna 2 Titer IU/ml

Pozitívne 3

Priemerná hodnota 0,22 11,8 39,2 127,5

Smerodajná odchýlka 0,08 1,65 5,14 14,13 Variačný koeficient 34,11 13,90 13,10 11,08

3. Významné interferencie Bolo testovaných 141 vzoriek s nasledujúcimi charakteristikami, ktoré by mohli potenciálne spôsobovať vznik nešpecifických reakcií. Špecificita = 99,29% (140/141)

Vzorka pozitívna na Počet vzoriek Reaktivita Poznámka CMV IgG 5 1 Druhý pokus negatívny CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0

Mumps IgG 7 0 Mumps IgM 3 0 Osýpky IgG 7 0 Osýpky IgM 7 0

EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0

Rubeola IgG 5 0 Rubeola IgM 5 0

HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0

HIV 15 0 Myelóm 8 0

RF 15 0 ANA 10 0

HAMA 3 0 Celkom 141 1

12 – REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern

Med. J. 1975; 68, 1433-1443. 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the

HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581.

3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285.

4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxo-plasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 18, 271-275.

5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L’AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315.

6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIVinfected patients.AIDS 1996; 10, 1521-1527.

7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J.: Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234.

8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988).

9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906.

10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913.

11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G.: Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977.

12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. : Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158.

13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158.

14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805.

15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222.

16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262.

17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxo-plasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49.

18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332.

19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660 - 663.

20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269.

21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983.

22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69.

23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407

24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115.

25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316.

PREHĽAD PRACOVNÉHO POSTUPU 1. Termostat inkubátora nastavte na teplotu 37 ± 1 °C. 2. Narieďte chromogén R9 substrátovým pufrom R8 v pomere 1:11

(substrátový roztok). 3. Narieďte 10 x koncentrovaný premývací roztok R2 destilovanou

vodou v pomere 1:10. 4. Všetky jamky 1 krát premyte nariedeným premývacím roztokom

(R2d). 5. Kalibrátory a vzorky zrieďte riediacim roztokom R7 v pomere 1:101. 6. Podľa nasledujúcej schémy napipetujte do jamiek 200 µl

nariedených kalibrátorov a vzoriek:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A R3 S5

B R4a S6

C R4b S7

D R4c S8

E S1 S9

F S2 S10

G S3 S11

H S4 S12

7. Inkubujte 1 hodinu pri 37 °C. 8. Pripravte pracovný roztok konjugátu (R6 + R7). 9. Odsajte obsah jamiek a 3 krát premyte nariedeným premývacím

roztokom (R2d). 10. Do všetkých jamiek napipetujte 200 µl pracovného roztoku

konjugátu. 11. Inkubujte 1 hodinu pri 37 °C. 12. Odsajte obsah jamiek a 4 krát premyte nariedeným premývacím

roztokom (R2d). 13. Do všetkých jamiek napipetujte 200 µl roztoku substrátu (R8 + R9). 14. Inkubujte 30 minút pri izbovej teplote (+18-30 °C) v tme. 15. Do každej jamky napipetujte 100 µl zastavovacieho roztoku (R10). 16. Zmerajte absorbancie na spektrofotometri pri 450/620 nm.

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33

0459

05/2006

code: 881002