Unidad de Epidemiologia Molecular IMTAvH

X Curso y Taller de Adiestramiento en Técnicas de Biología Molecular Aplicadas a Enfermedades Infecciosas

y Tropicales (PCR, Real-time PCR y Secuenciamiento)

Guía de Práctica de:"Introducción en el análisis de genética de

poblaciones"

I. Caracterización molecular de las muestras analizadas con MS(programa Excel)

1. Determinar los alelos (pb) para cada MS.2. Codificar los alelos para cada MS.3. Identificar muestras con más de una clona (+ de un alelo

encontrado, organismo haploide)4. Determinar las combinaciones únicas (Haplotipos)

II. Evaluación de los microsatélitesAbrir en Excel el archivo “MS database curso 2013.xls (hoja all infxs)”

A. Detección de infecciones policlonales (%) de cada MS (%)= # infecciones policlonales/#total de infecciones Comparar Porcentage de detección de infxs

policlonales/MS (%) entre los MS usados.¿Cuál es el MS que detectó un mayor número de infecciones policlonales? Por qué un MS detectaría infecciones policlonales más frecuentemente que otros MS?

B. Variabilidad genética de los microsatélites (índice de Heterozigocidad esperada, He) Abrir en el block de notas el archivo “analisis2013.txt”. Convertir el archivo en un formato compatible con el

programa FSTAT. 1. Copiar “analisis2013.txt” a la carpeta GenepopV4.2. Abrir programa Genepop.3. Tipear: analisis2013.txt y hacer ENTER.4. Observar resultados preliminares.5. Hacer ENTER.6. Seleccionar “Ecumenicism: file conversión” tipeando

7 y hacer ENTER.

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7. Seleccionar la opción Genepop ->Fstat tipeando 1 y luego hacer ENTER.

8. Notar que el archivo analisis2013.txt.DAT se ha creado en la carpeta Genepop.

9. Cerrar la ventana del Genepop.10. Buscar el archivo en la carpeta Genepop y copiarlo

a una nueva carpeta en el escritorio.

Fstat for Windows v2.9.3.21. Abrir el programa FSTAT.2. En el cuadro de opciones “Gene diversities and

sample statistics” seleccionar “Allele frequencies”, “Number of alleles” y “Gene diversity”.

3. Abrir el archivo generado por Genepop haciendo click en File>Open>seleccionar el archivo analisis2013.txt.DAT y hacer ENTER.

4. Hacer click en el botón RUN. Aparecerá un aviso de que el archivo analisis2013.txt.DAT fue procesado.

5. Ir a la carpeta que crearon en el escritorio, renombrar el archivo analisis2013.txt.out por resultados1.txt

6. Abrir el archivo resultados1.txt.7. Observar los resultados y discutir (Número de alelos,

frecuencias alélicas, He). ¿Eliminaría Ud algún microsatélite de su

análisis? Y de otros estudios? ¿Cuál es el microsatelite más variable (más

polimórfico)? ¿Cuál es el microsatélite más informativo?

III. Estudio de la estructura genética de poblaciones parasitarias

Análisis del desequilibrio de ligación (Linkage Dissequilibrium, LD)

1. Abrir el programa FSTAT.2. En el cuadro de opciones “Genotypic disequilibrium”

> Overall or for each sample marcar Test between all pairs of loci.

3. En el cuadro de opciones “Genotypic disequilibrium” > Nominal level for multiple tests marcar 5/100 (grado de confiabilidad, 1/1000 es más confiable pero demora más en procesar).

4. Ir a la carpeta que crearon en el escritorio, renombrar el archivo analisis2013.txt.out por resultadosLD.txt

5. Determinar el Pvalue al 5% (los valores menores al Pvalue obtenido indican que existe LD)

Existe LD en esta población??? ¿Posibles causas?

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¿posibles efectos?

Idenficando haplotipos1. Abrir el programa GenClone.2. Usando GenClone abrir el archivo

genclone2013.txt3. Automáticamente al abrir el archivo se va a

generar el archivo genclone2013.outgenclone. Abrirlo con Excel.

4. Identificar los haplotipos (Distinct MLG designation). Con esta información ya se puede asignar el haplotipo específica a cada muestra.

Identificando clusters de haplotiposAbrir en Excel el archivo “MS database curso 2013.xls (hoja monoclonales). Identificar los haplotipos (combinaciones únicas de alelos encontrados).

5. Entrar a la web de eBURST http://eburst.mlst.net/6. Seleccionar la opción Single Dataset.7. Seleccionar el número de loci =158. Copiar los datos de la hoja monoclonales.|9. Hacer click en SUBMIT.10. Click to launch eBurst.11. Hacer click en ventana análisis, luego en COMPUTE. 12. Discutir los resultados.

Links

Genepophttp://genepop.curtin.edu.au/

Fstathttp://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm

eBURST http://eburst.mlst.net/

GeneClonehttp://www.ccmar.ualg.pt/maree/software.php?soft=genclon

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