practica 1 guia de diluciones 2

5/13/2018 Practica 1 Guia de Diluciones 2 - slidepdf.com

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DILUCION.ES

1.- INTRODUCCrON

EI anallsis clinico de muestras biol6gicas oel desarrollo de proyectos de investigacion

en unlaboratorio, requiereque el personal del mismo este suficienlemente entrenado en Io

que respects a 'a preparaci6n de soluciones y dituciones de muestras, previoa fas pruebas

concretas. Obviamente, si se desea que una determinada tecnica de laboratorio lenga un

desempeno optima y produzca resultados precisos, los reactivos y las muestras deben

prepararse correctamenle ..Ademas, las muestras a analizar (ej. 8uero) deben diluirse cas

siempre antes de las pruebas. La diluci6n consiste en anadir a un volumen de muestra

biol6gica tanlos volumenes de diluyente (agua destitada, soluci6nsafina. buffer. entreotros)

como sean necesarios para obtener fa dilution deseada, fa misma tienecomo consecueneia

inmediata la disminucion de la cortcentraeion de los diferentes componentes de la muestra. En

el laboratorio se pued'en presentar diferentes circunstancias que obligan en un momenta

determinado a preparar una determinada diluci6n de una muestra. A cominua.ei6n se

describiran una serie deejemplos, recomendaciones y orientaciones con el objetivo de facilitar

lacomprension yrealizacion de ;la8diferentes tecnicas para preparar dtluciones -".

UNIDADES DE M EDIDA (VO LUM EN)En la mayoria. de los casos en las preparaeiones de las diluciones se utilizan pequeiios

volomenes tanto del especimencomo del diluyente, estos volumenes generalmente se

encuentran enel orden de los micfolitros (1-11).ecuerde que 1ml es igual a 1.000 IJIy que 1 p

es ;iguala 0,001 ml.jrate de familiarizarseconlas conversiones de mt a iU I y viceversa (en todo

caso haga los calculos que correspondan), tal y como se muestra a confinuacien:

Ul ml

1OI·d 0,01 ml

151-.1J 0,025 ml

50 U-I 0,05 ml

100 pi 0,1 ml2001.11 I 0,2.mt

250IJI a,25ml

500 pi 0,5ml,

750IJI O,75,ml Ii

900 IJ O,9ml

1.000 IJI 1ml I1.500 pi 1,5ml

Tenga en mente que siempre tiene que realizar sus calculos Htilizando la misma unidad

de medida de volumen (Ej., pi,{) ml), en todo caso realice las eonverslones que tengsn tugar.

PRINCIPIO DE LAS DILUCIONES SIMPLES

Para preoarar una difuci6n, mezele un volumen especffico de la muestra 6 especsnen

(ej. Suero) con un cierto volumen de un diluyente. Recuerde que para preparar la diluci6n

siempre agregue primero el diluyente y seguidamentela muestra (ej. Suero}, finafment

mezelsen forma adecuada.



En un caso simple, una parte de suero una parte igual de diluyente produciran una

dlwcian de % (a 1:2). La expresion "1:2" representa ia relacion de la cantidad de partes de

suero con el numero total de partes, en este caso represents una parte de suero y una partede diluyente para un total de dos (2) partes. Una muestra pura de suero, es decir, que no

contenga ninguna parte del diluyente se representaria por la relacion 1/1 (6 1.:1), es decir el

total de partes es una (1) Y estcirepresentada unicamente por la muestra. Es importante tener

presente 1.0 enado. ya que algunas pruebas de laboratorio (Ej.• V.D.R.L cuantitativo). la

muestra del paciente se analiza en forma pura y diluida.

CALCULO DE DILUCIONES

Una dilueion de 1/100 puede prepararse mezclando 1 parte de suero eon 99 partes de

diluyente; por ejemplo 1 ml + 99 ml (total de partes: 100; volumen final 100 mil. Ahora bien, si

mantenemos la relacion de volumen de suero y la de dituyente necesaria para preparar una

determinada dilucien (como en este ejemplo; diluci6n 1/100: 1 + 99), podemos variar los

volumenes de cada uno de ellos y se obtendra la misma diluci6n.

Supongamos que tenemos que preparar una dilucion 11100 y disponemos de poco

suero (6 las condiciones de la tecnica implican que no hay necesidad de utilizar volumenes

rnayores), en base a 10 expuesto podriamos preparar J·adiluci6n utilizando tan solo 50

microiitros (I.d) en este sentido, para caleular el volumen de suero multiplicamos 50 x 1, 10 queobviamente nos da 50 ~I de suero y para calcular el volumen de diluyente, multiplicamos 50 x

99, obteniendose como resultado 4.950 J . l 1 , de manera que mezclando en un tuba de ensayo

4.950 ~I de diluyente y 50 ~t de suero, obtendriamos una diluci6n 1/100, peroeneste caso el

volumen final seria de 4,.95 ml. Este procedimiento se podria aplicar para preparar otras

dfluciones (ej., %, 1120 , 1/40, 1/320, 1/1280).

P"REPARACION DE UNA DILUCION DE LA MUESTRA A UN VOLUMENFINAL

Con frecuencia se puede presentar la necesidad de preparar una diluci6n de la muestra

a un volumen final (0 total) determinado, por ejernplo, para realizar una prueba

inmunoserol6gica se requiere preparar 1.000 J . l t (1 m.) de una diluci6n 1120de la muestra de

suero de un determinado paciente, para eUo podemos proceder de tres maneras diferentes,

slendola primera la siguiente:

1,.-Aplicamos la formula:

V1 x C1 =V2 x C2

Donde:

V1 = = 1000 (.II

C1 = 1120

V2 = Volumen de suero que tenemos que aspirar y mezelar oon un volumen

determinado del dituyente para preparar la dilucion deseada. (cuyo volumen final

es de 1.000 J..II)

C2 = 111(Recuerde que-el suero esta puro, es decir, no diluido)

Por oonsiguiente:



1.000 ~I x 1120 = V2 x 111

1.000 ~l x 1120 = V2

V2;:;:: 1.000 ~1120

V2 ;:;::50 J - I t de suero

Como et volumen final de la diluci6n es 1.000 J . , I I ! , tenemos que mezciar 9 5 0 J . , I I de

diluyente can 50 fJl del suero del paciente.

2.- Otra alternativa para calcular el volumen de suero del. paciente necesario para. preparar

1.000 fJl de suero diluido 1120, serla la siguiente:

Aplicar la formula del Factor de Dilucion (FO):

FD = V fVm

Oonde:

o ;:;::s la dilucion preparada (si se expresa como una citra entera es el factor de

diluci6n (FD:20).

Vf = Equivale al volumen final 0 total de la difucion (volumen de suero + volumen de

diluyente).

Vm = Corresponde a t volumen inicial de la muestra a diluir (en este caso, suero) que

tenemos que mezdar con el diluyente para preparar la dilucion al Vf deseado.

En nuestro ejemplo:

FD (20) = 1.000 t111Vm; por 10 que:Vm = 1.000 J - I 1 / 2 0 ;

Es decir 50 fJl de suero del paciente. el cuat tenemos que mezctar con 950 III de

diluyente para preparar la dilucion deseada

3.- Finalmente, se podria aplicar una regia de tres simple:

Como se requiere preparar una diluci6n del suero 1/20, esto signffica que 1 parte de

suero esta contenida en un total de 20 partes (suero + diluyente) ..Lo eitado es equivalente a

decir que 1 volumen de suero sin diluir esta contenido en 20 volamenes de suero diluido (V f =

suero + dUuyerrte). por 1 0 que:

1 volumen de suero sin diluir 20volumenes de suero diluido (V f )

"X" IJI de suero sin diluir 1.000 IJI de suaro dilurdo (Vf)

Oespejando la incognita "){"

X = 1.000 IJIx 1120 = 50 fJl de suero



EI cual tenemos que mezclar con 950 t J J de diluyente para preparar la ditucian deseada

CALCULO DE DILUCION FINAL DE UNAMEZCLA DE SUERO NO DILUtDO

CON VOlUMEN DE D'llUYENTE.

Con bastante periodicidad se plantea la interrogante de calcular la diluci6n final

derivada de mezclar un volumen detenninado del suero no diluido procedente de un paciente

con un volumen de diluyente, par ejemplo, supongamos que en un tuba de ensayo se han

agreg,ado ,400 1-110,4 ml) de diluyente y posteriormente 100 III (0,1 ml) de suero puro del

paciente. Elcalculo dela dilucian final obtentda se puede realizar de fa siguiente manera:

Aplicar la formula de Factor de Dilucion:

VfFD=-Vm

Donde:

Vf::: 400 IJI(60,4 ml) + 1.00 tJl (00,1 ml) = 500 , . t I (0 0,5 mt)

Vm = 100 i ,J1(60,1 rnl)

Enet ejempto citado:

FD = 500 i,J l J 100 pi = 5

Por 1 0 que Ja diJucion preparada es el inverso del FD, es decir 1/5 (6 1 , :5)

otra aitemativa para calcutar fa misrna diluci6n serta la siguiente:

100 jJl del suero en unVf de 500 ill,

1 I.ft(una parte de suero) en un Vf ("X"), que es equivalente al total de partes.

Como se puede observar se trata de una regia de ires simple, as! que procedemos a

despejar ta incOgnita Vf (6 "X")

V{ = 500!J.l. x 1 p I -;- 100 lJ l

Arrojando como resultado que el Vf = 5, es decir fa dilucion preparada es 1/5 (6 1: .5)



CALCULO DE DILUCION FINAL DE UNA MEZCLA. DE SUERO(PREVIAMENTE DILUIDO) CON VOLUMEN DE DILUYENTE.

En el caso anterior, la diluci6n se calcul6 en funci6n que el suero del paciente estaba

puro (no diluido), pero puede darse el caso (que de hecho se presenta con mucha frecuencia,

par ejempfo, en caos de diluciones seriadas), que el suero provenga de una drluci6n previa del

mismo. Supongamos que en un tubo de ensayo se han agregado 400 1 .110 ,4 ml) de diluyente y

posterionnente 100 III (0,1 ml) del suero previamente diluido 112 . Eso significa que hemos

realizado una diluci6n 1/5 de un suero que ya estaba dlluido Y z , de rnanera que con respecto al

suero pure, el suero qued6 diluido 10 veces mas, es decir,la diluci6n final seria eI producto de

muttipticar dos fracciones, en estecaso: 1 /5 x % = 1J10

Tenga siempre presente que la diluci6n final de un suero tiene como punto de

referenda al suero puro no diluido y cada vez que tenga que calcular la diluci6n realizada en

un determinado tubo de ensayo (u otro recipiente), tome en cuenta S f el suero que se agreg6

estaba pure 6 diluido, en caso de estar diluido, la dilucion final: sertael producto de dos

fracciones, una de elias seria la dj~Iucj6nrealizada y la otra la diluci6n previa del suero.

DILUCIONES SERIADAS DOBLES.las diluciones seriadas son el producto de mezclar y transferir un volumen con stante de

suero en sucesivos tubos de ensayo que contienen diluyente en volumen constante 0 en

volumenes variables. las mismas se realizan en casos que se desee preparar dituciones altas

de una muestra, utilizando para ella volumenes pequei'iOs tanto del especimen como de

diluyente 6 cuando se desea titular la presencia de un determinado anticuerpo 0 de un

antigeno en una muestra biol6gica. Cuando se trabaja con diluciones seriadas. es Util expresar

tadas las diluciones en terminos de fracciones. Esto hace que resolver un problema de

diluciones seriadas se convierta en una cuestion de multiplicaci6n de fracciones.

Par Ej., una diluci6n seriada en dos (6 1/2) a un volumen constante de diJuyente,es una

dilucion en la que un volumen fijo de suero se mezcla y se traspasa en sucesivos tubos que

contienen identico volumen de diluyente. Esta dilucion doble puede expresarse asi:

1 1 diluci6n en dos = Partes transferidas I total de partes

Un ejemplo de una diJuci6n seriada 112 (0 en dos) a unvolumen constante de difuyente

se describe en el siguiente grafico (partiendo de un suero puro).

La dilucion seriada % mostrada en el graflCO produjo una drtucion flnat de 11256 (61:256) e involucroel uso de ,s tubos de ensayo. Utitizando un volumen constants de 100 lJ

para. mezclar y transferir.



Mezcle y transfiera Descarte

100 IJIde diluyente en cada tuba

7 84 5 63

. Cada tubo es una dilucicn de 1:2 del tuba anterior y la diluci6n final de cada tuba es un producto de dos

fracciones

1-x2

1-x2

1

2

1

=256

1

-x2

1

-x2

1-x2

1

-x2

1_:x2

Multiplique las fracciones para encontrar la diluci6n final de cualquiera de los tubos

1

32

1

2

1 1 1

64

1

128

1

16

1

2564-

8

Para cada tubo del ejernplo:

Partes transferidas = 100 IJI 1 1

= =Total de partes = 200 iJl Diluci6n endos 2

En este caso, una diluci6n en dos 0dobte

DILUCIONES SERIADAS CUADRUPLES~

Es posible preparar la misma diluci6n final det caso anterior, utntzando el mismo

volumen de suero puro (100 I.d) y un nurnero menor de tubos de ensayo, por ejempio, sl

deseamos prepararle con 4 tubos, es decir, la mitad de los tubas empleados en el ejemplo enreferencia, cada tuba debe representar el equivalente ados dilucfones 1~2,es decir, Y z x Y z =1/4, par 10que tendrlamos que hacer dilucianes seriadas % (6 en cuatro), tal y como se

muestra a continuaci6n:



Mezcle y transfiera

100 fJl de suero en el primer tUbo(0:)~ ~ ~ ~

Descarte

• Cada tubo es una diluciOn de 1:4 del tubo anterior Y' la diluci6n final de cada tubo es un producto de dos

fracciones

Multiplique las fracciones para encontrar la diluci6n final de cualquiera de los tubos

3001-11de diluyente en cada tubo

Para cada tubo del ejemplo:

Partes transferidas= 100 iJl

1

-x4

. En este caso, una dilUci6n en cuatro

Total de partes= 400 1 1 1

1

1-x4

1-4

2

1-x4

1

16

=

3 4

1 1

-x =4 256

1

64

1

256

1 1

4

=Diluci6n en cuatro

En caso que deseemos preparar Ia misma ditucion (11256), utiJizando iniciaimente 100

IJ I de suero puro y tan solo 2 tubos de ensayo. tendriamos que hacer diluciones seriadas 1/16(0 en dieciseis), debido a que (siguiendo el rnisrno razonamiento) cada tubo debe representar

una dilucion equivalente a cuatro diluciones 1:2, es de cir, % x % x % X % :; 1nS (6 ados

diluciones 1: 4 . ; ' ! 4 x '! 4 = 1116).

En base a 10 expuesto, preparariamos la diluci6n colocando 1500 1-111,5 ml) de

diluyente en dos tubos de ensayo, le agregariamos 100 IJIde suero puro al primero de elias,

se mezcla y se transfiere 1001-11al otro tubo, mezctariamos nuevamente y descartariamos 100

1-11,omo en los ejemptos en referencia, obteniendose ta dilucion final deseada: 1/16 x 1116 =

1/256 rver siguiente grafico)



Partes transferidas = 100 pi 1 1

Mezcle y transfiera

100 1 1 1 de suero en el primer tubO(fV ~ ~

1500 1 1 1 de diluyente en cada tubo

Descarte

Tubo N° 1 2

•Cada tuba es una diluci6n de 1:4 del tubo anterior y la dilucion final de cada tuba es un producto de dos

fracciones

1 1 1~·x -x =16 16 256

Multtpfique las fracciones para encontrar la diluci6n final de cualquiera de los tubas

1 1

16 256

Para cada tubo del ejernplo:

=Total de partes = 1500 IJI Diluci6n en 16 16

, En este caso, una dikicion en cuatro

DILUCIONES SERIADAS A VOLUMEN VARIABLE.

En ciertas circunstancias, las diluciones seriadas se preparan variando el volumen de

diluyente (diluci6n seriada a vohJmenes variables).. Supongamos que tenemos la necesidad de

preparar una diluci6n 11160 del suero obtenido de un paciente, la mismala podriamos obtener

en la forma que se describe en el presente grafrco:

1



I

r - - -I

Mezcle y transfiera

Descarte

100 pi de suero en el primer tUba{fVU0 U0 U0 U0 U0 U0

Tuba N° 1 2 3 4 5 6

. Va lumen de diluyente en cada tuba 400 fJ l 100 ~I 1001-11 100 I J I 100~d 100 IJ \

Diluci6n del tubo 1 1 1 1 1 1-x -x -x -x -x5 2 2 2 2 2

Diluci6n final 1 1 1 1 1 1- - - - -5 10 20 40 80 160

En esta altemativa fueron necesarios seis (6) tubos para IIegar a la diluci6n deseada.

Cabe destacar, que cualquier pequeno error en el proceso de diluci6n aumenta

exponencialmente con cada tubo adicionaL Por to tanto, siempre es mejor utifizar el numero

minima de tubos para obtener las diluciones que deseamos preparar. A continuacion se

muestra una forma mas eficiente de obtener la misma diluci6n usando cuatro (4) tubos de

diluci6n:

Mezcle y transfiera

100 IJIde suero en el

primer tuba Oescarte

Tuba N° 1 2 3 4

Volumen de diluyente en cada tuba 900 1-11 3001-11 100 IJ I 100 pi

Diluci6n del tubo 1 1 1 1 1

-x -x -x -x =-10 4 2 2 160

Diluci6n final 1 1 1 1

- -10 40 80 160

En resumen, al hacer diluciones seriadas:



• Recuerde que el volumen de suero que se utiliza para mezclar y transferir permanece

constante, mientras que el volumen del diluyente puede variar 0 permanecer constante,

con et fin de producir la dHucion mas apropiada.

• Para conservar el suero, use siempre el volumen mas pequerio posible para diluir.

• Si bien uti.liza el volumen mas pequeno posible para diluir, recuerde que no se

recomienda utilizar menos de 50 ~I (vohJmenes finales) para las dituciones seriadas,

porque un volumen menor que este seria dificil de contmlar con precision.

• Muchos errores se producen cuando s hacen diluciones seriadas porque se pierde el

rastm de la secueneia. Esto puede evitarse utitizando dos carrifes adyacentes en la

gradilla, de manera que, una vez mezclado el suero en el tubo correspondiente, este se

coloque en el carril donde hemos decidido ordenar los tubos con las diluciones que

vamos secuencialmente preparando. Cuando se usan placas de microtitulad6n, se

puede utilizar una tapa 0 hacer una marea en la mesa de trabajo que indique et pociflo

donde se va a agregar la muestra diluida y mover la placa despues de realizada cada

dilucion.

CALCULO DE FACTOR DE Df·LUCION EN DILUCIONES SERIADAS.

Es reeomendable familiarizarse con 10 que se denomina "factor de dilucion'" termino et cual

esta asociado a la preparacion de diluciones seriadas como se muestr:a a continuacion:

Supongamos que para realizar una determinada prueba semicuantitativa se requiere realizar

las siguientes diluciones seriadas del suero: 1/10; 1/20; 1/40; 1/80; 1/160; 1/320. De cada

dilucion se van a utilizar 100 IJIpara la prueba inmunoserol6gica. Como se necesitan 100 IJIde

cada dilucion, se pueden preparar 500 pl decada una de las diluciones

. . .. . Volumen final de Ladilucian

Vol. tntclUl de la muestra(X) = F d D., . , ( )actor e 1UClOn FD

TUBO 1:

Oiluci6n: 1110. Factor de Diluci6n (FD): 10

Volumen de ta Dilucion (Vf): 500

Volumen inicial de la muestra (Vm): X500 lJ l

Vol. inicial de la muestra(X) =10

Vol.inicial de fa muestra(X) ::::50 liZde suero puro

En el tube W 1 se anaden 450

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